Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Samling og karakterisering af polyelektrolytkompleksmiceller

Published: March 2, 2020 doi: 10.3791/60894
Automatic Translation
1, 1, 1
1Pritzker School of Molecular Engineering, The University of Chicago

Summary

Vi leverer protokoller og repræsentative data til design, samling og karakterisering af polyelektrolytkompleksmicelles, nanopartikler af kerneskallen dannet af polyelektrolytter og hydrofile ladede blok-copolymerer.

Abstract

Polyelektrolyt kompleks micelles (PCMs), core-shell nanopartikler dannet af selvsamling af ladede polymerer i vandig løsning, giver en kraftfuld platform til at udforske fysik polyelektrolyt interaktioner og tilbyder også en lovende løsning på det presserende problem med at levere terapeutiske oligonucleotider in vivo. Udvikling af prædiktive struktur-ejendom relationer for PCMs har vist sig vanskeligt, til dels på grund af tilstedeværelsen af stærke kinetiske fælder under nanopartikel selvsamling. Denne artikel diskuterer kriterier for valg af polymerer til PCM konstruktion og giver protokoller baseret på salt annealing, der gør det muligt samling af repeterbare, lav polydispersity nanopartikler. Vi diskuterer også PCM karakterisering ved hjælp af lys spredning, lille vinkel X-ray spredning, og elektron mikroskopi.

Introduction

Når modsat ladede polyelektrolytter blandes i vandig opløsning, entropi gevinst fra frigivelse af deres modtællere forårsager demixing af opløsningen i en polymer-rige kondenseret fase og en polymer-forarmet supernatant1,2,3,4,5, et fænomen kendt som polyelektrolyt kompleksation. Hvis en neutral hydrofile blok konjugeres til den ene eller begge polyelektrolytter, sker nanoskalafaseadskillelsen i stedet (figur 1A). De resulterende selvsamlede kerneskal nanopartikler er skiftevis benævnt polyelektrolyt komplekse micelles (PCMs), polyion kompleks micelles, blok ionomkomplekser, eller coacervate-core micelles analogt til overfladeaktive micellization, selv om alle komponenter i systemet er hydrofile6,7. En PCM evne til at indkapsle hydrofile molekyler såsom proteiner og nukleinsyrer, samt den omfattende tunabilitet, der tilbydes af blokken copolymer luftfartsselskab arkitektur gør dem attraktive kandidater til at levere terapeutiske molekyler i vivo8,9,10,11,12,13.

Levering af terapeutiske kerner syrer til cellulære mål er en særlig vigtig udfordring, og en, som PCMs tilbyder flere fordele. Terapeutiske nukleinsyrer (genetisk DNA, mRNA, og oligonucleotider såsom siRNA) har et enormt potentiale for at forbedre menneskers sundhed, men skal overvinde mange biologiske og fysiske barrierer for at indse, at potentielle14,15,16. Nøgne nukleinsyrer nedbrydes af serum og cellulære nukleases, er hurtigt ryddet fra cirkulation, og deres stærke negative ladning gør det vanskeligt for dem at trænge ind cellemembraner uden hjælp. De nuværende metoder til at overvinde disse barrierer omfatter dyre kemiske ændringer for at forhindre skader fra nukleases og/eller indkapsling i forskellige lipidnanopartikler samlet via hydrofobe interaktioner15,17,18. Mens disse metoder har vist sig effektive til lokale injektioner og levermålretning, giver systemisk brug betydelige begrænsninger af toksicitet, immunogenicitet og begrænset biodistribution16. I modsætning hertil bruger PCM'er den negative ladning af nukleinsyrer til at kondensere dem inden for den faseseparerede kerne, mens den neutrale korona giver en steric barriere mod nedbrydning samt en platform til at indarbejde ligander for at forbedre målretning eller internalisering11,19. In vitro og dyreforsøg har vist, at PCM'er effektivt kan levere forskellige nukleinsyre nyttelast20,21,22,23,24, men svagheder i vores evne til at forudsige PCM egenskaber såsom størrelse, form, og stabilitet fra egenskaberne af de konstituerende polymerer har hindret deres bredere vedtagelse.

Det seneste arbejde fra vores gruppe og andre på området er begyndt at løse dette problem ved at udvikle struktur-ejendom, og i nogle tilfælde struktur-ejendom-funktion relationer for PCM'er dannet af nukleinsyrer og forskellige kationiske-neutrale polymerer7,25,26,27. To konsekvente temaer, der er opstået fra disse undersøgelser er vigtigheden af at udvikle velkontrollerede, repeterbare protokoller for PCM samling og fordelen ved at bruge flere teknikker til at karakterisere de resulterende nanopartikler. Polyelektrolytter, især dem med høj ladning tæthed som nukleinsyrer, interagere med hinanden meget stærkt, og synes at let blive kinetisk fanget ved blanding, hvilket resulterer i PCM præparater, der er meget følsomme over for små variationer i proceduren og vise høj polydispersitet og dårlig repeterbarhed fra batch til parti. PcMs har også vist sig at vedtage en bred vifte af former og størrelser afhængigt af atomniveau konfigurationer af deres komponenter, og fange denne mangfoldighed med enhver individuel karakterisering teknik er meget vanskeligt, især da nogle almindelige teknikker såsom dynamisk lys spredning (DLS) kræver antagelser om partikelform for deres fortolkning.

I denne artikel diskuterer vi materialedesign og -udvælgelse til pc'er med fokus på oligonucleotider og kationiske-neutrale diblock-copolymerer. Vi beskriver derefter en saltglødningsprotokol, der bruger høje saltkoncentrationer efterfulgt af langsom dialyse for at undgå kinetisk fældefangst under PCM-samling. Polyelektrolytterne blandes i høje saltforhold, hvor elektrostatiske attraktioner screenes, og saltkoncentrationen sænkes langsomt, så polyelektrolytterne kan falde til ro i deres mest energisk gunstige konfigurationer, svarende til den langsomme afkølingsproces med termisk glødning. Ved hjælp af denne protokol, vi er regelmæssigt i stand til at opnå usædvanlig lav polydispersity og høj repeterbarhed for oligonucleotid PCMs7,26. Endelig beskriver vi, hvordan fire separate måleteknikker kan bruges til at karakterisere PCMs over en meget bred vifte af længdeskalaer, fra ekstern morfologi til intern struktur: DLS, multi-vinkel lys spredning (MALS), lille vinkel X-ray spredning (SAXS), og transmission elektron mikroskopi (TEM). Vi håber, at disse protokoller vil gøre det muligt for flere forskere effektivt at udforske mulighederne for disse interessante nanopartikler.

Polymer udvælgelse og forberedelse
PCM egenskaber er stærkt påvirket af de fysiske og kemiske egenskaber af de konstituerende polymerer, hvilket gør polymer udvælgelse et kritisk skridt i designprocessen. De mest velkarakteriserede blokcopolymerer til nukleinsyre-PC'er er lineære diblocks såsom poly(lysin)-poly (ethylenglycol) (pLys-PEG), men PCM'er kan dannes mellem polyelektrolytter og en række hydrofile neutralladede polymerer, som kan genereres på en høj gennemløbsmåde28. Valget af ladede gruppe påvirker i høj grad stabiliteten af ionparring og form af micelles26, og PCM størrelse har vist sig at stige med længden af den ladede blok5,7,26 ( Figur2), således PCM egenskaber, der skal indstilles til kravene i en ønsket anvendelse. For lineære diblocks, har vi konstateret, at den opkrævede blok skal have mindst 10 afgifter og være stærkt opkrævet på den ønskede pH. Længere ladede blokke kan fremme PCM dannelse med oligonucleotider såsom siRNA, som er vanskelige at komplekse med kortere blokke21. Vi har med succes observeret PCM dannelse med blok længder op til 200, og litteraturen beskriver længere polymerer. Der er større fleksibilitet i valget af neutrale blok24, men erfaringen har vist, at meget korte neutrale blokke fører til aggregering i stedet for nanopartikeldannelse, og at den minimale neutrale længde stiger med ladet bloklængde. For pLys-PEG kræves der en PEG MW på mindst 3.000-5.000 for pLys-længder under ~50, og der kræves længere længder, da den ladede blok øges yderligere. Øget neutral bloklængde resulterer i øget PCM-størrelse, især shelltykkelse, på grund af steric fortrængning af de neutrale polymerer.

Dette manuskript præsenterer en protokol til forberedelse af pcms fra lyophilized høj renhed pLys-PEG og oligonucleotider af kendt mængde, men bør være let kan tilpasses til andre systemer så godt. Vi har testet det med succes med flere ladede polypeptider, herunder polyarginin og polyglutamic syre, samt flere syntetiske polyelektrolytter, såsom polyakrylsyre og poly (vinylbenzyl trimethylammonium). Vi beskriver også forberedelse af pcms med et stoichiometric forhold af polyelektrolytafgifter, men dette kan nemt ændres. Vi finder det lettest at arbejde med at opkræve koncentrationsenheder (c.c.), som også naturligt rummer polymerer, der ikke er fuldt opladet. Hvis en af polymeren ikke er velkarakteriseret, skal man være omhyggelig med præcist at bestemme polymerlængderne/masserne og sikre, at overskydende salt ikke er til stede ud over det, der er nødvendigt for f.eks. Tilstedeværelsen af eventuelt tilbageholdt vand bør også tages i betragtning, når koncentrationerne beregnes. Nukleinsyrekoncentrationen kan kvantificeres bekvemt ved absorbans ved 260 nm, og tilstedeværelsen eller fraværet af terminalfosfater bør overvejes ved beregning af c.c.

Ved brug af oligonucleotider som polyanioner hjælper hybridiseringstilstanden og den kemiske struktur med at bestemme tilbøjeligheden til selvmontering og egenskaberne ved den resulterende PCM5,7,26. Optimering af disse, inden for kravene til biologisk effekt, hvis du bruger PCMs til levering, vil øge sandsynligheden for at danne de ønskede strukturer. Nyttige værktøjer til analyse af hybridisering omfatter MATLAB funktioner til nukleinsyrer, NUPACK29og IDT OligoAnalyzer. Vi anbefaler at analysere en kandidat sekvens for at forstå styrken af binding til 1) sig selv i en hårnål dannelse; 2) en anden kopi af den samme sekvens (selv-dimer); og 3) til andre oligonucleotider, der findes i systemet. DNA og RNA smeltetemperaturer for en bestemt sekvens kan også beregnes ved hjælp af nærmeste nabo metode30,31. Termisk glødning af nukleinsyrer (trin 2.3) denatures enhver resterende sekundær struktur i de enkelte nukleotider og fremmer ligevægt foldning.

PCM-tegnning og -analyse
En bred vifte af teknikker er tilgængelige til at karakterisere nanopartikler, herunder statisk og dynamisk lys spredning, lille vinkel spredning af elektroner eller neutroner, og elektron mikroskopi. I denne artikel leverer vi protokoller for to lysspredningsteknikker, lille vinkel røntgenspredning og to elektronmikroskopiteknikker.

DLS måler autokorrelation en tidsmæssige udsving i spredning intensitet i én vinkel fra Brownian bevægelse af prøven. Montering af disse data kan give hydrodynamisk radius og polydispersitet til sfæriske micelles (figur 3). Multivinkellysspredning (MALS) måler den statiske spredningsintensitet i mange vinkler. Denne vinkelafhængighed beskriver nanopartiklens form, men er begrænset til længdeskalaer længere end ~50 nm for synligt lys, hvilket begrænser dens effektivitet for mindre nanopartikler. Begge teknikker er baseret på brydningsindeks mismatch og primært beskrive de udvendige dimensioner af nanopartikel.

Lille vinkel X-ray spredning (SAXS) bruger røntgenstråler som spredning sonde, og deres kortere bølgelængde tillader målinger over en række ~ 0,1-100 nm. Montering af den observerede spredningsintensitet vs. vinkel (konventionelt udtrykt som momentumoverførsel q)giver oplysninger om PCM morfologi (dvs. størrelse og form) og også intern struktur. Hvis en absolut intensitet kalibrering er tilgængelig, og hvis spredning intensitet kan ekstrapoleres til nul vinkel, PCM masse og sammenlægning nummer kan også anslås32,hvilket gør SAXS en yderst alsidig og værdifuld metode. Neutronspredning af små vinkler (SANS) er følsom over for en tilsvarende længdeskala, men er kun tilgængelig på specialiserede faciliteter og vil ikke udtrykkeligt blive drøftet i denne artikel33,34,35.

De seneste år har set fremkomsten af benchtop SAXS instrumenter, men vi finder, at synchrotron kilder er bedre egnet til PCM karakterisering, som deres højere intensitet gør det muligt data, der skal indsamles meget hurtigere for disse lav kontrast prøver. Vi leverer en kort protokol til at erhverve PCM SAXS data på Beamline 12-ID-B på Advanced Photon Source (Argonne National Laboratory, USA) fra et brugerperspektiv. Denne protokol bør gælde for de fleste synkrotronkilder, men det anbefales stærkt at rådføre sig med lokalt personale, før der foreslås et eksperiment. Vi leverer også en datareduktions- og analyseprotokol ved hjælp af Irena36, et gratis sæt makroer skrevet til Igor Pro. Irena indeholder et alsidigt sæt af formfaktorer til modellering af SAXS-data og giver mulighed for konstruktion af multikomponentmodeller, der er i stand til at beskrive pcms' komplekse spredningsprofil (se repræsentative resultater, figur 4). Irena har også omfattende dokumentation og tutorials til rådighed online. Før du forsøger nedenstående procedurer, anbefaler vi kendskab til disse, især tutorial "Modellering af SAXS data med to vigtigste scatterer populationer".

Strålingsskader er en bekymring for røntgenspredning, men flere foranstaltninger kan anvendes til at minimere det. Vi anbefaler især at bruge en flowcelleopsætning med en sprøjtepumpe og PCM-prøve, der flyder under dataindsamling, i stedet for en forseglet kapillær. Dette forenkler også i høj grad baggrunden subtraktion. Vi foreslår også, at der tages flere eksponeringer af den flydende prøve i stedet for en længere for at begrænse den strøm, som en enkelt mængde prøve ser, og for at gøre det muligt at sammenligne eksponeringsdataene for at identificere eventuelle skader.

I modsætning til spredningsteknikkerne, som generelt kræver tilpasning til fortolkningen, giver transmissionselektronmikroskopi (TEM) et reelt visuelt rumbillede af nanopartiklerne ved at passere en elektronstråle gennem prøven og projicere et billede på en scintillationsskærm (figur 5). Vi præsenterer protokoller for to TEM teknikker i denne artikel. Cryo TEM fryser micelle prøver i et tyndt lag glaslegemeis, der bevarer strukturel kropsbygning med minimale fremmede stoffer, optimal for micelles ≤~10-100 nm i radius. Negativ plet TEM bruger et heavy metal salt (f.eks uran) til at omgive prøven, efter at den er blevet tørret på overfladen af et gitter. Den tætte plet vil sprede flere elektroner end prøven, tilføjer kontrast og producerer et negativt billede af prøven. Cryo TEM anbefales til billeder i høj kvalitet. Men det er dyrere, tidskrævende, og kan ikke give tilstrækkelig kontrast. Når dette giver anledning til bekymring, bør der anvendes negative farvede prøver. Eksempler på hver findes i figur 5.

Hver af disse teknikker rapporterer om lidt forskellige aspekter af nanopartikler, med forskellige styrker og begrænsninger. Lysspredning er let tilgængelig, og er ofte den hurtigste tilgang, men har betydelige begrænsninger i størrelse og form opløsning. SAXS kan give oplysninger over en lang række længdeskalaer ved rimelig høj gennemløb, men kræver specialiseret udstyr til at erhverve data, samt modellering til at fortolke det. TEM billeder er ligetil at fortolke, men kan begrænses i modsætning og er i sagens natur lav gennemløb. Vores erfaring har vist, at ved hjælp af flere teknikker til karakterisering i høj grad øger de oplysninger, der kan opnås om PCM egenskaber og forenkler fortolkningen af datasæt opnået fra hver enkelt alene. F.eks. undersøger SAXS og TEM primært en PCM's tætte kerne, mens lysspredningsrapporter om nanopartiklens overordnede dimensioner. Således kombinere dem giver mulighed for måling af både kerne og korona størrelse. TEM's evne til at erhverve virkelige rumbilleder kan give data om jorden til at gøre det muligt at vælge passende formfaktorer til modellering af SAXS-data, som ellers ville være tvetydige. I denne artikel beskrives protokoller for alle fire teknikker, og der gives et eksempel på brug af dem til at karakterisere et ukendt eksempel i diskussionsafsnittet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling af materialer

  1. Afveje lyophilized diblock polymer og tilsæt vand op til næsten den mængde, der kræves for en bestand opløsning på 10 mg/ml endelig koncentration. Vortex ved maksimal hastighed i 2 min.
  2. Sonicate i 5 min. Meget lange diblocks kan kræve yderligere sonikering. Bestanden opløsning bør synes helt gennemsigtig og homogen.
  3. Juster pH til 7,4 ved hjælp af NaOH eller HCl efter behov. Tilsæt vand til det endelige volumen. pLys-PEG-opløsninger er ret stabile, men skal nedkøles til langtidsopbevaring, og pH-værdien skal kontrolleres før brug. Lyophilization er at foretrække frem for frysning.
  4. Resuspend lyophilized oligonucleotid(s) ved den ønskede bestandkoncentration, typisk 2-5 mM molekylær koncentration for længder på 50 nt eller derunder. Vortex grundigt for at sikre fuld opløsning.
  5. Beregn molarkoncentrationer ved hjælp af molekylvægt eller længde som beskrevet i indledningen.
  6. Beregn molarladningskoncentrationer (c.c.), hvor

Equation 1

Polyelektrolytladningen er antallet af ladede monomerer, mens nukleinsyreladningen er antallet af baser minus 1, idet der ikke antages at være nogen fosforylering. Husk, at dobbeltstrenget DNA vil have dobbelt så mange ladninger pr molekyle i forhold til enkeltstrenget DNA.

  1. Opret fortyndet lager ved 20 mM c.c. for hver polymer.

2. Nukleinsyre Polyelektrolyt Micelle Forberedelse

  1. I et mikrocentrifugerør på 1,5 ml blandes følgende med et samlet volumen på 280 μL:
    1. 200 μL nukleasefrit vand (ultrarent vand til PCM'er, der ikke indeholder nukleinsyrer).
    2. 40 μL 10x fosfatbufferede saltvand (PBS, 137 mM natriumchlorid, 10 mM fosfat, pH 7.4 ved fortyndet til 1x) eller anden egnet buffer37.
    3. 40 μL 20 mM c.c. oligonucleotid. Til dobbeltstrengede oligonucleotider tilsættes 20 μL af hver streng ved 20 mM c.c.
  2. Økuv oligonucleotidopløsningen i 5 min ved 70 °C. Hvis den beregnede smeltetemperatur for oligonukleotider er højere, skal temperaturen forhøjes i overensstemmelse hermed. Bemærk, at RNA vil nedbrydes ved forhøjede temperaturer, så dette trin bør ikke være længere, hvis dette eller andre følsomme komponenter er til stede.
  3. Afkøles i 15 min. Tilsæt 40 μL 20 mM c.c. diblock, derefter vortex straks i 20 s ved maksimal hastighed. Inkuber5 min ved stuetemperatur (RT).
  4. Udfør saltet anneal.
    1. Der tilsættes 80 μL natriumchlorid til en endelig koncentration på 1 M NaCl og det endelige volumen på 400 μL. Vortex for 10 s ved maksimal hastighed.
    2. Inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur, derefter indlæses i dialyse patroner. Bemærk, at de anførte molekylvægtsafskæringer bestemmes for kugleformede proteiner og ikke vil være nøjagtige for lineære polymerer. Vi oplever, at en 2k MWCO patron undgår prøvetab og også giver mulighed for gradvise ændringer i ionisk styrke.
    3. Forbered dialyse bade.
      1. Beregn mængden af dialyse bad behov:
        Equation 2
      2. Bland 10x PBS (eller anden ønsket buffer), 5 M NaCl og ultrarent vand for en endelig opløsning på 1x PBS og 0,5 M NaCl, samt to opløsninger på 1x PBS.
    4. Lastdialysepatroner.
      1. Mærk patroner med permanent markør. Soak patroner i buffer i mindst 2 min at fugte membraner.
      2. Fjern hætten ved at dreje mod uret. Lastprøve ved hjælp af gellæsserpipettespids. Fjern overskydende luft ved forsigtigt at klemme membraner. Udskift hætte.
      3. Læg patroner i 1x PBS, 0,5 M natriumchloriddialysebad. Patroner skal flyde, med begge membraner udsat for badet. Skum flåd kan bruges, hvis det er nødvendigt.
    5. Dialyse
      1. Inkuber i 24 timer under omrøring langsomt med en magnetisk rørebar.
      2. Flyt patronerne til et nyt bad på 1x PBS eller en anden ønsket arbejdsbuffer. Inkuber i 24 timer, omrøring langsomt med en magnetisk rørebar. Gentag dette trin.
    6. Udsttag prøven.
      1. Tag patronerne ud af badet. Fjern hætten og genindsmningsprøve ved hjælp af en gel, der læsser pipettespidsen. Bemærk, at det genvundne volumen kan være højere end de oprindelige 400 μL på grund af hævelse af membranen. Optag genvundet volumen, hvis let fortynding giver anledning til bekymring.
      2. Prøven anbringes i et rent mikrocentrifugerør på 1,5 ml. PcMs forberedt på denne måde bør være stabil i flere måneder, når nedkølet, forudsat at nuklease forurening er blevet undgået.

3. Dynamisk lysspredning

  1. For at sikre støvfrie forhold skal buffere filtreres omhyggeligt (filtreret 3x gennem en 0,22 μm sprøjte eller vakuumfilter) og glasvarer, der rengøres grundigt mellem prøverne. Det er også vigtigt at sikre, at prøven har opnået termisk ligevægt, før målingen udføres.
  2. Pcm-prøven fortyndes til 0,2 mM c.c. (10x, hvis den ovenfor beskrevne protokol tages i brug) med den ønskede arbejdsbuffer og lægges i en passende cuvette. Vi bruger en lille volumen cuvette, som kræver ~ 200 μL prøve efter fortynding.
  3. Indstil DLS-detektorposition til 90°.
  4. Juster lasereffekten og/eller dæmpningen, så tællehastigheden er 100.000-200.000 tællinger pr. sekund (cps), hvis det er muligt. Tællesatser så lavt som 10 kcps kan bruges, men måletider kan være nødvendigt at udvide for at opnå gode statistikker (trin 4.1). Højere optællingsrater bør undgås, da flere spredninger vil forvirre målingen.
  5. Anskaf data i 1 min. Optællingssatsen skal være konstant i hele anskaffelsestiden. Hvis ikke, indikerer dette, at en del af prøven eller instrumentet endnu ikke er ligestillet.
  6. Undersøg autokorrelationsdataene. Den lange basislinje skal være meget flad, og autokorrelationskurven skal være glat med minimalt punkt, som vist i figur 3A. Baseline drift indikerer manglende ligevægt, og støj i dataene kan forbedres ved at erhverve flere data.
  7. Tilpas funktionen Autokorrelation.
    1. Brug REPES38,39 til at udføre regulariseret omvendt Laplace transformation til at levere en fordeling af afslapning gange og en diffusion koefficient, D. Denne metode beregner derefter hydrodynamisk radius, Rh, ved hjælp af Stokes-Einstein ligning:
      Equation 3
      Figur 1B viser en repræsentation af Rh, og figur 3B viser resultatet af REPES.
    2. Alternativt kan du bruge andre metoder, herunder CONTIN40,41 (en alternativ legaliseringsalgoritme) eller ikke-negativ mindstekvadratisk montering (NNLS). Ensartede resultater fra flere tilpasningsmetoder er en signatur af data af høj kvalitet. Bemærk, at kummulananalyse (standard på mange instrumenter) giver ikke-fysiske værdier for multimodale størrelse/længdefordelinger.

4. Lysspredning med flere vinkler

BEMÆRK: Lysspredningsintensitet i forhold til vinkel kan måles på en række forskellige instrumenter. Vi har opnået gode resultater ved hjælp af både goniometer-baserede instrumenter og multiple-detektor instrumenter, køre i batch-mode.

  1. Juster PCM-koncentrationen og belysningsintensiteten for at give tilstrækkeligt signal/støj i forhold til en prøve, der kun er buffer i alle vinkler, uden at mætte nogen detektor. Sidstnævnte kan testes ved at forberede prøver ved forskellige fortyndingsfaktorer og kontrollere for lineariteten af intensitet vs. koncentration (under forudsætning af minimal interaktion mellem pc'er).
  2. Lysspredningshastigheden registreres fra 15° til 135° i 1 min vinkel. Hvis prøven og instrumentet er korrekt ekvilibreret, vil spredningshastigheden være konstant i løbet af måletiden.
  3. Plot den normaliserede spredning sats, jegsynder (θ), vs q, hvor jeg er spredning sats. q er spredningsvektoren (foton momentumoverførsel) som defineret af

Equation 4

hvor η = opløsningsmidlets brydningsindeks, θ = målevinklen og λ = lyskildens bølgelængde. Figur 4 viser et plot af MALS spredning intensitet.

5. Lille vinkel Røntgenspredning

  1. Dataindsamling
    1. Klargør PCM-prøver som beskrevet ovenfor ved 2 mM-ladningskoncentration for oligonucleotid-pc'er for rigelig spredning over baggrunden. For PCM'er, der mangler tunge atomer (f.eks. fosfor i nukleinsyrer), kan der være behov for højere koncentrationer. Spredning længde tætheder kan anslås ved hjælp af regnemaskiner såsom SASSIE42.
    2. For at minimere strålingsskader ved at skylle på frie radikaler tilsættes glycerol fra en koncentreret (f.eks. opløsning, således at micelleopløsningen indeholder 1% (v/v) glycerol. Bemærk, at pæn glycerol er meget tyktflydende og vanskeligt præcist at måle. Fortynding med vand eller buffer anbefales stærkt.
    3. Forbered en stor mængde arbejdsbuffer med 1% glycerol til brug som baggrundsskærm.
    4. Klargør det strålelinjespecifikke flowcelleapparat og kalibreringsdetektoren. Protokollen bruger en 3 mm diameter kvarts kapillær forbundet til en computer-kontrolleret sprøjtepumpe med en lille diameter, og minimal længde polyethylen slanger. Der kræves en minimumsvolumen på ~ 140 μL pr. prøve med denne opsætning.
    5. Bestem parametre for prøveeksponering. Den optimale eksponering vil variere baseret på stråleintensitet, detektorfølsomhed og koncentration, spredningsstyrke og skadefølsomhed af prøven, men målet er at udsætte prøven for den minimale flux, der kræves for at opnå tilstrækkelig spredningsintensitet over q-området af interesse.
    6. For oligonucleotid/pLys-PEG PCMs giver 30x 0,2 s eksponeringer med en 1 Hz gentagelseshastighed god datakvalitet med ringe mærkbar skade. For nye prøver kan følgende fremgangsmåde være nyttig:
      1. Pcm-prøver tilberedes over en række koncentrationer (f.eks. 10-10.000 μM c.c.c.).
      2. Fra en mellemliggende koncentration, alternative PCM og buffer-only prøver med varierende eksponeringgange. Se nedenfor for dataindsamling og reduktion procedure. Prøvesignalet skal have gode statistikker (små statistiske fejl eller jævn variation på tværs af q). Hvis statistikkerne er dårlige, kan eksponeringstiden øges.
      3. Prøvesignalet bør også tydeligt kunne skelnes fra baggrunden over q-interesseområdet. Beregne og afbilde forholdet (signal-baggrund)/baggrundsforholdet i forhold til q for at bestemme signal-/baggrundsforholdet. Hvis signal-/baggrundsforholdet er lavt, skal prøvekoncentrationen øges.
      4. Kontroller, at spredningsintensiteten (normaliseret til koncentration) er uafhængig af prøvekoncentrationen ved at erhverve data ved højere og lavere koncentrationer, skaleringseksponeringstid, hvis det er nødvendigt. Interpartikelinteraktioner (den mest sandsynlige årsag til koncentrationsafhængighed) vil være mest udtalt i det lave q-område.
    7. Anskaf data til PCM-prøver og baggrund (dvs. buffer med glycerol).
      1. Afsæt sprøjtepumpen til at flytte prøven gennem kapillær. Enten tovejs eller en gang-through bevægelse er acceptabelt, men der bør udvises forsigtighed for at isolere hver prøve (f.eks ved at indsætte en luftboble mellem prøverne). Prøverne kan genanvendes og kan genbruges, hvis der ikke ses strålingsskader.
      2. Når flowet er startet, skal du udløse det røntgeneksponerings- og dataindsamlingsprogram, der er beskrevet ovenfor. Der skal udvises forsigtighed, at stråleeksponeringen ender, før væskestrømmen gør.
    8. Efter hver prøve skal du udføre azimuthal i gennemsnit og afbilde 1D-profilerne (dvs. intensitet vs. q)for hver eksponering sammen. De bør være identiske i statistiske fejl. Ændring af signal over tid kan indikere strålingsskader.
      1. Isolerede unormale profiler kan indikere tilstedeværelsen af mikrobobler. Hvis der observeres bobler ofte, kan en reduktion af strømningshastigheden hjælpe.
    9. Gennemsnit 1D spredning profiler.
    10. Anskaf data for test, der kun indeholder buffere, ofte (én gang pr. 4-5 PCM-prøver), og sammenlign disse over tid. Øget signal fra prøver, der kun giver buffer, indikerer, at kapillæren kan være forurenet med strålingsskadet prøve.
      1. Når der bemærkes kontaminering, vaskes kapillæren med blegemiddel, og overvej at reducere eksponeringstiden, hvis det er muligt.
  2. Datareduktion og -analyse ved hjælp af Irena
    1. Importere micelle- og baggrund ASCII-datasæt (SAS/Data import & export/Import ASCII SAS-data).
    2. Træk baggrundsspredning fra eksempeldata. Typisk viser de højeste q-værdier (f.eks. q > 0,5) usammenhængende spredning fra det opløsningsmiddel, der dominerer signalet. Skalering af baggrundsdata, der svarer til eksempeldataene i dette q-område, fjerner enhver variation på grund af variationer i stråleintensiteten og prøvekoncentrationen.
      1. Afbilde eksemplet og baggrunden sammen på en log-log-skala. Kontroller flad intensitet ved høj q (SAS/Data Manipulation/Data Manipulation I). Beregne eksempel-/baggrundsforholdet (Data1/Data 2), afbilde på en lineær logskala, og kontroller den høje q-asymptote.
      2. Beregne det gennemsnitlige (eksempel/baggrund) forhold over dette q-område (brug en brugerdefineret makro eller kopi/sæt ind i et regneark fra databrowseren).
      3. Ved hjælp af makroen Datamanipulation skal du skalere baggrunden (f.eks. rediger data 2) ved hjælp af det forhold, der er beregnet ovenfor, og afbilde forholdet mellem baggrundssubtraket signal til baggrund vs. q ([Data1-Data2]/Data2), og kontrollere, at den nu asymptotes til nul ved høj q. Registrer dette forhold. det skal være <1-2% væk fra 1,0 for hver prøve.
      4. Afbild det baggrundssubtrakede signal (Data1-Data2) vs. q, og gem dataene med et nyt navn. Overskriv ikke de oprindelige data.
      5. Hvis der ikke foreliggerhøj- q-data, skal du bruge en skaleringsfaktor på 1 til subtraktion i baggrunden, men vær opmærksom på, at der kan indføres unøjagtigheder i q-områder, hvor signal-/baggrundsforholdet er lille.
    3. Åbn modelmakroen (SAS/Modeling), og indlæs og afbild derefter de baggrundssubherede data (Data cntrls/Add data). Skaler ikke i denne makro.
    4. Først skal du finde en omtrentlig model for pcm'ens udvendige overflade (micellestørrelse/-figur):
      1. I Data cntrlsskal du vælge lavt til moderat q-område (f.eks. ~0,003Å-1 < q < ~0.1Å-1). Hvis svingninger er synlige, skal du medtage dem.
      2. Vælg en formfaktor, der passer til dataene. Hældningen ved lav q er tegn på nanopartikelform, som også kan verificeres gennem TEM og/eller MALS. Brug Schulz-Zimm spheroid (q0), cylinder (q-1), eller fleksibel cylinder (q-2)modeller. Irena leverer værktøjer til montering af strømlove(SAS/Support Tools til plot og tabeller).
      3. Vælg den første spredningspopulation (1P) i Model cntrls, og sørg for, at den er den eneste, der er i brug (Markér afkrydsningsfeltet Brug?
      4. Vælg Størrelsesdist. for Model, og vælg den ønskede distributionstype og formfaktor. Angiv de oprindelige parametre for søgningen ved at angive værdier i felterne Skalering, Middelstørrelseog Bredde, og klik på Beregn model for at tegne den resulterende formularfaktor.
        BEMÆRK: Den fleksible cylinderformfaktor kan tilføjes som en brugerformfaktor og downloades fra https://usaxs.xray.aps.anl.gov/software/irena. Parametre 1 og 2 svarer til længden af cylinderen og Kuhn længde, henholdsvis.
      5. Når der er fundet rimelige parametre, skal du klikke på Tilpas model for at udføre en ikke-lineær mindst firkant, der passer til dataene. Størrelsesfordelingsmodellen giver middelradius og bredde.
        Til beregning af polydispersity (PDI) brug
        Equation 5
        Som det er tilfældet med enhver ikke-lineær monteringsprocedure, kan det være nødvendigt at justere dataområdet(q-området) og startparametrene for at opnå en stabil, fysisk rimelig pasform.
      6. Når en rimelig pasform er opnået, gemme det(Store i Notebook/Store i mappen).
    5. Dernæst model spredningen af de enkelte polymerer i PCM kernen. Dette kan opfanges ved en magt lov model (f.eks q-2 for ideelle kæder, q-5 /3 for hævede kæder, osv.). Irena gennemfører dette gennem en Beaucage model43:
      Equation 6
      hvor P er magtloven, og G og B er forudsætninger.
      1. Juster datakontrolelementerne, så de dækker hele q-området, og omplot modellen igen (Beregn model). Typisk vil overskydende spredning blive observeret i det moderate til høje q-område (f.eks. q > ~0,1 Å-1).
      2. Brug datakontrolelementerne til at vælge q-området, hvor overskydende spredning (>10x formfaktormodellen) overholdes.
      3. Tilføj en anden spredning befolkning (2P) og sørg for det er den eneste i brug (fravælg Brug? for 1P).
      4. Vælg Samlet niveau for modellen. B og P er de relevante parametre. Brug plottestøtteværktøjerne eller tilpas P/B mellem csrs-makroen for at få et første gæt for disse parametre, og juster Guinier-faktor G og Rg for at sikre, at modellen ikke forudsiger overdreven spredning ved lav q.
      5. Med hensyn til formfaktoren skal du udføre en ikke-lineær tilpasning og registrere parametrene og modellen.
    6. Dernæst, Hvis en diffraktion peak er til stede, som i figur 4, tilføje en tredje model for en diffraktion peak i q vifte af interesse (q = ~ 0,22 Å-1 i dette tilfælde).
    7. Når der opnås omtrentlige tilpasningsværdier for de enkelte spredningspopulationer, skal du tænde alle tre sammen (vælg Brug? for hver) og optimere den kombinerede pasform.
    8. Kontroller, at hver værdi forbliver fysisk rimelig. Resultatet af denne procedure bør være en sammensat model , der beskriver SAXS-dataene langt over en lang række størrelsesskalaer, som vist i figur 4. Gem tilpasningen ved hjælp af knappen Store i mappe, så den gemmer i Igor.

6. Transmission Elektron mikroskopi (TEM)

  1. Cryo TEM
    1. Vælg gitteret. Vi anbefaler holey carbon support film på en standard TEM gitter eller lacey carbon som et alternativ. I begge tilfælde vil hullerne mellem kulstof et billedområde af ren glasagtig is og prøve og ingen film.
    2. Placer gittercarbonsiden op i et glødeafgiftsapparat på et rent glasdias. Indpakning dias i laboratoriefilm kan hjælpe med gitter håndtering. Undgå at røre midten af nettet med pincet og altid knibe nær kanten af nettet.
    3. Udsæt gitteret i 30 s.
    4. Forbered en vitrifikationsrobot til prøveaflejring.
      1. Indstil til 100% fugtighed og RT og tilføj blotting papir. Forbered flydende ethan og flydende kvælstof bade i bunden af robotten. Se online tutorials og videoer for yderligere hjælp med vitrifikation robot forberedelse og brug.
    5. Fortyndet prøve 5x.
    6. Brug de negative action pincet forsynet med vitrifikation robot, afhente et gitter, derefter vedhæfte pincet til robotten og flytte pincet ind i kammeret.
    7. Mens du er i robotten, tilsættes 4 μL af prøven til kulsiden af nettet ved hjælp af en pipette gennem hullet i siden af maskinen.
    8. Inkuber i 4 min.
    9. Ved hjælp af robotten, blot 3-5 s med filterpapir.
    10. Vitrifikationsrobotten vil kaste gitteret ud i flydende ethan.
    11. Fjern pincet og flytte nettet til flydende kvælstof og ind i en opbevaringsbeholder, som også bør være under flydende nitrogen. Denne proces løser prøven i et tyndt lag glaslegemeis. Minimer den tid, gitteret tilbringer ud af den flydende ethan eller flydende nitrogen i løbet af dette trin.
    12. Kryoprøveholderen afkøles med flydende nitrogen. Hold en Dewar og reservoir fuld.
    13. Når gitteret er klar til billedbillede, skal du lægge gitteret på kryoprøveholderen. Prøven holdes under flydende nitrogen eller kortvarigt i den ekstremt kolde nitrogendamp lige over væskeoverfladen.
    14. Billede gitteret på 120 kV mellem 75kx og 150kx i tynd og tyk is, fordi forskellige størrelser micelles kan foretrække en vis istykkelse.
      1. Begræns stråleeksponeringen for at undgå smeltende is og beskadige prøven. Fokuser ikke direkte på, hvor planlægning til billede; fokus i nærheden. Udsæt kun interesseområdet, mens du optager et billede.
      2. Sørg for at skelne væskeethandråber fra prøven, når du ser billeder (se figur 5).
  2. Konventionel TEM ved hjælp af negativ farvning
    1. Gør pletten klar.
      1. Kog ~ 10 ml ultrarent vand. Afvej 0,1 g uranylformat (UFo) i et 15 ml konisk rør.
      2. Tilsæt 5 ml varmt vand til UFo-pulveret for en 2% opløsning. Luk tæt og wrap i aluminiumsfolie at blokere lys. En 1% uranyl acetat pletten er også almindeligt anvendt.
      3. Vortex eller ryst kraftigt i 5 min. Fastgørelse af røret til vortexer vil hjælpe. Filtrer gennem et 0,2 μm sprøjtefilter i et rent konisk rør.
      4. Lad afkøle 10 min til RT. Tilsæt 25 μL 5M NaOH og vortex straks i 2 min.
        1. Alternativt kan du fryse 200 μL aliquots af 2% UFo. Når det er klar til brug, tø en aliquot, tilsættes 1 μL 5 M NaOH, og vortex i 2 min.
      5. Hold pletten pakket ind i folie eller væk fra lys.
    2. Prøven fortyndes 10x i 1x PBS (eller den ønskede buffer).
    3. Vælg gitter. Vi anbefaler carbon support film på kobber net. Den mørkere, mere skinnende side af nettet er den kulstofbelagte side, hvor prøven vil blive deponeret og plettet.
    4. Placer gittercarbonsiden op i et glødeafgiftsapparat på et rent glasdias. Se trin 6.1.2.
    5. Udsæt gitteret i 30 s.
    6. Saml gitteret op med carbon siden stadig vender op og hold med negativ handling pincet ved kanten af nettet for at forhindre rive billeddannelse område i midten. Sæt pincet med nettet stadig holdt kulstof side op.
    7. Påfør en 4 μL dråbe prøve på toppen (carbon side) af nettet med en pipette.
    8. Inkuber4 min.
    9. Med ~1 min venstre, pipette en 10 μL og en 20 μL dråbe UFo opløsning på et stykke ren laboratorium film.
    10. Brug filterpapir til at transportere prøven fra kanten af gitteret (vinkelret kontakt) for at undgå kontakt med billedoverfladen.
    11. Brug enpincenerne (der stadig holder gitteret) anbringes straks prøvesiden af gitteret på 10 μL UFo-dråber, og fjern derefter straks væsken (vasketrin). Det er vigtigt ikke at lade nettet tørre, så stop ikke mellem trin.
    12. På samme måde påføres 20 μL UFo-dråberpå nettet. Hold gitteret på UFo i 40 s. Wick væsken ud og lad nettet tørre.
    13. Billede det tørre gitter ved 120 kV mellem 20.000 x og 100.000x.
    14. Sørg for at bortskaffe alle UFo-forurenede materialer korrekt ved hjælp af institutionens sikkerhedstjeneste for radioaktivt affald.
    15. Når det er nødvendigt, kan lysstyrke/kontrastforbedring og et medianfilter anvendes på TEM-billeder i ImageJ for at reducere baggrundsstøj. Efterbehandling bør ske ensartet, kun for billeder, der ikke udnyttes til kvantitative målinger såsom intensitet, og bør altid indberettes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at illustrere de ovenfor beskrevne karakteriseringsmetoder viser vi typiske resultater for PCM'er, der er samlet fra oligonucleotider og blokere copolymerer af forskellig længde og kemi (figur 1). Figur 2 giver et eksempel på, hvordan PCM-kernestørrelse (som bestemt fra SAXS og TEM, figur 4 og figur 5) varierede med ladet bloklængde. Figur 3 viser DLS-data og tilpasningsresultater for sfæriske PCM'er dannet af relativt lange køjeprodukter og korte enkeltstrengede oligonucleotider. Figur 4 illustrerer, hvordan komplekse SAXS-intensitetsspektre kan være nøjagtigt egnede ved at kombinere modeller for de mange rumlige korrelationer, der var til stede (ekstern overflade, intra-core spredning, inter-helix bestilling), og hvordan MALS kunne bruges til at udvide spredningsmålinger til længere længdeskalaer. Endelig viser figur 5 repræsentative elektronmikroskopidata for PCMs af varierende morfologi.

Figure 1
Figur 1: Samling og karakterisering af nukleinsyre-PCM'er. A) Anioniske polymerer, såsom oligonucleotider, dannede faseadskilte komplekser med kationiske områder af diblock copolymerer. Tilstedeværelsen af en hydrofile neutral blok (grå) resulterede i dannelse af stabile PCM nanopartikler. (B) PCMs var kerne-shell nanopartikler med flere parametre til at karakterisere. Den samlede størrelse (hydrodynamisk radius, Rh) kunne bestemmes ved hjælp af DLS, kerneradius (Rc)kunne findes ved hjælp af SAXS og TEM, corona størrelse kunne beregnes som Rh-Rc, og morfologi kunne bestemmes over flere længde skalaer ved at kombinere SAXS, MALS, og TEM. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Micelle størrelse afhængighed. Micelle kernestørrelse blev primært bestemt af længden af den ladede blok copolymer, og stort set uafhængig af længden af homopolymer7,26. Dette giver mulighed for kontrol af PCM størrelse ved valg af blok polymer. De data, der vises her, er for pLys-PEG med 88 nt/bp DNA og er tidligere blevet rapporteret26. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Dynamisk lysspredning. (A) Autokorrelationsfunktion (vilkårlige enheder) for 10 nt enkeltstrenget DNA + pLys(100)-PEG(10k) PCM. B) Hydrodynamisk radiusfordeling (histogram) fra REPES fit. Autokorrelationsfunktionen henfalder til en flad værdi med en enkelt tidsskala, hvilket resulterer i et enkelt størrelseshøjdepunkt i REPES størrelsesfordelingen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Repræsentative SAXS- og MALS-data, der er egnede til en cylindrisk mikrofon. SAXS-data (grå cirkler) vises for PCM'er, der er samlet fra pLys(50)-PEG(5k) og 88 bp dobbeltstrenget DNA. Ved lav q (< 10-2 Å-1)viste intensiteten en ca. q-2 afhængighed af momentumoverførsel, hvilket indebærer en fleksibel cylinderform (ormlignende micelle). MALS-data (åbne sorte cirkler) viser den samme afhængighed, hvilket indikerer, at micellerne var mindst flere mikrometer i længden (bekræftet af TEM-billeddannelse, figur 5C,D). Spheroidal micelles ville vise en flad afhængighed (q0)af intensitet på q i dette interval. De farvede linjer illustrerer multikomponenttilpasningsproceduren for PCM SAXS-data, der er beskrevet i afsnit 5. Spredning ved lave q (store afstandsskalaer) var domineret af pc'ens udvendige overflade og passer godt af en fleksibel cylindermodel (rød). Ved højere q værdier (mindre længde skala), spredning var domineret af de enkelte polymerer inde i PCM kerne, passer her ved en magt lov (grøn) med lav q cutoff. Vi observerede også parallel pakning af dobbeltstrengede DNA helices i PCM kernen, hvilket resulterer i en kvasi-Bragg diffraktion peak (blå). Den sorte stiplede linje viser, at kombinationen af disse modeller nøjagtigt beskrev SAXS-dataene, og tilføjelsen af lysspredningsdata (åbne cirkler) udvidede størrelsesområdet over næsten fire størrelsesordener. Passende resultater gav en PCM befolkning med gennemsnitligradius = 11,0 nm og PDI = 0,03, magt lov ved høj q = 1,81 og diffraktion peak repræsenterer inter-helix afstand på 2,71 nm. SAXS-data er tidligere blevet rapporteret26 og er offentligt tilgængelige44. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: TEM-billeder af nukleinsyre-PC'er. (A-B) Cryo TEM af 22 nt enkeltstrenget DNA + pLys(50)-PEG(5k) PCMs, der viser overvejende sfærisk morfologi. Blå pile angiver flydende ethandråber, ikke at forveksle med PCMs (teksturerede spheroidal objekter). (A) er lidt under-fokuseret, tilføjer mindre kontrast og samtidig bevare opløsning. (B) er væsentligt underfokuseret, hvilket tilføjer mere kontrast, men ofrer klarhed. Justeringer af lysstyrke og kontrast og et medianfilter på to pixel blev anvendt på begge billeder. (C-D) Negative farvede TEM på 88 bp dobbeltstrenget DNA + pLys(50)-PEG(5k) PCMs, som er lange fleksible cylindre. I begge tilfælde var kerneradier fra TEM i overensstemmelse med de værdier, der blev opnået ved montering af SAXS-data. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Som nævnt ovenfor, protokollerne præsenteres her er skrevet med fokus på oligonucleotider som polyanion komponent og pLys-PEG som kationisk-neutral blok copolymer, men vi har testet dem med en række polymerer, såsom poly (akrylsyre), polyglutamat, og PEG-poly (vinylbenzyl trimethylammonium), og mener, at de vil være generelt gældende for de fleste polyelektrolyt par. En parameter, der kan være nødvendigt at optimere, er saltkoncentrationen, der anvendes til glødning, fordi det skal være højt nok til, at PCM'er ikke dannes i begyndelsen af annealen. Dette kan kontrolleres eksperimentelt af DLS, eller i forhold til observation af faseadskillelse med polyelektrolytter alene (ingen neutral blok). Termisk glødning kan anvendes, hvis salt annealing er uønsket, selv om de resulterende polydispersities er større7. De koncentrationer, der anvendes til karakterisering også kan være nødvendigt at optimere, fordi større nanopartikler sprede mere lys end små, og nukleinsyrer er mere effektive til spredning af røntgenstråler end mange andre polymerer på grund af tilstedeværelsen af elektron-tætte fosforatomer i rygraden. Det kan også være nødvendigt at kontrollere bufferens pH nærmere, hvis en af polyelektrolyten har en pKa tæt på arbejdstilstanden.

I denne artikel præsenterer vi protokoller for to lysspredningsteknikker (dvs. multivinkel/statisk lysspredning og dynamisk lysspredning), samt lille vinkel røntgenspredning, og både kryo og konventionel negativ plettransmission elektron mikroskopi, med repræsentative data for hver. Ikke alle teknikker er nødvendige for alle scenarier, og andre er også tilgængelige, hvilket rejser spørgsmålet om, som bør anvendes, når. Rigelig gennemgang litteratur findes om dette emne45,46, men vi foreslår følgende, når der karakteriserer en ny PCM eller lignende nanopartikel. Begynd med at kontrollere for sammenlægning, både ved visuel inspektion for turbiditet og ved optisk mikroskopi. Hvis der ikke observeres sammenlægning, er det næste skridt at afgøre, om der findes nanopartikler. DLS er en hurtig måde at afgøre dette, fordi PCMs sprede lys kraftigt, og svage eller ikke-eksisterende lys spredning er en stærk indikator for dårlig nanopartikel dannelse. Mens DLS kan bekræfte tilstedeværelsen af nanopartikler, er det vanskeligt at bestemme deres størrelse og form uden henvisning til andre data, som de fleste analysemetoder er afhængige af Stokes-Einstein forholdet, som forudsætter sfæriske partikler. MALS kan bekræfte sfæriske former (flad normaliseret intensitet vs. vinkel), men kan ikke være i stand til at bestemme formen af nonspherical partikler, medmindre størrelsen fordelingen er både smal og sker for at falde i det korrekte område for opløsning. Derfor anbefaler vi, at du udfører TEM, SAXS eller begge dele på en pcm-prøve for fuldt ud at karakterisere dens egenskaber.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker Phil Griffin og Tera Lavoie fra Soft Matter Characterization Facility og Advanced Electron Microscopy Facility, henholdsvis på The University of Chicago. Vi takker også Xiaobing Zuo og Soenke Seifert fra Advanced Photon Source på Argonne National Laboratory og NIST Center for Hierarchical Materials Design (CHiMaD) for støtte. Vi takker Jeff Ting og Michael Lueckheide for deres bidrag til dette arbejde.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70 mm circle filter paper Whatman 1001-070 Filter paper for wicking during grid prep
Carbon Film TEM grid Electron Microscopy Sciences CF200-Cu TEM grid
DAWN Wyatt Technology DAWN MALS instrument
DNA oligonucleotide Integrated DNA Nanotechnologies Inc Custom oligonucleotide
Lacey Carbon TEM grid Electron Microscopy Sciences LC200-Cu TEM grid
Methoxy-poly(ethylene glycol)-block-poly(l-lysine hydrochloride) PEG5k - PLKC50 Alamanda Polymers Inc mPEG5K-b-PLKC50 Example block copolymer
Milli-Q Millipore Sigma Ultrapure water
NanoDrop Thermo Scientific For measuring nucleic acid concentration
negative-action tweezers Dumont N7 Tweezers for grid preparation
Parafilm "M" Bemis Company Inc PM996 Laboratory film
Quantifoil Holey Carbon TEM grid Electron Microscopy Sciences Q210CR1.3 TEM grid
Research Goniometer and Laser Light Scattering System Brookhaven Instruments BI-200SM DLS/MALS instrument
Slide-A-Lyzer G2 2K 0.5 mL Thermo Scientific Pierce Protein Biology 87723 Dialysis cartridge
small volume cuvette Brookhaven Instruments BI-SVC Cuvette for DLS/MALS
Solarus 950 Advanced Plasma System Gatan Solarus 950 Plasma system for TEM grids
Talos TEM FEI Talos TEM used for cryo samples
Tecnai Spirit TEM FEI Spirit TEM used for dry samples
Uranyl Formate SPI-Chem 16984-59-1 For negative staining samples for TEM
Vitrobot FEI Vitrobot Vitrification robot for cryo grid preparation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Spruijt, E., Westphal, A. H., Borst, J. W., Cohen Stuart, M. A., van der Gucht, J. Binodal compositions of polyelectrolyte complexes. Macromolecules. 43 (15), 6476-6484 (2010).
  2. van der Gucht, J., Spruijt, E., Lemmers, M., Cohen Stuart, M. A. Polyelectrolyte complexes: bulk phases and colloidal systems. Journal of Colloid and Interface Science. 361 (2), 407-422 (2011).
  3. Priftis, D., Laugel, N., Tirrell, M. Thermodynamic characterization of polypeptide complex coacervation. Langmuir. 28 (45), 15947-15957 (2012).
  4. Fu, J., Schlenoff, J. B. Driving Forces for Oppositely Charged Polyion Association in Aqueous Solutions: Enthalpic, Entropic, but Not Electrostatic. Journal of the American Chemical Society. 138 (3), 980-990 (2016).
  5. Vieregg, J. R., et al. Oligonucleotide-Peptide Complexes: Phase Control by Hybridization. Journal of the American Chemical Society. 140 (5), 1632-1638 (2018).
  6. Voets, I. K., de Keizer, A., Cohen Stuart, M. A. Complex coacervate core micelles. Advances in Colloid and Interface Science. 147-148, 300-318 (2009).
  7. Lueckheide, M., Vieregg, J. R., Bologna, A. J., Leon, L., Tirrell, M. V. Structure-Property Relationships of Oligonucleotide Polyelectrolyte Complex Micelles. Nano Letters. 18 (11), 7111-7117 (2018).
  8. De Kruif, C. G., Weinbreck, F., de Vries, R. Complex coacervation of proteins and anionic polysaccharides. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 9 (5), 340-349 (2004).
  9. Vieregg, J. R., Tang, T. Y. D. Polynucleotides in cellular mimics: Coacervates and lipid vesicles. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 26, 50-57 (2016).
  10. Marciel, A. B., Chung, E. J., Brettmann, B. K., Leon, L. Bulk and nanoscale polypeptide based polyelectrolyte complexes. Advances in Colloid and Interface Science. 239, 187-198 (2017).
  11. Cabral, H., Miyata, K., Osada, K., Kataoka, K. Block Copolymer Micelles in Nanomedicine Applications. Chemical Reviews. 118 (14), 6844-6892 (2018).
  12. Tan, Z., et al. Block Polymer Micelles Enable CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein Delivery: Physicochemical Properties Affect Packaging Mechanisms and Gene Editing Efficiency. Macromolecules. 52 (21), 8197-8206 (2019).
  13. Horn, J. M., Kapelner, R. A., Obermeyer, A. C. Macro- and Microphase Separated Protein-Polyelectrolyte Complexes: Design Parameters and Current Progress. Polymers. 11 (4), 578 (2019).
  14. Juliano, R. L. The delivery of therapeutic oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 44 (14), 6518-6548 (2016).
  15. Kanasty, R., Dorkin, J. R., Vegas, A., Anderson, D. Delivery materials for siRNA therapeutics. Nature Materials. 12 (11), 967-977 (2013).
  16. Lorenzer, C., Dirin, M., Winkler, A. M., Baumann, V., Winkler, J. Going beyond the liver: progress and challenges of targeted delivery of siRNA therapeutics. Journal of Controlled Release. 203, 1-15 (2015).
  17. Allen, T. M., Cullis, P. R. Liposomal drug delivery systems: from concept to clinical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (1), 36-48 (2013).
  18. Li, W., Szoka, F. C. Lipid-based nanoparticles for nucleic acid delivery. Pharmaceutical Research. 24 (3), 438-449 (2007).
  19. Miyata, K., Nishiyama, N., Kataoka, K. Rational design of smart supramolecular assemblies for gene delivery: chemical challenges in the creation of artificial viruses. Chemical Society Reviews. 41 (7), 2562-2574 (2012).
  20. Oishi, M., Nagasaki, Y., Itaka, K., Nishiyama, N., Kataoka, K. Lactosylated poly(ethylene glycol)-siRNA conjugate through acid-labile ss-thiopropionate linkage to construct pH-sensitive polyion complex micelles achieving enhanced gene silencing in hepatoma cells. Journal of the American Chemical Society. 127 (6), 1624-1625 (2005).
  21. Christie, R. J., et al. Targeted polymeric micelles for siRNA treatment of experimental cancer by intravenous injection. ACS Nano. 6 (6), 5174-5189 (2012).
  22. Kuo, C. H., et al. Inhibition of atherosclerosis-promoting microRNAs via targeted polyelectrolyte complex micelles. Journal of Materials Chemistry B. 2 (46), 8142-8153 (2014).
  23. Ge, Z., et al. Targeted gene delivery by polyplex micelles with crowded PEG palisade and cRGD moiety for systemic treatment of pancreatic tumors. Biomaterials. 35 (10), 3416-3426 (2014).
  24. Van Bruggen, C., Hexum, J. K., Tan, Z., Dalai, R. J., Reineke, T. M. Nonviral Gene Delivery with Cationic Glycopolymers. Accounts of Chemical Research. 52 (5), 1347-1358 (2019).
  25. Hayashi, K., et al. Influence of RNA Strand Rigidity on Polyion Complex Formation with Block Catiomers. Macromolecular Rapid Communications. 37 (6), 486-493 (2016).
  26. Marras, A. E., Vieregg, J. R., Ting, J. M., Rubien, J. D., Tirrell, M. V. Polyelectrolyte Complexation of Oligonucleotides by Charged Hydrophobic-Neutral Hydrophilic Block Copolymers. Polymers. 11 (1), 83 (2019).
  27. Phillips, H. R., et al. Glycopolycation-DNA Polyplex Formulation N/P Ratio Affects Stability, Hemocompatibility, and in Vivo Biodistribution. Biomacromolecules. 20 (4), 1530-1544 (2019).
  28. Ting, J. M., Wu, H., Herzog-Arbeitman, A., Srivastava, S., Tirrell, M. V. Synthesis and Assembly of Designer Styrenic Diblock Polyelectrolytes. ACS Macro Letters. 7 (6), 726-733 (2018).
  29. Zadeh, J. N., et al. NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems. Journal of Computational Chemistry. 32 (1), 170-173 (2011).
  30. Santa Lucia, J. A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (4), 1460-1465 (1998).
  31. Xia, T., et al. Thermodynamic parameters for an expanded nearest-neighbor model for formation of RNA duplexes with Watson-Crick base pairs. Biochemistry. 37 (42), 14719-14735 (1998).
  32. Orthaber, D., Bergmann, A., Glatter, O. SAXS experiments on absolute scale with Kratky systems using water as a secondary standard. Journal of Applied Crystallography. 33 (2), 218-225 (2000).
  33. Srivastava, S., et al. Gel phase formation in dilute triblock copolyelectrolyte complexes. Nature Communications. 8, 14131 (2017).
  34. Lindhoud, S., et al. Salt-induced disintegration of lysozyme-containing polyelectrolyte complex micelles. Langmuir. 25 (19), 11425-11430 (2009).
  35. Lindhoud, S., de Vries, R., Schweins, R., Stuart, M. A. C., Norde, W. Salt-induced release of lipase from polyelectrolyte complex micelles. Soft Matter. 5 (1), 242-250 (2009).
  36. Ilavsky, J., Jemian, P. R. Irena: tool suite for modeling and analysis of small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 42 (2), 347-353 (2009).
  37. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  38. Jakeš, J. Regularized positive exponential sum (REPES) program-A way of inverting laplace transform data obtained by dynamic light scattering. Collection of Czechoslovak Chemical Communications. 60 (11), 1781-1797 (1995).
  39. Schillen, K., Brown, W., Johnsen, R. M. Micellar Sphere-to-Rod Transition in an Aqueous Triblock Copolymer System - a Dynamic Light-Scattering Study of Translational and Rotational Diffusion. Macromolecules. 27 (17), 4825-4832 (1994).
  40. Provencher, S. W. Contin - a General-Purpose Constrained Regularization Program for Inverting Noisy Linear Algebraic and Integral-Equations. Computer Physics Communications. 27 (3), 229-242 (1982).
  41. Provencher, S. W. A Constrained Regularization Method for Inverting Data Represented by Linear Algebraic or Integral-Equations. Computer Physics Communications. 27 (3), 213-227 (1982).
  42. Sarachan, K. L., Curtis, J. E., Krueger, S. Small-angle scattering contrast calculator for protein and nucleic acid complexes in solution. Journal of Applied Crystallography. 46 (6), 1889-1893 (2013).
  43. Beaucage, G. Approximations leading to a unified exponential power-law approach to small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 28 (6), 717-728 (1995).
  44. Marras, A. E., Vieregg, J. R., Ting, J. M., Rubien, J. D., Tirrell, M. V. Materials Data Facility. , 10.18126/M2QW8R (2018).
  45. Modena, M. M., Rühle, B., Burg, T. P., Wuttke, S. Nanoparticle Characterization: What to Measure. Advanced Materials. , (2019).
  46. Mourdikoudis, S., Pallares, R. M., Thanh, N. T. K. Characterization techniques for nanoparticles: comparison and complementarity upon studying nanoparticle properties. Nanoscale. 10 (27), 12871-12934 (2018).

Tags

Kemi nukleinsyre levering polyelektrolyt kompleks micelle nanopartikler fase adskillelse oligonucleotider
Samling og karakterisering af polyelektrolytkompleksmiceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marras, A. E., Vieregg, J. R.,… More

Marras, A. E., Vieregg, J. R., Tirrell, M. V. Assembly and Characterization of Polyelectrolyte Complex Micelles. J. Vis. Exp. (157), e60894, doi:10.3791/60894 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter