Summary
Wir beschreiben eine Methode zur Identifizierung neutrophiler extrazellulärer Fallen (NETs) in formaldehydfixierten und paraffin-eingebetteten kardiogenen arterieogenen arteriellen Thromben mit wärmeinduziertem Antigen-Retrieval und einem doppelten Immunlabeling-Protokoll.
Abstract
Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs), bestehend aus zellfreier DNA (cfDNA) und Proteinen wie Histonen und neutrophiler Elastase (NE), werden von Neutrophilen als Reaktion auf systemische Entzündungen oder Krankheitserreger freigesetzt. Obwohl NETs bisher gezeigt haben, dass sie die Gerinnselbildung verstärken und die Fibrinolyse bei Menschen und Hunden hemmen, ist die Rolle von NETs bei Katzen mit kardiogener arterieller Thromboembolie (CATE), einer lebensbedrohlichen Komplikation, die zur hypertrophen Kardiomyopathie sekundär ist. , ist unbekannt. Eine standardisierte Methode zur Identifizierung und Quantifizierung von NETs in kardiogenen arteriellen Thromben bei Katzen wird unser Verständnis ihrer pathologischen Rolle in CATE fördern. Hier beschreiben wir eine Technik zur Identifizierung von NETs in formaldehydfixierten und paraffin-eingebetteten Thromben innerhalb der Aortenverzweigung, die während der Nekropsie extrahiert wird. Nach der Deparaffinierung mit Xylol wurden Aortenschnitte indirekt wärmeinduzierte Antigenabrufungen unterzogen. Abschnitte wurden dann blockiert, permeabilisiert, und ex vivo NETs wurden durch Kolokalisierung von zellfreier DNA (cfDNA), citrulliniertem Histon H3 (citH3) und neutrophiler Elastase (NE) mittels Immunfluoreszenzmikroskopie identifiziert. Um die Immundetektion von NETs in Thromben zu optimieren, wurde die Autofluoreszenz von Gewebeelementen durch die Verwendung eines Autofluoreszenz-Quenching-Verfahrens vor der Mikroskopie eingeschränkt. Diese Technik könnte ein nützliches Werkzeug sein, um NETs und Thrombose bei anderen Arten zu studieren und bietet neue Einblicke in die Pathophysiologie dieses komplexen Zustandes.
Introduction
Katzen mit hypertropher Kardiomyopathie sind dem Risiko lebensbedrohlicher thromboembolischer Komplikationen1,2ausgesetzt. Trotz der hohen Morbidität und Mortalität im Zusammenhang mit fein kardiogener arterieller Thromboembolie (CATE) ist die zugrunde liegende Pathophysiologie von CATE bei Katzen schlecht verstanden. Es gibt auch begrenzte diagnostische und therapeutische Instrumente zur Behandlung und Identifizierung von Katzen, die von diesem verheerenden Zustand bedroht sind3.
Zusätzlich zu seiner Rolle bei der angeborenen Immunität haben Neutrophilen gezeigt, dass sie eine Rolle bei der Thrombose spielen, indem sie neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) freisetzen, die webartige Netzwerke zellfreier DNA (cfDNA) sind, die mit Histonen und granulären Proteinen wie Neutrophilenase (NE) und Myeloperoxidase verkrustet sind. Neutrophile durchlaufen NETs Bildung als Reaktion auf systemische Entzündung, direkte Begegnung mit Krankheitserregern, und Interaktion mit aktivierten Blutplättchen4,5,6,7. Bei Hunden, neutrophil-abgeleitete DNA hat sich gezeigt, dass GerinnselLyse hemmen, während NET-Proteine die Gerinnselbildung beschleunigen. Die Fähigkeit von NETs, zirkulierende Zellen und Gerinnungskomponenten zu fangen, ist auch der Schlüssel zu ihren thrombogenen Eigenschaften8,9,10,11,12.
NETs werden durch Kolokalisierung von extrazellulären neutrophilen Proteinen, Histonen und cfDNA nachgewiesen. Aus diesem Grund ist die Identifizierung und Quantifizierung von NETs in festen Geweben durch Immunfluoreszenz von deparaffiniertem Gewebe dem traditionellen Hämatoxylin- und Eosinfleck (H&E) mit Hellfeldmikroskopie4,5überlegen. Mehrere Studien am Menschen mit Immunfluoreszenzmikroskopie identifizierten NETs als strukturelle Komponenten von koronaren arteriellen Thromben, zerebralen Schlaganfall-Thromben, Atherothrombose und venösem Thrombi13,14,15,16,17. Bis heute wurde eine standardisierte Methode zur Erkennung und Quantifizierung von NETs in Katzenthromben nicht beschrieben. Da die Identifizierung von NETs in transinenkardiinen arterienförmigen Thromben zukünftige translationale Forschung entolieren kann, beschreiben wir Techniken der NET-Identifikation und -Bewertung in paraffin-eingebetteten arteriellen Thromben bei Katzen.
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Protocol
Alle hier beschriebenen Methoden wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee an der University of California, Davis, durchgeführt. Nekropsien und Biopsien von Geweben wurden mit Zustimmung der Eigentümer durchgeführt.
1. Gewebefixierung, Einbettung und Schnitt
- Dissect out der aortenbifurkation, einschließlich der absteigenden Aorta, Femoralarterie, und die gemeinsamen Iliasarterien (Abbildung 1A), kurz nach humaner Euthanasie oder Tod. Blunt sezieren die Faszie (Abbildung 1B), bevor sie vollständig in 10% neutral gepuffertes Formalin für mindestens 24 h und nicht länger als 48 h getaucht wird.
- Um die Probe zu dehydrieren, tauchen Sie zuerst in 10% neutral gepuffertes Formalin ein, das 1 h auf 37 °C erhitzt wird. Dann tauchen Sie in steigenden Konzentrationen von Ethanol erhitzt auf 37 °C (70%, 95%, 100%) 2x für je 1 h. Schließlich, ohne Spülung, tauchen Sie 2x in 100% Toluin erhitzt auf 37 °C für 1 h jeder.
- Paraffin auf 62 °C erhitzt hinzufügen und das Paraffin vollständig über Nacht erstarren lassen.
- Abschnitt 2–3 m des paraffineingebetteten Gewebes mit einem Mikrotome und auf positiv geladenen Glasdias platzieren. Schnittgewebe bis zu einer weiteren Analyse bei -80 °C lagern.
2. Deparaffinierung, Rehydratation und wärmeinduzierte Antigenabruf
- Um die Deparaffinierung und Rehydrierung von Abschnitten auf Glasgleitern durchzuführen, legen Sie Glasschlitten in Regale und verarbeiten Sie in der folgenden Reihenfolge:
- Vollständig in 100% Xylol für 3 min untertauchen. Wiederholen Sie diesen Schritt 2x. Spülen Sie nicht zwischen den Schritten.
- Vollständig in abnehmenden Ethanolkonzentrationen untertauchen (100%, 95%, 70%) bei Raumtemperatur (RT), 3x für je 3 min. Spülen Sie nicht zwischen den Schritten.
- Vollständig in entionisiertes Wasser für 2 min untertauchen. Wiederholen.
- Legen Sie Abschnitte in Tris-gepufferte Salin mit 0,1 % Tween (TBST, pH = 7,6) für 2–3 min.
- Füllen Sie das Reservoir mit entionisiertem Wasser, das auf 100 °C erhitzt wird. Lassen Sie die Dampfkammer für 20 min ausdemieren.
HINWEIS: Die wärmeinduzierte Antigenabrufung wird am besten mit indirekter Erwärmung durchgeführt, die von einem Dampfer mit einer voreingestellten Temperatureinstellung erzeugt wird, z. B. einem Lebensmitteldampfer. - Erhitzen Sie die handelsübliche Antigen-Retrievallösung, die Tris und EDTA (pH = 9) enthält, auf einer temperaturgeregelten Kochplatte unter ständigem Rühren auf 95–97 °C. Stellen Sie sicher, dass es nicht kocht.
HINWEIS: Die Lösung sollte trüb werden, sobald sie erwärmt ist. - Gießen Sie die beheizte Antigen-Retrieval-Lösung in einen Schiebebehälter und legen Sie den Behälter in die Kammer des Dampfers. Lassen Sie die Antigen-Retrieval-Lösung auf die Temperatur des Dampfers für 3–4 min ausdemaieren. Stellen Sie sicher, dass die Temperatur der Kammer 95 °C beträgt.
- Untertauchen Sie die Dias vollständig in die beheizte Antigen-Retrieval-Lösung und setzen Sie den Einsatz der externen Erwärmung über den Dampfer für 20 min fort.
- Entfernen Sie den Schieberbehälter aus dem Dampfer und lassen Sie die Dias und die Antigen-Retrieval-Lösung auf RT abkühlen. Bewahren Sie die verdünnte Antigen-Retrieval-Lösung bei 4 °C auf und verwenden Sie bei Bedarf bis zu 2x.
- Waschen Sie die Dias 3x mit TBST für 5 min.
3. Immunkennzeichnung und Autofluoreszenzabschreckung
HINWEIS: In Tabelle 1 ist die Zusammensetzung der blockierenden Puffer aufgeführt, die in den folgenden Schritten verwendet werden.
- Inkubieren Sie Abschnitte in Blocking Buffer 1 für 2 h bei RT unter sanftem Schaukeln (30–50 U/min). Versiegeln Sie mit Paraffinfolie, um ein Trocknen zu vermeiden.
- Ohne Waschen sofort 100 l polyklonalen antihumanen citrullinierten Histon-H3-Antikörper (0,03 mg/ml im Sperrpuffer 1) direkt auf das Dia auftragen.
- Legen Sie einen Abdeckzettel (24 mm x 40 mm x 0,13–0,17 mm) auf jeden Abschnitt, um eine gleichmäßige Verteilung des Antikörpergemischs zu ermöglichen.
- 12–16 h bei 4 °C mit sanftem Schaukeln (30–50 Umdrehungen von 15:0 00 Uhr) bebrüten. Versiegeln Sie mit Parafilmfolie, um ein Trocknen zu vermeiden.
- 3x mit TBST für 5 min waschen.
- Tragen Sie 100 l Ziegenanti-Kaninchen-Antikörper auf, die mit Alexa Fluor 488 konjugiert sind (verdünnt auf eine Endkonzentration von 0,04 mg/ml oder 1:50 in Blocking Buffer 1), wie in Schritt 3.3 beschrieben. 1 h bei RT unter sanftem Schaukeln (30–50 U/min) inkubieren. Schützen Sie Dias vor Licht.
- Waschen Sie mit TBST 3x für 5 min.
- Inkubieren Sie Abschnitte in Blocking Buffer 2 über Nacht bei 4 °C unter sanftem Schaukeln (30–50 U/min). Vor Licht schützen.
- Waschen Sie mit TBST 3x für 5 min.
- Blockabschnitte in Blocking Buffer 3, wie in Schritt 3.3 bei RT beschrieben, für 2 h unter sanftem Schaukeln (30–50 U/min).
- Inkubieren Abschnitte mit biotinylierten polyklonalen Kaninchen antihumanen NE-Antikörper (Endkonzentration = 0,2 g/ml in Blocking Buffer 3) bei 4 °C für 12–16 h, wie in den Schritten 3.2–3.4 beschrieben.
- Waschen Sie mit TBST 3x für 5 min.
- Inkubieren Sie mit Alexa Fluor 594 Streptavidin-Konjugat (verdünnt auf 1:100 oder 0,02 mg/ml in Blocking Buffer 3), wie in den Schritten 3.2–3.3 für 1 h bei RT beschrieben.
- Waschen Sie mit TBST 1x für 5 min.
- Tragen Sie 100 l Autofluoreszenz-Abschrecklösungsmischung direkt auf die Abschnitte für 1 min auf, wie vom Hersteller angewiesen.
- Waschen Sie die Dias sofort mit TBST 6x für 10 min.
- Bedecken Sie jede Folie mit 100 l von 300 nM DAPI für 5 min im Dunkeln.
- Waschen Sie mit TBST für 3 min. Wiederholen Sie dies für insgesamt 5x.
- Tragen Sie einen Tropfen (ca. 50 l) Antifade-Montagemedium, Teil des Autofluoreszenz-Abschreckkits, direkt auf die Glasrutsche auf, die den Abschnitt umgibt. Legen Sie einen Abdeckzettel (24 mm x 40 mm x 0,13–0,17 mm) vorsichtig auf den Abschnitt, ohne Blasen zu erzeugen.
- Proben bei 4 °C über Nacht im Dunkeln aushärten lassen, bis sich das Montagemedium für die mikroskopische Analyse mit Tauchlinsen gehärtet hat.
4. Neutrophile extrazelluläre Trap-Identifikation
HINWEIS: Das folgende Protokoll verwendet ein invertiertes Epifluoreszenzmikroskop mit einer 1.280 x 960 digitalen CCD-Kamera (siehe Tabelle der Materialien).
- Um Thrombi zu lokalisieren, scannen Sie kranially zu kauarisch entlang der Länge der Aorta, Aortenbifurkation, und jede Femoralarterie mit Phasenkontrastmikroskopie mit einem 10-fachen Objektiv. Ein Thrombus ist ein Konglomerat von Geweben, die rote Blutkörperchen, weiße Blutkörperchen und Blutplättchen neben dem Endothel auf Phasenkontrast und Hellfeldmikroskopie enthalten (Abbildung 2A, Abbildung 2B).
- Erste Untersuchung von Abschnitten für NETs mit dem DAPI-Kanal (Erregung = 357/44 nm) mit 10x- und 20-fach-Objektiven (Abbildung 2C). Beachten Sie, dass cfDNA als dekondensierte DNA erscheint, die nicht innerhalb der Grenzen des Zytoplasmas einer Zelle liegt, wenn sie auf Phasenkontrast oder Hellfeldmikroskopie gesehen wird.
- Identifizieren Sie extrazelluläres NE und CitH3 auf den Texas Red Kanälen (Erregung = 585/29 nm, Emission = 628/32 nm) und grünen fluoreszierenden Proteinkanal (Erregung = 470/22 nm, Emission = 525/50 nm) bzw. mit 10, 20 und 40x Objektiven.
- Bewerten und analysieren Sie NETs innerhalb eines Thrombus mit verfügbarer Software, z. B. Image J (NIH). Die NET-Bildung wird anhand der Kolokalisierung von cfDNA, extrazellulärem CitH3 und NE wie zuvor beschrieben18identifiziert. Halten Sie konsistente Belichtungszeit und Gewinne jedes Kanals während der gesamten Aufnahme von Bildern aufrecht, um eine Sättigung der Pixelintensität zu vermeiden.
- Ordnen Sie jeden Thrombus basierend auf seiner Nähe zur absteigenden Aorta zu, indem Sie ihn in drei gleiche Zonen unterteilen, wobei Zone 1 der Aorta, Zone 3 am weitesten von der Aorta und Zone 2 zwischen Zonen 1 und 3 am nächsten liegt. Wenn der Bediener für den Gesundheitszustand jedes Subjekts geblendet ist, nehmen Sie mindestens zehn zufällige Felder in jeder Zone ein. Charakterisieren Sie die Verteilung von NETs in Thrombi, indem Sie die Anzahl der Felder mit NETs in jeder Zone durchschnittlichisieren oder die durchschnittliche NET-Belegungsfläche pro Zone berechnen.
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Representative Results
Mit diesem Protokoll zur Deparaffinierung, wärmeinduzierten Antigenabruf ungegnet und doppelte Immunkennzeichnung von Paraffin-eingebettetem Thromben identifizierten wir neTs zum ersten Mal in feline CATE. Thrombi innerhalb der aortenigen Bifurkation wurden durch Fluoreszenzmikroskopie und Hellfeldmikroskopie mittels Standard-H&E-Färbung und Phasenkontrastmikroskopie lokalisiert. Bei der Hellfeldmikroskopie bestand der transinale arterielle Thrombi aus roten Blutkörperchen, Leukozyten, Fibrin und Blutplättchen (Abbildung 3A). Obwohl H&E bestimmte NET-Komponenten nicht beflecken kann, traten NETs häufig als Netzwerke von tiefvioletten Fäden unterschiedlicher Länge in der Umgebung von Erythrozyten und Leukozyten auf (Abbildung 3A, gepunkteter Umriss). Ein Thrombus wurde als gut abgegrenzte Struktur innerhalb des Gefäßraums auf Phasenkontrastmikroskopie charakterisiert (Abbildung 2A, Abbildung 4B). Wir bestätigten ferner das Vorhandensein von NETs in diesen Bereichen durch Immunfluoreszenzmikroskopie (Abbildung 3B). Die Vergrößerung dieser Bereiche ergab große Aggregate von NETs, bestehend aus cfDNA, extrazelluläre mitH3 und NE(Abbildung 2C, Abbildung 3B, weiß gepunkteter Umriss). Mit der gleichen Technik, um nach Thrombi und NETs bei Katzen ohne CATE zu suchen, fanden wir heraus, dass Blätter von lyzierten Neutrophilen gelegentlich in unmittelbarer Nähe des Endothels nachgewiesen werden konnten. Obwohl diese Neutrophile einige morphologische Eigenschaften der NET-Bildung zeigten, sollten sie nicht mit einem organisierten Thrombus in Verbindung gebracht werden. Wir haben in keiner der Kontrollproben Thromben identifiziert (Abbildung 4A).
Abbildung 5A zeigt eine tiefe Autofluoreszenz von Gerinnselelementen wie Erythrozyten und Kollagen, wenn sie bei der grünen Wellenlänge (488 nm) abgebildet werden, was unsere Fähigkeit, cfDNA und Proteinkolokalisierung zu erkennen, behinderte. Wir fanden heraus, dass kurze Autofluoreszenzabschreckung mit einem kommerziell erhältlichen Kit nach Der Immunolabeling die Empfindlichkeit der Proteinkolokalisierung und NET-Erkennung signifikant erhöhte, selbst in Gebieten mit einer Fülle von Erythrozyten(Abbildung 5B, Pfeilspitzen).
Abbildung 1: Repräsentative Nekropsie-Fotografien einer sezierten Aortenverzweigung von einer Katze mit kardiogener arterieller Thromboembolie. (A) Die absteigende Aorta wurde 4–5 cm Schädel (Cr) zur Aortenbifurkation seziert. (B) Faszien wurden sorgfältig seziert, bis die absteigenden Aorta (1) und Iliasarterien (2,3) am kaudalen Aspekt (Cd) deutlich sichtbar waren. Beachten Sie den Thrombus innerhalb der Aortenbifurkation (*). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Repräsentative Phasenkontrast- und Immunfluoreszenzbilder von NETs in einem Thrombus, der in einer feinaortischen Bifurkation gefunden wird. (A) Phasenkontrastmikroskopie zeigte einen Thrombus als eine diskrete und gut abgegrenzte Struktur in der Nähe der Aorta. Kombinierte Phasenkontrast- und Fluoreszenzfärbung von DNA (blau) zeigte das Vorhandensein von Leukozyten und zellfreier DNA im Thrombus. Der Boxbereich besteht aus einer großen Konzentration zellfreier DNA. Original 10x Vergrößerung; Skala bar = 400 m. (B) Der Boxbereich in (A) wurde um das 20-fache vergrößert. Zellfreie DNA und intrazelluläre DNA, die mit DAPI (blau), neutrophiler Elastase (NE) und citrulliniertem Histon H3 (citH3) gefärbt waren, erschienen grün bzw. rot. (Original 20x Vergrößerung; Skala bar = 100 'm). (C) NETs, die auf der Kolokalisierung zellfreier DNA, extrazellulärer NE und CitH3 identifiziert wurden, wurden skizziert (gepunktete Linie). Original 40x Vergrößerung; Maßstabsleiste = 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Repräsentatives Bild eines felinen arteriellen Thrombus mit H&E und Immunfluoreszenzfärbung. (A) Auf H&E-Färbung waren große Konzentrationen von Neutrophilen und Erythrozyten sichtbar. Extrazelluläre Chromatine erschienen als tiefviolette Fäden unterschiedlicher Länge, umgeben von Erythrozyten und Neutrophilen (gepunkteter Umriss, schwarzer Pfeil). (B) Neutrophile extrazelluläre Fallen wurden leicht mit Immunfluoreszenzmikroskopie am gleichen Thrombus (gepunkteter Umriss, weißer Pfeil) visualisiert. NETs wurden als Kolokalisierung von cfDNA (blau), NE (grün) und citH3 (rot) identifiziert. Original 20x Vergrößerung; Maßstabsleiste = 200 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Repräsentative Phasenkontrast- und Immunfluoreszenzbilder von Aortenbifurkationen. (A) Phasenkontrast- und Immunfluoreszenzbilder von Aortenbifurkationen bei einer Katze ohne arterielle Thrombose. Beachten Sie das Fehlen von Thromben oder Aggregaten von Neutrophilen innerhalb des Lumens der Aortenbifurkation von der Katze ohne arterielle Thrombose. (B) Phasenkontrast- und Immunfluoreszenzbilder von Aortenbifurkationen bei einer Katze, bei der eine kardiogene arterielle Thromboembolie diagnostiziert wurde. Die Aortenbifurkationen wurden für DNA (blau), neutrophile Elastase (grün) und citrulliniertes Histon H3 (rot) gebeizt. In diesem Fall wurde bei der Katze ein gut abgegrenzter Thrombus festgestellt, der in die Gefäßwand wölbt und den größten Teil des aortenförmigen Lumens besetzte, mit kardiogener arterieller Thromboembolie. NETs, die durch die Kolokalisierung von cfDNA, NE und citH3 gekennzeichnet sind, wurden innerhalb des Thrombus (gepunkteter Umriss) identifiziert. Original 10x Vergrößerung; Maßstabsleiste = 400 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Repräsentativer Phasenkontrast (PC) und Immunfluoreszenzbilder von arteriellen Thromben von zwei Katzen. Die Dias wurden für CitH3, NE und DNA gebeizt und mit 488 nm (rot), 595 nm (grün) bzw. 357 nm (blau) Wellenlängen bzw. 40x Vergrößerung abgebildet. Kardiogene arterielle Thrombi bei Katzen hatte eine Fülle von Erythrozyten (*, gepunktete Linie). (A) Die Autofluoreszenz von Erythrozyten war über die 488 nm Wellenlänge am deutlichsten, was die Detektion von Kolokalisierungssignalen und die Identifizierung von NETs verringerte. (B) Das Abschrecken reduzierte die Autofluoreszenz bei der Wellenlänge von 488 nm signifikant, insbesondere in Bereichen mit einer hohen Konzentration von Erythrozyten (*, gepunktete Linie). Es verbesserte den Nachweis von kolokalisierten Proteinen, CitH3 und neutrophiler Elastase (Pfeilspitze), in Gegenwart von Erythrozyten (Scale bar = 200 m). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Beilage 1: Repräsentative Immunfluoreszenzbilder von arteriellen Thromben von einer Katze. Die Abschnitte wurden für DNA (blau), CitH3 (rot) und entweder Myeloperoxidase (A) oder neutrophile Elastase (B) gefärbt. (A) Trotz der Verwendung eines felinespezifischen Myeloperoxidase-Antikörpers (MPO, 1:5) blieb die Färbeintensität von MPO gering. (B) Mit einem polyklonalen neutrophilen Elastase (NE)-Antikörper, der bekanntermaßen mit mehreren Arten kreuzreagiert, waren die Immunreaktivität und die Färbeintensität signifikant höher. Beachten Sie die charakteristischen lobulated Kerne von Neutrophilen umgeben von NE (Pfeile). Original 40x Vergrößerung; Maßstabsleiste = 100 m. Bitte klicken Sie hier, um diese Figur herunterzuladen.
| Blocking Buffer | Zusammensetzung | |
| 1 | TBS mit 0,1% Tween-20, 0,1% NP40, 5% Ziegenserum | |
| 2 | TBS mit 0,1% Tween-20, 10% Kaninchenserum, 0,1%NP-40 | |
| 3 | TBS mit 0,1% Tween-20, 5% BSA, 0,1% NP-40 | |
Tabelle 1: Zusammensetzung der sperrpuffer für die Immunfluoreszenz.
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Discussion
Wir beschreiben ein Protokoll zur Identifizierung von NETs in festen kardiogenen arteriellen Thromben mit einem Doppel-Immunolabeling-Protokoll und einer Immunfluoreszenzmikroskopie. Obwohl nur kardiogene arterielle Thromben gefärbt wurden, konnte dieses Protokoll theoretisch für andere Thrombentypen und andere Tierarten verwendet werden. Die Identifizierung von NETs innerhalb des felinen arteriellen Thrombens deutet darauf hin, dass NETs bei Derene bei Katzen eine Rolle spielen können.
Der Nachweis von NETs durch Immunfluoreszenz in festem und paraffinintegriertem Gewebe ist konventionellen histologischen Flecken wie H&E überlegen, die oft Chromatinfäden zeigen, die von Neutrophilen umgeben sind13. Immunhistochemie und Immunfluoreszenz von festen arteriellen Thromben ermöglichen den gleichzeitigen Nachweis von cfDNA und anderen extrazellulären Proteinen wie CitH3, bekannt als spezifisch für die NETs-Bildung18,19. Da Kryopräparate für den NET-Nachweis in Geweben und Thromben suboptimal sind, haben wir unsere Proben in 10% neutral gepuffertem Formalin konserviert, das 4% Formaldehyd und 10% Methanol enthält. Zellfreie Nukleinsäuren werden nicht direkt durch Formaldehyd fixiert. Stattdessen werden sie innerhalb fester Proteinstrukturen immobilisiert, die durch teilweise reversible Methylenbrückenquerverbindungen, die durch Formaldehyd20induziert werden, verändert werden. Um Artefakte und Autofluoreszenzen durch Ameisensäure und Ketone, die durch Oxidation von Formaldehyd entstehen, weiter zu begrenzen, können die Forscher methanolfreies Paraformaldehyd verwenden, das im Puffer für die Fixierung verdünnt wird. Da sich die Dauer der Fixierung auf die Immunreaktivität auswirkt, empfehlen wir eine Fixierung für nicht länger als 24 h vor Derhydrierung und Paraffineinbettung. Paraffin-eingebettete Gewebe oder Gerinnsel können dann zur Deparaffinierung und Färbung gelagert werden.
Die chemische Fixierung durch Formaldehyd und Paraformaldehyd verändert die tertiäre Struktur von Proteinen, maskiert die Antigene von Interesse und verhindert die Bindung von Antikörpern an spezifische Epitope21. Antigen-Retrieval, ein Prozess, der die Methylenbrücken-Kreuzverbindungen durchbricht, ist vor der Immundetektion in formalinfixierten Geweben unerlässlich. Basierend auf den Erfahrungen der Autoren verbessert die wärmeinduzierte Antigenabrufung mit einer alkalischen Retrievallösung (pH = 9 in Tris/EDTA-Puffer) mit milder indirekter Erwärmung den Nachweis von Proteinen und NETs bei gleichzeitiger Minimierung von Artefakten und Autofluoreszenz. Die Temperatur der Antigen-Retrievallösung sollte den Siedepunkt (>100 °C) nicht erreichen, da die Denaturierung von Proteinen zu unspezifischen Bindungs- und Hintergrundgeräuschen führen kann.
Eine Einschränkung der NET-Identifikation in festen Gerinnseln ist, dass Immunfluoreszenzfärbung unter verschiedenen Antigen-Retrieval-Bedingungen sehr variabel sein kann18. Vergleichbar mit den Ergebnissen von Brinkmann et al. fanden wir heraus, dass höhere Inkubationstemperaturen (>55 °C) zu einer optimalen Färbung der Histonen in den Kernen und des endenkondensierten Chromatins19führten. Wir stellten jedoch fest, dass die Färbeintensität der Myeloperoxidase, eines granularen Proteins, das in Neutrophilen und NETs vorgefunden wird, unter den vorgeschlagenen Bedingungen gering war. Die schlechte Immunreaktivität der Myeloperoxidase war trotz der Verwendung eines felinespezifischen Antikörpers konsistent (Ergänzung Abbildung 1). Daher empfehlen wir den Prüfern, die Dauer und die Bedingungen (z. B. pH, Temperatur) des Antigen-Retrieval-Prozesses zu ändern, um ein zufriedenstellendes Signal auf der Grundlage des Antigens von Interesse zu liefern.
Eine der Herausforderungen bei der Identifizierung von NE bei Tierarten ist der Mangel an artspezifischen Antikörpern. Um die Interferenzen bei der Verwendung von Primärantikörpern derselben Art zu vermeiden, haben wir einen zusätzlichen Sperrschritt mit einer hohen Konzentration von Kaninchen-Immunglobulinen aufgenommen, um alle verbleibenden Bindungsstellen an den Ziegen-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörpern zu sättigen. Ein großer Nachteil dieser Technik ist, dass sie zeitaufwändig ist, da sie mehrere Inkubationsschritte erfordert. Die Prüfer sollten zwei verschiedene Kontrollen umfassen, die einen der beiden primären Antikörper im zweiten Immunlabeling-Schritt ausschließen, um sicherzustellen, dass der sekundäre Antikörper aus einem der beiden Immunlabelling-Schritte speziell an seinen primären Antikörper bindet. Die Spezifität der identifizierten NET-Strukturen kann durch DNase-Verdauung oder die Einbeziehung biologischer Kontrollen, die aus aortenverzweigungsischen Katzen ohne CATE bestehen, weiter überprüft werden (Abbildung 5). Darüber hinaus sollten Negativkontrollen, die aus der gleichen Konzentration von Isotypkontrollantikörpern wie die primären Antikörper bestehen, einbezogen werden, um unspezifische Antikörperwechselwirkungen, unspezifische Bindung an Fc-Rezeptoren und zelluläre Autofluoreszenz auszuschließen. Den Ermittlern wird empfohlen, dieses Protokoll auf der Grundlage der Verfügbarkeit artspezifischer Antikörper zu ändern. Wenn keine artspezifischen Antikörper verfügbar sind, empfehlen wir, zunächst die Immunreaktivität von Antikörpern mittels Immunzytochemie zu bewerten oder das Proteintranskript der für die Homologie interessierten Art auf die referenzierten Transkripte zu bewerten.
Faktoren wie Probenfixierung, unzureichende Deparaffinierung und das Vorhandensein spezifischer Gewebekomponenten können zu Autofluoreszenz in Thromben führen. Während der Aldehydfixierung können Sichame mit Aldehyden zu Schiff-Basiskomplexen kombinieren, die Fluoreszenz22emittieren. Unvollständige Deparaffinisierung kann auch chemisch modifizieren die Proteine im Gewebe, wodurch Autofluoreszenz23. Extrazelluläre Komponenten in Gefäßproben wie Kollagen, Elastin und rote Blutkörperchen werden bei Säugetieren auf natürliche Weise fluoreszierend berichtet24,25. Da natürliche oder iatrogene Autofluoreszenz in den grünen Wellenlängen am deutlichsten zu erkennen ist (Erregung = 488 nm, Emission = 500–550 nm), kann die Verwendung von weitroten Fluorophoren einige Autofluoreszenzminimieren 26. Im vorliegenden Protokoll haben wir ein kommerziell erhältliches Autofluoreszenz-Abschreckungskit verwendet, das elektrostatisch an autofluoreszierende Gewebeelemente binden soll. Wir empfehlen den Forschern, die Dauer der Autofluoreszenzabschreckung zu optimieren, da die Empfehlung des Herstellers von 5 min die Immunreaktivität weniger reichlich vorhandener Proteine verringern kann. Alternativ können die Ermittler auch die Autofluoreszenz mit Sudan Black B, 3,3'-Diaminobenzidin oder Trypan blue27dämpfen.
Da NETs heterogen innerhalb eines Thrombus verteilt sind, wird eine gründliche Kartierung der gesamten Aorta- und Iliasarterien empfohlen. Regionen, die für cfDNA, citH3 und NE positiv sind, werden dann vergrößert. Die Kolokalisierung von cfDNA, citH3 und NE wurde häufig verwendet, um die NET-Bildung zu identifizieren und die NETZbildung von anderen Formen des Zelltodes zu unterscheiden. Im Gegensatz zu einer kürzlich durchgeführten Studie am Menschen, in der herausgefunden wurde, dass NETs an der Peripherie des koronaren Thrombi konzentriert sind, wurden die meisten NETs in transinellen arteriellen Thromben am Schädelaspekt des Gerinnsels28gruppiert. Obwohl wir ein standardisiertes Protokoll zur Identifizierung von NETs verwendet haben, bleibt die mikroskopische Auswertung und Quantifizierung von NETs subjektiv. Hier haben wir eine blinde und systematische Methode eingesetzt, um Die Voreingenommenheit des Beobachters während der mikroskopischen Analyse zu minimieren. Da die Anzahl der NETs in einer Probe durch die Anzahl der Neutrophilen beeinflusst werden kann, können die Forscher NETs relativ zur Anzahl der Neutrophilen quantifizieren, indem sie Neutrophile auf der Grundlage der Kernmorphologie, des Zelldurchmessers und der Expression neutrophiler Proteine identifizieren. Eine weitere Herausforderung der NET-Identifikation mittels Mikroskopie besteht darin, dass NETs schlecht definierte Ränder haben und dazu neigen, sich zusammenzuschließen und nebulöse Strukturen zu bilden. Dies könnte zu einer Unter- oder Überschätzung der Anzahl der NE in einer bestimmten Stichprobe führen. Daher können NETs anstelle von DAPI mit Sytox Green für eine klarere Identifizierung und Denotation von zellabhängiger DNA aus der NET-Bildung gebeizt werden.
Wir haben ein Doppelte-Immunolabeling-Protokoll entwickelt, um NETs in paraffin-eingebetteten feinförmigen arteriellen Thromben zu identifizieren. Die Deparaffinierung, Rehydratation und Antigenabruf müssen vor der Immunkennzeichnung von CitH3 und NE erfolgen. Dieser Test kann ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung der NET-Bildung bei Katzen sein und ein besseres Verständnis der Pathophysiologie von CATE bei Katzen bieten.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Studie wurde von Mitteln der University of California, Davis, Center for Companion Animal Health (CCAH 2018-30-F) unterstützt. Die Autoren möchten Dr. Kevin Woolard für den Einsatz des Fluoreszenzmikroskops würdigen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) | Life Technologies Corporation | D1306 | |
| Alexa Fluor 594 Streptavidin conjugate | ThermoFisher Scientific | Catalog # S11227 | |
| Anti-citrullinated histone H3 antibody | Abcam | Ab5103 | |
| EVOS FL Cell Imaging System | ThermoFisher Scientific | AMEFC4300 | |
| EVOS Imaging System Objective 10x | ThermoFisher Scientific | AMEP4681 | NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm |
| EVOS Imaging System Objective 20x | ThermoFisher Scientific | AMEP4682 | NA 0.40, WD 6.8 mm |
| EVOS Imaging System Objective 40x | ThermoFisher Scientific | AMEP4699 | NA 0.75, WD 0.72 mm |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody | ThermoFisher Scientific | Catalog # A32723 | |
| Goat serum | Jackson Immuno Research Labs | Catalog # NC9660079. Manufacturer Part # 005-000-121 | |
| Neutrophil elastase antibody | Bioss Antibodies | Bs-6982R-Biotin | Rabbit polyclonal Antibody, Biotin conjugated |
| NP40 | Pierce | Product # 28324. Lot # EJ64292 | |
| Positive charged microscope slides | Thomas Scientific | Manufacturer No. 1354W-72 | |
| Rabbit serum | Life Technology | Catalog # 10510 | |
| Target Retrieval Solution | Agilent Dako | S2367 | TRIS/EDTA, pH 9 (10x) |
| TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit | Vector Laboratories | SP-8400 |
References
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