Summary
Vi beskriver en metode for å identifisere nøytrofile ekstracellulære feller (NETs) i formaldehyd-fast og parafin-innebygd feline kardiogent arteriell trombe ved hjelp av varmeindusert antigen gjenfinning og en dobbel immunmerking protokoll.
Abstract
Nøytrofile ekstracellulære feller (NETs), bestående av cellefritt DNA (cfDNA) og proteiner som histoner og nøytrofile elastase (NE), frigjøres av nøytrofiler som svar på systemisk betennelse eller patogener. Selv om NETs tidligere har vist seg å forsterke koagulasjonsdannelse og hemme fibrinolyse hos mennesker og hunder, har netenes rolle hos katter med kardiogen arteriell tromboembolisme (CATE), en livstruende komplikasjon sekundær truende til hypertrofisk kardiomyopati , er ukjent. En standardisert metode for å identifisere og kvantifisere NETs i kardiogene arterielle trombi hos katter vil fremme vår forståelse av deres patologiske rolle i CATE. Her beskriver vi en teknikk for å identifisere NETs i formaldehyd-fast og parafininnebygd trombi innenfor aortabifurcation, ekstrahert under necropsy. Etter deparaffinisering med xylen gjennomgikk aortaseksjoner indirekte varmeindusert antigengjenfinning. Seksjoner ble deretter blokkert, permeabilisert, og ex vivo NETs ble identifisert ved kolokalisering av cellefri DNA (cfDNA), citrullinert histone H3 (citH3) og nøytrofile elastase (NE) ved hjelp av immunofluorescensmikroskopi. For å optimalisere immundeteksjonen av NETs i trombi, ble autofluorescens av vevselementer begrenset ved hjelp av en autofluorescensssinfeksjonsprosess før mikroskopi. Denne teknikken kan være et nyttig verktøy for å studere NETs og trombose i andre arter og gir ny innsikt i patofysiologien til denne komplekse tilstanden.
Introduction
Katter med hypertrofisk kardiomyopati er i fare for livstruende tromboemboliske komplikasjoner1,2. Til tross for den høye sykelighet og dødelighet forbundet med feline kardiogent arteriell tromboembolisme (CATE), er den underliggende patofysiologien til CATE hos katter dårlig forstått. Det er også begrenset diagnostiske og terapeutiske verktøy for å behandle og identifisere katter i fare for denne ødeleggende tilstanden3.
I tillegg til sin rolle i medfødt immunitet, nøytrofiler har vist seg å spille en rolle i trombose ved å slippe nøytrofile ekstracellulære feller (NETs), som er web-lignende nettverk av celle-fri DNA (cfDNA) encrusted med histoner og granulære proteiner som nøytrofile elastase (NE) og myeloperoxidase. Nøytrofiler gjennomgår NETs formasjon som svar på systemisk betennelse, direkte møte med patogener og interaksjon med aktiverte blodplater4,,5,,6,7. Hos hunder har nøytrofilavledet DNA vist seg å hemme koagulasjonslyse, mens NET-proteiner akselererer koagulasjonsdannelse. NeTs evne til å fange sirkulerende celler og koagulasjonskomponenter er også nøkkelen til deres trombogene egenskaper8,,9,,10,,11,,12.
NETs oppdages ved samlokalisering av ekstracellulære nøytrofile proteiner, histoner og cfDNA. På grunn av dette er identifisering og kvantifisering av NETs i faste vev ved immunofluorescens av deparaffinert vev bedre enn tradisjonell hematoksyslin og eosin (H&E) flekk ved hjelp av lyse feltmikroskopi4,5. Flere humane studier ved hjelp av immunofluorescensmikroskopi identifisertNETer som strukturelle komponenter av koronararteriell trombi, cerebral hjerneslag trombi, attherothrombosis, og venøs trombi13,14,15,16,17. Hittil er det ikke beskrevet en standardisert metode for å oppdage og kvantifisere NETs i feline trombi. Fordi identifisering av NETs i feline kardiogene arterielle trombi kan lette fremtidig translasjonell forskning i NETs og trombose, beskriver vi teknikker for NETTO identifikasjon og vurdering i parafininnebygd arteriell trombi hos katter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder beskrevet her ble utført i samsvar med retningslinjene til Institutional Animal Care and Use Committee ved University of California, Davis. Necropsies og biopsier av vev ble utført med eiernes samtykke.
1. Vevfiksering, innebygging og snitting
- Dissekere ut aortabifurcation, inkludert synkende aorta, lårarterien, og de vanlige iliac arteriene (Figur 1A), kort tid etter human eutanasi eller død. Sløv dissekere ut fascia (Figur 1B) før du senker den helt i 10% nøytralbufret formalin i minst 24 timer og ikke lenger enn 48 timer.
- For å dehydrere prøven, må du først senke senk i 10 % nøytralbufret formalin oppvarmes til 37 °C i 1 time. Deretter nedsenki i økende konsentrasjoner av etanol oppvarmet til 37 °C (70%, 95%, 100%) 2x for 1 t hver. Til slutt, uten snering, nedsenke2x i 100% toluen oppvarmet til 37 °C i 1 time hver.
- Tilsett parafin oppvarmet til 62 °C og la parafinen stivne helt over natten.
- Parafininnebygd vevet § 2–3 μm ved hjelp av mikrotome og plasser på positivt ladede glasssklier. Oppbevar snittevevet ved -80 °C inntil videre analyse.
2. Deparaffinisering, rehydrering og varmeindusert antigengjenfinning
- Hvis du vil utføre deparaffinisering og rehydrering av seksjoner på glasslysbilder, plasserer du glasslysbilder i stativer og behandler i følgende rekkefølge:
- Senk helt ned i 100% xylen i 3 min. Gjenta dette trinnet 2x. Ikke skyll mellom trinnene.
- Senk helt ned i synkende konsentrasjoner av etanol (100%, 95%, 70%) ved romtemperatur (RT), 3x i 3 min hver. Ikke skyll mellom trinnene.
- Senk helt ned i deionisert vann i 2 min. Gjenta.
- Plasser seksjoner i Tris-bufret saltvann med 0,1 % Tween (TBST, pH = 7.6) i 2–3 min.
- Fyll beholderen med deionisert vann oppvarmet til 100 °C. La dampkammeret likevektig i 20 min.
MERK: Varmeindusert antigenhenting utføres best med indirekte oppvarming generert av en dampbåt med en forhåndsinnstilt temperaturinnstilling, for eksempel en matdamper. - Varm opp den kommersielt tilgjengelige antigengjenfinningsoppløsningen som inneholder Tris og EDTA (pH = 9) til 95–97 °C på en temperaturkontrollert kokeplate med konstant omrøring. Sørg for at det ikke koker.
MERK: Oppløsningen skal bli overskyet når den er varmet opp. - Hell den oppvarmede antigengjenfinningsløsningen i en glidebeholder og plasser beholderen i dampkammeret. La antigengjenfinningsoppløsningen likevekter til dampkokerens temperatur i 3–4 min. Pass på at temperaturen på kammeret er ~95 °C.
- Senk skliene helt ned i den oppvarmede antigengjenfinningsløsningen og fortsett påføringen av ekstern oppvarming via dampbåten i 20 min.
- Fjern skyvebeholderen fra dampmaskinen og la lysbildene og antigengjenfinningsløsningen avkjøles til RT. Oppbevar den fortynnede antigengjenfinningsoppløsningen ved 4 °C og gjenbruk opptil 2x ved behov.
- Vask lysbildene 3x med TBST i 5 min.
3. Immunmerking og autofluorescenssslukking
MERK: Tabell 1 beskriver sammensetningen av blokkeringsbufferne som brukes i følgende trinn.
- Inkuber seksjoner i blokkering sbuffer 1 for 2 timer ved RT under skånsom gynge (30–50 rpm). Forsegle med parafinfilm for å unngå tørking.
- Uten vask, bruk umiddelbart 100 μL fortynnet kaninpolyklonalt anti-humant citrullinert histone H3 (citH3) antistoff (0,03 mg/ml fortynnet i blokkeringsbuffer 1) direkte på lysbildet.
- Plasser en trekkslip (24 mm x 40 mm x 0,13–0,17 mm) på hver seksjon for å tillate jevn fordeling av antistoffblandingen.
- Inkuber for 12–16 timer ved 4 °C med mild gynge (30–50 o/min). Forsegle med parafilmfilm for å unngå tørking.
- Vask 3x med TBST i 5 min.
- Påfør 100 μL geitanti-kaninantistoff som er konjugert på Alexa Fluor 488 (fortynnet til en endelig konsentrasjon på 0,04 mg/ml eller 1:50 i blokkeringsbuffer 1) som beskrevet i trinn 3.3. Inkuber for 1 h på RT under skånsom gynge (30-50 rpm). Beskytt lysbilder mot lys.
- Vask med TBST 3x i 5 min.
- Inkuber seksjoner i blokkering buffer 2 over natten ved 4 °C under skånsom gynge (30–50 rpm). Beskytt mot lys.
- Vask med TBST 3x i 5 min.
- Blokker seksjoner i blokkeringsbuffer 3 som beskrevet i trinn 3.3 ved RT i 2 timer under skånsom gynge (30–50 rpm).
- Inkuber seksjoner med biotinylated polyklonal kanin anti-humant NE antistoff (endelig konsentrasjon = 0,2 μg/ml i blokkering buffer 3) ved 4 °C for 12–16 h som beskrevet i trinn 3.2–3.4.
- Vask med TBST 3x i 5 min.
- Inkuber med Alexa Fluor 594 streptavidin konjugat (fortynn til 1:100 eller 0,02 mg/ml i blokkeringsbuffer 3) som beskrevet i trinn 3.2–3.3 for 1 h ved RT. Beskytt mot lys og tetning med parafin for å hindre tørking.
- Vask med TBST 1x i 5 min.
- Påfør 100 μL autofluorescensblandingsblanding direkte på seksjonene i 1 min som instruert av produsenten.
- Vask umiddelbart lysbildene med TBST 6x i 10 min.
- Dekk hvert lysbilde med 100 μL 300 nM DAPI i 5 min i mørket.
- Vask med TBST i 3 min. Gjenta dette for totalt 5x.
- Påfør en dråpe (~ 50 μL) antifade monteringsmedium, en del av autofluorescenssslukkingssettet, direkte på glasslysbildet rundt seksjonen. Plasser en trekkslip (24 mm x 40 mm x 0,13–0,17 mm) forsiktig på seksjonen uten å lage bobler.
- Tillat prøver å kurere over natten i mørket ved 4 °C til monteringsmediet har herdet for mikroskopisk analyse med nedsenkinglinser.
4. Nøytrofil ekstracellulær felleidentifikasjon
MERK: Følgende protokoll benytter et invertert mikroskop i epifluorescens med et digitalt CCD-kamera på 1280 x 960 (se Materialtabellen).
- For å finne trombi, skann kranielt til caudally langs lengden av aorta, aorta bifurcation, og hver lårarterie ved hjelp av fase kontrast mikroskopi med en 10x mål. En trombe er en konglomerat av vev som inneholder røde blodlegemer, hvite blodlegemer og blodplater ved siden av endotelet på fasekontrast og lyse feltmikroskopi (Figur 2A, Figur 2B).
- Først undersøke seksjoner for NETs ved hjelp av DAPI-kanalen (eksitasjon = 357/44 nm) med 10x og 20x mål (Figur 2C). Legg merke til at cfDNA vises som dekondensert DNA som ikke er innenfor rammen av cytoplasma av en celle når sett på fase kontrast eller lyse feltmikroskopi.
- Identifiser ekstracellulær NE og citH3 på Texas Red kanaler (eksitasjon = 585/29 nm, utslipp = 628/32 nm) og grønn fluorescerende protein kanal (eksitasjon = 470/22 nm, utslipp = 525/50 nm), henholdsvis med 10, 20 og 40x mål.
- Evaluer og analyser NETs i et trombe ved hjelp av tilgjengelig programvare, for eksempel Image J (NIH). NET-dannelse er identifisert basert på samlokalisering av cfDNA, ekstracellulær citH3 og NE som tidligere beskrevet18. Opprettholde konsekvent eksponeringstid og gevinster for hver kanal gjennom hele oppkjøpet av bilder for å unngå metning i pikselintensitet.
- Kart hver trombe basert på sin nærhet til synkende aorta ved å dele den inn i tre like soner, med sone 1 nærmest aorta, sone 3 lengst fra aorta, og sone 2 mellom soner 1 og 3). Med operatøren blindet til den medisinske tilstanden til hvert emne, ta minst ti tilfeldige felt i hver sone. Karakteriser fordelingen av NETs i trombi ved å snitte antall felt med NETs i hver sone eller beregne gjennomsnittlig NET-opptar område per sone.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av denne protokollen for deparaffinisering, varmeindusert antigengjenfinning og dobbel immunmerking av parafininnebygd trombi, identifiserte vi NETs i feline CATE for første gang. Trombi innenfor aortabifurcation ble plassert ved fluorescens mikroskopi og lyse feltmikroskopi ved hjelp av standard H & E farging og fase kontrast mikroskopi. På lyse feltmikroskopi besto feline arteriell trombi av røde blodlegemer, leukocytter, fibrin og blodplater (Figur 3A). Selv om H & E ikke kan beise bestemte NET-komponenter, dukket NETs ofte opp som nettverk av dype lilla tråder av ulike lengder rundt nærliggende erytrocytter og leukocytter (figur 3A, stiplet disposisjon). En trombe ble karakterisert som en godt avgrenset struktur innenfor vaskulær plass på fasekontrastmikroskopi (Figur 2A, Figur 4B). Vi bekreftet videre tilstedeværelsen av NETs innenfor disse områdene ved immunofluorescensmikroskopi (figur 3B). Forstørrelse av disse områdene viste store aggregater av NETs, bestående av cfDNA, ekstracellulær citH3 og NE (Figur 2C, Figur 3B, hvit prikkete disposisjon). Ved hjelp av samme teknikk for å søke etter trombi og NETs hos katter uten CATE, fant vi ut at ark med lyzed nøytrofiler kunne oppdages av og til i nærheten av endotelet. Selv om disse nøytrofiler viste noen morfologiske egenskaper av NET formasjon, bør de ikke være forbundet med noen organisert trombbus. Vi identifiserte ikke trombi i noen av kontrollprøvene (figur 4A).
Figur 5A demonstrerer dyp autofluorescens av koagulasjonselementer som erytrocytter og kollagen når de ble avbildet ved den grønne (488 nm) bølgelengden, noe som hindret vår evne til å oppdage cfDNA og proteinkolokalisering. Vi fant at kort autofluorescenssslukking ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig sett etter immunmerking økte følsomheten til proteinkolokalisering og NET-deteksjon, selv i områder med en overflod av erytrocytter (Figur 5B, pilspisser).
Figur 1: Representative necropsy fotografier av en dissekert aorta bifurcation fra en katt med kardiogene arteriell tromboembolisme. (A) Den synkende aorta ble dissekert 4–5 cm kranial (Cr) til aortabifurcation. (B) Fascia ble nøye dissekert ut til synkende aorta (1) og iliac arterier (2,3) var tydelig synlig på caudal aspektet (Cd). Legg merke til tromben i aortabifurcation (*). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representative fasekontrast og immunfluorescensbilder av NETs i en trombe som finnes i en feline aortabifurcation. (A) Fasekontrastmikroskopi avslørte en trombe som en diskret og godt avgrenset struktur nær aorta. Kombinert fasekontrast og fluorescensfarging av DNA (blå) viste tilstedeværelsen av leukocytter og cellefritt DNA i tromben. Det boksede området består av en stor konsentrasjon av cellefritt DNA. Opprinnelig 10x forstørrelse; Skalastang = 400 μm. (B) Det boksede området i (A) ble ytterligere forstørret ved 20x. Cellefritt DNA og intracellulært DNA farget med DAPI (blå), nøytrofil elastase (NE) og citrullinert histone H3 (citH3) dukket opp grønn og rød, henholdsvis. (Original 20x forstørrelse; Skalabar = 100 μm). (C) NETs, identifisert basert på kolokalisering av cellefritt DNA, ekstracellulær NE og citH3, ble skissert (stiplet linje). Opprinnelig 40x forstørrelse; Skala bar = 100 μm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representativt bilde av en feline arteriell trombe ved hjelp av H&E og immunfluorescensfarging. (A) På H&E flekk var stor konsentrasjon av nøytrofiler og erytrocytter synlige. Ekstracellulære kromatiner dukket opp som dype lilla tråder av ulike lengder omgitt av erytrocytter og nøytrofiler (stiplet omriss, svart pil). (B) Nøytrofile ekstracellulære feller ble lett visualisert ved hjelp av immunofluorescensmikroskopi på samme trombe (stiplet omriss, hvit pil). NETs ble identifisert som kolokalisering av cfDNA (blå), NE (grønn) og citH3 (rød). Opprinnelig 20x forstørrelse; Skala bar = 200 μm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representative fasekontrast og immunfluorescensbilder av aortabifurcations. (A) Fase kontrast og immunofluorescens bilder av aorta bifurcations i en katt uten arteriell trombose. Legg merke til fraværet av trombi eller aggregater av nøytrofiler i lumen av aortabifurasjonen fra katten uten arteriell trombose. (B) Fasekontrast og immunofluorescensbilder av aortabifurcations hos en katt diagnostisert med kardiogent arteriell tromboembolisme. De aortabifurcations ble farget for DNA (blå), nøytrofil elastase (grønn), og citrullinert histone H3 (rød). I dette tilfellet ble en godt avgrenset trombe som svulmer inn i vaskulærveggen og okkuperte det meste av aortalumen notert i katten med kardiogent arteriell tromboembolisme. NETs, preget av samlokalisering av cfDNA, NE og citH3, ble identifisert i tromben (prikkete omrisset). Opprinnelig 10x forstørrelse; Skala bar = 400 μm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Representativ fasekontrast (PC) og immunfluorescensbilder av arteriell trombi fra to katter. Lysbildene ble farget for henholdsvis citH3, NE og DNA og avbildet ved 488 nm (rød), 595 nm (grønn) og 357 nm (blå) bølgelengder, ved 40x forstørrelse. Kardiogen arteriell trombi hos katter hadde en overflod av erytrocytter (*, stiplet linje). (A) Autofluorescens fra erytrocytter var mest fremtredende over 488 nm bølgelengde, redusere påvisning av colocalization signal og identifisering av NETs. (B) Slukke betydelig redusert autofluorescens ved 488 nm bølgelengde, spesielt i områder med en høy konsentrasjon av erytrocytter (*, stiplet linje). Det forbedret påvisning av kolokaliserte proteiner, citH3 og nøytrofile elastase (pilhode), i nærvær av erytrocytter (Scale bar = 200 μm). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplement Figur 1: Representative immunfluorescensbilder av arteriell trombi fra en katt. Seksjonene ble farget for DNA (blå), citH3 (rød), og enten myeloperoxidase (A) eller nøytrofile elastase (B). (A) Til tross for bruk av et kattespesifikt myeloperoxidaseantistoff (MPO, 1:5), forble flekkintensiteten til MPO dårlig. (B) Ved hjelp av et polyklonal nøytrofilelastase (NE) antistoff, kjent for å kryssreagere med flere arter, var immunreaktiviteten og fargeintensiteten signifikant høyere. Legg merke til de karakteristiske lobulated kjerner av nøytrofiler omgitt av NE (piler). Opprinnelig 40x forstørrelse; Scale bar = 100 μm. Vennligst klikk her for å laste ned denne figuren.
| Blokkere buffer | Sammensetning | |
| 1 | TBS med 0,1% Tween-20, 0,1% NP40, 5% geitserum | |
| 2 | TBS med 0,1% Tween-20, 10% kaninserum, 0,1% NP-40 | |
| 3 | TBS med 0,1% Tween-20, 5% BSA, 0,1% NP-40 | |
Tabell 1: Sammensetning av blokkeringsbuffere som brukes til immunfluorescens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver en protokoll for å identifisere NETs i fast feline kardiogent arteriell trombi ved hjelp av en dobbel immunmerking protokoll og immunofluorescens mikroskopi. Selv om bare kardiogene arterielle trombi ble farget, kan denne protokollen i teorien brukes til andre typer trombi og i andre veterinærarter. Identifikasjon av NETs innenfor feline arteriell trombi antyder at NETs kan spille en rolle i trombose hos katter.
Påvisning av NETs ved immunofluorescens i fast og parafininnebygd vev er bedre enn konvensjonelle histologiske flekker som H & E, som ofte viser tråder av kromatin omgitt av nøytrofiler13. Immunhistokjemi og immunfluorescens av fast arteriell trombi tillater samtidig påvisning av cfDNA og andre ekstracellulære proteiner som citH3, kjent for å være spesifikke for NETs formasjon18,19. Fordi kryopreparater er suboptimale for NET-deteksjon i vev og trombi, bevarte vi prøvene våre i 10% nøytralbufret formalin, som inneholder 4% formaldehyd og 10% metanol. Cellefrie nukleinsyrer er ikke direkte festet av formaldehyd. I stedet er de immobilisert innenfor faste proteinstrukturer, som endres av delvis reversible metylenbrokrysskoblinger indusert av formaldehyd20. For ytterligere å begrense gjenstander og autofluorescens forårsaket av maursyre og ketoner generert av oksidasjon av formaldehyd, kan forskerne velge å bruke metanolfri paraformaldehyd fortynnet i buffer for fiksering. Fordi varigheten av fiksering påvirker immunreaktivitet, anbefaler vi fiksering i ikke lenger enn 24 timer før dehydrering og parafininnebygging. Parafininnebygdvev eller blodpropper kan deretter lagres for deparaffinisering og farging.
Kjemisk fiksering ved formaldehyd og paraformaldehyd endrer den tertiære strukturen av proteiner, maskerer antigenene av interesse og forhindrer binding av antistoffer mot spesifikke epitoper21. Antigen gjenfinning, en prosess som bryter metylenbroen krysslinker, er viktig før du utfører immundeteksjon i formalin-fikset vev. Basert på forfatternes erfaring, varmeindusert antigen gjenfinning ved hjelp av en alkalisk gjenfinningløsning (pH = 9 i Tris / EDTA buffer) med mild indirekte oppvarming forbedrer påvisning av proteiner og NETs samtidig minimere artefakter og autofluorescens. Temperaturen på antigengjenfinningsløsningen bør ikke nå kokepunktet (> 100 °C), fordi denaturering av proteiner kan føre til uspesifikk binding og bakgrunnsstøy.
En begrensning av NETTO identifikasjon i faste blodpropper er at immunfluorescens farging kan være svært variabel under ulike antigen gjenfinningforhold18. Sammenlignbare med resultatene funnet av Brinkmann et al., fant vi at høyere inkubasjonstemperaturer (> 55 °C) resulterte i optimal farging av histoner i kjernene og dekondensert kromatin19. Vi fant imidlertid at fargeintensiteten til myeloperoxidase, et granulært protein som finnes i nøytrofiler og NETs, var lav under de foreslåtte forholdene. Den dårlige immunreaktiviteten til myeloperoxidase var konsistent til tross for bruk av et kattespesifikt antistoff (Supplement Figur 1). Derfor oppfordrer vi etterforskerne til å endre varigheten og betingelsene (f.eks. pH, temperatur) av antigengjenfinningsprosessen for å gi et tilfredsstillende signal basert på interesseantigenet.
En av utfordringene med å identifisere NETs i veterinærarter er mangelen på artsspesifikke antistoffer. For å forhindre forstyrrelsen som oppstår ved bruk av primære antistoffer som stammer fra samme art, inkluderte vi et ekstra blokkeringstrinn som bruker en høy konsentrasjon av kaninimmunoglobuliner for å mette eventuelle gjenværende bindingssteder på geitantikaninsekundære antistoffer. En stor ulempe med denne teknikken er at den er tidkrevende, fordi det krever flere inkubasjonstrinn. Etterforskerne bør inkludere to forskjellige kontroller som utelukker enten primærantistoff i det andre immunmerkingstrinnet for å sikre at det sekundære antistoffet fra et immunmerkingstrinn binder seg spesielt til det primære antistoffet. Spesifisiteten til de identifiserte NET-strukturene kan ytterligere verifiseres av DNase-fordøyelsen eller inkludering av biologiske kontroller bestående av aorta bifurcations fra katter uten CATE (figur 5). I tillegg bør negative kontroller som består av samme konsentrasjon av isotypekontrollantistoffer som de primære antistoffene inkluderes for å utelukke ikke-spesifikke antistoffinteraksjoner, uspesifikk binding til Fc-reseptorer og cellulær autofluorescens. Etterforskere rådes til å endre denne protokollen basert på tilgjengeligheten av artsspesifikke antistoffer. Hvis ingen artsspesifikke antistoffer er tilgjengelige, anbefaler vi først å evaluere immunreaktiviteten til antistoffer ved hjelp av immuncytokjemi eller evaluere proteintranskripsjonen fra arten av interesse for homologi til de refererte transkripsjonene.
Faktorer som prøvefiksering, utilstrekkelig deparaffinisering og tilstedeværelse av spesifikke vevskomponenter kan føre til autofluorescens i trombi. Under aldehyd fiksering kan aminer kombineres med aldehyder for å danne Schiff basekomplekser, som avgir fluorescens22. Ufullstendig deparaffinisering kan også kjemisk endre proteinene i vevet, og skaper autofluorescens23. Ekstracellulære komponenter i vaskulære prøver som kollagen, elastin og røde blodlegemer rapporteres å naturlig fluorisere i pattedyr24,,25. Fordi naturlig eller iatrogen autofluorescens er mest merkbar i de grønne bølgelengdene (eksitasjon = 488 nm, utslipp = 500–550 nm), kan bruk av fjernrøde fluoroforer minimere noen autofluorescens26. I den nåværende protokollen benyttet vi et kommersielt tilgjengelig autofluorescenssslukkingssett designet for å elektrostatisk binde seg til autofluorescerende vevselementer. Vi anbefaler at etterforskerne optimaliserer varigheten av autofluorescenssslukking, fordi produsentens anbefaling på 5 min kan redusere immunreaktivitet av mindre rikelig proteiner. Alternativt kan etterforskerne også dempe autofluorescens ved hjelp av Sudan Black B, 3,3'-diaminobenzidine eller trypan blå27.
Fordi NETs er heterogent fordelt i en trombe, anbefales en grundig kartlegging av hele aorta og iliac arterier. Regioner som er positive for cfDNA, citH3 og NE blir deretter forstørret. Kolokaliseringen av cfDNA, citH3 og NE har blitt mye brukt til å identifisere NET-dannelse og for å skille NET-dannelse fra andre former for celledød. I motsetning til en nylig menneskelig studie som fant NETs å være konsentrert i periferien av koronar trombi, de fleste nets i feline arteriell trombe ble gruppert på kranial aspekt av blodpropp28. Selv om vi brukte en standardisert protokoll for å identifisere NETs, forblir mikroskopisk evaluering og kvantifisering av NETs subjektiv. Her benyttet vi en blindet og systematisk metode for å minimere observatørbias under mikroskopisk analyse. Fordi antall NETs i en prøve kan påvirkes av antall nøytrofiler, kan forskerne kvantifisere NETs i forhold til antall nøytrofiler ved å identifisere nøytrofiler basert på nukleær morfologi, cellediameter og uttrykk for nøytrofilspesifikke proteiner. En annen utfordring med NET-identifikasjon ved hjelp av mikroskopi er at NETs har dårlig definerte marginer, og de har en tendens til å fusjonere, og danner nebuløse strukturer. Dette kan føre til under- eller overvurdering av antall NETs i et gitt utvalg. Derfor, i stedet for DAPI, nets kan være farget ved hjelp av Sytox Green for klarere identifisering og denotasjon av celle-appendant DNA fra NETs dannelse.
Vi har utviklet en dobbel immunmerkingsprotokoll for å identifisere NETs i parafininnebygd feline arteriell trombi. Deparaffinisering, rehydrering og antigengjenfinning må skje før immunmerking av citH3 og NE. Denne analysen kan være et verdifullt verktøy for studiet av NET-dannelse hos katter og gi en bedre forståelse av patofysiologien til CATE hos katter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Studien ble støttet av midler fra University of California, Davis, Center for Companion Animal Health (CCAH 2018-30-F). Forfatterne ønsker å anerkjenne Dr. Kevin Woolard for bruk av fluorescensmikroskopet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) | Life Technologies Corporation | D1306 | |
| Alexa Fluor 594 Streptavidin conjugate | ThermoFisher Scientific | Catalog # S11227 | |
| Anti-citrullinated histone H3 antibody | Abcam | Ab5103 | |
| EVOS FL Cell Imaging System | ThermoFisher Scientific | AMEFC4300 | |
| EVOS Imaging System Objective 10x | ThermoFisher Scientific | AMEP4681 | NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm |
| EVOS Imaging System Objective 20x | ThermoFisher Scientific | AMEP4682 | NA 0.40, WD 6.8 mm |
| EVOS Imaging System Objective 40x | ThermoFisher Scientific | AMEP4699 | NA 0.75, WD 0.72 mm |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody | ThermoFisher Scientific | Catalog # A32723 | |
| Goat serum | Jackson Immuno Research Labs | Catalog # NC9660079. Manufacturer Part # 005-000-121 | |
| Neutrophil elastase antibody | Bioss Antibodies | Bs-6982R-Biotin | Rabbit polyclonal Antibody, Biotin conjugated |
| NP40 | Pierce | Product # 28324. Lot # EJ64292 | |
| Positive charged microscope slides | Thomas Scientific | Manufacturer No. 1354W-72 | |
| Rabbit serum | Life Technology | Catalog # 10510 | |
| Target Retrieval Solution | Agilent Dako | S2367 | TRIS/EDTA, pH 9 (10x) |
| TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit | Vector Laboratories | SP-8400 |
References
- Maron, B. J., Fox, P. R. Hypertrophic cardiomyopathy in man and cats. Journal of Veterinary Cardiology: The Official Journal of the European Society of Veterinary Cardiology. 17, Suppl 1 6-9 (2015).
- Payne, J. R., et al. Prognostic indicators in cats with hypertrophic cardiomyopathy. Journal of Veterinary Internal Medicine. 27 (6), 1427-1436 (2013).
- Borgeat, K., Wright, J., Garrod, O., Payne, J. R., Fuentes, V. L. Arterial Thromboembolism in 250 Cats in General Practice: 2004-2012. Journal of Veterinary Internal Medicine. 28 (1), 102-108 (2014).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs. Nature Reviews. Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
- Goggs, R., Jeffery, U., LeVine, D. N., Li, R. H. L. Neutrophil-extracellular traps, cell-free DNA and immunothrombosis in companion animals: A review. Veterinary Pathology. , 300985819861721 (2019).
- de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. Nuclear smears observed in H & E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps. Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).
- Li, R., Tablin, F. A Comparative Review of Neutrophil Extracellular Traps in Sepsis. Frontiers in Veterinary Sciences. 5 (291), (2018).
- Borissoff, J. I., et al. Elevated levels of circulating DNA and chromatin are independently associated with severe coronary atherosclerosis and a prothrombotic state. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (8), 2032-2040 (2013).
- Moschonas, I. C., Tselepis, A. D. The pathway of neutrophil extracellular traps towards atherosclerosis and thrombosis. Atherosclerosis. 288, 9-16 (2019).
- Perdomo, J., et al. Neutrophil activation and NETosis are the major drivers of thrombosis in heparin-induced thrombocytopenia. Nature Communications. 10 (1), 1322 (2019).
- Li, B., et al. Neutrophil extracellular traps enhance procoagulant activity in patients with oral squamous cell carcinoma. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 145 (7), 1695-1707 (2019).
- Li, R. H. L., Tablin, F. In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (138), e58083 (2018).
- de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. Nuclear smears observed in H&E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps. Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).
- Farkas, ÁZ., et al. Neutrophil extracellular traps in thrombi retrieved during interventional treatment of ischemic arterial diseases. Thrombosis Research. 175, 46-52 (2019).
- Qi, H., Yang, S., Zhang, L. Neutrophil Extracellular Traps and Endothelial Dysfunction in Atherosclerosis and Thrombosis. Frontiers in Immunology. 8, 928 (2017).
- Laridan, E., et al. Neutrophil extracellular traps in ischemic stroke thrombi. Annals of Neurology. 82 (2), 223-232 (2017).
- Laridan, E., Martinod, K., Meyer, S. F. D. Neutrophil Extracellular Traps in Arterial and Venous Thrombosis. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).
- Li, R. H. L., Johnson, L. R., Kohen, C., Tablin, F. A novel approach to identifying and quantifying neutrophil extracellular trap formation in septic dogs using immunofluorescence microscopy. BMC Veterinary Research. 14 (1), 210 (2018).
- Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Immunodetection of NETs in Paraffin-Embedded Tissue. Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).
- Moelans, C. B., Oostenrijk, D., Moons, M. J., van Diest, P. J. Formaldehyde substitute fixatives: effects on nucleic acid preservation. Journal of Clinical Pathology. 64 (11), 960-967 (2011).
- Rait, V. K., Xu, L., O'Leary, T. J., Mason, J. T. Modeling formalin fixation and antigen retrieval with bovine pancreatic RNase A II. Interrelationship of cross-linking, immunoreactivity, and heat treatment. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (3), 300-306 (2004).
- Willingham, M. C. An alternative fixation-processing method for preembedding ultrastructural immunocytochemistry of cytoplasmic antigens: the GBS (glutaraldehyde-borohydride-saponin) procedure. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 31 (6), 791-798 (1983).
- Davis, A. S., et al. Characterizing and Diminishing Autofluorescence in Formalin-fixed Paraffin-embedded Human Respiratory Tissue. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 62 (6), 405-423 (2014).
- Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon. Journal of Investigative Medicine: The Official Publication of the American Federation for Clinical Research. 47 (6), 326-332 (1999).
- Hirsch, R. E., Zukin, R. S., Nagel, R. L. Intrinsic fluorescence emission of intact oxy hemoglobins. Biochemical and Biophysical Research Communications. 93 (2), 432-439 (1980).
- Billinton, N., Knight, A. W. Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence. Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).
- Mosiman, V. L., Patterson, B. K., Canterero, L., Goolsby, C. L. Reducing cellular autofluorescence in flow cytometry: an in-situ method. Cytometry. 30 (3), 151-156 (1997).
- Ducroux, C., et al. Thrombus Neutrophil Extracellular Traps Content Impair tPA-Induced Thrombolysis in Acute Ischemic Stroke. Stroke. 49 (3), 754-757 (2018).
