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Immunology and Infection

Identification des pièges extracellulaires Neutrophil dans paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi à l’aide de la microscopie à l’immunofluorescence

Published: March 29, 2020 doi: 10.3791/60834

Summary

Nous décrivons une méthode pour identifier les pièges extracellulaires neutrophiles (NET) dans le formaldéhyde-fixe et paraffin-intégré thrombi cardiogénique félin utilisant la récupération d’antigène induite par la chaleur et un protocole d’immunolabeling double.

Abstract

Les pièges extracellulaires neutrophiles (NET), composés d’ADN sans cellules (CFDNA) et de protéines comme les histones et l’élastase neutrophile (NE), sont libérés par les neutrophiles en réponse à une inflammation systémique ou à des agents pathogènes. Bien qu’il ait déjà été démontré que les TTRO augmentent la formation de caillots et inhibent la fibrinolyse chez l’homme et les chiens, le rôle des NET chez les chats atteints de thromboembolisme artériel cardiogénique (CATE), une complication potentiellement mortelle secondaire à la cardiomyopathie hypertrophique , est inconnu. Une méthode normalisée pour identifier et quantifier les NET dans les thrombi artéraux cardiogéniques chez les chats fera progresser notre compréhension de leur rôle pathologique dans CATE. Ici, nous décrivons une technique pour identifier des NET dans les thrombi formaldéhyde-fixes et paraffin-incorporés dans la bifurcation aortique, extraite pendant l’autopsie. Après la deparaffinisation avec le xylène, les sections aortiques ont subi la récupération indirecte d’antigène thermique-induite. Les sections ont ensuite été bloquées, perméabilisées, et les NET ex vivo ont été identifiés par la colocalisation de l’ADN sans cellule (CFDNA), de l’histone H3 (citH3) et de l’élastase neutrophile (NE) utilisant la microscopie d’immunofluorescence. Pour optimiser l’immunodétection des NET dans thrombi, l’autofluorescence des éléments tissulaires a été limitée en utilisant un processus d’étanchéité de l’autofluorescence avant la microscopie. Cette technique pourrait être un outil utile pour étudier les TNI et la thrombose chez d’autres espèces et offre de nouvelles perspectives sur la pathophysiologie de cette condition complexe.

Introduction

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Les chats atteints de cardiomyopathie hypertrophique sont à risque de complications thromboemboliques potentiellement mortelles1,2. En dépit de la morbidité et de la mortalité élevées liées au thromboembolism artériel cardiogénique félin (CATE), la pathophysiologie sous-jacente de CATE chez les chats est mal comprise. Il existe également des outils diagnostiques et thérapeutiques limités pour traiter et identifier les chats à risque de cette condition dévastatrice3.

En plus de son rôle dans l’immunité innée, il a été démontré que les neutrophiles jouent un rôle dans la thrombose en libérant des pièges extracellulaires neutrophiles (NET), qui sont des réseaux web d’ADN sans cellules (CFDNA) incrustés d’histones et de protéines granulaires comme le neutrophile elastase (NE) et le myeloperoxidase. Les neutrophiles subissent la formation de NETs en réponse à l’inflammation systémique, la rencontre directe avec des agents pathogènes, et l’interaction avec les plaquettes activées4,5,6,7. Chez les chiens, l’ADN dérivé du neutrophile a été montré pour inhiber la lyse de caillot, tandis que les protéines NET accélèrent la formation de caillots. La capacité des NET à piéger les cellules circulantes et les composants de coagulation est également la clé de leurs propriétés thrombogéniques8,9,10,11,12.

Les NET sont détectés par colocalisation des protéines neutrophiles extracellulaires, des histones, et de l’ADNC. Pour cette raison, l’identification et la quantification des NET dans les tissus fixes par immunofluorescence des tissus déparaffinisés est supérieure à l’hématoxyline traditionnelle et la tache d’éosine (H et E) utilisant la microscopie de champ lumineux4,5. Plusieurs études humaines utilisant la microscopie d’immunofluorescence ont identifié des NET comme composants structurels de thrombi coronaires, thrombi de course cérébrale, atherothrombose, et thrombi veineux13,14,15,16,17. À ce jour, aucune méthode normalisée permettant de détecter et de quantifier les TNN dans les thrombi félins n’a pas été décrite. Puisque l’identification des NET dans les thrombi artérogènes cardiogéniques félins peut faciliter la recherche translationnelle future dans les NET et la thrombose, nous décrivons des techniques d’identification et d’évaluation de NET dans les thrombi artériels paraffine-embeddeds chez les chats.

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Protocol

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Toutes les méthodes décrites ici ont été effectuées conformément aux lignes directrices du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Californie à Davis. Des nécropsies et des biopsies des tissus ont été effectuées avec le consentement des propriétaires.

1. Fixation des tissus, intégration et sectionnement

  1. Disséquer la bifurcation aortique, y compris l’aorte descendante, l’artère fémorale, et les artères iliaques communes(figure 1A), peu de temps après l’euthanasie ou la mort sans cruauté. Disséquer émoussé le fascia (figure 1B) avant de le submerger complètement dans 10% de formaline tamponnée neutre pour un minimum de 24 h et pas plus de 48 h.
  2. Pour déshydrater l’échantillon, d’abord immergé dans 10% de formaline tamponnée neutre chauffée à 37 oC pendant 1 h. Ensuite, submergez dans des concentrations croissantes d’éthanol chauffé à 37 oC (70%, 95%, 100%) 2x pour 1 h chacun. Enfin, sans rinçage, immerger 2x dans 100% toluene chauffé à 37 oC pour 1 h chacun.
  3. Ajouter la paraffine chauffée à 62 oC et laisser la paraffine se solidifier complètement toute la nuit.
  4. Section 2 à 3 m du tissu incorporé par la paraffine à l’aide d’une microtome et place sur des lames de verre chargées positivement. Entreposez les tissus sectionnés à -80 oC jusqu’à une analyse plus approfondie.

2. Déparaffinisation, réhydratation et récupération d’antigène induite par la chaleur

  1. Pour effectuer la déparaffinisation et la réhydratation des sections sur des toboggans en verre, placez les glissières en verre dans les grilles et procédez dans l’ordre suivant :
    1. Submergez complètement dans 100% de xylène pendant 3 min. Répétez cette étape 2x. Ne pas rincer entre les étapes.
    2. Submerger complètement dans les concentrations décroissantes d’éthanol (100%, 95%, 70%) à température ambiante (RT), 3x pendant 3 minutes chacun. Ne pas rincer entre les étapes.
    3. Submerger complètement dans de l’eau déionisée pendant 2 min. Répéter.
  2. Placez les sections dans la ligne saline tris-tamponnée avec 0,1 % d’interpolation (TBST, pH - 7,6) pour 2 à 3 min.
  3. Remplissez le réservoir d’eau déionisée chauffée à 100 oC. Laisser la chambre de vapeur s’équilibrer pendant 20 min.
    REMARQUE : La récupération d’antigène induite par la chaleur est mieux effectuée avec le chauffage indirect généré par un vapeur avec un réglage de température prédéfini, tel qu’un vapeur de nourriture.
  4. Chauffer la solution de récupération d’antigène disponible dans le commerce contenant Tris et EDTA (pH 9) à 95-97 oC sur une plaque chaude à température contrôlée avec une agitation constante. Assurez-vous qu’il ne fait pas bouillir.
    REMARQUE : La solution doit devenir trouble une fois réchauffée.
  5. Verser la solution chauffée de récupération d’antigène dans un récipient de toboggan et placer le récipient dans la chambre du vapeur. Laissez la solution de récupération d’antigènes équilibrer à la température du vapeur pendant 3 à 4 min. Assurez-vous que la température de la chambre est de 95 oC.
  6. Submergez complètement les glissières dans la solution de récupération d’antigène chauffée et continuez l’application du chauffage externe via le vapeur pendant 20 min.
  7. Retirer le récipient de la glissière du vapeur et laisser refroidir les glissières et la solution de récupération d’antigènes pour RT. Stocker la solution diluée de récupération d’antigènes à 4 oC et réutiliser jusqu’à 2x si nécessaire.
  8. Laver les diapositives 3x avec TBST pendant 5 min.

3. Immunolabeling et autofluorescence étanchéité

REMARQUE : Le tableau 1 détaille la composition des tampons de blocage utilisés dans les étapes suivantes.

  1. Sections incubantes dans Blocking Buffer 1 pour 2 h à RT sous bascule douce (30-50 tr/min). Sceller avec un film de paraffine pour éviter le séchage.
  2. Sans lavage, appliquez immédiatement 100 l d’anticorps anti-humains polyclolinés de lapin dilué d’histone H3 (citH3) (0,03 mg/mL dilués dans le tampon de blocage 1) directement sur la glissière.
  3. Placez un coverlip (24 mm x 40 mm x 0,13 à 0,17 mm) sur chaque section pour permettre une distribution uniforme du mélange d’anticorps.
  4. Incuber de 12 à 16 h à 4 oC avec bascule douce (30 à 50 tr/min). Sceller avec le film de parafilm pour éviter le séchage.
  5. Laver 3x avec TBST pendant 5 min.
  6. Appliquer 100 l d’anticorps anti-lapin de chèvre conjugué à Alexa Fluor 488 (dilué à une concentration finale de 0,04 mg/mL ou 1:50 dans Blocking Buffer 1) tel que décrit à l’étape 3.3. Incuber pendant 1 h à RT sous le basculement doux (30-50 tr/min). Protégez les diapositives de la lumière.
  7. Laver avec TBST 3x pendant 5 min.
  8. Sections incubées dans Blocking Buffer 2 pendant la nuit à 4 oC sous le basculement doux (30-50 tr/min). Protégez-vous de la lumière.
  9. Laver avec TBST 3x pendant 5 min.
  10. Sections de bloc dans Blocking Buffer 3 comme décrit dans l’étape 3.3 à RT pour 2 h sous le basculement doux (30-50 tr/min).
  11. Sections incubées avec anticorps ANTI-humains biotinylés de lapin polyclonal (concentration finale de 0,2 g/mL dans le tampon de blocage 3) à 4 oC pour 12-16 h comme décrit dans les étapes 3.2-3.4.
  12. Laver avec TBST 3x pendant 5 min.
  13. Incuber avec Alexa Fluor 594 streptavidin conjugué (diluer à 1:100 ou 0,02 mg/mL dans Blocking Buffer 3) tel que décrit dans les étapes 3,2-3,3 pour 1 h à RT. Protéger de la lumière et sceller avec paraffine pour empêcher le séchage.
  14. Laver avec TBST 1x pendant 5 min.
  15. Appliquer 100 L de mélange de solution d’étanchéité autofluorescence directement sur les sections pendant 1 min comme indiqué par le fabricant.
  16. Laver immédiatement les lames avec TBST 6x pendant 10 min.
  17. Couvrir chaque diapositive de 100 l de 300 nM DAPI pendant 5 minutes dans l’obscurité.
  18. Laver avec TBST pendant 3 min. Répétez-le pour un total de 5x.
  19. Appliquer une goutte (50 l) de milieu de montage d’antifade, une partie du kit d’étanchéité à l’autofluorescence, directement sur la glissière en verre entourant la section. Placer un coverlip (24 mm x 40 mm x 0,13 à 0,17 mm) doucement sur la section sans créer de bulles.
  20. Laisser les échantillons guérir toute la nuit dans l’obscurité à 4 oC jusqu’à ce que le milieu de montage soit durci pour une analyse microscopique avec des lentilles d’immersion.

4. Identification du piège extracellulaire Neutrophil

REMARQUE : Le protocole suivant utilise un microscope à épifluorescence inversé avec une caméra CCD numérique de 1 280 x 960 (voir Tableau des matériaux).

  1. Pour localiser thrombi, numériser cranially à caudally le long de la longueur de l’aorte, la bifurcation aortique, et chaque artère fémorale utilisant la microscopie de contraste de phase avec un objectif de 10x. Un thrombus est un conglomérat de tissus contenant des globules rouges, des globules blancs et des plaquettes adjacents à l’endothélium sur le contraste de phase et la microscopie de champ lumineux(figure 2A, figure 2B).
  2. Examinez d’abord les sections pour les TNN à l’aide du canal DAPI (excitation 357/44 nm) avec des objectifs 10x et 20x(figure 2C). Notez que l’ADN cfDNA apparaît comme de l’ADN déconstruisé qui n’est pas dans les limites du cytoplasme d’une cellule lorsqu’il est vu sur le contraste de phase ou la microscopie de champ lumineux.
  3. Identifiez l’EN extracellulaire et le citH3 sur les canaux Texas Red (excitation de 585/29 nm, émission de 628/32 nm) et le canal de protéines fluorescentes vertes (excitation de 470/22 nm, émissions de 525/50 nm), respectivement avec des objectifs de 10, 20 et 40x.
  4. Évaluer et analyser les TNI dans un thrombus à l’aide de logiciels disponibles, tels que l’image J (NIH). La formation NET est identifiée en fonction de la colocalisation de l’ADFC, du citH3 extracellulaire et de l’EN comme indiqué précédemment18. Maintenir un temps d’exposition et des gains constants de chaque canal tout au long de l’acquisition d’images afin d’éviter la saturation de l’intensité des pixels.
  5. Cartographiez chaque thrombus en fonction de sa proximité avec l’aorte descendante en le divisant en trois zones égales, avec la zone 1 la plus proche de l’aorte, la zone 3 la plus éloignée de l’aorte et la zone 2 entre les zones 1 et 3). Avec l’opérateur aveuglé à l’état de santé de chaque sujet, prendre au moins dix champs aléatoires dans chaque zone. Caractériser la distribution des TEN dans les thrombi en faisant la moyenne du nombre de champs avec DEST dans chaque zone ou en calculant la zone moyenne d’occupation du NET par zone.

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Representative Results

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Utilisant ce protocole pour la deparaffinisation, la récupération d’antigène induite par la chaleur, et le double immunolabeling des thrombi paraffines-incorporées, nous avons identifié des NET dans le CATE félin pour la première fois. Thrombi dans la bifurcation aortique ont été localisés par microscopie de fluorescence et microscopie de champ lumineux utilisant la coloration standard de H et E et la microscopie de contraste de phase. Sur la microscopie de champ lumineux, les thrombi artériels félins se composaient de globules rouges, de leucocytes, de fibrine et de plaquettes(figure 3A). Bien que le H-E ne puisse pas tacher des composants NETS spécifiques, les NET apparaissaient souvent comme des réseaux de fils violets profonds de différentes longueurs entourant les érythrocytes et les leucocytes voisins(figure 3A, contour pointillé). Un thrombus a été caractérisé comme une structure bien délimitée dans l’espace vasculaire sur la microscopie de contraste de phase(figure 2A, figure 4B). Nous avons également confirmé la présence de NETs dans ces domaines par microscopie immunofluorescence(figure 3B). Le grossissement de ces zones a révélé de grands agrégats de NET, composés de cfDNA, citH3 extracellulaire, et NE(figure 2C, figure 3B, contour pointillé blanc). En utilisant la même technique pour rechercher des thrombi et des NET chez les chats sans CATE, nous avons constaté que des feuilles de neutrophiles lyzed pouvaient être détectées occasionnellement à proximité de l’endothélium. Bien que ces neutrophiles aient montré quelques caractéristiques morphologiques de la formation de NET, ils ne devraient pas être associés à n’importe quelle thrombus organisé. Nous n’avons identifié aucun thrombi dans aucun des échantillons témoins(figure 4A).

La figure 5A démontre une profonde autofluorescence d’éléments de caillot comme les érythrocytes et le collagène lorsqu’il est représenté à la longueur d’onde verte (488 nm), ce qui a entravé notre capacité à détecter la colocalisation de l’ADNfc et des protéines. Nous avons constaté que l’étanchéité à l’autofluorescence brève utilisant un kit disponible dans le commerce après l’immunolabeling a augmenté de manière significative la sensibilité de la colocalisation des protéines et de la détection NET, même dans les zones avec une abondance d’érythrocytes (figure 5B, pointes de flèche).

Figure 1
Figure 1 : Photographies représentatives d’autopsie d’une bifurcation aortique disséquée d’un chat avec le thromboembolisme artériel cardiogénique. (A) L’aorte descendante a été disséquée 4-5 cm crânien (Cr) à la bifurcation aortique. (B) Fascia a été soigneusement disséqué jusqu’à ce que l’aorte descendante (1) et les artères iliaques (2,3) étaient clairement visibles à l’aspect caudal (Cd). Notez le thrombus dans la bifurcation aortique . S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Images représentatives de contraste de phase et d’immunofluorescence des NED dans une thrombus trouvée dans une bifurcation aortique féline. (A) La microscopie de contraste de phase a indiqué une thrombus comme structure discrète et bien délimitée près de l’aorte. Le contraste combiné de phase et la coloration de fluorescence de l’ADN (bleu) ont montré la présence de leucocytes et d’ADN sans cellules dans le thrombus. La zone en boîte se compose d’une grande concentration d’ADN sans cellules. Grossissement original 10x; Barre d’échelle de 400 m (B) La zone en boîte en (A) a été agrandie à 20x. L’ADN sans cellule et l’ADN intracellulaire tachés de DAPI (bleu), d’élastase neutrophile (NE), et d’histone H3 (citH3) citrullinated sont apparus verts et rouges, respectivement. (Grossissement original 20x; Barre d’échelle à 100 m). (C) LES NIT, identifiés en fonction de la colocalisation de l’ADN sans cellules, de l’EN extracellulaire et du citH3, ont été décrits (ligne pointillée). Grossissement original 40x; Barre d’échelle de 100 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Image représentative d’une thrombus artérielle féline utilisant la coloration de H et E et d’immunofluorescence. (A) Sur la tache de H et E, une grande concentration de neutrophiles et d’érythrocytes étaient visibles. Les chromatines extracellulaires sont apparues comme des fils violets profonds de différentes longueurs entourées d’érythrocytes et de neutrophiles (contour pointillé, flèche noire). (B) Neutrophil pièges extracellulaires ont été facilement visualisés à l’aide de microscopie immunofluorescence sur le même thrombus (contour pointillé, flèche blanche). Les TNE ont été identifiés comme colocalisation de l’ADFC (bleu), de l’EN (vert) et du citH3 (rouge). Grossissement original de 20x; Barre d’échelle de 200 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Contraste de phase représentative et images d’immunofluorescence des bifurcations aortiques. (A) Images de contraste de phase et d’immunofluorescence des bifurcations aortiques chez un chat sans thrombose artérielle. Notez l’absence de thrombi ou d’agrégats de neutrophiles dans les lumen de la bifurcation aortique du chat sans thrombose artérielle. (B) Images de contraste de phase et d’immunofluorescence des bifurcations aortiques dans un chat diagnostiqué avec le thromboembolisme artériel cardiogénique. Les bifurcations aortiques ont été tachées pour l’ADN (bleu), l’élastase neutrophile (vert), et citrullinated histone H3 (rouge). Dans ce cas, un thrombus bien délimité renflement dans la paroi vasculaire et occupant la plupart des lumen aortiques a été noté dans le chat avec le thromboembolisme artériel cardiogénique. Les TEN, caractérisées par la colocalisation de l’ADNC, de l’EN et du citH3, ont été identifiées dans le thrombus (contour pointillé). Grossissement original 10x; Barre d’échelle de 400 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Contraste de phase représentatif (PC) et images immunofluorescence des thrombi artériels de deux chats. Les diapositives ont été tachées pour le citH3, l’EN et l’ADN et illustrées à 488 nm (rouge), 595 nm (vert), et 357 nm (bleu) longueurs d’onde, respectivement, à 40x grossissement. Les thrombi artérogènes cardiogéniques chez les chats avaient une abondance d’érythrocytes (en ligne pointillée). (A) L’autofluorescence des érythrocytes était la plus importante à travers la longueur d’onde de 488 nm, diminuant la détection du signal de colocalisation et de l’identification des NT. (B) L’autofluorescence a considérablement réduit à la longueur d’onde de 488 nm, particulièrement dans les secteurs avec une forte concentration d’érythrocytes (, ligne pointillée). Il a amélioré la détection des protéines colocalisées, citH3, et l’élastase de neutrophile (tête de flèche), en présence d’érythrocytes (barre d’échelle '200 'm). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Supplément Figure 1 : Images représentatives d’immunofluorescence d’thrombi artérielles d’un chat. Les sections ont été tachées pour l’ADN (bleu), citH3 (rouge), et soit myeloperoxidase (A) ou neutrophil elastase (B). (A) Malgré l’utilisation d’un anticorps myeloperoxidase spécifique au félin (MPO, 1:5), l’intensité de coloration de MPO est restée faible. (B) Utilisant un anticorps polyclonal de neutrophile d’elastase (NE), connu pour recouper avec plusieurs espèces, l’immunoréactivité et l’intensité de coloration étaient sensiblement plus élevées. Notez les noyaux lobulés caractéristiques des neutrophiles entourés de NE (flèches). Grossissement original 40x; Barre d’échelle de 100 m. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce chiffre.

Blocage du tampon Composition
1 SCT avec 0,1% Tween-20, 0,1% NP40, 5% sérum de chèvre
2 SCT avec 0,1% Tween-20, 10% sérum de lapin, 0.1%NP-40
3 SCT avec 0,1 % Tween-20, 5 % BSA, 0,1 % NP-40

Tableau 1 : Composition des tampons de blocage utilisés pour l’immunofluorescence.

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Discussion

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Nous décrivons un protocole pour identifier des NET dans les thrombi artérogènes cardiogéniques félins fixes utilisant un protocole d’immunolabeling double et la microscopie d’immunofluorescence. Bien que seulement les thrombi artérogènes cardiogéniques aient été tachés, en théorie ce protocole pourrait être employé pour d’autres types de thrombi et dans d’autres espèces vétérinaires. L’identification des NET dans les thrombi artériels félins suggère que les TN peuvent jouer un rôle dans la thrombose chez les chats.

La détection des NET par immunofluorescence dans les tissus fixes et paraffin-intégrés est supérieure aux taches histologiques conventionnelles comme H et E, qui montre souvent des fils de chromatine entourés de neutrophiles13. L’immunohistochimie et l’immunofluorescence des thrombi artéraux fixes permettent la détection simultanée de l’ADFC et d’autres protéines extracellulaires comme le citH3, connu pour être spécifique à la formation de NETs18,19. Parce que les cryopréparations sont sous-optimales pour la détection NET dans les tissus et les thrombi, nous avons conservé nos échantillons dans 10% de formaline neutre tamponnée, qui contient 4% de formaldéhyde et 10% de méthanol. Les acides nucléiques exempts de cellules ne sont pas directement fixés par le formaldéhyde. Au lieu de cela, ils sont immobilisés dans des structures protéiques fixes, qui sont altérées par des liaisons transversales partiellement réversibles du pont de méthylène induites par le formaldéhyde20. Pour limiter davantage les artefacts et l’autofluorescence causés par l’acide formique et les cétones générés par l’oxydation du formaldéhyde, les chercheurs peuvent choisir d’utiliser du paraformaldéhyde sans méthanol dilué dans le tampon pour la fixation. Parce que la durée de fixation affecte l’immunoréactivité, nous recommandons la fixation pour un plus grand 24 h avant la déshydratation et l’intégration de paraffine. Les tissus ou caillots incorporés à la paraffine peuvent ensuite être stockés pour la deparaffinisation et la coloration.

La fixation chimique par le formaldéhyde et le paraformaldéhyde modifie la structure tertiaire des protéines, masquant les antigènes d’intérêt et empêchant la liaison des anticorps à des épitopes spécifiques21. La récupération d’antigène, un processus qui brise les liaisons croisées du pont de méthylène, est essentielle avant d’effectuer l’immunodetection dans les tissus formalin-fixes. D’après l’expérience des auteurs, la récupération d’antigène induite par la chaleur à l’aide d’une solution de récupération alcalin (pH 9 dans le tampon Tris/EDTA) avec un chauffage indirect doux améliore la détection des protéines et des NET tout en minimisant les artefacts et l’autofluorescence. La température de la solution de récupération d’antigène ne devrait pas atteindre le point d’ébullition (100 'C), parce que la dénaturation des protéines peut conduire à une liaison non spécifique et au bruit de fond.

Une limitation de l’identification NET dans les caillots fixes est que la coloration d’immunofluorescence peut être très variable dans différentes conditions de récupération d’antigène18. Comparable aux résultats trouvés par Brinkmann et coll., nous avons constaté que des températures d’incubation plus élevées (55 oC) ont entraîné une coloration optimale des histones dans les noyaux et la chromatine déconstruite19. Cependant, nous avons constaté que l’intensité de coloration de myeloperoxidase, une protéine granulaire trouvée dans les neutrophiles et les NET, était faible dans les conditions proposées. La faible immunoréactivité du myeloperoxidase était constante malgré l’utilisation d’un anticorps félin spécifique(Supplément Figure 1). Par conséquent, nous encourageons les enquêteurs à modifier la durée et les conditions (p., pH, température) du processus de récupération de l’antigène afin de donner un signal satisfaisant basé sur l’antigène d’intérêt.

L’un des défis de l’identification des TNE chez les espèces vétérinaires est le manque d’anticorps spécifiques aux espèces. Pour éviter les interférences rencontrées lors de l’utilisation d’anticorps primaires provenant de la même espèce, nous avons inclus une étape de blocage supplémentaire en utilisant une forte concentration d’immunoglobulines de lapin pour saturer tous les sites de liaison restants sur les anticorps secondaires anti-lapin de chèvre. Un inconvénient majeur de cette technique est qu’elle prend beaucoup de temps, car elle nécessite de multiples étapes d’incubation. Les chercheurs devraient inclure deux contrôles différents qui excluent l’un ou l’autre anticorps primaire dans la deuxième étape d’immunolactage pour s’assurer que l’anticorps secondaire de l’étape d’immunolabelling lie spécifiquement à son anticorps primaire. La spécificité des structures NETTE identifiées peut être vérifiée par la digestion DNase ou l’inclusion de contrôles biologiques composés de bifurcations aortiques de chats sans CATE(figure 5). En outre, les contrôles négatifs se composant de la même concentration d’anticorps de contrôle d’isotype que les anticorps primaires devraient être inclus pour exclure des interactions non spécifiques d’anticorps, la liaison non spécifique aux récepteurs de Fc, et l’autofluorescence cellulaire. Il est conseillé aux chercheurs de modifier ce protocole en fonction de la disponibilité d’anticorps spécifiques aux espèces. Si aucun anticorps spécifique à l’espèce n’est disponible, nous conseillons d’abord d’évaluer l’immunoréactivité des anticorps à l’aide d’immunocytochemistry ou d’évaluer la transcription des protéines des espèces d’intérêt pour l’homologie aux transcriptions référencées.

Des facteurs comme la fixation de l’échantillon, la déparaffinisation inadéquate et la présence de composants tissulaires spécifiques peuvent mener à l’autofluorescence dans thrombi. Pendant la fixation de l’aldéhyde, les amines peuvent se combiner avec des aldéhydes pour former des complexes de base de Schiff, qui émettent la fluorescence22. La deparaffinisation incomplète peut également modifier chimiquement les protéines dans le tissu, créant l’autofluorescence23. Des composants extracellulaires dans des échantillons vasculaires tels que le collagène, l’élastine et les globules rouges sont rapportés pour fluorer naturellement chez les mammifères24,25. Parce que l’autofluorescence naturelle ou iattrogénique est plus perceptible dans les longueurs d’onde vertes (excitation de 488 nm, émission de 500 à 550 nm), l’utilisation de fluorophores rouge foncé peut minimiser une certaine autofluorescence26. Dans le protocole actuel, nous avons utilisé un kit d’étanchéité autofluorescence disponible dans le commerce conçu pour se lier électrostatiquement aux éléments de tissu autofluorescents. Nous recommandons que les chercheurs optimisent la durée de l’étanchéité de l’autofluorescence, parce que la recommandation du fabricant de 5 min peut diminuer l’immunoréactivité des protéines moins abondantes. Alternativement, les enquêteurs peuvent également amortir l’autofluorescence en utilisant Sudan Black B, 3,3'-diaminobenzidine ou trypan bleu27.

Étant donné que les TTRO sont répartis avec hétérogène dans une thrombus, une cartographie complète de l’ensemble des artères aortes et iliaques est recommandée. Les régions positives pour l’ADNC, le citH3 et l’EN sont ensuite amplifiées. La colocalisation de l’ADNC, du citH3 et de l’EN a été largement utilisée pour identifier la formation de NET et pour différencier la formation net des autres formes de mort cellulaire. Contrairement à une étude humaine récente qui a constaté QUE les TND étaient concentrés à la périphérie des thrombi coronaires, la plupart des NET dans les thrombi artéraux félins ont été regroupés à l’aspect crânien du caillot28. Bien que nous ayons utilisé un protocole normalisé pour identifier les TN, l’évaluation microscopique et la quantification des TNN demeurent subjectives. Ici, nous avons utilisé une méthode aveuglée et systématique pour minimiser les biais d’observateurs lors de l’analyse microscopique. Puisque le nombre de NET dans un échantillon peut être influencé par le nombre de neutrophiles, les investigateurs peuvent quantifier les TNI par rapport au nombre de neutrophiles en identifiant des neutrophiles basés sur la morphologie nucléaire, le diamètre de cellules, et l’expression des protéines neutrophiles-spécifiques. Un autre défi de l’identification NET à l’aide de la microscopie est que les TN ont des marges mal définies et qu’ils ont tendance à fusionner, formant des structures nébuleuses. Cela pourrait entraîner une sous-estimation ou une surestimation du nombre de TEN dans un échantillon donné. Par conséquent, au lieu de DAPI, NETs peut être taché à l’aide de Sytox Green pour une identification plus claire et la dénotation de l’ADN cellule-appendant de la formation DE NETs.

Nous avons développé un protocole d’immunolabeling double pour identifier les NET dans les thrombi artériels félins paraffin-intégrés. La déféaffinisation, la réhydratation et la récupération d’antigène doivent avoir lieu avant l’immunolabeling du citH3 et de l’EN. Cet essai peut être un outil précieux pour l’étude de la formation NET chez les chats et fournir une meilleure compréhension de la pathophysiologie de CATE chez les chats.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

L’étude a été soutenue par des fonds de l’Université de Californie, Davis, Center for Companion Animal Health (CCAH 2018-30-F). Les auteurs aimeraient remercier le Dr Kevin Woolard pour l’utilisation du microscope à fluorescence.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) Life Technologies Corporation D1306
Alexa Fluor 594 Streptavidin conjugate ThermoFisher Scientific Catalog # S11227
Anti-citrullinated histone H3 antibody Abcam Ab5103
EVOS FL Cell Imaging System ThermoFisher Scientific AMEFC4300
EVOS Imaging System Objective 10x ThermoFisher Scientific AMEP4681 NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm
EVOS Imaging System Objective 20x ThermoFisher Scientific AMEP4682 NA 0.40, WD 6.8 mm
EVOS Imaging System Objective 40x ThermoFisher Scientific AMEP4699 NA 0.75, WD 0.72 mm
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody ThermoFisher Scientific Catalog # A32723
Goat serum Jackson Immuno Research Labs Catalog # NC9660079. Manufacturer Part # 005-000-121
Neutrophil elastase antibody Bioss Antibodies Bs-6982R-Biotin Rabbit polyclonal Antibody, Biotin conjugated
NP40 Pierce Product # 28324. Lot # EJ64292
Positive charged microscope slides Thomas Scientific Manufacturer No. 1354W-72
Rabbit serum Life Technology Catalog # 10510
Target Retrieval Solution Agilent Dako S2367 TRIS/EDTA, pH 9 (10x)
TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit Vector Laboratories SP-8400

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References

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Identification des pièges extracellulaires Neutrophil dans paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi à l’aide de la microscopie à l’immunofluorescence
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Duler, L., Nguyen, N., Ontiveros, E., Li, R. H. L. Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (157), e60834, doi:10.3791/60834 (2020).More

Duler, L., Nguyen, N., Ontiveros, E., Li, R. H. L. Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (157), e60834, doi:10.3791/60834 (2020).

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