Vi beskriver en metode for å identifisere nøytrofile ekstracellulære feller (NETs) i formaldehyd-fast og parafin-innebygd feline kardiogent arteriell trombe ved hjelp av varmeindusert antigen gjenfinning og en dobbel immunmerking protokoll.
Nøytrofile ekstracellulære feller (NETs), bestående av cellefritt DNA (cfDNA) og proteiner som histoner og nøytrofile elastase (NE), frigjøres av nøytrofiler som svar på systemisk betennelse eller patogener. Selv om NETs tidligere har vist seg å forsterke koagulasjonsdannelse og hemme fibrinolyse hos mennesker og hunder, har netenes rolle hos katter med kardiogen arteriell tromboembolisme (CATE), en livstruende komplikasjon sekundær truende til hypertrofisk kardiomyopati , er ukjent. En standardisert metode for å identifisere og kvantifisere NETs i kardiogene arterielle trombi hos katter vil fremme vår forståelse av deres patologiske rolle i CATE. Her beskriver vi en teknikk for å identifisere NETs i formaldehyd-fast og parafininnebygd trombi innenfor aortabifurcation, ekstrahert under necropsy. Etter deparaffinisering med xylen gjennomgikk aortaseksjoner indirekte varmeindusert antigengjenfinning. Seksjoner ble deretter blokkert, permeabilisert, og ex vivo NETs ble identifisert ved kolokalisering av cellefri DNA (cfDNA), citrullinert histone H3 (citH3) og nøytrofile elastase (NE) ved hjelp av immunofluorescensmikroskopi. For å optimalisere immundeteksjonen av NETs i trombi, ble autofluorescens av vevselementer begrenset ved hjelp av en autofluorescensssinfeksjonsprosess før mikroskopi. Denne teknikken kan være et nyttig verktøy for å studere NETs og trombose i andre arter og gir ny innsikt i patofysiologien til denne komplekse tilstanden.
Katter med hypertrofisk kardiomyopati er i fare for livstruende tromboemboliske komplikasjoner1,2. Til tross for den høye sykelighet og dødelighet forbundet med feline kardiogent arteriell tromboembolisme (CATE), er den underliggende patofysiologien til CATE hos katter dårlig forstått. Det er også begrenset diagnostiske og terapeutiske verktøy for å behandle og identifisere katter i fare for denne ødeleggende tilstanden3.
I tillegg til sin rolle i medfødt immunitet, nøytrofiler har vist seg å spille en rolle i trombose ved å slippe nøytrofile ekstracellulære feller (NETs), som er web-lignende nettverk av celle-fri DNA (cfDNA) encrusted med histoner og granulære proteiner som nøytrofile elastase (NE) og myeloperoxidase. Nøytrofiler gjennomgår NETs formasjon som svar på systemisk betennelse, direkte møte med patogener og interaksjon med aktiverte blodplater4,,5,,6,7. Hos hunder har nøytrofilavledet DNA vist seg å hemme koagulasjonslyse, mens NET-proteiner akselererer koagulasjonsdannelse. NeTs evne til å fange sirkulerende celler og koagulasjonskomponenter er også nøkkelen til deres trombogene egenskaper8,,9,,10,,11,,12.
NETs oppdages ved samlokalisering av ekstracellulære nøytrofile proteiner, histoner og cfDNA. På grunn av dette er identifisering og kvantifisering av NETs i faste vev ved immunofluorescens av deparaffinert vev bedre enn tradisjonell hematoksyslin og eosin (H&E) flekk ved hjelp av lyse feltmikroskopi4,5. Flere humane studier ved hjelp av immunofluorescensmikroskopi identifisertNETer som strukturelle komponenter av koronararteriell trombi, cerebral hjerneslag trombi, attherothrombosis, og venøs trombi13,14,15,16,17. Hittil er det ikke beskrevet en standardisert metode for å oppdage og kvantifisere NETs i feline trombi. Fordi identifisering av NETs i feline kardiogene arterielle trombi kan lette fremtidig translasjonell forskning i NETs og trombose, beskriver vi teknikker for NETTO identifikasjon og vurdering i parafininnebygd arteriell trombi hos katter.
Vi beskriver en protokoll for å identifisere NETs i fast feline kardiogent arteriell trombi ved hjelp av en dobbel immunmerking protokoll og immunofluorescens mikroskopi. Selv om bare kardiogene arterielle trombi ble farget, kan denne protokollen i teorien brukes til andre typer trombi og i andre veterinærarter. Identifikasjon av NETs innenfor feline arteriell trombi antyder at NETs kan spille en rolle i trombose hos katter.
Påvisning av NETs ved immunofluorescens i fast og parafininnebygd …
The authors have nothing to disclose.
Studien ble støttet av midler fra University of California, Davis, Center for Companion Animal Health (CCAH 2018-30-F). Forfatterne ønsker å anerkjenne Dr. Kevin Woolard for bruk av fluorescensmikroskopet.
4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) | Life Technologies Corporation | D1306 | |
Alexa Fluor 594 Streptavidin conjugate | ThermoFisher Scientific | Catalog # S11227 | |
Anti-citrullinated histone H3 antibody | Abcam | Ab5103 | |
EVOS FL Cell Imaging System | ThermoFisher Scientific | AMEFC4300 | |
EVOS Imaging System Objective 10x | ThermoFisher Scientific | AMEP4681 | NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm |
EVOS Imaging System Objective 20x | ThermoFisher Scientific | AMEP4682 | NA 0.40, WD 6.8 mm |
EVOS Imaging System Objective 40x | ThermoFisher Scientific | AMEP4699 | NA 0.75, WD 0.72 mm |
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody | ThermoFisher Scientific | Catalog # A32723 | |
Goat serum | Jackson Immuno Research Labs | Catalog # NC9660079. Manufacturer Part # 005-000-121 | |
Neutrophil elastase antibody | Bioss Antibodies | Bs-6982R-Biotin | Rabbit polyclonal Antibody, Biotin conjugated |
NP40 | Pierce | Product # 28324. Lot # EJ64292 | |
Positive charged microscope slides | Thomas Scientific | Manufacturer No. 1354W-72 | |
Rabbit serum | Life Technology | Catalog # 10510 | |
Target Retrieval Solution | Agilent Dako | S2367 | TRIS/EDTA, pH 9 (10x) |
TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit | Vector Laboratories | SP-8400 |