Summary
Bu makalenin amacı, laboratuvar faresinin entübasyonunun rafine bir yöntemini açıklamaktır. Yöntem noninvaziv ve bu nedenle, solunum fonksiyonu ve / veya akciğer içine tedavilerin indaşseri izleme gerektiren çalışmalar için idealdir.
Abstract
Literatürde fare entübasyonu için ya ağız boşluğu ndan glottisin görüntülenmesi ya da nefes borusunda kanül yerleşiminin doğrudan doğrulanması için ventral boyundaki kesi gerektiren çeşitli yöntemler açıklanmaktadır. Bu tür işlemlerle konuya bağlı göreceli zorluk veya doku travması, bir araştırmacının uzunlamasına çalışmalar yapabilmesine engel teşkil edebilir. Bu makalede, ventral boyun saç kaldırmak için bir depilatörü nardından sonra farenin fiziksel manipülasyon ne olursa olsun cilt derecesi ne olursa olsun orotracheal entübasyon için trakea transkutanöz görselleştirme izin veren bir teknik göstermektedir Pigmentasyon. Bu yöntem konuya zararsızdır ve sınırlı bir mürin anatomisi anlayışı ile kolayca elde edilir. Bu rafine yaklaşım, hastalığın ilerlemesini veya tedavilerin indatılması için gerekli olabilecek tekrarlanan entübasyonu kolaylaştırır. Bu yöntemin kullanılması, solunum yolu hastalıklarının fare modellerinde akciğer fonksiyonunu ölçmek için gerekli olan hayvan sayısının azalmasına ve teknik beceriye neden olabilir.
Introduction
Laboratuvar fareinsan solunum hastalığı için ortak bir hayvan modelidir. Bu nedenle, hem tedavilerin instillasyonu hem de solunum mekaniğinin ölçümü amacıyla fare entübasyonu için yayınlanmış çeşitli yöntemler bulunmaktadır. Açıklanan prosedürlerin çoğu bir laringoskop veya fiber optik ışıkkaynağı1,2,3,4,5,6,7gibi özel ekipman ile ağız boşluğu ile glottis görselleştirme gerektirir., Ancak, bu nispeten büyük bir kanül gerekli olduğunda zor olabilir, bu araştırmacının görünümünü gizlemek gibi. Limjunyawong ve ark.8 hangi küçük bir kutanöz kesi trakea görselleştirme için izin ventral boyun orta hattı boyunca yapılır entübasyon yöntemi ile bu endişe ele almış. İşlemin ardından kesi doku yapıştırıcısı ile kapatılır.
Sık tekrarlanan entübasyonlar gerektiren çalışmalar için, ardışık intübasyon ve bu sitenin kapatılması cilt marjları ve ventral boyun doku travması debridman gerektirir. Oral entübasyona transkutanöz trakeal görüntüleme yaklaşımının amacı, farelerde tek entübasyon olaylarının yanı sıra tekrarlanan entübasyon çalışmaları için özel olarak uygun olan rafine, noninvaziv bir teknik sunmaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan tüm hayvan faaliyetleri Ohio State Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır ve AAALAC onaylı tesislerde gerçekleştirilmiştir.
1. Prosedür Hazırlığı
- Entübasyon platformunu oluştur. Uygun platform eğimini elde etmek için, üç inç (7,6 cm) 3 halkalı bağlayıcı kullanın. 15−20 cm uzunluğunda 3-0 ipek veya diğer iplik malzemesini ikiye katlayın ve bir süspansiyon halkası oluşturmak için ipliğin uçlarını bantla eğimli platformun tepesine yapıştırın (Şekil 1).
- Uygun boyut ve uzunlukta bir kanül seçin.
NOT: 20−30 g fare için 1−1,5 inç (2,5−3,8 cm) uzunluğunda bir kateter 18 G'ye kadar kullanılabilir. Bu çalışmada 18 haftalık dişi BALB/c ve 10 haftalık C57BL/6 fare (n = 3 her tür) kullanıldı. Opak beyaz kateter kılıfı en iyi transkutanöz görüntülemeyi sağlar. - Kateterin distal ucundabir kesve alın ve yuvarlak bir yontma ucu oluşturmak için aşındırıcı kağıt ile kesme yüzeyini düzleştirin. Kanülde eğimli yaklaşık 1 cm'lik hafif bir büküm yavaşça oluşturun (Şekil 2).
NOT: Her fare için yeni bir kateter kullanılmalıdır. - Ketamin (5.4 mg/g vücut ağırlığı) ve intraperitoneal olarak uygulanan ksilazin (16 g/g vücut ağırlığı) ile fareyi anestezi edin. Gözlere steril oftalmit merhem uygulayın.
NOT: Uygun anestezik derinlik, farenin sağlam bir parmak sıkışmasına yanıt verilmemesi ile elde edilir. - Entübasyon platformunda, açılı yüzeyin üst kısmındaki ipek ipliğin etrafındaki üst kesici dişleri bağlayarak fareyi entübasyon platformunda supine pozisyonunda askıya alın(Şekil 3). Fare dorsal recumbency kare konumlandırılmış sonra, yavaşça kuyruk tabanını kavramak ve masaya doğru kuyruk geri çekmek. Fareyi sabitlemek için kuyruk tabanına bir bant parçası yerleştirin.
- 30−45 s için ventral servikal bölgeye tüy dökücü krem(Tablo)uygulayın sonra kuru bir gazlı bez kullanarak servikal bölgeden tüm tüy dökücü krem çıkarın. Gerekirse başvuru işlemini tekrarlayın. Iyice tuzlu veya distile su ile cilt durulayın sonra kuru silin herhangi bir kalıntı kaldırmak için.
2. Entübasyon Prosedürü
- Kanülün tanıtımı için ağzı yeterince açarak dili yavaşça geri çekmek için baskın olmayan elde düz, düz forseps kullanın.
NOT: Fare diş prizi kullanılmamalıdır, çünkü bu dilin zarar görmesine neden olur. - Baskın el ile, hafif viraj distal olan ucu konunun ağzının çatı karşı olacak şekilde ağız içine kanül ilerlemek.
- Dili bırakın ve kapalı çalgılardüz kenarı manubrium ulaşıncaya kadar ventral boyun boyunca caudally kaydırın. Bu hareket yanal tükürük bezleri yerinden ve trakea kapsayan kas düzleştirir. Trakea transkutan olarak beyaz bir çizgi olarak görünür (Şekil 3A). Gerekirse, kaudal yönde bir deri üzerinde gerginlik korurken bir kraniodorsal yönde forceps döndürmek yanal yerinden tükürük bezleri zirveye neden. Bu manevra trakea etrafında daha fazla kontrast oluşturur (Şekil 3B).
NOT: Nefes borusunu çökertebileceği ve solunumu bozabileceği nden ventral boyunda aşırı güç kullanmaktan kaçının. - Aynı anda bilek eşzamanlı fleksiyon ile baskın el insupination tarafından kanül ventrally distal ucu olta ise kanül ilerletin.
- Kanülün doğru yerleştirilmesi, opak kanülün trakeadaki görselleştirilmesiile gösterilir (Şekil 4B,D). Kanül, masseter kasının kökeni nin seviyesini geçtiyse ve kanülün nefes borusundaki görselleştirme onaylanmamışsa, kanülü geri alın ve manevrayı yeniden dene.
- Kanüle bir akciğer şişirme ampulü bağlayarak ve cihazın eşzamanlı depresyonu ile torasik genişleme gözlemleyerek uygun kanül yerleşimi doğrulayın.
- Kanül yerinden olmadan, farenin kesici kesici lerini entübasyon platformundan dikkatlice çözün. Fareyi yatay bir platforma(Malzeme Tablosu)taşıyın ve kanülü vantilatörün üzerindeki adaptöre takın. Derin enflasyon uzerine fareyi 60 s için havalandırın ve solunum direncini ölçer.
3. Kurtarma
- Yordam tamamlandıktan sonra fareyi ısıtılmış bir platforma taşıyın. Spontan solunumu teşvik etmek için ışık altı veya kuyruk puşları ile sürekli uyarım sağlayın.
- Ekstübasyon fare sadece çiğnemeye başladığında oluşabilir. Kavunu göbek seviyesinde tutun ve kanül deneğin ağzından tamamen çıkarılana kadar tüpü yavaşça ve fareden çekin.
NOT: İyileşme sürecinde mümkün olduğunca uzun süre sert kanül ile hava yolu desteği sağlamak tercih edilir. - Bir kez extübasyon, ısı desteği ile temiz bir kurtarma kafesi için fare aktarın. Fareyi tamamen ambulatuar olana ve kurtarma tamamlanana kadar sürekli olarak izleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bazal pulmoner fonksiyonun seri takibi
On sekiz haftalık dişi BALB/c ve 10 haftalık C57BL/6 fareler (her bir türün n = 3'ü) belirtilen yöntem kullanılarak 0, 3, 10 ve 17. Her gün entübasyon sonrasında, konu % 100 oksijen(Tablo Malzemeler)ile birlikte verilen mekanik bir ventilatöre bağlandı. Solunum direnci (Rrs) 5 s için düzenlenen 25 cm H2O derin bir enflasyon sonrasında 60 s için zorunlu salınım tekniği kullanılarak ölçüldü. Fizyolojik aralıktaki Rrs değerleri ile birlikte bu sürekli nefes tutma ile ilgili hiçbir yazılım hatası kanül uygun yerleşim için ek destek sağlar. Veriler, her bir zorlanmaiçinde zaman noktaları arasında gözlenen ölçülen Rr'lerin anlamlı bir farkını ortaya koymuştur(Şekil 5). Bu zaman içinde Rrs bir artış yokluğu dört ardışık zaman noktaları üzerinde solunum sisteminde travma ile ilişkili inflamasyon eksikliği gösterir varsayılır.
İstatistiksel analiz
Tanımlayıcı istatistikler (ortalama ve standart hata) istatistiksel analiz yazılımı(Tablo)kullanılarak hesaplanmıştır. Kolmogorov-Smirnov yöntemi Gaussian veri dağıtımını doğrulamak için kullanılmıştır. Veri kümelerinin istatistiksel analizleri eşleşmemiş ANOVA tarafından yapıldı ve bir post hoc Tukey-Kramer çoklu karşılaştırma sonrası test ile. Tüm veriler ortalama ± SEM. P < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı olarak sunulmuştur.
Şekil 1: Entübasyon platformu. Entübasyon platformu, bir süspansiyon döngüsü oluşturmak için bağlayıcının üstüne yapıştırılı ipek iplik halkası olan üç halkalı bir bağlayıcıdan oluşur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kanül hazırlığı. (A) Hazırlanan kanülün yanal görünümü. Kateterin distal ucundaki yuvarlak yamaçtan yaklaşık 1 cm'lik oluşan nazik açıya ve kanülün açısının açıya göre yönünü unutmayın. (B) Hazırlanan kanülün Dorsoventral görünümü. Yonca'nın yuvarlak ve düzgünleştirilmiş kenarına dikkat edin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Trakeal görselleştirme. (A) Forceps ventral boyun yerleştirilir ve cilt yavaşça tükürük bezleri yerinden ve ventral orta hat (siyah ok) üzerinde beyaz bir yapı olarak trakea görselleştirme sağlamak için caudally geri çekilir. (B) Ventral boyun daki forceps'un kraniodorsal rotasyonu tükürük bezlerinin çıkıntısını oluşturur (*). Trakea tükürük bezleri (siyah ok) arasında ventral orta hat üzerinde beyaz lineer yapı olarak görselleştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Uygun kanül yerleşimi. (A) C57BL/6 fare entübasyon platformu üzerinde bulunan kanül proksimal oral kaviteye tanıtıldı. (B) C57BL/6 fare kanül ile düzgün trakea yerleştirilir. Kanülkolayca trakea (beyaz ok) içinde beyaz yapı olarak görselolabilir unutmayın. (C) BALB/c fare entübasyon panosuna yerleştirilmiş kanül ile proksimal oral kaviteye sokuldu. (D) BALB/c fare kanülile düzgün trakea yerleştirilir. Beyaz kanül nefes borusu (siyah ok) içinde kolayca görüntülenebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Direncin seri ölçümü. Ölçülen Rrs anlamlı farklılıklar her zorlanma içinde zaman noktaları arasında gözlenmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Transkutanöz trakeal görme tekniği kullanılarak entübasyon, standart deri kesi yöntemine rafine bir yaklaşım sunar. Birkaç önemli adıma özel dikkat ile, entübasyon kolayca ve hızlı bir şekilde elde edilebilir. Hayvan, entübasyon platformunda fare nin nazik bir şekilde geri çekilmesi ile dorsal recumbency'ye kare olarak yerleştirilmelidir. Bu dikey hizalama ve entübasyon için uygun konumlandırma içine hayvan genişletecektir. Buna ek olarak, tüy dökücü krem 30−45 s'den daha uzun süre hayvanın cildiile temas halinde kalmamalı ve tüm kalıntıların tamamen temizlenmesi için iyice durulanmalıdır. Depilatif krem ile genişletilmiş cilt teması hayvan için gereksiz ağrıya neden olur ve ülserasyonlar trakea görünümünü engelleyebilir9. Baskın el kateteri glottisin içine soktukça uygun bilek hareketini kullanmak zorunludur. El supinasyon hareketi yle hareket ederken baskın bilek esnemelidir. Çerkezin düz kenarı nefes borusunu görselleştirmek için ventral boyuna basıldığından, konuyu yakından izlemek de önemlidir. Forsepsbasınç uzun bir süre için muhafaza edilirse trakea tıkanır ve hipoksiye neden olur. Hasta siyanotik görünürse, mukus membranları için kısa bir duraklama pembe bir renk dönmek ve solunum girişimleri tekrarlamadan önce stabilize etmek için izin verin.
Bu tekniği gerçekleştirmek için kapsamlı fare entübasyon deneyimi gerekli değildi. Deneyimsiz bireylerde en sık görülen komplikasyonlar arasında çoklu entübasyon girişimlerine bağlı laringeal travma ve üst solunum yolu iltihabı sayılabilir. Steroid olmayan anti-enflamatuarlar ile tıbbi müdahale belirtilen gibi bu hastaların iyileşmesi sırasında yakın izleme gereklidir. Tekrarlanan başarısız entübasyon girişimleri doku travması ve distal oral kavitenin iltihabıile sonuçlanabilir, bu da üst solunum gürültüsü, dispne, hipoksemi, uzun süreli iyileşme, tekrarlanan entübasyon veya ölüme neden olabilir.
Entübasyonun başarılı olmaması durumunda çeşitli değişiklikler önerilir. İlk olarak, kanül yontma pürüzsüz olduğundan emin olun, yuvarlak ve hayvanın boyutu için uygun uzunlukta kesilmiş. Bevel kenarı doku travmasını en aza indirmek ve entübasyon kolaylaştırmak için aşındırıcı kağıt kullanılarak düzeltilebilir7. Buna ek olarak, kanül yaklaşık 15 ° eğimli ve kanül ucu bir üçte bir mesafede hafif bir eğri sergiler kontrol edin Brown ve ark.6açıklandığı gibi 45 ° açıyla eğimli . Bu işlemi gerçekleştirmeden önce ve yaparken kateterin uygun yönde olup olmadığını her zaman kontrol edin.
Bu çalışmada, fareler akciğer fonksiyon ölçümleri kaydetmek için mekanik bir ventilasyon sistemi kullanılarak tekrarlanan akciğer fonksiyon testleri için entübe edildi. Büyük, 18 G kanül sıkı bir mühür oluşturmak için kullanılmıştır. Yaş veya zorlanma nedeniyle daha küçük bir trakeal çapı olan fareler üzerinde tekrar akciğer fonksiyon çalışmaları gerçekleştirmek için, daha büyük bir kanül yerleştirmek zor olabilir. Daha küçük bir kanül kullanım için seçilirse, uygun bir mühür hala elde edilebilir emin olun, ve kanül direnci test deneğin in ana yolu10direnci daha yüksek değildir . Başarılı bir derin enflasyon tedirginliği uygun bir mühür yeterli onaydır. Sadece akciğeriçine tedavilerin montajı isteniyorsa böyle bir mühür gereksiz olduğunu unutmayın.
Açıklanan yöntem dış doku hasarını önleyen değişiklikler yapmış olsa da, kanülün aşırı girişi nedeniyle glottis ve trakeada kümülatif travmanın üst sınırı hala bir fonksiyondur. Doku travması trakeanın luminal çapının azalmasına neden olacak iltihap eşlik ettiği için, bir çalışma sırasında hava yolu direncinde önemli artışlar için bir kontrol grubunun eşzamanlı olarak izlenmesi önerilir. Mevcut çalışmada tekrarlanan entübasyon prosedürleri boyunca hava yolu direncinde önemli artışlar gözlenmemiştir. Fareler çalışma süresi boyunca klinik olarak normal kalmıştır ve üst hava yolu yapılarının brüt nekropsisi tüm hayvanlarda çalışma sonucunda dikkate değer değildi.
Özetle, açıklanan entübasyon tekniği eğimli yüzey, forseps, polipropilen kanül ve tüydökücü malzemeleri de dahil olmak üzere minimal ekipman ile endotrakeal kanüller yerleştirmek için noninvaziv bir yöntem sunuyor. Bu rafine yöntem tekrarlayan doku travması ve ventral boyun veya trakeotomi prosedürü bir kutanöz insizyon sitesi ile ilişkili ağrı olmadan tekrarlanan entübasyon olayları sağlar. Buna ek olarak, bu yöntem tek tek fareler bir çalışma boyunca tekrar tekrar entübe edilebilir gerekli fare sayısını azaltır. Ayrıca, hava yolu görselleştirmesi için özel olarak tasarlanmış entübasyon kısıtlama cihazları, kapsamlar veya transilluminating ekipmanı ihtiyacını da ortadan kaldırır. Bu çalışmada BALB/c ve C57BL/6 suşları, nispeten genç ve küçük boyutlu (10−20 haftalık fareler) hem açık hem de koyu pigmentli suşlarda ve hayvanlarda teknik başarıyı göstermek için kullanılmıştır. Bu rafine teknik bileşiklerin tek veya tekrarlanan intratrakeal instillasyon, bronkoalveoler lavaj, görüntüleme veya akciğer fonksiyon testi için uygundur. Bu minimal invaziv, çok yönlü yöntem alt solunum yolu erişim gerektiren hemen hemen her prosedür için uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar Lucia Rosas, Lauren Doolittle, Lisa Joseph ve Lindsey Ferguson'a teknik yardımları ve Üniversite Laboratuvarı Hayvan Kaynakları'na hayvan bakım destekleri için teşekkür ediyorlar. Bu çalışma NIH T35OD010977 ve R01-HL102469 tarafından finanse edilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 G x 1 1/4" intravenous catheter, Safelet | Fisher Scientific | #14-841-14 | Cannula for intubation |
| 70% ethanol, 10 L | Fisher Scientific | 25467025 | Cleaning cannula |
| Abrasive paper (sandpaper) | Porter-Cable | 74001201 | Cannula preparation |
| AnaSed (xylazine sterile solution) injection (100 mg/mL) | Akorn Animal Health | NDC# 59399-111-50 | Anesthesia |
| Blue labeling tape (0.5 in x 14 yds) | Fisher Scientific | 15966 | Restraint on intubation platform |
| Braided silk suture without needle, nonsterile, (3-0) | Henry Schein | Item #1007842 | Intubation platform |
| Deltaphase Isothermal Pad | Braintree Scientific | 39DP | Mouse thermoregulation and recovery |
| Deltaphase Operating Board | Braintree Scientific | 39OP | Mouse recovery (prior to extubation) |
| Distilled water | ThermoFisher | 15230253 | Cleaning mouse following depilation |
| Eye Scissors, angled, sharp/sharp | Harvard Apparatus | 72-8437 | Cannula preparation |
| FlexiVent (FX Module 2) | Scireq | N/A | Record lung function data (not required to perform procedure, used in this study to validate procedure) |
| Gauze sponges | Fisher scientific | 13-761-52 | Hair removal |
| Heavy-Duty 3" 3-Ring View Binders | Staples | 24690CT | Intubation platform |
| Instat Software | Graphpad | N/A | Statistical analysis software |
| Insulin syringe (0.5 cc, U100) | Fisher Scientific | 329461 | Anesthesia administration |
| Ketamine HCl Injection, USP (100 mg/mL) | Llyod Laoratories | List No. 4871 | Anesthesia |
| Lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | Confirm cannula placement |
| Micro Forceps, Curved, Smooth | Harvard Apparatus | 72-0445 | Retract tongue and create tension on neck for cannula visualization |
| Nair (hair removal lotion), 9 oz bottle | Church & Dwight | 42010440 | Hair removal |
| Sterile saline (0.9%), 10 mL | Fisher Scientific | NC9054335 | Anesthesia, cleaning skin following hair removal |
References
- Spoelstra, E. N., et al. A novel and simple method for endotracheal intubation of mice. Laboratory Animals. 41 (1), 128-135 (2007).
- Rivera, B., Miller, S. R., Brown, E. M., Price, R. E. A Novel Method for Endotracheal Intubation of Mice and Rats Used in Imaging Studies. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 44 (2), 52-55 (2005).
- Sparrowe, J., Jimenez, M., Rullas, J., Martinez, A. E., Ferrer, S. Refined Intratracheal Intubation Technique in the Mouse, Complete Protocol Description for Lower Airway Models. Global Journal of Animal Scientific Research. 3 (2), 363-369 (2015).
- Deyo, D. J., Wei, J. A Novel Method of Intubation and Ventilation in Mice. Anesthesia & Analgesia. 88 (2), 179 (1999).
- Vergari, A., et al. A new method of orotracheal intubation in mice. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 8 (3), 103-106 (2004).
- Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice. Journal of Applied Physiology. 87 (6), 2362-2365 (1999).
- Das, S., MacDonald, K., Chang, H. S., Mitzner, W. A Simple Method of Mouse Lung Intubation. Journal of Visualized Experiments. (73), e50318 (2013).
- Limjunyawong, N., Mock, J., Mitzner, W. Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research. Journal of Visualized Experiments. (102), e52964 (2015).
- Qin, W., Baran, U., Wang, W. Lymphatic response to depilation-induced inflammation assessed with label-free optical lymphangiography. Lasers in Surgery and Medicine. 47 (8), 669-676 (2015).
- McGovern, T. K., Robichaud, A., Fereydoonzad, L., Schuessler, T. F., Martin, J. G. Evaluation of Respiratory System Mechanics in Mice using the Forced Oscillation Technique. Journal of Visualized Experiments. (75), e50107 (2013).
