Summary
Este protocolo presenta una manera simple y coherente de regular transitoriamente un gen de interés utilizando modRNA después del infarto de miocardio en ratones.
Abstract
El infarto de miocardio (MI) es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en el mundo occidental. En la última década, la terapia génica se ha convertido en una opción de tratamiento prometedor para las enfermedades cardíacas, debido a su eficiencia y efectos terapéuticos excepcionales. En un esfuerzo por reparar el tejido dañado después de la MI, varios estudios han empleado terapia génica viral o basada en el ADN, pero han enfrentado obstáculos considerables debido a la expresión pobre e incontrolada de los genes entregados, edema, arritmia e hipertrofia cardíaca. El ARNm modificado sintético (MODRNA) presenta un novedoso enfoque de terapia génica que ofrece un suministro de ARNm alto, transitorio, seguro, no nommunogénico y controlado al tejido cardíaco sin ningún riesgo de integración genómica. Debido a estas características notables combinadas con su farmacocinética en forma de campana en el corazón, modRNA se ha convertido en un enfoque atractivo para el tratamiento de enfermedades del corazón. Sin embargo, para aumentar su eficacia in vivo, es necesario seguir un método de entrega coherente y fiable. Por lo tanto, para maximizar la eficiencia de la entrega de modRNA y la consistencia del rendimiento en el uso de modRNA para aplicaciones in vivo, se presenta un método optimizado de preparación y entrega de la inyección intracardiaca modRNA en un modelo MI de ratón. Este protocolo hará que la entrega de modRNA sea más accesible para la investigación básica y traslacional.
Introduction
La terapia génica es una poderosa herramienta que implica la administración de ácidos nucleicos para el tratamiento, cura o prevención de enfermedades humanas. A pesar de los avances en los enfoques diagnósticos y terapéuticos para las enfermedades cardíacas, ha habido un éxito limitado en la administración de genes en el infarto de miocardio (MI) y la insuficiencia cardíaca (HF). Tan sencillo como parece el proceso de la terapia génica, es un enfoque marcadamente complejo teniendo en cuenta los muchos factores que deben optimizarse antes de emplear un vehículo de entrega en particular. El vector de administración correcto debe ser no inmunogénico, eficiente y estable dentro del cuerpo humano. Los esfuerzos en este campo han generado dos tipos de sistemas de administración: viral o no viral. Los sistemas virales ampliamente utilizados, incluida la transferencia de genes por adenovirus, retrovirus, lentivirus o virus asociados al adeno, han demostrado una capacidad de transducción excepcional. Sin embargo, su uso en clínicas es limitado debido a la fuerte respuesta inmune inducida1, riesgo de tumorigenesis2, o la presencia de anticuerpos neutralizantes3, todos los cuales siguen siendo un obstáculo importante para la aplicación amplia y eficaz de vectores virales en la terapia génica humana. Por otro lado, a pesar de su impresionante patrón de expresión, la entrega de ADN plásmido desnudo muestra una baja eficiencia de transfección, mientras que la transferencia de ARNm presenta una alta inmunogenicidad y susceptibilidad a la degradación por RNase4.
Con la extensa investigación en el campo del ARNm, modRNA se ha convertido en una herramienta atractiva para la entrega de genes al corazón y varios otros órganos debido a sus numerosas ventajas sobre los vectores tradicionales5. La sustitución completa de la uridina por pseudouridina de origen natural da como resultado una expresión proteica más robusta y transitoria, con una inducción mínima de la respuesta inmunitaria innata y el riesgo de integración genómica6. Los protocolos recientemente establecidos utilizan una cantidad optimizada de análogo de tapa antirrevertida (ARCA) que mejora aún más la traducción de proteínas al aumentar la estabilidad y transabilidad del ARNm sintético7.
Informes anteriores han mostrado la expresión de varios genes reporteros o funcionales entregados por modRNA en el miocardio de roedores después de MI. Con las aplicaciones de modRNA, áreas significativas del miocardio, incluyendo tanto cardiomiocitos como nocardiomiocitos, han sido trans infectadas con éxito lesión post-cardiaca8 para inducir la angiogénesis9,10, supervivencia de células cardíacas11, y la proliferación de cardiomiocitos12. Una sola administración de modRNA codificado para la follistatina humana mutada-como 1 induce la proliferación de CM adultos de ratón y aumenta significativamente la función cardíaca, disminuye el tamaño de la cicatriz, y aumenta la densidad capilar 4 semanas después de MI12. Un estudio más reciente reportó mejor función cardíaca después de MI con la aplicación de VEGFA modRNA en un modelo de cerdo10.
Por lo tanto, con la mayor popularidad del modRNA en el campo cardíaco, es esencial desarrollar y optimizar un protocolo para la entrega de modRNA al corazón post-MI. Aquí es un protocolo que describe la preparación y entrega de modRNA purificado y optimizado en una formulación biocompatible citrato-salina que proporciona una expresión de proteína robusta y estable sin estimular ninguna respuesta inmune. El método mostrado en este protocolo y vídeo demuestra el procedimiento quirúrgico estándar de un MI de ratón por ligación permanente de la arteria descendente anterior izquierda (LAD), seguido de tres inyecciones intracardiacas del sitio de modRNA. El objetivo de este artículo es definir claramente un método altamente preciso y reproducible de administración de modRNA al miocardio murino para hacer que la aplicación modRNA sea ampliamente accesible para la terapia génica cardíaca.
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Protocol
Todos los procedimientos con animales descritos aquí han sido aprobados por la Escuela de Medicina de Icahn en el Comité de Cuidado y Uso Institucional del Monte Sinaí.
1. Síntesis de modRNA
NOTA: Los detalles de la síntesis de modRNA se pueden encontrar en Kondrat et al.13.
- Pida las plantillas de plásmido(Tabla de materiales)y genere un producto PCR limpio para utilizarlo como plantilla de ARNm.
- Preparar los modRNAs por transcripción in vitro con una mezcla de ribonucleósido personalizada de la siguiente (Tabla de materiales): Kit de transcripción T7, 6 mM análogo de tapa anti-retroceso (ARCA) 30-O-Me-m7G(50) ppp(50)G, trifosfato de guanosina de 75 mM, trifosfato de adenosina de 75 mM, trifosfato de citidina de 75 mM, pseudouridina-5-trifosfato de 100 mM y enzima T7 DNase.
- Purificar el modRNA realizado en el paso 1.2 con un kit de limpieza de transcripción(Tabla de materiales)y tratar con fosfatasa antártica. A continuación, vuelva a purificar el modRNA con el kit de limpieza de transcripción y cuantifique utilizando un espectrofotómetro.
- Precipite el modRNA con acetato de etanol y amonio y resuspend en 10 mM Tris-HCl y 1 mM EDTA.
- Concentrar el modRNA para la entrega in vivo mediante filtros centrífugos y medir la calidad utilizando una plataforma de electroforesis automatizada(Tabla de Materiales).
2. Preparación de la inyección de modRNA para la entrega in vivo
- Calcular el volumen necesario para 100 g de inyección de luciferasa (Luc)/Cre modRNA en función de la concentración de modRNA.
- Mezclar el volumen calculado de modRNA con partes iguales de solución de sacarosa preparadas en agua libre de nucleasa (0,3 g/ml) y solución de citrato de 0,1 M (pH a 7) (20 l cada una recomendada).
- Lleve el volumen final de la inyección a 60 l añadiendo solución salina.
3. Cirugía de infarto de miocardio
- Anestesia y preparación del animal
NOTA: Este estudio utiliza ratones CFW masculinos y hembras de 8 a 12 semanas de edad.- Anestesar el ratón con 2% de isoflurano utilizando una cámara de inducción y colocar el animal en su espalda en una posición dorsal con una máscara facial sobre su nariz y boca para mantener la anestesia. Mantener la anestesia mediante ventilación mecánica utilizando un respirador equipado con un tubo de vía respiratoria de 7 x 8 mm y un filtro.
- Para inmovilizar al ratón en la plataforma de la cirugía, asegure sus extremidades con cinta quirúrgica. afeitar la zona del cuello y el lado izquierdo de la caja torácica y desinfectar usando 70% etanol y yodo povidona. Repita el paso de desinfección dos veces. Compruebe sus reflejos, pellizcando la cola y los pies traseros para evaluar la profundidad de la anestesia.
- Monitorizar y mantener continuamente la temperatura corporal del núcleo a la normotermia (37,5 x 38 oC).
- Mantener una vía aérea abierta realizando intubación intratraqueal. Para ello, coloque el ratón en una posición ventral con la boca hacia el experimentador y tire suavemente de la lengua. Ajuste el ángulo del cuello y enderece la trayectoria de intubación y empuje la cánula de intubación.
- En caso de que el animal no pueda respirar a través de él, se puede realizar traqueotomía. Realizar una incisión cervical a lo largo de la línea media aislando la piel, el músculo y el tejido que delinea la tráquea usando un microscopio. Cuando la tráquea sea claramente visible, inserte el tubo endotraqueal en el tejido entre dos anillos de cartucho por debajo de la glotis haciendo un pequeño agujero y sosteniendo la parte craneal de la tráquea usando fórceps microquirúrgicos.
- Observe el movimiento torácico del ratón para verificar que ambos pulmones están recibiendo oxígeno. La frecuencia respiratoria (RR) debe ser de aproximadamente 120 respiraciones por minuto, con una presión inspiratoria de 17-18 cm H2O.
- Ligadura de la arteria descendente anterior izquierda (LAD)
- Para realizar la ligadura LAD, gire el ratón con cuidado para que esté acostado en su lado derecho. Levante la piel y realice una toracotomía del lado izquierdo entre la 3a y la 4a costilla y disecciona el tejido y el músculo cuidadosamente. Use un cautey para prevenir el sangrado.
- Abra el tórax con cuidado y una vez abierto, encontrar el corazón, sin tocar el pulmón con ningún objeto afilado. Coloque los retractores en la incisión para mantener la cavidad torácica abierta y tener una visión clara del corazón. Ahora mueva los pulmones al borde de la incisión y retire la parte del saco pericárdico que está cubriendo el corazón para acceder a la superficie anterior del corazón.
- Identifique cuidadosamente el LAD, que puede ser visto como un vaso rojo luz profunda ubicado entre la arteria pulmonar y la aurícula izquierda. Ligar el LAD proximal con una sola sutura de una sutura de seda 7-0. Coloque un tubo torácico (28 G, catéter venal), entre la 4a y la 5a costilla.
- Cierre la incisión torácica en capas. Utilice las suturas de running de seda 6-0 para adaptar las costillas y utilice suturas de running de seda 5-0 para cerrar la piel. Asegúrese de dejar una ventana adecuada para la medición ecocardiográfica futura.
- Escurra cuidadosamente el tórax con solución isotónica caliente (9 g de cloruro de sodio en 1 L de agua) utilizando una jeringa de 2 ml. Coloque el ratón sobre su parte posterior. Si realiza la traqueotomía, saque el tubo endotraqueal y utilice suturas de seda 7-0 adaptando los anillos del cartucho traqueal con una sola puntada. Coloque la máscara facial sobre el ratón y cierre la piel con suturas de seda 5-0.
- Para la fase de recuperación, desconecte la cánula de intubación del respirador y permita la respiración espontánea. Coloque al animal debajo de una lámpara de calor hasta que alcance la conciencia. No deje al animal desatendido después de la cirugía hasta que esté completamente despierto.
- Gestione la terapia del dolor con buprenophine a 0,1 mg/kg de peso corporal, inyectada por vía subcutánea durante los próximos 3 días a intervalos de 12 h.
4. Entrega cardíaca de modRNA
- Entregar un total de 60 l del modRNA preparado en el paso 2.3 por vía intramuscular (IM) utilizando una jeringa de insulina (31 G) después de un MI.
- Inyectar 20 l del modRNA en tres sitios diferentes del músculo cardíaco que rodean el área del infarto (dos a cada lado de la ligadura y uno en el ápice). Realice las inyecciones inmediatamente después del LAD, antes de cerrar el tórax.
NOTA: Las imágenes representativas de los sitios de inyección de modRNA se pueden ver en la Figura 1.
- Inyectar 20 l del modRNA en tres sitios diferentes del músculo cardíaco que rodean el área del infarto (dos a cada lado de la ligadura y uno en el ápice). Realice las inyecciones inmediatamente después del LAD, antes de cerrar el tórax.
5. Validación de la expresión de proteínas en el corazón después de MI
- Expresión de modRNA luciferasa utilizando un sistema de imágenes de bioluminiscencia
NOTA: Un total de 100 g de ArNm De Luc preparado en 60 ml del tampón de citrato de sacarosa se inyecta directamente en el corazón de los ratones CFW después de la MI.- A las 24 h después de la inyección de MI y modRNA, anestesiar a los ratones con 2% de isoflurano utilizando una cámara de inducción e inyectar intraperitonealmente luciferina (150 mg/g de peso corporal) para validar la señal Luc in vivo.
- Ijelucia a los ratones utilizando un sistema de imágenes de bioluminiscencia cada 2 minutos hasta que la señal Luc alcance la saturación.
- Cuantifique los datos de imágenes recopilados con un software de análisis de imágenes. Utilice los ratones inyectados con solución salina sólo como lectura de línea base para la expresión de Luc y reste la señal de fondo recogida de los ratones inyectados en solución salina.
NOTA: La señal Luc se expresa en p/s/cm2/sr x 106.
- Inmunostaining for Cre transfection validation
- Para validar la transfección con Cre, sacrificar los animales 24 h postinyección utilizando una inyección intraperitoneal de 100 mg/kg de ketamina y 10 mg/kg de xilazina seguida de dislocación cervical. Antes de hacer una incisión, desinfecte el pecho y el abdomen con un hisopo de alcohol al 70%.
- Abra la cavidad torácica haciendo una incisión transversal 1 cm más baja que el esternón y mueva las tijeras hacia la cabeza, cortando a través de la caja torácica.
- Abra el tórax e inyecte 1 ml de PBS estéril en la cámara ventricular derecha para eliminar el exceso de sangre. Exéme el corazón inmediatamente y colóquelo en el PBS estéril para lavar la sangre restante.
- Fijar el corazón en 4% de paraformaldehído (PFA) durante 24 h, seguido de la incubación durante la noche en 30% de solución de sacarosa a 4 oC. Al día siguiente incrustar los corazones en un medio de temperatura de corte óptimo y secciones de ellos a un espesor de 10 m utilizando un criostato.
- Manche las secciones con anticuerpo primario contra la troponina cardiaca I (cTNI) y etiquete con un anticuerpo secundario fluorescente. Para identificar el núcleo, mancha con 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) durante 5 min. Imagen de las diapositivas usando un microscopio fluorescente.
6. Análisis estadístico
- Trazar un gráfico de barras basado en la expresión Luc en ratones con solución salina e inyectados en Luc e informar de los valores como medio de SEM. Compare los dos grupos utilizando una prueba t no asalada (****p < 0.0001).
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Representative Results
Ratones de ocho a diez semanas de edad fueron anestesiados con isoflurano e intubados. Después de que el animal estaba bajo anestesia, la región torácica izquierda fue afeitada y esterilizada con etanol, y el corazón fue expuesto para la ligadura de LAD. La arteria coronaria izquierda se ocluyó anudando firmemente la sutura debajo de la arteria (representación del diagrama Figura 1A). Después de un infarto exitoso (indicado por el paling de la pared libre ventricular izquierda), se entregó directamente en el miocardio una inyección directa de 100 g de Luc o Crerna modRNA disuelta en el tampón de citrato de sacarosa directamente en el miocardio en tres sitios diferentes (Figura 1B) que rodea el área de lesión utilizando una jeringa de insulina. El procedimiento de MI con inyecciones de modRNA duró 30-45 min por animal. Los animales mostraron aproximadamente 90% tasa de supervivencia postprocedibilidad. Después del procedimiento, el pecho y la piel se suturaron firmemente en capas y el animal fue retirado de la ventilación tan pronto como comenzó a respirar normalmente.
Después de realizar la ligadura laD y la posterior entrega de la inyección de modRNA Luc, validamos la transfección de modRNA Luc comprobando la expresión de proteína Luc 24 h postinyección utilizando un sistema de imágenes de bioluminiscencia (Figura 2A). En publicaciones anteriores establecimos que aunque la expresión proteica se puede ver hasta el día 6 posttransfección, la mayor eficiencia de transfección de modRNA se observa a las 24 h8. Del mismo modo, detectamos con éxito la señal Luc en el corazón tratada con inyección de ModRNA Luc (1,76 x 108) en comparación con los ratones inyectados con tampón de citrato de sacarosa después de MI (3,0 x10 5) (Figura 2B).
Además, buscamos validar la expresión modRNA comprobando su traducción y biodistribución en un ratón Rosa26mTmG transgénico. Este sistema de modelo de ratón expresa la expresión de fluorescencia tdTomato (mT) localizada por membrana celular en todas las células/tejidos del cuerpo y los cambios en la expresión de fluorescencia EGFP (mG) localizada por membrana celular tras la recombinación de crecombinación. Por lo tanto, para observar la expresión del modRNA Cre, se inyectó 100 g de modRNA Cre directamente en el miocardio post-MI en ratones macho y hembra Rosa26mTmG, y los animales fueron sacrificados 24 h después de la frecuencia. Los corazones se fijaron y procesaron para la inmunomancha con el marcador de cardiomiocitos cTNI y el marcador nuclear DAPI (Figura 3A). La expresión cre exitosa fue evidente debido a la aparición de celdas de color verde (Figura 3B), que fueron el resultado de la recombinación con el modRNA Cre entregado al ratón, representado por el cambio del color tdTomato a EGFP alrededor del sitio de inyección de Cre (Figura 3C).
Figura 1: Ligación LAD y parto cardíaco de modRNA. (A) Diagrama esquemático que muestra el área de ligadura LAD y tres sitios de inyección de modRNA. (B) Imágenes representativas de todo el corazón del ratón publican un MI exitoso inducido por ligadura permanente (a) y sitios de inyección de modRNA después del MI. Los 100 g de modRNA disueltos en 60 l de tampón de citrato de sacarosa se entregaron en la zona fronteriza que rodea el infarto, dos a ambos lados de la ligadura (b,c) y uno en el ápice (d). Barra de escala de 1 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Análisis de expresión Luc después de la inyección de modRNA. El tampón de citrato de sacarosa que contiene 100 g de ModRNA de Luc se inyectó directamente en el miocardio de ratones CFW en una cirugía de pecho abierto. El sistema de imágenes de bioluminiscencia se utilizó para calcular la expresión de proteínas Luc a las 24 horas después de la inyección. (A) Imágenes bioluminiscentes comparativas de ratones de control (transinfectados solo con tampón) frente a ratones inyectados con Luc modRNA. (B) Cuantificación de la señal Luc en comparación con los ratones de control medidos después de 24 horas utilizando el imager de bioluminiscencia. La barra de errores representa SEM con p < 0.0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Validación de la expresión Cre in vivo. Imágenes representativas de secciones transversales del corazón transfectadas (vista de eje corto) validando la expresión de Cre modRNA en rosa26mTmG ratón 24 horas postinyección. (A) Los cardiomiocitos inmunotenidos con cTNI (rojo). (B) Las células de color verde representan las células trans infectadas de Cre. (C) Imagen combinada que muestra celdas activadas de Cre alrededor de las dos inyecciones. El azul es la mancha nuclear DAPI. Barra de escala de 1 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La terapia génica ha demostrado un enorme potencial para avanzar significativamente en el tratamiento de la enfermedad cardíaca. Sin embargo, herramientas tradicionales empleadas en los ensayos clínicos iniciales para el tratamiento de la IC han demostrado un éxito limitado y están asociadas con efectos secundarios graves. El ARN modificado presenta un suministro de genes no virales que está ganando popularidad continuamente como herramienta de transferencia de genes en el corazón. ModRNA no requiere localización nuclear de genes para su traducción, y por lo tanto ofrece una expresión eficiente y rápida de la proteína. Además, como el ARNm no se integra en el huésped del genoma, la administración de genes por modRNA omite el riesgo de mutagénesis. En consecuencia, debido a sus ventajas sobre los vehículos convencionales de suministro de genes, modRNA se ha convertido en una de las plataformas más atractivas para la entrega de combinaciones de un solo gen o genes al corazón. Sin embargo, hasta la fecha no existe un protocolo estandarizado para la preparación y transferencia del modRNA al corazón postinjuro. Por lo tanto, el objetivo aquí era establecer un protocolo estándar y optimizado para la administración intracardiaca de modRNA en corazón de roedores para mejorar el uso de modRNA como herramienta de terapia génica y para que sea adecuado para fines terapéuticos.
En este protocolo, modRNA se prepara reemplazando la uridina por pseudouridina, seguida de taponar con ARCA en el extremo de 5'. Se ha demostrado que estos cambios en la estructura secundaria del ARNm producen una mayor traducción de proteínas en comparación con otras modificaciones de nucleótidos8. Además, esta estructura de ARNm alterada escapa a la inmunogenicidad después de las inyecciones de IM en ratones limitando su reconocimiento por receptores similares a peajes y nucleas6. Aquí, mostramos que la entrega de ARNm desnuda con tampón de citrato de sacarosa produce una fuerte traducción de proteínas en el corazón usando un modelo de MI de ratón. En nuestros estudios anteriores, establecimos la superioridad de modRNA suministrada con tampón de citrato de sacarosa en el corazón en comparación con la encapsulación de modRNA en nanopartículas, como la fecamine in vivo o el jetPEI in vivo, que puede dificultar la traducción de modRNA a la proteína8. La alta preservación del ARN por citrato y energía adicional proporcionada por la sacarosa para la endocitosis, además de rescatar el aglomerado modRNA de una sola cadena podría ser la razón del marcado aumento en la traducción de modRNA entregada en el tampón de citrato de sacarosa.
Aunque el uso de modRNA se ha intensificado en los estudios preclínicos y clínicos10,,14 en la última década, ciertas áreas necesitan ser investigadas para mejorar el éxito del modRNA en la clínica. En primer lugar, sintetizar modRNA en las altas cantidades necesarias para las investigaciones terapéuticas puede ser prohibitivo en cuanto a costos. Por lo tanto, es esencial desarrollar modRNA de grado clínico y rentable para mover el campo hacia una fase clínica de terapia de ARN en humanos. En segundo lugar, es necesario identificar un método de administración clínicamente aplicable para el modRNA. Teniendo en cuenta el daño causado por las inyecciones de IM cardíacas, los métodos de administración menos invasivos basados en catéter podrían ser más plausibles al transferir la gran cantidad de modRNA necesaria para transfecar corazones grandes.
En conclusión, este trabajo demostró la entrega exitosa de ARN que contiene modificaciones pseudouridinas en el corazón del ratón después de MI. La administración de modRNA en el tampón de citrato de sacarosa produjo una fuerte expresión proteica 24 horas después de la inyección. Este protocolo permite a los investigadores seguir una entrega estandarizada y evaluación de proteínas en el corazón después de la lesión y así proporcionar más accesibilidad en la preparación y entrega de modRNA para su investigación.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores reconocen a Ann Anu Kurian por su ayuda con este manuscrito. Este trabajo fue financiado por una beca de puesta en marcha de cardiología otorgada al laboratorio Zangi y también por la subvención DE NIH R01 HL142768-01
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Antarctic Phosphatase | New England Biolabs | M0289L | |
| Anti-reverse cap analog, 30-O-Mem7G(50) ppp(50)G | TriLink Biotechnologies | N-7003 | |
| Bioluminescense imaging system | Perkin Elmer | 124262 | IVIS100 charge-coupled device imaging system |
| Blunt retractors | FST | 18200-09 | |
| Cardiac tropnin I | Abcam | 47003 | |
| Cytidine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Dual Anesthesia System | Harvard Apparatus | 75-2001 | |
| Forceps- Adson | FST | 91106-12 | |
| Forceps- Dumont #7 | FST | 91197-00 | |
| Guanosine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| In vitro transcription kit | Invitrogen | AMB13345 | 5X MEGAscript T7 Kit |
| Intubation cannula | Harvard Apparatus | ||
| Megaclear kit | Life Technologies | ||
| Mouse ventilator | Harvard Apparatus | 73-4279 | |
| N1-methylpseudouridine-5-triphosphate | TriLink Biotechnologies | N-1081 | |
| NanoDrop Spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Olsen hegar needle holder with suture scissors | FST | 12002-12 | |
| Plasmid templates | GeneArt, Thermo Fisher Scientific | ||
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | FST | 14200-12 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | ||
| Sutures | Ethicon | Y433H | 5.00 |
| Sutures | Ethicon | Y432H | 6.00 |
| Sutures | Ethicon | 7733G | 7.00 |
| T7 DNase enzyme | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Tape station | Aligent | 4200 | |
| Transcription clean up kit | Invitrogen | AM1908 | Megaclear |
| Ultra-4 centrifugal filters 10k | Amicon | UFC801096 |
References
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