Summary
Das Ziel dieses Artikels ist es, eine verfeinerte Methode der Intubation der Labormaus zu beschreiben. Die Methode ist nichtinvasiv und daher ideal für Studien, die eine serielle Überwachung der Atemfunktion und/oder die Instillation von Behandlungen in die Lunge erfordern.
Abstract
Die Literatur beschreibt mehrere Methoden zur Mausintubation, die entweder eine Visualisierung der Glottis durch die Mundhöhle oder einen Schnitt im Ventralhals zur direkten Bestätigung der Kanülenplatzierung in der Luftröhre erfordern. Die relative Schwierigkeit oder das Gewebetrauma, das durch solche Verfahren zum Thema induziert wird, kann ein Hindernis für die Fähigkeit eines Prüfers sein, Längsschnittstudien durchzuführen. Dieser Artikel veranschaulicht eine Technik, bei der die physische Manipulation der Maus nach der Verwendung eines Enthaarungsmittels, um Haare aus dem ventralen Hals zu entfernen, eine transkutane Visualisierung der Luftröhre für orotracheale Intubation unabhängig vom Grad der Haut ermöglicht Pigmentierung. Diese Methode ist harmlos für das Thema und leicht mit einem begrenzten Verständnis der murinen Anatomie erreicht. Dieser verfeinerte Ansatz erleichtert die wiederholte Intubation, die für die Überwachung des Fortschreitens der Krankheit oder die Instillation von Behandlungen erforderlich sein kann. Die Verwendung dieser Methode kann zu einer Verringerung der Anzahl der Tiere und der technischen Fähigkeiten führen, die erforderlich sind, um die Lungenfunktion in Mausmodellen von Atemwegserkrankungen zu messen.
Introduction
Die Labormaus ist ein gängiges Tiermodell für menschliche Atemwegserkrankungen. So gibt es mehrere veröffentlichte Methoden für die Mausintubation zum Zwecke der Instillation von Behandlungen und Messung der Atemmechanik. Die meisten der beschriebenen Verfahren erfordern die Visualisierung der Glottis durch die Mundhöhle mit speziellen Geräten wie einem Laryngoskop oder einer lichtoptischen Lichtquelle1,2,3,4,5,6,7., Dies kann jedoch schwierig sein, wenn eine relativ große Kanüle benötigt wird, da sie die Sicht des Forschers verschleiern kann. Limjunyawong et al.8 haben dieses Anliegen mit einer Intubationsmethode angesprochen, bei der ein kleiner hautförmiger Schnitt entlang der Mittellinie des ventralen Halses gemacht wird, der eine Visualisierung der Luftröhre ermöglicht. Nach dem Eingriff wird der Schnitt mit Gewebekleber geschlossen.
Für Studien, die häufige wiederholte Intubationen erfordern, erfordert das sukzessive Einschneiden und Schließen dieser Stelle eine Debridementierung der Hautränder und gewebetrauma am ventralen Hals. Der Zweck des transkutanen Trachealvisualisierungsansatzes zur oralen Intubation ist es, eine raffinierte, nichtinvasive Technik zu liefern, die speziell für wiederholte Intubationsstudien sowie einzelne Intubationsereignisse bei Mäusen geeignet ist.
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Protocol
Alle hier beschriebenen tierischen Aktivitäten wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Ohio State University genehmigt und in AAALAC-akkreditierten Einrichtungen durchgeführt.
1. Verfahrensvorbereitung
- Konstruieren Sie die Intubationsplattform. Um die entsprechende Plattformneigung zu erreichen, verwenden Sie einen 3-Ring-Binder (7,6 cm). Falten Sie eine 15 x 20 cm Länge von 3-0 Seide oder anderen Fadenmaterial in der Hälfte und halten Sie die Enden des Gewindes an der Oberseite der geneigten Plattform mit Klebeband, um eine Suspensionsschleife zu erstellen (Abbildung 1).
- Wählen Sie eine Kanüle der entsprechenden Größe und Länge aus.
HINWEIS: Für eine 20-30 g-Maus kann ein 2,5-zoll-3,8 cm langer Katheter bis 18 G verwendet werden. Für diese Studie wurden 18 Wochen alte weibliche BALB/c- und 10-wöchige C57BL/6-Mäuse (n = 3 von jedem Stamm) verwendet. Eine undurchsichtige weiße Katheterhülle bietet die beste transkutane Visualisierung. - Schneiden Sie eine Abschrägung an der distalen Spitze des Katheters und glätten Sie die schnittoberfläche mit Schleifpapier, um eine abgerundete Abschrägungsspitze zu schaffen. Erstellen Sie vorsichtig eine leichte Biegung in der Kanüle ca. 1 cm von der Abschrägung (Abbildung 2).
HINWEIS: Für jede Maus sollte ein neuer Katheter verwendet werden. - Anästhetisieren Sie die Maus mit Ketamin (5,4 mg/g Körpergewicht) und Xylazin (16 g/g Körpergewicht) intraperitoneal verabreicht. Tragen Sie sterile ophthalimische Salbe auf die Augen auf.
HINWEIS: Die richtige Anästhesietiefe wird durch mangelnde Reaktion der Maus auf eine feste Zehenklemme erreicht. - Halten Sie die Maus in einer Supine-Position auf der Intubationsplattform auf, indem Sie die oberen Schneidezähne um das Seidenfaden an der Oberseite der abgewinkelten Oberfläche hängen (Abbildung 3). Sobald die Maus quadratisch in dorsaler Rekonnkrüsung positioniert ist, greifen Sie vorsichtig die Basis des Schwanzes und ziehen Sie den Schwanz in Richtung des Tisches zurück. Legen Sie ein Stück Klebeband über die Basis des Schwanzes, um die Maus zu sichern.
- Tragen Sie enthaarte Creme (Tabelle der Materialien) auf die ventrale Zervixregion für 30-45 s dann entfernen Sie alle Enthaarungscreme aus dem Zervixbereich mit einer trockenen Gaze. Wiederholen Sie den Bewerbungsprozess bei Bedarf. Spülen Sie die Haut gründlich mit Salzoder destilliertem Wasser ab, um Rückstände zu entfernen und dann trocken zu wischen.
2. Intubationsverfahren
- Verwenden Sie gerade, flache Zangen in der nicht dominanten Hand, um die Zunge sanft in einer Weise zurückzuziehen, die den Mund für die Einführung der Kanüle ausreichend öffnet.
HINWEIS: Rattenzahnzange sollte nicht verwendet werden, da dies die Zunge schädigt. - Mit der dominanten Hand, die Kanüle in den Mund so vorrücken, dass das Ende, das distal zur leichten Biegung ist, gegen das Dach des Mundes des Subjekts ist.
- Lösen Sie die Zunge und schieben Sie die flache Kante der geschlossenen Zange kauend entlang des ventralen Halses, bis das Manubrium erreicht ist. Diese Bewegung verdrängt seitlich die Speicheldrüsen und flacht den Muskel, der die Luftröhre bedeckt. Die Luftröhre erscheint transkutan als weiße Linie (Abbildung 3A). Drehen Sie bei Bedarf die Zange in craniodorsal-Richtung, während Sie die Spannung auf der Haut in kaudaler Richtung aufrechterhalten, um die seitlich verschobenen Speicheldrüsen zum Höhepunkt zu bringen. Dieses Manöver erzeugt mehr Kontrast um die Luftröhre (Abbildung 3B).
HINWEIS: Vermeiden Sie übermäßige Kraft auf den ventralen Hals, da es die Luftröhre kollabieren und die Atmung beeinträchtigen kann. - Fördern Sie die Kanüle und angeln Sie gleichzeitig die distale Spitze der Kanüle durch Supination der dominanten Hand bei gleichzeitiger Beugung des Handgelenks.
- Die richtige Platzierung der Kanüle wird durch Visualisierung der opaken Kanüle in der Luftröhre angezeigt (Abbildung 4B,D). Wenn die Kanüle über das Niveau des Ursprungs des Masseermuskels hinaus fortgeschritten ist und die Visualisierung der Kanüle in der Luftröhre nicht bestätigt wurde, ziehen Sie die Kanüle zurück und versuchen Sie es erneut.
- Bestätigen Sie die richtige Kanülenplatzierung, indem Sie eine Lungeninflationslampe an die Kanüle anschließen und die Brustvergrößerung mit gleichzeitiger Depression des Geräts beobachten.
- Ohne die Kanüle zu verdrängen, die Schneidezähne der Maus vorsichtig von der Intubationsplattform zu lösen. Bewegen Sie die Maus auf eine horizontale Plattform (Materialtabelle) und legen Sie die Kanüle an den Adapter am Beatmungsgerät ein. Nach der tiefen Inflation, belüften Sie die Maus für 60 s dann Atemwiderstand messen.
3. Wiederherstellung
- Sobald der Vorgang abgeschlossen ist, bewegen Sie die Maus auf eine erwärmte Plattform. Bieten Sie eine konstante Stimulation durch leichte Zehen- oder Schwanzkneifen, um die spontane Atmung zu fördern.
- Extubation kann auftreten, wenn die Maus gerade beginnt zu kauen. Greifen Sie die Kanüle auf Höhe der Nabe und ziehen Sie die Röhre vorsichtig kranially und weg von der Maus, bis die Kanüle vollständig aus dem Mund des Subjekts entfernt ist.
HINWEIS: Es ist vorzuziehen, die Atemwegsunterstützung mit der starren Kanüle so lange wie möglich während des Rückgewinnungsprozesses zu gewährleisten. - Einmal extubiert, übertragen Sie die Maus in einen sauberen Rückgewinnungskäfig mit Wärmeunterstützung. Überwachen Sie die Maus kontinuierlich, bis sie vollständig ambulant ist und die Wiederherstellung abgeschlossen ist.
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Representative Results
Serielle Überwachung der Basispulmonalenfunktion
Achtzehn Wochen alte weibliche BALB/c- und 10-wochen-alte C57BL/6-Mäuse (n = 3 von jedem Stamm) wurden mit der beschriebenen Methode am Tag 0, 3, 10 und 17 intubiert. Nach der Intubation an jedem Tag wurde das Motiv mit einem mechanischen Ventilator verbunden, der mit 100% Sauerstoff versorgt wurde (Materialtabelle). Der Atemwiderstand (Rrs) wurde mit der erzwungenen Schwingungstechnik für 60 s gemessen, nachdem eine tiefe Aufwinde auf 25 cm H2O für 5 s gehalten wurde. Keine Softwarefehler im Zusammenhang mit diesem anhaltenden Atemhalt zusammen mit Rrs-Werten innerhalb des physiologischen Bereichs bieten zusätzliche Unterstützung für die ordnungsgemäße Platzierung der Kanüle. Die Daten zeigten keine signifikanten Unterschiede der gemessenen Rrs zwischen den Zeitpunkten innerhalb jedes Stammes (Abbildung 5). Es wird angenommen, dass das Fehlen eines Anstiegs der Rrs im Laufe der Zeit auf einen Mangel an traumaassoziierten Entzündungen in der Atemwege über vier aufeinander folgende Zeitpunkte hindeutet.
Statistische Auswertung
Beschreibende Statistiken (Mittelwert und Standardfehler) wurden mit Hilfe einer statistischen Analysesoftware (Materialtabelle) berechnet. Die Kolmogorov-Smirnov-Methode wurde verwendet, um die Gaußsche Datenverteilung zu verifizieren. Statistische Auswertungen von Datensätzen wurden von ungepaarter ANOVA durchgeführt, mit einem Post-hoc-Bericht Tukey-Kramer nach dem Test. Alle Daten werden als Mittelwert dargestellt. P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.
Abbildung 1: Intubationsplattform. Die Intubationsplattform besteht aus einem Drei-Ring-Bindemittel mit einer Schleife aus Seidenfaden, die an der Oberseite des Bindemittels haftet, um eine Suspensionsschleife zu erstellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Kanülenpräparation. (A) Seitenansicht der vorbereiteten Kanüle. Beachten Sie den sanften Winkel, der ca. 1 cm von der abgerundeten Abschrägung am distalen Ende des Katheters und der Ausrichtung des Kanülenwinkels in Bezug auf die Abschrägung entsteht. (B) Dorsoventralansicht der präparierten Kanüle. Beachten Sie die abgerundete und geglättete Kante der Abschrägung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Trachealvisualisierung. (A) Zangen werden auf den ventralen Hals gelegt und die Haut wird sanft kaudal zurückgezogen, um die Speicheldrüsen seitlich zu verdrängen und die Luftröhre als weiße Struktur auf der ventralen Mittellinie (schwarzer Pfeil) zu beanstanden. (B) Craniodorsale Rotation der Zange am ventralen Hals erzeugt einen Vorsprung der Speicheldrüsen (*). Die Luftröhre wird als weiße lineare Struktur auf der ventralen Mittellinie zwischen den Speicheldrüsen (schwarzer Pfeil) visualisiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Richtige Kanülenplatzierung. (A) C57BL/6 Maus auf der Intubationsplattform positioniert mit der Kanüle in die proximale Mundhöhle eingeführt. (B) C57BL/6 Maus mit der Kanüle richtig in der Luftröhre platziert. Beachten Sie, dass die Kanüle leicht als weiße Struktur innerhalb der Luftröhre (weißer Pfeil) visualisiert werden kann. (C) BALB/c Maus auf der Intubationsplatte positioniert mit der Kanüle in die proximale Mundhöhle eingeführt. (D) BALB/c Maus mit der Kanüle richtig in der Luftröhre platziert. Die weiße Kanüle kann leicht innerhalb der Luftröhre (schwarzer Pfeil) visualisiert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Serielle Messung des Widerstands. Keine signifikanten Unterschiede der gemessenen Rrs zwischen den Zeitpunkten innerhalb jeder Sorte beobachtet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die Intubation mit der transkutanen Trachealvisualisierungstechnik bietet einen raffinierten Ansatz zur Standardmethode des Hautschnitts. Mit besonderer Aufmerksamkeit auf mehrere wichtige Schritte kann die Intubation einfach und schnell erreicht werden. Das Tier muss direkt in dorsaler Regung auf der Intubationsplattform platziert werden, wobei die Maus in sanftem Rückzug gesichert ist. Dadurch wird das Tier in vertikale Ausrichtung und richtige Positionierung für die Intubation erweitert. Darüber hinaus sollte die Enthaarungscreme nicht länger als 30 bis 45 s mit der Haut des Tieres in Kontakt bleiben und gründlich vorspülen, um alle Rückstände zu entfernen. Erweiterter Hautkontakt mit der Enthaarungscreme verursacht unnötige Schmerzen für das Tier und Geschwüre können den Blick auf die Luftröhrebehindern 9. Es ist zwingend notwendig, die richtige Handgelenkbewegung zu verwenden, da die dominante Hand den Katheter in die Glottis einführt. Das dominante Handgelenk sollte sich biegen, während sich die Hand in einer Supinationsbewegung bewegt. Es ist auch wichtig, das Thema genau zu überwachen, da die flache Kante der Zange auf den ventralen Hals gedrückt wird, um die Luftröhre zu visualisieren. Der Druck von den Zangen wird die Luftröhre ausblenden und Hypoxie verursachen, wenn sie für eine längere Dauer aufrechterhalten wird. Wenn der Patient zyanotisch erscheint, lassen Sie eine kurze Pause für Schleimhäute zu einer rosa Farbe zurückkehren und für die Atmung zu stabilisieren, bevor sich Versuche wiederholen.
Umfangreiche Mausintubationserfahrung war nicht notwendig, um diese Technik durchzuführen. Die häufigsten Komplikationen bei unerfahrenen Personen sind Kehlkopftrauma und Entzündungder der oberen Atemwege aufgrund mehrerer Intubationsversuche. Eine genaue Überwachung ist während der Genesung dieser Patienten erforderlich, da ein medizinisches Eingreifen mit nichtsteroidalen Entzündungshemmern angezeigt werden kann. Wiederholte erfolglose Intubationsversuche können zu Gewebetraumata und Entzündungen der distalen Mundhöhle führen, was zu Lärm in der oberen Atemwege, Dyspnoe, Hypoxämie, längerer Genesung, Unfähigkeit, wiederholte Intubation oder Tod durchzuführen, führen kann.
Für den Fall, dass die Intubation nicht erfolgreich ist, werden mehrere Änderungen empfohlen. Stellen Sie zunächst sicher, dass die Fase der Kanüle glatt, abgerundet und auf die entsprechende Länge für die Größe des Tieres geschnitten ist. Die Abschrägungskante kann mit Schleifpapier geglättet werden, um Gewebetraumata zu minimieren und die Intubation zu erleichtern7. Prüfen Sie außerdem, ob die Kanüle eine leichte Kurve von ca. 15° in einem Drittel Abstand von der Abschrägung aufweist und die Spitze der Kanüle in einem 45°-Winkel abgeschrägt ist, wie in Brown et al.6beschrieben. Überprüfen Sie immer, ob sich der Katheter vor und während der Durchführung dieses Verfahrens in der richtigen Ausrichtung befindet.
Für diese Studie wurden Mäuse für wiederholte Lungenfunktionstests mit einem mechanischen Beatmungssystem intubiert, um Lungenfunktionsmessungen aufzuzeichnen. Eine große, 18 G Kanüle wurde verwendet, um eine enge Dichtung zu schaffen. Um wiederholte Lungenfunktionsstudien an Mäusen mit einem kleineren Trachealdurchmesser aufgrund von Alter oder Belastung durchzuführen, kann es schwierig sein, eine größere Kanüle zu platzieren. Wenn eine kleinere Kanüle für den Einsatz gewählt wird, stellen Sie sicher, dass eine richtige Dichtung noch erreicht werden kann, und dass der Widerstand der Kanüle nicht höher ist als der Widerstand der Atemwege des Probanden10. Eine erfolgreiche tiefe Inflationsstörung ist eine ausreichende Bestätigung für ein geeignetes Siegel. Beachten Sie, dass eine solche Dichtung unnötig ist, wenn nur die Installation von Behandlungen in die Lunge gewünscht wird.
Obwohl die beschriebene Methode Änderungen vorgenommen hat, die äußere Gewebeschäden verhindern, ist die obere Grenze der Häufigkeit der Intubation immer noch eine Funktion des kumulativen Traumas der Glottis und Luftröhren aufgrund übermäßiger Einführung der Kanüle. Die gleichzeitige Überwachung einer Kontrollgruppe auf signifikante Erhöhungen der Atemwegsresistenz während einer Studie wird empfohlen, da Gewebetrauma von Entzündungen begleitet wird, die zu einem verringerten Luminaldurchmesser der Luftröhre führen. Signifikante Erhöhungen des Atemwegswiderstands im Laufe wiederholter Intubationsverfahren wurden in der aktuellen Studie nicht beobachtet. Mäuse blieben für die Studiendauer klinisch normal und die grobe Nekropsie der oberen Atemwegsstrukturen war am Studienschluss bei allen Tieren unauffällig.
Zusammenfassend bietet die beschriebene Intubationstechnik eine nichtinvasive Methode zur Platzierung von Endotrachealkanülen mit minimaler Ausrüstung, einschließlich einer geneigten Oberfläche, Zangen, einer Polypropylenkanüle und Enthaarungsvorräten. Diese verfeinerte Methode ermöglicht wiederholte Intubationsereignisse ohne wiederkehrende Gewebetraumata und Schmerzen im Zusammenhang mit einer hautnahe einschneidenden Stelle am ventralen Hals oder einem Tracheotomieverfahren. Darüber hinaus reduziert diese Methode die Anzahl der Mäuse, die benötigt werden, da einzelne Mäuse im Laufe einer Studie wiederholt intubiert werden können. Es entfällt auch die Notwendigkeit für speziell entwickelte Intubationsrückhalteeinrichtungen, Scopes oder Transilluminating-Geräte für die Visualisierung von Atemwegen. BALB/c- und C57BL/6-Stämme wurden in dieser Studie verwendet, um den Technischer Erfolg sowohl bei hellen als auch bei dunkelpigmentierten Stämmen und Tieren relativ jungen Alters und kleiner Größe (10 bis 20 Wochen alte Mäuse) zu demonstrieren. Diese raffinierte Technik eignet sich für die einmalige oder wiederholte intratracheale Instillation von Verbindungen, Bronchoalveolar-Lavage, Bildgebung oder Lungenfunktionstests. Diese minimalinvasive, vielseitige Methode kann für praktisch jedes Verfahren implementiert werden, das den Zugang zu den unteren Atemwegen erfordert.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Autoren danken Lucia Rosas, Lauren Doolittle, Lisa Joseph und Lindsey Ferguson für ihre technische Unterstützung und den University Laboratory Animal Resources für ihre Tierpflegeunterstützung. Diese Arbeit wird von NIH T35OD010977 und R01-HL102469 finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 G x 1 1/4" intravenous catheter, Safelet | Fisher Scientific | #14-841-14 | Cannula for intubation |
| 70% ethanol, 10 L | Fisher Scientific | 25467025 | Cleaning cannula |
| Abrasive paper (sandpaper) | Porter-Cable | 74001201 | Cannula preparation |
| AnaSed (xylazine sterile solution) injection (100 mg/mL) | Akorn Animal Health | NDC# 59399-111-50 | Anesthesia |
| Blue labeling tape (0.5 in x 14 yds) | Fisher Scientific | 15966 | Restraint on intubation platform |
| Braided silk suture without needle, nonsterile, (3-0) | Henry Schein | Item #1007842 | Intubation platform |
| Deltaphase Isothermal Pad | Braintree Scientific | 39DP | Mouse thermoregulation and recovery |
| Deltaphase Operating Board | Braintree Scientific | 39OP | Mouse recovery (prior to extubation) |
| Distilled water | ThermoFisher | 15230253 | Cleaning mouse following depilation |
| Eye Scissors, angled, sharp/sharp | Harvard Apparatus | 72-8437 | Cannula preparation |
| FlexiVent (FX Module 2) | Scireq | N/A | Record lung function data (not required to perform procedure, used in this study to validate procedure) |
| Gauze sponges | Fisher scientific | 13-761-52 | Hair removal |
| Heavy-Duty 3" 3-Ring View Binders | Staples | 24690CT | Intubation platform |
| Instat Software | Graphpad | N/A | Statistical analysis software |
| Insulin syringe (0.5 cc, U100) | Fisher Scientific | 329461 | Anesthesia administration |
| Ketamine HCl Injection, USP (100 mg/mL) | Llyod Laoratories | List No. 4871 | Anesthesia |
| Lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | Confirm cannula placement |
| Micro Forceps, Curved, Smooth | Harvard Apparatus | 72-0445 | Retract tongue and create tension on neck for cannula visualization |
| Nair (hair removal lotion), 9 oz bottle | Church & Dwight | 42010440 | Hair removal |
| Sterile saline (0.9%), 10 mL | Fisher Scientific | NC9054335 | Anesthesia, cleaning skin following hair removal |
References
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- Rivera, B., Miller, S. R., Brown, E. M., Price, R. E. A Novel Method for Endotracheal Intubation of Mice and Rats Used in Imaging Studies. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 44 (2), 52-55 (2005).
- Sparrowe, J., Jimenez, M., Rullas, J., Martinez, A. E., Ferrer, S. Refined Intratracheal Intubation Technique in the Mouse, Complete Protocol Description for Lower Airway Models. Global Journal of Animal Scientific Research. 3 (2), 363-369 (2015).
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