Summary
本文的目的是描述实验室小鼠插管的精细方法。该方法是非侵入性的，因此非常适合需要对呼吸功能进行连续监测和/或将治疗灌输到肺部的研究。
Abstract
文献描述了几种小鼠插管方法，这些方法要么需要通过口腔对glottis进行可视化，要么要求在腹腔颈部进行切口的可视化，以便直接确认气管中的切口位置。此类程序对受试者引起的相对困难或组织创伤可能妨碍调查员进行纵向研究的能力。本文演示了一种技术，即使用脱毛器从腹腔颈部去除毛发后对小鼠进行物理操作，无论皮肤程度如何，气管的截皮可视化都可用于排泄管。色素 沉着。这种方法对主体无害，对鼠解剖结构的理解有限，很容易实现。这种精细的方法有助于反复插管，这可能是监测疾病进展或灌输治疗的所必需的。使用这种方法可能会减少在呼吸疾病小鼠模型中测量肺功能所需的动物数量和技术技能。
Introduction
实验鼠是人类呼吸道疾病的常见动物模型。因此，有几种已公布的小鼠插管方法，用于灌输治疗和测量呼吸力学。大部分所述程序要求透过口腔对牙洞进行化形，并配备专用设备，例如喉镜或光纤光源121、2、3、4、5、6、7。5,6,73,4,,,然而，当需要相对较大的管条时，这可能很困难，因为它会模糊研究人员的观点。Limjunyawong等人8日用插管的方法解决了这个问题，在插管方法中，沿着腹腔颈的中线进行小切口，以便对气管进行可视化。手术后，切口用组织胶粘剂封闭。
对于需要频繁重复插管的研究，该部位的连续切口和关闭需要使皮肤边缘和腹腔颈的组织创伤被除污。口服插管的跨皮气管可视化方法的目的是提供一种精细的非侵入性技术，专门适用于小鼠的重复插管研究以及单插管事件。
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Protocol
此处描述的所有动物活动均已获得俄亥俄州立大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准，并在 AAALAC 认可的设施中进行。
1. 程序准备
- 构建插管平台。要达到适当的平台斜率，请使用三英寸（7.6 厘米）3 环活页夹。将 15⁄20 厘米长的 3-0 丝或其他螺纹材料折成两半，用胶带将螺纹的末端粘附到倾斜平台的顶部，以创建悬架环（图 1）。
- 选择适当尺寸和长度的管条。
注：对于 20×30 g 的鼠标，可以使用 1±1.5 英寸（2.5*3.8 厘米）长导管，最高可达 18 G。在这项研究中，使用了18周大的雌性BALB/c和10周大的C57BL/6小鼠（每株3只）。不透明的白色导管护套可提供最佳的截皮可视化效果。 - 在导管的远端切割斜角，用磨料纸平滑切割表面，以创建圆角尖。轻轻地在从斜面约 1 厘米的导管中创建一个轻微的弯曲（图 2）。
注：每只鼠标都应使用新的导管。 - 用氯胺酮（5.4毫克/克体重）和锡拉辛（16微克/克体重）对小鼠进行内腹施用。 将无菌性眼皮药膏涂在眼睛上。
注：适当的麻醉深度是通过鼠标对坚定的脚趾捏缺乏反应来实现的。 - 通过将上切口钩在倾斜表面顶部的丝线周围的上切口，将鼠标悬挂在插管平台上的上部位置（图 3）。一旦鼠标被完全定位在背底中，轻轻抓住尾部的底座，将尾巴缩向桌子。将一块胶带放在尾部底部，以固定鼠标。
- 将脱毛霜 （材料表） 涂抹到腹腔颈区域 30~45 s，然后用干纱布从颈椎区域去除所有脱毛霜。如果需要，请重复申请过程。用盐水或蒸馏水彻底冲洗皮肤，去除任何残留物，然后擦干。
2. 插管程序
- 使用非显性手的直、平钳轻轻缩回舌头，以充分张开嘴以引入导管。
注：不应使用大鼠牙钳，因为这将损坏舌头。 - 用占优势的手，将导管推进到嘴上，使与轻微弯曲的末端对主体的嘴的屋顶。
- 松开舌头，沿着腹腔颈部滑动封闭钳子的平边，直到达到止动膜。这个运动横向取代唾液腺和扁平覆盖气管的肌肉。气管看起来像白线（图3A）。如有必要，将钳子旋转至颅骨方向，同时保持皮肤上的紧张方向，使横向置换的唾液腺达到峰值。这种策略在气管周围产生更多的对比度（图3B）。
注：避免腹腔颈部过度用力，因为它会使气管破裂并损害呼吸。 - 推进导管，同时通过同时弯曲手腕的主导手，将导管口的远端倾斜。
- 气管中不透明管的可视化表明管状管的正确位置（图4B，D）。如果管状物已推进超过按摩体肌肉的起源水平，气管中管状体的可视化尚未确认，则收回导管并重新尝试操作。
- 通过将肺充气灯泡连接到导管，并观察胸腔扩张与器件的并发凹陷，确认适当的导管放置。
- 在不取代导管的情况下，小心地将鼠标的切口从插管平台上拔下。将鼠标移到水平平台（材料表），然后将导管插入呼吸机上的适配器。深膨胀后，给鼠标通风60度，然后测量呼吸阻力。
3. 恢复
- 该过程完成后，将鼠标移动到加热平台。通过轻脚趾或尾捏提供恒定的刺激，以鼓励自发呼吸。
- 当鼠标开始咀嚼时，可能会出现排泄。抓住轮毂水平的导管，轻轻拉管，然后从鼠标上拉开，直到导管从主体的嘴上完全取下。
注：在回收过程中，最好在恢复过程中尽可能长时间地使用硬质管提供气道支撑。 - 一旦被切除，将鼠标转移到一个干净的回收笼与热支持。持续监控鼠标，直到鼠标完全流动，恢复完成。
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Representative Results
基线肺功能的串行监测
18周大的雌性BALB/c和10周大的C57BL/6小鼠（每株中的3只）在第0天、3日、10日和17日使用所述方法插管。每天插管后，受试者连接到一个机械呼吸机，提供100%氧气（材料表）。呼吸阻力 （Rrs） 在深膨胀到 25 厘米 H2O 保持 5 s 后，使用强制振荡技术测量了 60 s。与这种持续呼吸保持和生理范围内的Rrs值相关的软件错误为正确放置导管提供了额外的支持。数据显示，每个应变内的时间点之间观察到的测量 Rrs 没有显著差异（图 5）。假定Rrs随时间长期没有增加，表明呼吸系统连续四个时间点缺乏与创伤相关的炎症。
统计分析
使用统计分析软件（材料表）计算描述性统计（均值和标准误差）。科尔莫戈罗夫-斯米尔诺夫方法用于验证高斯数据分布。数据集的统计分析由未配对的ANOVA进行，在测试后进行后临时图基-克莱默多重比较。所有数据均以平均值表示 = SEM. P < 0.05 被视为具有统计显著性。
图 1：插管平台。插管平台由三环活页夹组成，其丝线环粘附在活页夹顶部，以创建悬架环。请点击此处查看此图形的较大版本。
图2：导流器制备。（A） 准备管的横向视图。请注意，从导管远端的圆斜角创建的柔和角度约为 1 厘米，管护角相对于斜面的方向。（B） 准备管的多索芬纳观点。请注意斜面的圆角和平滑边。请点击此处查看此图形的较大版本。
图 3：气管可视化。（A） 钳子被放置在腹腔颈部，皮肤被轻轻缩回，以横向取代唾液腺，并提供气管的可视化作为一个白色的结构在腹腔中线（黑色箭头）。（B） 腹颈上钳子的颅骨旋转产生唾液腺的突起 （*）。气管被可视化为唾液腺之间心室中线的白色线性结构（黑色箭头）。请点击此处查看此图形的较大版本。
图 4：适当的管状放置。（A） C57BL/6 鼠标位于插管平台上，将导管引入近端口腔。（B） C57BL/6 鼠标，管状管正确放置在气管中。请注意，管状管可以很容易地可视化为气管内的白色结构（白色箭头）。（C） BALB/c 鼠标位于插管板上，带有引入近端口腔的导管。（D） BALB/c 鼠标与气管正确放置。在气管（黑色箭头）内，可轻松可视化白色管状管。请点击此处查看此图形的较大版本。
图 5：电阻的串行测量。在每个应变内的时间点之间观察到测量的 Rrs 没有显著差异。请点击此处查看此图形的较大版本。
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Discussion
采用横皮气管可视化技术的插管技术为标准皮肤切口方法提供了一种精细的方法。特别注意几个关键步骤，可以轻松快速地实现插管。动物必须被放置在插管平台上的背底中，用轻柔的回缩固定。这将延长动物到垂直对齐和适当的定位插管。此外，脱毛霜不应与动物的皮肤接触超过30~45s，并应彻底冲洗以清除所有残留物。延长皮肤接触脱毛霜会造成不必要的疼痛的动物和溃疡可以阻碍气管9的看法。使用适当的手腕运动是势在必行的，因为显性手将导管引入glottis。占主导地位的手腕应该弯曲，而手在supis运动移动。当钳子的平边压在心内颈部以可视化气管时，密切监视主体也至关重要。来自钳子的压力将阻塞气管，如果长期保持，会导致缺氧。如果患者出现青色，允许暂时暂停粘膜返回到粉红色，呼吸稳定，然后再重复尝试。
执行此技术不需要广泛的鼠标插管体验。在缺乏经验的个人最常见的并发症包括喉外伤和上气道炎症由于多次插管尝试。密切监测是有必要在这些患者的恢复过程中，作为医疗干预与非类固醇抗炎药可能指示。反复不成功的插管尝试可能导致组织创伤和远端口腔炎症，这可能导致上呼吸道噪音、呼吸困难、低氧血症、长期恢复、无法重复插管或死亡。
如果插管不成功，建议进行多次修改。首先，确保割管的斜面光滑、圆润，并切割到动物大小的适当长度。斜面边缘可以使用磨料纸进行平滑，以尽量减少组织创伤，促进插管7。此外，检查在距离斜面三分之一的距离处，导管是否呈现出约15°的轻微曲线，并且导管的尖端以 45° 角斜线，如 Brown 等人 6所述。在执行此过程之前和期间，始终检查导管是否处于正确方向。
在这项研究中，小鼠管，使用机械通风系统进行重复肺功能测试，以记录肺功能测量。一个大的，18G的密封器被用来创建一个紧密的密封。要对由于年龄或应变而气管直径较小的小鼠进行重复肺功能研究，放置较大的管状管可能具有挑战性。如果选择较小的导管供使用，请确保仍能达到适当的密封，并且导管的电阻不高于测试主体气道10的电阻。成功的深层通货膨胀扰动是适当密封的充分确认。请注意，如果只需要将治疗安装到肺部，则不需要这种密封。
虽然所述方法已进行了防止外部组织损伤的修改，但插管频率的上限仍然是由于过度引入导管而对腺炎和气管的累积创伤。建议在研究期间同时监测对照组气道阻力显著增加，因为组织创伤伴有炎症，导致气管的亮度直径降低。在重复插管过程中，气道阻力显著增加，在目前的研究中没有观察到。小鼠在研究期间保持临床正常状态，而所有动物的研究结论中，上气道结构的粗尸检并不显著。
总之，所述插管技术提供了一种非侵入性方法，用于将内切管管与最小的设备，包括倾斜表面、钳子、多丙烯管和脱毛用品。这种精制方法允许重复插管事件，没有复发性组织创伤和疼痛与腹腔颈部的切口部位或气管切开手术相关。此外，这种方法减少了所需的小鼠数量，因为单个小鼠在整个研究过程中可能会反复插管。它还消除了用于气道可视化的插管约束装置、示波器或转体设备的需求。BALB/c和C57BL/6菌株用于证明在较小和体积较小（10~20周老鼠）的浅色和深色色素菌株和动物的技术成功。这种精制技术适用于化合物的单次或重复腹内灌输、支气管切开、成像或肺功能测试。这种微创、多功能的方法几乎可以用于任何需要进入下呼吸道的程序。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢露西娅·罗莎斯、劳伦·杜利特尔、丽莎·约瑟夫和林赛·弗格森的技术援助，感谢大学实验室动物资源组织对动物保护的支持。这项工作由NIH T35OD010977和R01-HL102469资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 G x 1 1/4" intravenous catheter, Safelet | Fisher Scientific | #14-841-14 | Cannula for intubation |
| 70% ethanol, 10 L | Fisher Scientific | 25467025 | Cleaning cannula |
| Abrasive paper (sandpaper) | Porter-Cable | 74001201 | Cannula preparation |
| AnaSed (xylazine sterile solution) injection (100 mg/mL) | Akorn Animal Health | NDC# 59399-111-50 | Anesthesia |
| Blue labeling tape (0.5 in x 14 yds) | Fisher Scientific | 15966 | Restraint on intubation platform |
| Braided silk suture without needle, nonsterile, (3-0) | Henry Schein | Item #1007842 | Intubation platform |
| Deltaphase Isothermal Pad | Braintree Scientific | 39DP | Mouse thermoregulation and recovery |
| Deltaphase Operating Board | Braintree Scientific | 39OP | Mouse recovery (prior to extubation) |
| Distilled water | ThermoFisher | 15230253 | Cleaning mouse following depilation |
| Eye Scissors, angled, sharp/sharp | Harvard Apparatus | 72-8437 | Cannula preparation |
| FlexiVent (FX Module 2) | Scireq | N/A | Record lung function data (not required to perform procedure, used in this study to validate procedure) |
| Gauze sponges | Fisher scientific | 13-761-52 | Hair removal |
| Heavy-Duty 3" 3-Ring View Binders | Staples | 24690CT | Intubation platform |
| Instat Software | Graphpad | N/A | Statistical analysis software |
| Insulin syringe (0.5 cc, U100) | Fisher Scientific | 329461 | Anesthesia administration |
| Ketamine HCl Injection, USP (100 mg/mL) | Llyod Laoratories | List No. 4871 | Anesthesia |
| Lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | Confirm cannula placement |
| Micro Forceps, Curved, Smooth | Harvard Apparatus | 72-0445 | Retract tongue and create tension on neck for cannula visualization |
| Nair (hair removal lotion), 9 oz bottle | Church & Dwight | 42010440 | Hair removal |
| Sterile saline (0.9%), 10 mL | Fisher Scientific | NC9054335 | Anesthesia, cleaning skin following hair removal |
References
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