Summary

تحديد الفخاخ نيوتروفيل خارج الخلية في البارافين جزءا لا يتجزأ من الخيط الشرياني Thrombi باستخدام المجهر Immunofluorescence

Published: March 29, 2020
doi:

Summary

نحن نصف طريقة لتحديد الفخاخ خارج الخلية العدلات (NETs) في الفورمالديهايد ثابتة والبارافين جزءا لا يتجزأ من القلب القلب والقلب thrombi باستخدام استرجاع المستضد الناجم عن الحرارة وبروتوكول تسمية المناعة المزدوجة.

Abstract

الفخاخ خارج الخلية العدلة (NETs)، تتألف من الحمض النووي خالية من الخلايا (cfDNA) والبروتينات مثل الهستونات واللاستاز العدلات (NE)، يتم تحريرها من قبل العدلات استجابة لالتهاب الجهازية أو مسببات الأمراض. على الرغم من أن NETs قد ثبت سابقا لزيادة تكوين الجلطة وتثبيط الانف في البشر والكلاب، ودور NETs في القطط مع تجلط الشرايين القلب (CATE)، وهي مضاعفات تهدد الحياة الثانوية لاعتلال عضلة القلب فرط التروب ، غير معروف. طريقة موحدة لتحديد وقياس NETs في تجلط الشرايين القلب في القطط سوف تعزز فهمنا لدورها المرضي في CATE. هنا ، نصف تقنية لتحديد NETs في الفورمالديهايد ثابتة والبارافين جزءا لا يتجزأ من thrombi داخل بيثرة الأبهري ، المستخرجة أثناء النخر. بعد إزالة البارافينمع الزيلين، خضعت الأقسام الأبهرية لاسترجاع مستضد غير مباشر بسبب الحرارة. ثم تم حظر الأقسام ، permeabilized ، وex vivo NETs تم تحديدها عن طريق توطين الحمض النووي الخالي من الخلايا (cfDNA) ، citrullinated histone H3 (citH3) ، وelastase العدلات (NE) باستخدام المجهر المناعي. لتحسين الكشف المناعي للNETs في thrombi ، تم الحد من الفلور اتمنامن عناصر الأنسجة باستخدام عملية إخماد الفلور الذاتي قبل المجهر. يمكن أن تكون هذه التقنية أداة مفيدة لدراسة NETs وتجلط الدم في الأنواع الأخرى وتقدم رؤى جديدة في الفيزيولوجيا المرضية لهذه الحالة المعقدة.

Introduction

القطط مع اعتلال عضلة القلب الضخامي هي في خطر من مضاعفات تجلط الدم المهددة للحياة1,2. على الرغم من ارتفاع معدلات الاعتلال والوفيات المرتبطة بتجلط الشرايين القلبوية (CATE) ، فإن الفيزيولوجيا المرضية الكامنة في CATE في القطط غير مفهومة بشكل جيد. وهناك أيضا محدودة أدوات التشخيص والعلاج لعلاج وتحديد القطط المعرضة لخطر هذه الحالة المدمرة3.

بالإضافة إلى دورها في الحصانة الفطرية، وقد ثبت العدلات للعب دور في تجلط الدم من خلال الإفراج عن الفخاخ خارج الخلية العدلة (NETs)، والتي هي شبكات تشبه على شبكة الإنترنت من الحمض النووي خالية من الخلايا (cfDNA) مرصعة الهستون والبروتينات الحبيبية مثل العدلات الإيلاداس (NE) وmyeloperoxidase. العدلات الخضوع لتكوين NETs استجابة لالتهاب الجهازية، ومواجهة مباشرة مع مسببات الأمراض، والتفاعل معالصفائحالدموية المنشط4،,,,7. في الكلاب ، وقد ثبت الحمض النووي المستمدة من العدلات لمنع تجلط الجلطات ، في حين أن البروتينات NET تسريع تشكيل الجلطة. قدرة NETs على اعتراض الخلايا المتداولة ومكونات التخثر هو أيضا مفتاح لخصائصها تخثر8،9،10،11،12.

يتم الكشف عن NETs عن طريق توطين البروتينات العدلات خارج الخلية، الهستونات، وcfDNA. وبسبب هذا، فإن تحديد وقياس NETs في الأنسجة الثابتة عن طريق immunofluescence من الأنسجة deparaffinized متفوقة على الهيماتوكسيلين التقليدية والإيوسين (H & E) وصمة عار باستخدام المجهر حقل مشرق4،5. حددت العديد من الدراسات البشرية باستخدام المجهر المناعي NETsك المكونات الهيكلية للتجلط الشرياني التاجي، السكتة الدماغية الدماغية، التروثرومبوسيس، وتجلط الرثرة الوريدية13،14،15،16،17. وحتى الآن، لم يتم وصف طريقة موحدة للكشف عن الـ NETs وقياسها كمياً في ثثرم القطط. لأن تحديد NETs في تجلط الشرايين القلب والقلب القطط قد يسهل البحوث الانتقالية في المستقبل في NETs والتجلط، ونحن وصف تقنيات تحديد صافي وتقييم في تجلط الشرايين جزءا لا يتجزأ من البارافين في القطط.

Protocol

تم تنفيذ جميع الأساليب الموصوفة هنا وفقًا للمبادئ التوجيهية للجنة الرعاية والاستخدام المؤسسية للحيوانات في جامعة كاليفورنيا، ديفيس. وأجريت النُقاز وخزعات الأنسجة بموافقة المالكين. 1. تثبيت الأنسجة، والتضمين، وأقسام تشريح التشعب الأبهري ، بما في ذلك الشريان الأورطي …

Representative Results

باستخدام هذا البروتوكول لdeparaffinization، استرجاع المستضد الناجم عن الحرارة، وتسمية المناعة المزدوجة من thrombi البارافين المضمنة، حددنا NETs في FELINE CATE للمرة الأولى. تم تحديد موقع Thrombi داخل التشعب الأبهري عن طريق المجهر الفلوري والمجهر الميداني الساطع باستخدام تلطيخ H & E القياسي والمجهر التباين في ?…

Discussion

نحن نصف بروتوكول لتحديد NETs في خثرة الشرايين القلب ية الثابتة القطط باستخدام بروتوكول تسمية المناعة المزدوجة والمجهر الفلورات المناعية. على الرغم من أن فقط تجلط الشرايين القلبية كانت ملطخة، من الناحية النظرية يمكن استخدام هذا البروتوكول لأنواع أخرى من thrombi وفي الأنواع البيطرية الأخرى. يش…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم دعم الدراسة بأموال من جامعة كاليفورنيا، ديفيس، مركز الصحة الحيوانية المرافقة (CCAH 2018-30-F). يود المؤلفون أن ينوهوا بالدكتور كيفن وولارد لاستخدام المجهر الفلوري.

Materials

4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) Life Technologies Corporation D1306
Alexa Fluor 594 Streptavidin conjugate ThermoFisher Scientific Catalog # S11227
Anti-citrullinated histone H3 antibody Abcam Ab5103
EVOS FL Cell Imaging System ThermoFisher Scientific AMEFC4300
EVOS Imaging System Objective 10x ThermoFisher Scientific AMEP4681 NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm
EVOS Imaging System Objective 20x ThermoFisher Scientific AMEP4682 NA 0.40, WD 6.8 mm
EVOS Imaging System Objective 40x ThermoFisher Scientific AMEP4699 NA 0.75, WD 0.72 mm
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody ThermoFisher Scientific Catalog # A32723
Goat serum Jackson Immuno Research Labs Catalog # NC9660079. Manufacturer Part # 005-000-121
Neutrophil elastase antibody Bioss Antibodies Bs-6982R-Biotin Rabbit polyclonal Antibody, Biotin conjugated
NP40 Pierce Product # 28324. Lot # EJ64292
Positive charged microscope slides Thomas Scientific Manufacturer No. 1354W-72
Rabbit serum Life Technology Catalog # 10510
Target Retrieval Solution Agilent Dako S2367 TRIS/EDTA, pH 9 (10x)
TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit Vector Laboratories SP-8400

References

  1. Maron, B. J., Fox, P. R. Hypertrophic cardiomyopathy in man and cats. Journal of Veterinary Cardiology: The Official Journal of the European Society of Veterinary Cardiology. 17, 6-9 (2015).
  2. Payne, J. R., et al. Prognostic indicators in cats with hypertrophic cardiomyopathy. Journal of Veterinary Internal Medicine. 27 (6), 1427-1436 (2013).
  3. Borgeat, K., Wright, J., Garrod, O., Payne, J. R., Fuentes, V. L. Arterial Thromboembolism in 250 Cats in General Practice: 2004-2012. Journal of Veterinary Internal Medicine. 28 (1), 102-108 (2014).
  4. Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs. Nature Reviews. Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
  5. Goggs, R., Jeffery, U., LeVine, D. N., Li, R. H. L. Neutrophil-extracellular traps, cell-free DNA and immunothrombosis in companion animals: A review. Veterinary Pathology. , 300985819861721 (2019).
  6. de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. Nuclear smears observed in H & E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps. Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).
  7. Li, R., Tablin, F. A Comparative Review of Neutrophil Extracellular Traps in Sepsis. Frontiers in Veterinary Sciences. 5 (291), (2018).
  8. Borissoff, J. I., et al. Elevated levels of circulating DNA and chromatin are independently associated with severe coronary atherosclerosis and a prothrombotic state. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (8), 2032-2040 (2013).
  9. Moschonas, I. C., Tselepis, A. D. The pathway of neutrophil extracellular traps towards atherosclerosis and thrombosis. Atherosclerosis. 288, 9-16 (2019).
  10. Perdomo, J., et al. Neutrophil activation and NETosis are the major drivers of thrombosis in heparin-induced thrombocytopenia. Nature Communications. 10 (1), 1322 (2019).
  11. Li, B., et al. Neutrophil extracellular traps enhance procoagulant activity in patients with oral squamous cell carcinoma. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 145 (7), 1695-1707 (2019).
  12. Li, R. H. L., Tablin, F. In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (138), e58083 (2018).
  13. de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. Nuclear smears observed in H&E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps. Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).
  14. Farkas, &. #. 1. 9. 3. ;. Z., et al. Neutrophil extracellular traps in thrombi retrieved during interventional treatment of ischemic arterial diseases. Thrombosis Research. 175, 46-52 (2019).
  15. Qi, H., Yang, S., Zhang, L. Neutrophil Extracellular Traps and Endothelial Dysfunction in Atherosclerosis and Thrombosis. Frontiers in Immunology. 8, 928 (2017).
  16. Laridan, E., et al. Neutrophil extracellular traps in ischemic stroke thrombi. Annals of Neurology. 82 (2), 223-232 (2017).
  17. Laridan, E., Martinod, K., Meyer, S. F. D. Neutrophil Extracellular Traps in Arterial and Venous Thrombosis. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).
  18. Li, R. H. L., Johnson, L. R., Kohen, C., Tablin, F. A novel approach to identifying and quantifying neutrophil extracellular trap formation in septic dogs using immunofluorescence microscopy. BMC Veterinary Research. 14 (1), 210 (2018).
  19. Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Immunodetection of NETs in Paraffin-Embedded Tissue. Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).
  20. Moelans, C. B., Oostenrijk, D., Moons, M. J., van Diest, P. J. Formaldehyde substitute fixatives: effects on nucleic acid preservation. Journal of Clinical Pathology. 64 (11), 960-967 (2011).
  21. Rait, V. K., Xu, L., O’Leary, T. J., Mason, J. T. Modeling formalin fixation and antigen retrieval with bovine pancreatic RNase A II. Interrelationship of cross-linking, immunoreactivity, and heat treatment. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (3), 300-306 (2004).
  22. Willingham, M. C. An alternative fixation-processing method for preembedding ultrastructural immunocytochemistry of cytoplasmic antigens: the GBS (glutaraldehyde-borohydride-saponin) procedure. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 31 (6), 791-798 (1983).
  23. Davis, A. S., et al. Characterizing and Diminishing Autofluorescence in Formalin-fixed Paraffin-embedded Human Respiratory Tissue. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 62 (6), 405-423 (2014).
  24. Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon. Journal of Investigative Medicine: The Official Publication of the American Federation for Clinical Research. 47 (6), 326-332 (1999).
  25. Hirsch, R. E., Zukin, R. S., Nagel, R. L. Intrinsic fluorescence emission of intact oxy hemoglobins. Biochemical and Biophysical Research Communications. 93 (2), 432-439 (1980).
  26. Billinton, N., Knight, A. W. Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence. Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).
  27. Mosiman, V. L., Patterson, B. K., Canterero, L., Goolsby, C. L. Reducing cellular autofluorescence in flow cytometry: an in-situ method. Cytometry. 30 (3), 151-156 (1997).
  28. Ducroux, C., et al. Thrombus Neutrophil Extracellular Traps Content Impair tPA-Induced Thrombolysis in Acute Ischemic Stroke. Stroke. 49 (3), 754-757 (2018).

Play Video

Cite This Article
Duler, L., Nguyen, N., Ontiveros, E., Li, R. H. L. Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (157), e60834, doi:10.3791/60834 (2020).

View Video