Summary
O objetivo deste artigo é descrever um método refinado de intubação do rato de laboratório. O método é não invasivo e, portanto, ideal para estudos que requerem monitoramento serial da função respiratória e/ou instilação de tratamentos no pulmão.
Abstract
A literatura descreve vários métodos para intubação de camundongos que requerem visualização da grunagem através da cavidade oral ou incisão no pescoço ventral para confirmação direta da colocação da cânula na traqueia. A dificuldade relativa ou o trauma tecidual induzido ao sujeito por tais procedimentos pode ser um impedimento para a capacidade do pesquisador de realizar estudos longitudinares. Este artigo ilustra uma técnica na qual a manipulação física do camundongo após o uso de um depilatório para remover cabelos do pescoço ventral permite a visualização transcutânea da traqueia para intubação orotraqueal, independentemente do grau da pele Pigmentação. Este método é inócuo ao sujeito e facilmente alcançado com uma compreensão limitada da anatomia murina. Essa abordagem refinada facilita a intubação repetida, que pode ser necessária para monitorar a progressão da doença ou a instilação dos tratamentos. O uso deste método pode resultar em uma redução do número de animais e habilidade técnica necessária para medir a função pulmonar em modelos de camundongos de doenças respiratórias.
Introduction
O rato de laboratório é um modelo animal comum para doenças respiratórias humanas. Assim, existem vários métodos publicados para a intubação do rato para fins tanto de instilação de tratamentos quanto de medição da mecânica respiratória. A maioria dos procedimentos descritos requer visualização da gária através da cavidade oral com equipamentos especializados como laringoscópio ou fonte de luz de fibra óptica1,,2,,3,,4,,5,,6,7. No entanto, isso pode ser difícil quando uma cânula relativamente grande é necessária, pois pode obscurecer a visão do pesquisador. Limjunyawong et al.8 abordaram essa preocupação com um método de intubação no qual uma pequena incisão cutânea é feita ao longo da linha média do pescoço ventral permitindo a visualização da traqueia. Após o procedimento, a incisão é fechada com adesivo de tecido.
Para estudos que requerem intubações repetidas frequentes, a incisamento e o fechamento sucessivos deste local exigem debridamento das margens da pele e trauma tecidual no pescoço ventral. O objetivo da abordagem transcutânea de visualização traqueal para a intubação oral é fornecer uma técnica refinada e não invasiva especificamente adequada para estudos repetidos de intubação, bem como eventos de intubação única em camundongos.
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Protocol
Todas as atividades de animais aqui descritas foram aprovadas pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade Estadual de Ohio e foram conduzidas em instalações credenciadas pela AAALAC.
1. Preparação do procedimento
- Construa a plataforma de entubação. Para alcançar a inclinação da plataforma apropriada, utilize um aglutinante de 3,6 cm (três polegadas). Dobre um comprimento de 15-20 cm de seda 3-0 ou outro material de rosca ao meio e adere as extremidades da rosca ao topo da plataforma inclinada com fita para criar um laço de suspensão(Figura 1).
- Selecione uma cânula do tamanho e comprimento apropriados.
NOTA: Para um mouse de 20-30 g, pode ser usado um cateter de 1-1,5 polegadas (2,5-3,8 cm) de comprimento até 18 G. Para este estudo, foram utilizados ratos BALB/c femininos de 18 semanas e C57BL/6 de 10 semanas (n = 3 de cada cepa). Uma bainha de cateter branco opaco fornece a melhor visualização transcutânea. - Corte um bisel na ponta distal do cateter e suavize a superfície de corte com papel abrasivo para criar uma ponta de bisel arredondada. Crie suavemente uma leve curvatura na cânula a aproximadamente 1 cm do bisel(Figura 2).
NOTA: Um novo cateter deve ser usado para cada rato. - Anestesiar o rato com cetamina (5,4 mg/g de peso corporal) e xilazina (16 μg/g de peso corporal) administrado intraperitonealmente. Aplique pomada oftalmológica estéril nos olhos.
NOTA: A profundidade anestéstica adequada é alcançada pela falta de resposta do mouse a uma pitada firme do dedo do dedo. - Suspenda o mouse em posição supina na plataforma de intubação, ligando os incisivos superiores ao redor do fio de seda na parte superior da superfície angular(Figura 3). Uma vez que o mouse esteja posicionado diretamente na recumbência dorsal, segure suavemente a base da cauda e retraia a cauda em direção à mesa. Coloque um pedaço de fita sobre a base da cauda para fixar o mouse.
- Aplique creme depilatório(Tabela de Materiais)na região cervical ventral por 30-45 s e, em seguida, remova todo o creme depilatório da região cervical usando uma gaze seca. Repita o processo de aplicação, se necessário. Enxágüe completamente a pele com água salina ou destilada para remover qualquer resíduo e depois enxugue.
2. Procedimento de intubação
- Use fórceps retas e planas na mão não dominante para retrair suavemente a língua de uma maneira que abra suficientemente a boca para a introdução da cânula.
NOTA: Os fórceps de dente de rato não devem ser usados, pois isso danificará a língua. - Com a mão dominante, avance a cânula para a boca de tal forma que a extremidade que é distal para a curva leve é contra o teto da boca do sujeito.
- Solte a língua e deslize a borda plana dos fórceps fechados ao longo do pescoço ventral até que o manúbrio seja atingido. Este movimento desloca lateralmente as glândulas salivares e achata o músculo que cobre a traqueia. A traqueia aparece transcutâneamente como uma linha branca (Figura 3A). Se necessário, gire os fórceps em uma direção craniodorsal, mantendo a tensão na pele em uma direção caudal para fazer com que as glândulas salivares deslocadas lateralmente aumentem. Esta manobra cria mais contraste em torno da traqueia (Figura 3B).
NOTA: Evite força excessiva no pescoço ventral, pois pode colapsar a traqueia e prejudicar a respiração. - Avance a cânula enquanto simultaneamente aconesto a ponta distal da cânula ventralmente pela supinação da mão dominante com flexão simultânea do pulso.
- A colocação adequada da cânula é indicada pela visualização da cânula opaca na traquéia (Figura 4B,D). Se a cânula foi avançada além do nível de origem do músculo masseter e a visualização da cânula na traqueia não foi confirmada, retraia a cânula e tente novamente a manobra.
- Confirme a colocação adequada da cânula conectando uma lâmpada de inflação pulmonar à cânula e observando a expansão torácica com a depressão simultânea do dispositivo.
- Sem deslocar a cânula, desengaque cuidadosamente os incisivos do mouse da plataforma de intubação. Mova o mouse para uma plataforma horizontal(Tabela de Materiais)e insira a cânula no adaptador no ventilador. Após a inflação profunda, ventile o mouse para 60 s e, em seguida, meça a resistência respiratória.
3. Recuperação
- Uma vez que o procedimento esteja concluído, mova o mouse para uma plataforma aquecida. Forneça estimulação constante através de pinças de dedo do dedo leve ou cauda para incentivar a respiração espontânea.
- A extubação pode ocorrer quando o rato começa a mastigar. Segure a cânula ao nível do cubo e puxe suavemente o tubo cranialmente e afaste-se do mouse até que a cânula seja completamente removida da boca do sujeito.
NOTA: É preferível fornecer suporte das vias aéreas com a cânula rígida pelo maior tempo possível durante o processo de recuperação. - Uma vez extubado, transfira o rato para uma gaiola de recuperação limpa com suporte térmico. Monitore continuamente o mouse até que esteja totalmente ambulatorial e a recuperação esteja completa.
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Representative Results
Monitoramento serial da função pulmonar da linha de base
As fêmeas balb/c de dez semanas e os camundongos C57BL/6 de 10 semanas (n = 3 de cada cepa) foram entubados utilizando o método descrito nos dias 0, 3, 10 e 17. Após a intubação em cada dia, o sujeito foi conectado a um ventilador mecânico fornecido com 100% de oxigênio (Tabela de Materiais). A resistência respiratória (Rrs) foi medida utilizando-se a técnica de oscilação forçada para 60 s após uma inflação profunda de 25 cm H2O realizada para 5 s. Nenhum erro de software associado a este respaldo de respiração sustentado, juntamente com os valores de Rrs dentro do alcance fisiológico, fornecem suporte adicional para a colocação adequada da cânula. Os dados não revelaram diferenças significativas de Rrs medidos observadas entre os pontos de tempo dentro de cadacepa( Figura 5 ). Presume-se que a ausência de aumento de Rrs ao longo do tempo indica falta de inflamação associada ao trauma no sistema respiratório ao longo de quatro pontos de tempo consecutivos.
Análise estatística
As estatísticas descritivas (erro médio e padrão) foram calculadas utilizando-se software de análise estatística (Tabela de Materiais). O método Kolmogorov-Smirnov foi utilizado para verificar a distribuição de dados gaussianos. As análises estatísticas dos conjuntos de dados foram feitas por ANOVA não pareado, com uma comparação múltipla pós-hoc Tukey-Kramer após o teste. Todos os dados são apresentados como média ± SEM. P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
Figura 1: Plataforma de intubação. A plataforma de intubação consiste em um aglutinante de três anéis com um laço de fio de seda aderido ao topo da pasta para criar um laço de suspensão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Preparação de cânula. (A)Visão lateral da cânula preparada. Observe o ângulo suave criado aproximadamente 1 cm a partir do bisel arredondado na extremidade distal do cateter e a orientação do ângulo da cânula em relação ao bisel. (B)Visão dorsoventral da cânula preparada. Observe a borda arredondada e suavizada do bisel. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Visualização traqueal. (A)Os fórceps são colocados no pescoço ventral e a pele é suavemente retraída caudally para deslocar lateralmente as glândulas salivares e fornecer visualização da traqueia como uma estrutura branca na linha média ventral (seta preta). (B) A rotação craniodorsal dos fórceps no pescoço ventral cria uma saliência das glândulas salivares (*). A traqueia é visualizada como a estrutura linear branca na linha média ventral entre as glândulas salivares (seta preta). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Colocação adequada da cânula. (A) Mouse C57BL/6 posicionado na plataforma de intubação com a cânula introduzida na cavidade oral proximal. (B) Mouse C57BL/6 com a cânula devidamente colocada na traqueia. Observe que a cânula pode ser facilmente visualizada como a estrutura branca dentro da traqueia (seta branca). (C) Mouse BALB/c posicionado na placa de intubação com a cânula introduzida na cavidade oral proximal. (D) Mouse BALB/c com a cânula devidamente colocada na traqueia. A cânula branca pode ser facilmente visualizada dentro da traquéia (seta preta). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Medição serial da resistência. Não foram observadas diferenças significativas de Rrs medidos entre os pontos de tempo dentro de cada cepa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A intubação utilizando a técnica de visualização traqueal transcutânea oferece uma abordagem refinada ao método padrão de incisão cutânea. Com atenção especial a vários passos-chave, a intubação pode ser facilmente e rapidamente alcançada. O animal deve ser colocado diretamente em recumbência dorsal na plataforma de intubação com o rato preso em retração suave. Isso estenderá o animal para o alinhamento vertical e o posicionamento adequado para a intubação. Além disso, o creme depilatório não deve permanecer em contato com a pele do animal por mais de 30-45 s e deve ser cuidadosamente enxaguado para remoção de todo o resíduo. O contato prolongado da pele com o creme depilatório causará dor desnecessária para o animal e ulcerações podem obstruir a visão da traqueia9. É imperativo usar o movimento adequado do pulso, pois a mão dominante introduz o cateter na grunio. O pulso dominante deve flexionar enquanto a mão se move em um movimento de supinação. Também é fundamental monitorar o sujeito de perto, pois a borda plana dos fórceps são pressionadas no pescoço ventral para visualizar a traqueia. A pressão dos fórceps irá ocluir a traqueia e causar hipóxia se mantida por uma duração prolongada. Se o paciente parecer cianótico, permita uma breve pausa para que as membranas mucosas retornem a uma cor rosa e para que a respiração se estabilize antes de repetir as tentativas.
A extensa experiência de intubação do rato não foi necessária para realizar essa técnica. As complicações mais comuns em indivíduos inexperientes incluem trauma laríngeo e inflamação das vias aéreas superiores devido a múltiplas tentativas de intubação. Um acompanhamento próximo é necessário durante a recuperação desses pacientes, pois pode ser indicada intervenção médica com anti-inflamatórios não esteróides. Tentativas repetidas de intubação mal sucedidas podem resultar em trauma tecidual e inflamação da cavidade oral distal, o que pode resultar em ruído respiratório superior, disspnéia, hipoxemia, recuperação prolongada, incapacidade de realizar intubação repetida ou morte.
Várias modificações são recomendadas no caso de a intubação não ser bem sucedida. Primeiro, certifique-se de que o bisel da cânula esteja liso, arredondado e cortado no comprimento apropriado para o tamanho do animal. A borda do bisel pode ser suavizada usando papel abrasivo para minimizar o trauma tecidual e facilitar a intubação7. Além disso, verifique se a cânula exibe uma curva leve de aproximadamente 15° a um terço de distância do bisel e a ponta da cânula é chanfrada em um ângulo de 45°, conforme descrito em Brown et al.6. Verifique sempre se o cateter está na orientação adequada antes e durante a realização deste procedimento.
Para este estudo, os camundongos foram entubados para repetidos testes de função pulmonar utilizando um sistema de ventilação mecânica para registrar as medidas da função pulmonar. Uma grande cânula de 18 G foi usada para criar um selo apertado. Para realizar estudos repetidos de função pulmonar em camundongos com um diâmetro traqueal menor devido à idade ou tensão, pode ser desafiador colocar uma cânula maior. Se uma cânula menor for eleita para uso, certifique-se de que um selo adequado ainda possa ser alcançado, e que a resistência da cânula não seja maior do que a resistência das vias aéreas do sujeito de teste10. Uma perturbação de inflação profunda bem sucedida é a confirmação adequada de um selo apropriado. Observe que tal vedação é desnecessária se apenas a instalação de tratamentos no pulmão for desejada.
Embora o método descrito tenha feito modificações que previnem danos nos tecidos externos, o limite superior de frequência de intubação ainda é uma função de trauma cumulativo à gruna e traqueia devido à introdução excessiva da cânula. Recomenda-se o monitoramento simultâneo de um grupo controle para aumentos significativos na resistência das vias aéreas durante um estudo, uma vez que o trauma tecidual é acompanhado de inflamação que resultará na diminuição do diâmetro luminal da traqueia. Aumentos significativos na resistência das vias aéreas ao longo dos repetidos procedimentos de intubação não foram observados no presente estudo. Os camundongos permaneceram clinicamente normais durante a duração do estudo e a necropsia bruta das estruturas das vias aéreas superiores não foi notável na conclusão do estudo em todos os animais.
Em resumo, a técnica descrita de intubação oferece um método não invasivo para a colocação de cânulas endotraqueais com equipamentos mínimos, incluindo uma superfície inclinada, fórceps, uma cânula de polipropileno e suprimentos depilatórios. Este método refinado permite eventos repetidos de intubação sem trauma tecidual recorrente e dor associada a um sítio de incisão cutânea no pescoço ventral ou um procedimento de traqueotomia. Além disso, este método reduz o número de camundongos necessários, pois camundongos individuais podem ser repetidamente entubados ao longo de um estudo. Também elimina a necessidade de dispositivos de contenção de intubação especialmente projetados, escopos ou equipamentos transiluminadores para visualização das vias aéreas. As cepas BALB/c e C57BL/6 foram utilizadas neste estudo para demonstrar o sucesso da técnica em cepas pigmentadas claras e escuras e animais de idade relativamente jovem e de pequeno porte (camundongos de 10 a 20 semanas). Esta técnica refinada é adequada para instilação intratraqueal única ou repetida de compostos, lavagem broncoalveolar, imagem ou teste de função pulmonar. Este método minimamente invasivo e versátil pode ser implementado para praticamente qualquer procedimento que exija acesso ao trato respiratório inferior.
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Disclosures
Os autores não têm nada para revelar.
Acknowledgments
Os autores agradecem a Lucia Rosas, Lauren Doolittle, Lisa Joseph e Lindsey Ferguson por sua assistência técnica e ao Laboratório Universitário recursos animais por seu apoio aos cuidados com animais. Este trabalho é financiado por NIH T35OD010977 e R01-HL102469.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 G x 1 1/4" intravenous catheter, Safelet | Fisher Scientific | #14-841-14 | Cannula for intubation |
| 70% ethanol, 10 L | Fisher Scientific | 25467025 | Cleaning cannula |
| Abrasive paper (sandpaper) | Porter-Cable | 74001201 | Cannula preparation |
| AnaSed (xylazine sterile solution) injection (100 mg/mL) | Akorn Animal Health | NDC# 59399-111-50 | Anesthesia |
| Blue labeling tape (0.5 in x 14 yds) | Fisher Scientific | 15966 | Restraint on intubation platform |
| Braided silk suture without needle, nonsterile, (3-0) | Henry Schein | Item #1007842 | Intubation platform |
| Deltaphase Isothermal Pad | Braintree Scientific | 39DP | Mouse thermoregulation and recovery |
| Deltaphase Operating Board | Braintree Scientific | 39OP | Mouse recovery (prior to extubation) |
| Distilled water | ThermoFisher | 15230253 | Cleaning mouse following depilation |
| Eye Scissors, angled, sharp/sharp | Harvard Apparatus | 72-8437 | Cannula preparation |
| FlexiVent (FX Module 2) | Scireq | N/A | Record lung function data (not required to perform procedure, used in this study to validate procedure) |
| Gauze sponges | Fisher scientific | 13-761-52 | Hair removal |
| Heavy-Duty 3" 3-Ring View Binders | Staples | 24690CT | Intubation platform |
| Instat Software | Graphpad | N/A | Statistical analysis software |
| Insulin syringe (0.5 cc, U100) | Fisher Scientific | 329461 | Anesthesia administration |
| Ketamine HCl Injection, USP (100 mg/mL) | Llyod Laoratories | List No. 4871 | Anesthesia |
| Lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | Confirm cannula placement |
| Micro Forceps, Curved, Smooth | Harvard Apparatus | 72-0445 | Retract tongue and create tension on neck for cannula visualization |
| Nair (hair removal lotion), 9 oz bottle | Church & Dwight | 42010440 | Hair removal |
| Sterile saline (0.9%), 10 mL | Fisher Scientific | NC9054335 | Anesthesia, cleaning skin following hair removal |
References
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