Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Montering och karakterisering av Polyelektrolyt Complex Micelles

Published: March 2, 2020 doi: 10.3791/60894
Automatic Translation
1, 1, 1
1Pritzker School of Molecular Engineering, The University of Chicago

Summary

Vi tillhandahåller protokoll och representativa data för design, montering och karaktäriserande polyelektrolyt komplexa miceller, core-shell nanopartiklar som bildas av polyelektrolyter och hydrofila laddade block sampolymerer.

Abstract

Polyelektrolyt komplexa miceller (PCMs), core-shell nanopartiklar som bildas av självmontering av laddade polymerer i vattenlösning, ger en kraftfull plattform för att utforska fysikpolyelektrolytinteraktioner och erbjuder också en lovande lösning på det akuta problemet med att leverera terapeutiska oligonukleotider in vivo. Att utveckla prediktiva struktur-egendom relationer för PCMs har visat sig svårt, delvis på grund av förekomsten av starka kinetiska fällor under nanopartikel självmontering. I den här artikeln beskrivs kriterier för att välja polymerer för PCM-konstruktion och ger protokoll baserade på saltglödgning som möjliggör montering av repeterbara nanopartiklar med låg polydispersity. Vi diskuterar också PCM karakterisering med ljusspridning, liten vinkelröntgenspridning och elektronmikroskopi.

Introduction

När motsatta laddade polyelektrolyter blandas i vattenlösning, entropi vinst från utsläpp av sina kontringar orsakar avblandning av lösningen i en polymer-rik kondenserad fas och en polymer-utarmade supernatant1,2,3,4,5, ett fenomen som kallas polyelektrolyt komplexation. Om ett neutralt hydrofiliskt block konjugeras till en eller båda av polyelektrolyterna, uppstår nanoskalafasseparation istället (figur 1A). De resulterande självmonterade kärnskalnanopartiklarna kallas omväxlande polyelektrolytkomplexa miceller (PCMs), polyjonkomplexa miceller, blockjonomerkomplex eller coacervate-core micelles analogt till ytaktiva micellization, även om alla komponenter i systemet är hydrofila6,7. En PCM förmåga att kapsla in hydrofila molekyler såsom proteiner och nukleinsyror, liksom den omfattande tunability som erbjuds av blocket sampolymer bärare arkitektur gör dem attraktiva kandidater för att leverera terapeutiska molekyler in vivo8,9,10,11,12,13.

Att leverera terapeutiska nukleinsyror till cellulära mål är en särskilt viktig utmaning, och en utmaning för vilken PCMs erbjuder flera fördelar. Terapeutiska nukleinsyror (genetiska DNA, mRNA och oligonukleotider såsom siRNA) har en enorm potential för att förbättra människors hälsa, men måste övervinna många biologiska och fysiska hinder för att inse att potentiella14,15,16. Nakna nukleinsyror bryts ned av serum och cellulära nucleases, snabbt rensas från cirkulationen, och deras starka negativa laddning gör det svårt för dem att penetrera cellmembran utan hjälp. Nuvarande metoder för att övervinna dessa hinder inkluderar kostsamma kemiska modifieringar för att förhindra skador från nucleases och / eller inkapsling i olika lipid nanopartiklar monteras via hydrofoba interaktioner15,17,18. Medan dessa metoder har visat sig vara effektiva för lokala injektioner och lever inriktning, systemisk användning presenterar betydande begränsningar av toxicitet, immunogenicitet, och begränsad biodistribution16. Däremot använder PCMs den negativa laddningen av nukleinsyror för att kondensera dem inom den fasseparerade kärnan, medan den neutrala koronan ger en steric barriär mot nedbrytning samt en plattform för att införliva ligands för att förbättra inriktning eller internalisering11,19. In vitro och djurstudier har visat att PCM-datorer effektivt kan leverera olika nukleinsyra nyttolaster20,21,22,23,24, men svagheter i vår förmåga att förutsäga PCM egenskaper såsom storlek, form och stabilitet från egenskaperna hos de ingående polymererna har hindrat deras bredare antagande.

Senaste arbetet av vår grupp och andra inom området har börjat ta itu med detta problem genom att utveckla struktur-egendom, och i vissa fall struktur-egendom-funktion relationer för PCMs bildas från nukleinsyror och olika cationic-neutrala polymerer7,25,26,27. Två konsekventa teman som har uppstått ur dessa studier är vikten av att utveckla välkontrollerade, repeterbara protokoll för PCM-montering och fördelen med att använda flera tekniker för att karakterisera de resulterande nanopartiklarna. Polyelektrolyter, särskilt de med hög laddningstäthet som nukleinsyror, interagerar mycket starkt med varandra och verkar lätt fastna vid blandning, vilket resulterar i PCM-preparat som är mycket känsliga för små variationer i förfarandet och uppvisar hög polydispersity och dålig repeterbarhet från parti till parti. PCMs har också visat sig anta ett brett spektrum av former och storlekar beroende på atomnivå konfigurationer av sina komponenter, och fånga denna mångfald med någon enskild karakterisering teknik är mycket svårt, särskilt eftersom vissa vanliga tekniker såsom dynamisk ljus spridning (DLS) kräver antaganden om partikelform för deras tolkning.

I den här artikeln diskuterar vi materialdesign och urval för PCM, med fokus på oligonukleotider och katjoniska-neutrala diblock sampolymerer. Vi beskriver sedan ett salt glödgning protokoll som använder höga saltkoncentrationer följt av långsam dialys för att undvika kinetisk fångst under PCM montering. Polyelektrolyterna blandas i höga saltförhållanden där elektrostatiska attraktioner screenas, då sänks saltkoncentrationen långsamt för att polyelektrolyterna ska kunna bosätta sig i sina mest energiskt gynnsamma konfigurationer, analoga med den långsamma kylningsprocessen av termisk glödgning. Med hjälp av detta protokoll, vi regelbundet kunna uppnå exceptionellt låg polydispersity och hög repeterbarhet för oligonucleotide PCMs7,26. Slutligen beskriver vi hur fyra separata mättekniker kan användas för att karakterisera PCMs över ett mycket brett spektrum av längdskalor, från extern morfologi till intern struktur: DLS, multi-vinkel ljus spridning (MALS), liten vinkel röntgen spridning (SAXS), och överföring elektronmikroskopi (TEM). Vi hoppas att dessa protokoll kommer att göra det möjligt för fler forskare att effektivt utforska kapaciteten hos dessa intressanta nanopartiklar.

Polymerval och beredning
PCM egenskaper påverkas starkt av de fysiska och kemiska egenskaperna hos de ingående polymererna, vilket gör polymerval ett kritiskt steg i designprocessen. De mest välkarakteriserade blocksampolymererna för nukleinsyrapcms är linjära diblocks såsom poly (lysin)-poly (etylenglykol) (pLys-PEG), men PCMs kan bildas mellan polyelektrolyter och en mängd hydrofila neutrala laddade polymerer, som kan genereras i en hög genomströmning sätt28. Valet av laddad grupp påverkar starkt stabiliteten i jonparning och form av miceller26, och PCM storlek har visat sig öka med längden på den laddade blocket5,7,26 (figur 2), vilket gör PCM egenskaper som skall justeras för kraven på en önskad ansökan. För linjära diblocks har vi funnit att det laddade blocket ska ha minst 10 avgifter och laddas starkt vid önskat pH. Längre laddade block kan främja PCM-bildning med oligonukleotider såsom siRNA, som är svåra att komplexa med kortare block21. Vi har framgångsrikt observerat PCM-bildning med blocklängder upp till 200, och litteraturen beskriver längre polymerer. Mer flexibilitet finns i valet av neutrala block24, men erfarenheten har visat att mycket korta neutrala block leder till aggregering snarare än nanopartikelbildning, och att den minsta neutrala längden ökar med laddad blocklängd. För pLys-PEG krävs en PEG MW på minst 3 000–5 000 för pLys-längder under ~50, och längre längder krävs eftersom det laddade blocket höjs ytterligare. Ökad neutral blocklängd resulterar i ökad PCM-storlek, särskilt skaltjocklek, på grund av steric trängsel av neutrala polymerer.

Detta manuskript presenterar ett protokoll för att förbereda PCMs från lyophilized hög renhet pLys-PEG och oligonukleotider av känd kvantitet, men bör lätt anpassas till andra system också. Vi har testat det framgångsrikt med flera laddade polypeptider, inklusive polyarginin och polyglutamussyra, samt flera syntetiska polyelektrolyter, såsom polyakrylsyra och poly(vinylbensyltrimethylammonium). Vi beskriver också förbereda PCMs med ett stoichiometriskt förhållande av polyelektrolyt avgifter, men detta är lätt att ändra. Vi tycker att det är lättast att arbeta med laddningskoncentrationsenheter (c.c.), som också naturligt rymmer polymerer som inte är fulladdade. Om antingen polymer inte är väl karakteriserad, bör man se till att exakt bestämma polymerlängder / massor och se till att överflödigt salt inte finns utöver vad som behövs för laddning neutralisering genom dialys, till exempel. Förekomsten av allt behållat vatten bör också redovisas när koncentrationerna beräknas. Nukleinsyrakoncentrationen kan enkelt kvantifieras genom absorbans vid 260 nm, och förekomsten eller frånvaron av terminalfosfater bör beaktas vid beräkning av c.c.

Vid användning av oligonukleotider som polyanioner, hybridisering tillstånd och kemisk struktur bidra till att bestämma benägenheten för självmontering och egenskaperna hos den resulterande PCM5,7,26. Optimera dessa, inom kraven för biologisk effekt om du använder PCM för leverans, kommer att öka sannolikheten för att bilda de önskade strukturerna. Användbara verktyg för att analysera hybridisering inkluderar MATLAB-funktioner för nukleinsyror, NUPACK29och IDT OligoAnalyzer. Vi rekommenderar att analysera en kandidat sekvens för att förstå styrkan i bindning till 1) själv i en hårnål formation; 2) en annan kopia av samma sekvens (själv-dimer); och 3) till andra oligonukleotider som finns i systemet. DNA och RNA-smälttemperaturer för en viss sekvens kan också beräknas med hjälp av närmaste grannemetod 30,31. Termisk glödgning av nukleinsyror (steg 2.3) denaturerar eventuell akvariesekundär struktur i de enskilda nukleotiderna och främjar jämviktsvikning.

PCM karakterisering och analys
Ett brett spektrum av tekniker finns tillgängliga för att karakterisera nanopartiklar, inklusive statisk och dynamisk ljusspridning, liten vinkelspridning av elektroner eller neutroner och elektronmikroskopi. I den här artikeln tillhandahåller vi protokoll för två ljusspridningstekniker, liten vinkelröntgenspridning och två elektronmikroskopitekniker.

DLS mäter autokorrelationen av tidsmässiga fluktuationer i spridningsintensiteten i en vinkel från Brownian motion av provet. Montering av dessa data kan ge hydrodynamisk radie och polydispersity för sfäriska miceller(figur 3). Mals (Flera vinkelvinklar) mäter den statiska spridningsintensiteten i många vinklar. Detta kantiga beroende beskriver formen på nanopartikelen men är begränsad till längdskalor längre än ~50 nm för synligt ljus, vilket begränsar dess effektivitet för mindre nanopartiklar. Båda teknikerna är baserade på brytningsindex obalans och främst beskriva de yttre dimensionerna av nanopartikel.

Små vinkel röntgen spridning (SAXS) använder röntgenstrålar som spridning sonden, och deras kortare våglängd tillåter mätningar över en räckvidd på ~ 0,1-100 nm. Montering av den observerade spridningsintensiteten kontra vinkeln (konventionellt uttryckt som momentumöverföring q)ger information om PCM-morfologi (dvs. storlek och form) och även intern struktur. Om en absolut intensitetkalibrering finns tillgänglig, och om spridningsintensiteten kan extrapoleras till nollvinkel kan PCM-massa och aggregering också uppskattas32,vilket gör SAXS till en extremt mångsidig och värdefull metod. Liten vinkel neutron spridning (SANS) är känslig över ett liknande spektrum av längdskalor men är endast tillgänglig på specialiserade anläggningar och kommer inte uttryckligen diskuteras i denna artikel33,34,35.

De senaste åren har sett tillkomsten av bänksaxs instrument, men vi tycker att synkrotron källor är bättre lämpade för PCM karakterisering, eftersom deras högre intensitet tillåter data som ska samlas in mycket snabbare för dessa låg kontrast prover. Vi tillhandahåller ett kort protokoll för att förvärva PCM SAXS-data på Beamline 12-ID-B på Advanced Photon Source (Argonne National Laboratory, USA) ur ett användarperspektiv. Detta protokoll bör tillämpas på de flesta synkroniseringskällor, men samråd med lokal personal innan du föreslår ett experiment rekommenderas starkt. Vi tillhandahåller också ett datareducerings- och analysprotokoll med Irena36, en fri uppsättning makron skrivna för Igor Pro. Irena innehåller en mångsidig uppsättning formfaktorer för modellering AV SAXS-data och möjliggör konstruktion av multikomponentmodeller som kan beskriva pcms komplexa spridningsprofil (se representativa resultat, figur 4). Irena har också omfattande dokumentation och handledning finns tillgängliga online. Innan du försöker förfarandena nedan rekommenderar vi förtrogenhet med dessa, särskilt handledningen "Modellering av SAXS-data med två huvudsakliga scatterer populationer".

Strålningsskador är ett problem för röntgenspridning, men flera åtgärder kan användas för att minimera den. I synnerhet rekommenderar vi att du använder en flödescellinställning med en sprutpump och PCM-prov som flödar under datainsamling, snarare än en förseglad kapillär. Detta förenklar också kraftigt bakgrunden subtraktion. Vi föreslår också att ta flera exponeringar av det flödande provet snarare än en längre för att begränsa flödet som en enda volym av prov ser och för att möjliggöra jämförelse av exponeringsdata för att identifiera eventuella skador.

I motsats till spridningsteknikerna, som i allmänhet kräver montering för att tolka, ger transmissionselektronmikroskopi (TEM) en verklig visuell bild av nanopartiklarna genom att passera en elektronstråle genom provet och projicera en bild på en scintillationsskärm (figur 5). Vi presenterar protokoll för två TEM tekniker i denna artikel. Cryo TEM fryser glimmerprover i ett tunt lager glasaktig is, bevara strukturell konformation med minimala främmande ämnen, optimalför miceller ≤~10-100 nm i radie. Negativ fläck TEM använder ett tungmetallsalt (t.ex. uran) för att omge provet efter att det har torkats på ytan av ett rutnät. Den täta fläcken sprider fler elektroner än provet, lägger kontrast och producerar en negativ bild av provet. Cryo TEM rekommenderas för högkvalitativa bilder. Det är dock dyrare, tidskrävande, och kanske inte ger tillräcklig kontrast. När detta är ett problem bör negativa färgade prover användas. Exempel på var och en visas i figur 5.

Var och en av dessa tekniker rapporterar om något olika aspekter av nanopartiklar, med olika styrkor och begränsningar. Ljusspridning är lätt tillgänglig och är ofta den snabbaste metoden, men har betydande begränsningar i storlek och formupplösning. SAXS kan ge information om ett stort antal längdskalor vid någorlunda hög genomströmning, men kräver specialiserad utrustning för att förvärva data, samt modellering för att tolka den. TEM-bilder är enkla att tolka men kan begränsas i kontrast och är i sig lågt genomströmning. Vår erfarenhet har visat att använda flera tekniker för karakterisering ökar kraftigt den information som kan erhållas om PCM egenskaper och förenklar tolkningen av datauppsättningar som erhållits från var och en ensam. Saxs och TEM undersöker till exempel i första hand ett PCM-tals täta kärna, medan ljusspridningsrapporter om nanopartikelens övergripande dimensioner. Således, kombinera dem tillåter mätning av både kärna och korona storlek. TEM: s förmåga att förvärva verkliga rymdbilder kan ge mark sanningsdata för att möjliggöra val av lämpliga formfaktorer för modellering SAXS data som annars skulle vara tvetydiga. I den här artikeln beskrivs protokoll för alla fyra tekniker och en exempelprocess för att använda dem för att karakterisera ett okänt exempel anges i avsnittet Diskussion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Beredning av material

  1. Väg ut lyophilized diblock polymer och tillsätt vatten upp till nästan den volym som krävs för en lagerlösning på 10 mg/ml slutlig koncentration. Virvel vid maximal hastighet i 2 min.
  2. Sonicate i 5 min. Mycket långa diblocks kan kräva ytterligare ultraljudsbehandling. Lagerlösningen bör verka helt transparent och homogen.
  3. Justera pH till 7,4 med NaOH eller HCl efter behov. Tillsätt vatten till den slutliga volymen. pLys-PEG-lösningar är ganska stabila men bör förvaras för långtidsförvaring och pH måste kontrolleras före användning. Lyophilization är att föredra framför frysning.
  4. Resuspend lyophilized oligonucleotide(s) vid önskad lagerkoncentration, vanligtvis 2–5 mM molekylär koncentration för längder av 50 nt eller nedan. Virvel noggrant för att säkerställa fullständig upplösning.
  5. Beräkna molarkoncentrationer med molekylvikt eller längd enligt beskrivningen i inledningen.
  6. Beräkna molarladdningskoncentrationer (c.c.), där

Equation 1

Polyelektrolytladdningen är antalet laddade monomerer, medan nukleinsyraladdningen är antalet baser minus 1, förutsatt att ingen fosforylering inte är. Tänk på att dubbelsträngad DNA kommer att ha dubbelt så många laddningar per molekyl jämfört med enkelsträngat DNA.

  1. Skapa utspädd lager vid 20 mM c.c. för varje polymer.

2. Nukleinsyra Polyelektrolyt Micelle Beredning

  1. I ett mikrocentrifugrör på 1,5 ml, blanda följande till en total volym på 280 μL:
    1. 200 μl nucleasefritt vatten (ultrarent vatten för PCMs som inte innehåller nukleinsyror).
    2. 40 μl 10x fosfatbuffrad saltlösning (PBS, 137 mM natriumklorid, 10 mM fosfat, pH 7,4 vid utspädd till 1x) eller annan lämplig buffert37.
    3. 40 μL av 20 mM c.c. oligonucleotid. För dubbelsträngade oligonucleotides, tillsätt 20 μL av varje sträng vid 20 mM c.c.
  2. Inkubera oligonucleotide lösningen i 5 min vid 70 °C. Om den beräknade smälttemperaturen för oligonukleotider är högre bör temperaturen höjas i enlighet med detta. Observera att RNA kommer att försämras vid förhöjda temperaturer, så det här steget bör inte vara längre om det ena eller andra känsliga komponenter finns.
  3. Kyl i 15 min. Tillsätt 40 μL 20 mM c.c. diblock, sedan virvel omedelbart för 20 s vid maximal hastighet. Inkubera 5 min vid rumstemperatur (RT).
  4. Utför saltanneal.
    1. Tillsätt 80 μl natriumklorid på 5 m för en slutlig koncentration på 1 M NaCl och slutvolymen på 400 μL. Virvel för 10 s vid maximal hastighet.
    2. Inkubera i 10 min i rumstemperatur och fyll sedan på dialyspatroner. Observera att de listade molekylviktscutoffsna bestäms för klotformiga proteiner och inte kommer att vara korrekta för linjära polymerer. Vi finner att en 2k MWCO patron undviker provförlust och ger också gradvisa förändringar i jonisk styrka.
    3. Förbered dialysbad.
      1. Beräkna den volym av dialysbad som behövs:
        Equation 2
      2. Blanda 10x PBS (eller annan önskad buffert), 5 M NaCl och ultrapuret vatten för en slutlig lösning på 1x PBS och 0,5 M NaCl, samt två lösningar på 1x PBS.
    4. Ladda dialyspatroner.
      1. Etikettpatroner med permanent markör. Blötlägg patroner i buffert i minst 2 min till hydratmembran.
      2. Ta bort locket genom att vrida moturs. Lastprov med gellastning pipett spets. Ta bort överflödig luft genom att försiktigt klämma membran. Byt ut locket.
      3. Lägg patroner i 1x PBS, 0,5 m natriumklorid dialys bad. Patroner bör flyta, med båda membranen utsätts för badet. Skumflöten kan användas om det behövs.
    5. Dialys
      1. Inkubera för 24 h omrörning långsamt med en magnetisk rörstång.
      2. Flytta patronerna till ett nytt bad med 1x PBS eller annan önskad arbetsbuffert. Inkubera för 24 h, rör långsamt med en magnetisk rörstång. Upprepa det här steget.
    6. Återställ provet.
      1. Ta bort patronerna från badet. Ta bort locket och återställ provet med hjälp av en gel lastning pipett spets. Observera att den återvunna volymen kan vara högre än den ursprungliga 400 μL på grund av membransvullnad. Rekordstor återvunnen volym om en lätt utspädning är ett problem.
      2. Placera provet i ett rent mikrocentrifugrör på 1,5 ml. PCMs beredd på detta sätt bör vara stabil i flera månader när kylda, förutsatt att nuclease kontaminering har undvikits.

3. Dynamisk ljusspridning

  1. För att säkerställa dammfria förhållanden bör buffertarna noggrant filtreras (filtreras 3x genom en 0,22 μm spruta eller vakuumfilter) och glasvaror rengörs noggrant mellan proverna. Det är också viktigt att se till att provet har nått termisk jämvikt innan mätningen utförs.
  2. Späd PCM-provet till 0,2 mM c.c. (10x om du använder det protokoll som beskrivs ovan) med önskad arbetsbuffert och lasta in i en lämplig cuvette. Vi använder en liten volym cuvette, som kräver ~ 200 μL prov efter utspädning.
  3. Ställ in DLS-detektorns position till 90°.
  4. Justera lasereffekten och/eller dämparen så att räknehastigheten är 100 000–200 000 antal per sekund (cps), om möjligt. Antal taltal så låga som 10 kcps kan användas, men mättiderna kan behöva förlängas för att få bra statistik (steg 4.1). Högre antal tal bör undvikas, eftersom flera spridning kommer att förvirra mätningen.
  5. Skaffa data för 1 min. Räknekursen bör vara konstant under hela förvärvstiden. Om inte, detta tyder på att vissa komponenter i provet eller instrumentet ännu inte har jämvikt.
  6. Undersök autokorrelationsdata. Den långa siktlinjen bör vara mycket platt, och autokorrelationskurvan bör vara smidig, med minimal spridning, som visas i figur 3A. Baslinjedrift indikerar bristande jämvikt, och buller i data kan förbättras genom att skaffa mer data.
  7. Passar autokorrelationsfunktion.
    1. Använd REPES38,39 för att utföra reglerad omvänd Laplace omvandling för att leverera en fördelning av avslappningstider och en diffusionskoefficient, D. Denna metod beräknar sedan hydrodynamisk radie, Rh, med stokes-Einstein ekvation:
      Equation 3
      Figur 1B visar en representation av Rh och figur 3B visar resultatet av REPES.
    2. Alternativt kan du använda andra metoder, inklusive CONTIN40,41 (en alternativ regularization-algoritm) eller icke-negativa minsta kvadratmontering (NNLS). Konsekventa resultat från flera monteringsmetoder är en signatur av högkvalitativa data. Observera att cumulantanalys (standard på många instrument) ger icke-fysiska värden för multimodalstorlek/längdfördelningar.

4. Ljusspridning med flera vinklar

OBS: Ljusspridningsintensitet kontra vinkel kan mätas på en mängd olika instrument. Vi har fått bra resultat med både goniometer-baserade instrument och flera detektorinstrument, körs i batch-läge.

  1. Justera PCM-koncentrationen och belysningsintensiteten för att ge tillräcklig signal/brus jämfört med ett buffertprov i alla vinklar utan att mätta någon detektor. Den senare kan testas genom att man förbereder prover vid olika utspädningsfaktorer och kontroll av intensitetens linjäritet jämfört med koncentrationen (förutsatt minimal interaktion mellan PCM).
  2. Registrera ljusspridningshastigheten från 15° till 135° i 1 min per vinkel. Om provet och instrumentet är korrekt jämvikta, kommer spridningshastigheten att vara konstant under mättiden.
  3. Rita den normaliserade spridningshastigheten, jagsynd (θ), kontra q, där jag är spridningshastigheten. q är spridningsvektorn (fotonmomentumöverföring) enligt definitionen i

Equation 4

där η = lösningsmedelbrytningsindexet, θ = mätvinkeln och λ = ljuskällans våglängd. Bild 4 visar en tomt av MALS spridningsintensitet.

5. Liten vinkel röntgen spridning

  1. Datainsamling
    1. Förbered PCM-prover enligt beskrivningen ovan vid 2 mM-laddningskoncentration för oligonucleotide PCMs för riklig spridning ovanför bakgrunden. För PCMs som saknar tunga atomer (t.ex. fosfor i nukleinsyror) kan högre koncentrationer krävas. Spridningslängddensiteter kan uppskattas med hjälp av kalkylatorer som SASSIE42.
    2. För att minimera strålningsskador genom rensning av fria radikaler, tillsätt glycerol från ett koncentrerat (t.ex. 50%) lagerlösning så att micelle-lösningen innehåller 1% (v/v) glycerol. Observera att snyggt glycerol är mycket viskös och svårt att exakt mäta. Spädning med vatten eller buffert rekommenderas starkt.
    3. Förbered en stor mängd arbetsbuffert med 1 % glycerol för användning som bakgrundsövervakare.
    4. Förbered den beamline specifika flödescellapparaten och kalibrera detektorn. Protokollet använder en kvarts kapillär med en kvarts diameter på 3 mm som är ansluten till en datorstyrd sprutpump med liten diameter och minimal längd polyetenrör. En minsta volym på ~140 μL per prov behövs med den här inställningen.
    5. Bestäm exempelexponeringsparametrar. Den optimala exponeringen varierar beroende på strålintensitet, detektorkänslighet och koncentration, spridningsstyrka och skadekänslighet för provet, men målet är att utsätta provet för det minimala flöde som krävs för att erhålla tillräcklig spridningsintensitet över q-intervallet av intresse.
    6. För oligonucleotide/pLys-PEG PCMs, 30x 0,2 s exponeringar på en 1 Hz repetitionshastighet ger god datakvalitet med liten märkbar skada. För nya exempel kan följande procedur vara användbar:
      1. Förbered PCM-prover över en rad koncentrationer (t.ex. 10–10 000 μM c.c.).
      2. Från en mellanliggande koncentration, alternativa PCM och buffert-bara prover med varierande exponeringstider. Se nedan för datainsamling och minskningsförfarande. Provsignalen bör ha god statistik (litet statistiskt fel eller smidig variation över q). Om statistiken är dålig kan exponeringstiden ökas.
      3. Provsignalen bör också tydligt skiljas från bakgrund över q-serien sett av intresse. Beräkna och rita (signal-bakgrund)/bakgrundsförhållande jämfört med q för att bestämma signal/bakgrundsförhållande. Om signal-/bakgrundsförhållandet är lågt bör provkoncentrationen ökas.
      4. Kontrollera att spridningsintensiteten (normaliserad till koncentration) är oberoende av provkoncentrationen genom att förvärva data vid högre och lägre koncentrationer, vilket vid behov skalningsexponeringstiden. Interparticle interaktioner (den mest sannolika orsaken till koncentrationsberoende) kommer att vara mest uttalad i den låga q-intervallet.
    7. Hämta data för PCM-prover och bakgrund (dvs. buffert med glycerol).
      1. Tryck ut sprutpumpen för att flytta provet genom kapillären. Antingen dubbelriktad eller en gång genomgående rörelse är godtagbart, men man bör vara noga med att isolera varje prov (t.ex. genom att sätta in en luftbubbla mellan proverna). Proverna får återvinnas och får återanvändas om inga strålningsskador uppvisas.
      2. När flödet har startat, utlösa röntgenexponering och datainsamlingsprogram som beskrivs ovan. Var försiktig så att strålexponeringen slutar innan vätskeflödet gör det.
    8. Efter varje prov utför du azimuthal i genomsnitt och rita 1D-profilerna (dvs. intensitet jämfört med q)för varje exponering tillsammans. De bör vara identiska inom statistiska fel. Ommantsignal över tid kan indikera strålningsskador.
      1. Isolerade avvikande profiler kan tyda på förekomsten av mikrobubblor. Om bubblor observeras ofta kan det hjälpa att minska flödeshastigheten.
    9. Genomsnitt av 1D-spridningsprofilerna.
    10. Hämta data för exempel endast buffert (en gång per var4–5 PCM-exempel) och jämför dessa över tid. Ökad signal från prover endast av buffertindikerar att kapillären kan vara förorenad med strålningsskadat prov.
      1. När kontaminering märks, tvätta kapillären med blekmedel och överväg att minska exponeringstiden om möjligt.
  2. Dataminskning och analys med Irena
    1. Importera micelle- och bakgrundsdatauppsättningar för ASCII (SAS/Dataimport & export/Import ASCII SAS-data).
    2. Subtrahera bakgrundsspridning från exempeldata. Vanligtvis visar de högsta q-värdena (t.ex. q > 0.5) osammanhängande spridning från lösningsmedlet som dominerar signalen. Skala bakgrundsdata för att matcha exempeldata över detta q-intervall tar bort alla variationer på grund av strålintensitetsvariation och provkoncentration.
      1. Rita provet och bakgrunden tillsammans på en loggskala. Verifiera platt intensitet vid hög q (SAS/Data Manipulation/Data Manipulation I). Beräkna provet/bakgrundsförhållandet (Data1/Data 2), rita på en linjär loggskala och verifiera asymptotmed hög-q-asymptot.
      2. Beräkna det genomsnittliga (exempel/bakgrunds)förhållandet över det här q-intervallet (använd ett anpassat makro eller kopiera/klistra in i ett kalkylblad från databläddraren).
      3. Använd datamanipulationsmakrot, skala bakgrunden (t.ex. Ändra data 2)med hjälp av förhållandet som beräknas ovan och rita förhållandet mellan bakgrundssubtrad signal till bakgrund kontra q ([Data1-Data2]/Data2), kontrollera att den nu asymptoter till noll vid hög q. Registrera detta förhållande; Det bör vara <1–2% från 1,0 för varje prov.
      4. Rita den bakgrundssubtrata signalen (Data1-Data2) jämfört med q och spara data med ett nytt namn. Skriv inte över de ursprungliga uppgifterna.
      5. Om datamed hög q inte är tillgänglig använder du en skalningsfaktor på 1 för bakgrundssubtraktion, men tänk på att felaktigheter kan införas i q-intervall där signal/bakgrundsförhållandet är litet.
    3. Öppna modellmakrot (SAS/Modellering),läs sedan in och rita in de bakgrundssubtrahera data (Data cntrls/Add data). Skala inte i det här makrot.
    4. Hitta först en ungefärlig modell för PCM:s yttre yta (micelle storlek/form):
      1. I Data cntrls, välj låg till måttlig q-intervall (t.ex. ~0.003Å-1 < q < ~0.1Å-1). Om svängningar är synliga, inkludera dem.
      2. Välj en formulärfaktor som är lämplig för data. Lutningen på låg q är ett tecken på nanopartikelform, som också kan verifieras genom TEM och/eller MALS. Använd Schulz-Zimm spheroid (q0), cylinder (q-1), eller flexibel cylinder (q-2)modeller. Irena tillhandahåller verktyg för montering av kraftlagar (SAS/Support Tools for plots and tables).
      3. I Modell cntrlsväljer du den första spridningspopulationen (1P)och ser till att den är den enda som används (Markera kryssrutan Använd?
      4. Välj Storleksavhandling. Ange initiala parametrar för sökningen genom att ange värden i fälten Skala, Medelstorlekoch Bredd och klicka på Beräkna modell för att rita den resulterande formfaktorn.
        Formfaktorn för flexibel cylinder kan läggas till som användarformfaktor och laddas ner från https://usaxs.xray.aps.anl.gov/software/irena. Parametrarna 1 och 2 motsvarar cylinderns längd respektive Kuhns längd.
      5. När rimliga parametrar har hittats klickar du på Anpassa modell för att utföra en ickelinjär minsta kvadrat som passar data. Storleksfördelningsmodellen ger genomsnittlig radie och bredd.
        Så här beräknar du användning av polydispersitet (PDI)
        Equation 5
        Precis som med alla icke linjära monteringsprocedurer kan det vara nödvändigt att justera dataområdet(q-regionen) och startparametrarna för att få en stabil, fysiskt rimlig passform.
      6. När en rimlig passform har erhållits, spara den(Store i anteckningsbok/Lagra i mapp).
    5. Därefter modellera spridningen av de enskilda polymererna inom PCM-kärnan. Detta kan fångas av en effektlagsmodell (t.ex. q-2 för idealiska kedjor, q-5/3 för svullna kedjor etc.). Irena genomför detta genom en Beaucage modell43:
      Equation 6
      där P är maktlagen och G och B är prefactors.
      1. Justera datakontrollerna så att de täcker hela q-området och rita om modellen (Beräkna modell). Vanligtvis kommer överskottsspridning att observeras i det måttliga till höga q-intervallet (t.ex. q > ~0.1Å-1).
      2. Använd datakontrollerna för att välja det q-intervall där överskottsspridning (>10x formfaktormodellen) observeras.
      3. Lägg till en andra spridningspopulation (2P) och se till att den är den enda som används (avmarkera Användning? för 1P).
      4. Välj Enhetlig nivå för modellen. B och P är relevanta parametrar. Använd plottningstödverktygen eller Makrot Fit P/B mellan csrs för att få en första gissning för dessa parametrar och justera Guinier-faktorerna G och Rg för att säkerställa att modellen inte förutspår överdriven spridning vid låg q.
      5. När det gäller formfaktorn utför du en icke-linjär passform och registrerar parametrarna och modellen.
    6. Nästa, Om en diffraktion topp är närvarande, som i figur 4,lägga till en tredje modell för en diffraktion topp i q utbud av intresse(q = ~ 0,22 Å-1 i detta fall).
    7. När ungefärliga passformsvärden har erhållits för de enskilda spridningspopulationerna aktiverar du alla tre tillsammans (välj Använd? för varje) och optimera den kombinerade passformen.
    8. Kontrollera att varje värde förblir fysiskt rimligt. Resultatet av detta förfarande bör vara en sammansatt modell som beskriver SAXS data långt över ett stort antal storlekskalor, vilket illustreras i figur 4. Spara passformen med knappen Lagra i mapp för att lagra i Igor.

6. Transmission Electron Mikroskopi (TEM)

  1. Cryo TEM
    1. Markera rutnätet. Vi rekommenderar holey kol stöd film på en vanlig TEM rutnät eller lacey kol som ett alternativ. I båda fallen kommer hålen mellan kolet att ge ett bildområde av ren glaskropp is och prov och ingen film.
    2. Placera nätet kol sida upp i en glöd urladdningsapparat på en ren glasrutschbana. Inslagning bilden i laboratoriefilm kan hjälpa till med rutnätshantering. Undvik att vidröra mitten av nätet med pincett och alltid nypa nära kanten av nätet.
    3. Exponera rutnätet för 30 s.
    4. Förbered en förglasningsrobot för provdeposition.
      1. Ställ in på 100% luftfuktighet och RT och tillsätt blotting papper. Förbered flytande etan och flytande kvävebad vid basen av roboten. Se online tutorials och videor för ytterligare hjälp med förstoring robot förberedelse och användning.
    5. Späd provet 5x.
    6. Använd de negativa actionpincetterna som medföljer förglasroboten, plocka upp ett rutnät och fäst sedan pincetten till roboten och flytta pincetten in i kammaren.
    7. Lägg 4 μL av provet i roboten med hjälp av en pipett genom hålet i maskinens sida.
    8. Inkubera i 4 min.
    9. Med hjälp av roboten, blot 3-5 s med filterpapper.
    10. Förglasroboten kommer att störta nätet i flytande etan.
    11. Ta bort pincetten och flytta nätet till flytande kväve och in i en förvaringsbehållare, som också bör vara under flytande kväve. Denna process fixar provet i ett tunt lager glasaktig is. Minimera den tid som nätet tillbringar ut ur flytande etan eller flytande kväve under detta steg.
    12. Kyl kryoprovhållaren med flytande kväve. Håll en Dewar och reservoar full.
    13. När du är redo att avbilda, ladda rutnätet på kryoprovhållaren. Förvara provet under flytande kväve eller kort i den extremt kalla kväveångan strax ovanför vätskeytan.
    14. Bild rutnätet på 120 kV mellan 75kx och 150kx i tunn och tjock is, eftersom olika storlek miceller kan föredra en viss istjocklek.
      1. Begränsa strålexponeringen för att undvika smältande is och skada provet. Fokusera inte direkt där du planerar att avbilda. fokus i närheten. Exponera bara intresseområdet när du tar en bild.
      2. Var noga med att skilja vätskeetan droppar från provet när du tittar på bilder (se bild 5).
  2. Konventionell TEM med negativ färgning
    1. Förbered fläcken.
      1. Koka ~ 10 ml ultrarent vatten. Väg ut 0,1 g uranyl formate (UFo) i ett 15 ml koniskt rör.
      2. Tillsätt 5 ml varmt vatten till UFo-pulvret för en 2% lösning. Stäng tätt och linda in aluminiumfolie för att blockera ljus. En 1% uranyl acetat fläck används också ofta.
      3. Vortex eller skaka kraftigt i 5 min. Fäst röret till virveln kommer att hjälpa. Filtrera genom ett 0,2 μm sprutafilter i ett rent koniskt rör.
      4. Låt svalna 10 min till RT. Tillsätt 25 μL av 5M NaOH och virvel omedelbart i 2 min.
        1. Alternativt fryser du 200 μL alikvoter på 2% UFo. När du är klar för användning, tina en alikvot, tillsätt 1 μL av 5 M NaOH och virvel i 2 min.
      5. Håll fläcken insvept i folie eller borta från ljus.
    2. Späd provet 10x i 1x PBS (eller önskad buffert).
    3. Välj rutnät. Vi rekommenderar kolstöd film på koppar galler. Den mörkare, glansigare sidan av nätet är den kolbelagda sidan där provet kommer att deponeras och färgas.
    4. Placera nätet kol sida upp i en glöd urladdningsapparat på en ren glasrutschbana. Se steg 6.1.2.
    5. Exponera rutnätet för 30 s.
    6. Plocka upp nätet med kolsidan fortfarande vänd uppåt och håll med negativa åtgärder pincett vid kanten av nätet för att förhindra att riva bildområdet i mitten. Ställ ner pincetten med nätet fortfarande höll kol sida upp.
    7. Applicera ett provpå 4 μl provpå nätets övre (kolsida) med en pipett.
    8. Inkubera 4 min.
    9. Med ~1 min kvar, pipett e en 10 μL och en 20 μL droppe UFo lösning på en bit ren laboratoriefilm.
    10. Använd filterpapper för att transportera provet från kanten av nätet (vinkelrät kontakt) för att undvika kontakt med bildytan.
    11. Använd pincetten (som fortfarande håller i nätet), placera omedelbart provsidan på nätet nedåt på 10 μL UFo-droppen och vek sedan omedelbart av vätskan (tvättsteg). Det är viktigt att inte låta nätet torka, så stanna inte mellan stegen.
    12. På liknande sätt, applicera 20 μL UFo droppe på nätet. Håll av gallret på UFo i 40-talet. Wick vätskan av och låt nätet torka.
    13. Bild det torra nätet på 120 kV mellan 20.000 x och 100.000 x.
    14. Var noga med att korrekt kassera alla UFo-förorenade material med hjälp av institutionens säkerhetstjänst för radioaktivt avfall.
    15. Vid behov kan ljusstyrka/kontrastförbättring och ett medianfilter användas på TEM-bilder i ImageJ för att minska bakgrundsbrus. Efterbehandling bör göras enhetligt, endast för bilder som inte används för kvantitativa mätningar såsom intensitet, och bör alltid rapporteras.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För att illustrera karakteriseringsmetoder som beskrivs ovan visar vi typiska resultat för PCMs monterade från oligonukleotider och blocksampolymerer av olika längder och kemister(figur 1). Figur 2 ger ett exempel på hur PCM-kärnstorlek (enligt saxs och TEM, figur 4 och figur 5)varierade med laddad blocklängd. Figur 3 visar DLS-data och passande resultat för sfäriska PCMs som bildats från relativt långa blocksampolymerer och korta enkelsträngade oligonukleotider. Figur 4 illustrerar hur komplexa SAXS-intensitetsspektra kan passa korrekt genom att kombinera modeller för de olika rumsliga korrelationer som fanns (extern yta, spridning inom kärnkärnan, inter-helix-beställning) och hur MALS skulle kunna användas för att utöka spridningsmätningarna till längre längdskalor. Slutligen visar figur 5 representativa elektronmikroskopi data för PCMs av varierande morfologi.

Figure 1
Bild 1: Montering och karakterisering av nukleinsyrapcms. (A)Anjoniska polymerer, såsom oligonukleotider, bildade fasseparerade komplex med cationic regioner av diblock sampolymerer. Förekomsten av ett hydrofilneutralt block (grått) resulterade i bildandet av stabila PCM nanopartiklar. (B)PCMs var kärnskal nanopartiklar med flera parametrar att karakterisera. Den totala storleken (hydrodynamisk radie, Rh)kan bestämmas med DLS, kärnradien (Rc)kunde hittas med saxs och TEM, korona storlek kan beräknas som Rh-Rc, och morfologi kan bestämmas över flera längd skalor genom att kombinera SAXS, MALS och TEM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Micelle storlekberoende. Micelle kärnstorlek bestämdes främst av längden på den laddade blocket av blocket sampolymer, och till stor del oberoende av längden på homopolymer7,26. Detta möjliggör kontroll av PCM storlek genom val av block polymer. Uppgifterna som visas här är för pLys-PEG med 88 nt/bp DNA och har tidigare rapporterats26. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Bild 3: Dynamisk ljusspridning. (A)Autocorrelation funktion (godtyckliga enheter) för 10 nt enkel-strandade DNA + pLys(100)-PEG(10k) PCM. (B)Hydrodynamisk radiedistribution (histogram) från REPES-passform. Autokorrelationsfunktionen förföll till ett planvärde med en enda tidsskala, vilket resulterade i en enda storlekstopp i REPES-storleksfördelningen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Representativa SAXS- och MALS-data och passar för en cylindrisk micelle. SAXS-data (grå cirklar) visas för PCMs monterade från pLys(50)-PEG(5k) och 88 bp dubbelsträngat DNA. Vid låg q (< 10-2 Å-1) visade intensiteten ett cirka q-2 beroende av momentumöverföring, vilket innebär en flexibel cylinderform (maskliknande micelle). MALS-data (öppna svarta cirklar) visar samma beroende, vilket tyder på att micellerna var minst flera mikrometer långa (bekräftas av TEM-avbildning, figur 5C,D). Spheroidal micelles skulle visa ett platt beroende (q0)av intensitet på q i detta intervall. De färgade linjerna illustrerar multikomponentmonteringsproceduren för PCM SAXS-data som beskrivs i avsnitt 5. Spridning vid låga q (stora avståndskalor) dominerades av PCM:s yttre yta och passade väl med en flexibel cylindermodell (röd). Vid högre q värden (mindre längd skala), spridning dominerades av de enskilda polymerer inuti PCM kärnan, passar här av en makt lag (grön) med låg q cutoff. Vi observerade också parallell förpackning av dubbelsträngade DNA-helices inom PCM-kärnan, vilket resulterar i en kvasi-Bragg diffraktion topp (blå). Den svarta streckade linjen visar att kombinera dessa modeller exakt beskrev SAXS data, och tillsats av ljus spridningsdata (öppna cirklar) utvidgas storleksintervallet över nästan fyra storleksordningar. Passande resultat gav en PCM-population med medelradie = 11,0 nm och PDI = 0,03, effektlag på hög q = 1,81 och diffraktionstoppen representerar mellanspiralavstånd på 2,71 nm. SAXS data har tidigare rapporterats26 och är allmänt tillgängliga44. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Bild 5: TEM-bilder av nukleinsyrapcms. (A–B) Cryo TEM av 22 nt enkelsträngad DNA + pLys(50)-PEG(5k) PCMs, som visar övervägande sfärisk morfologi. Blå pilar indikerar flytande etandroppar, inte att förväxla med PCMs (texturerat sfäridalobjekt). (A)är något underfokuserad, lägga till liten kontrast samtidigt som upplösningen bevaras. (B)är betydligt underfokuserad, lägga till mer kontrast men offra klarhet. Justeringar av ljusstyrka och kontrast och ett medianfilter med två pixlar tillämpades på båda bilderna. (C-D) Negativt färgat TEM på 88 bp dubbelsträngad DNA + pLys(50)-PEG(5k) PCMs, som är långa flexibla cylindrar. I båda fallen överensstämde kärnradier från TEM med de värden som erhållits från montering av SAXS-data. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Som nämnts ovan, de protokoll som presenteras här är skrivna med fokus på oligonucleotides som polyanion komponent och pLys-PEG som cationic-neutral block sampolymer, men vi har testat dem med en mängd olika polymerer, såsom poly (akrylsyra), polyglutamat, och PEG-poly (vinylbensyl trimetylammonium), och tror att de kommer att vara allmänt tillämpliga för de flesta polyelektrolytpar. En parameter som kan behöva optimeras är saltkoncentrationen som används för glödgning, eftersom det bör vara tillräckligt högt att PCMs inte bildas i början av anneal. Detta kan kontrolleras experimentellt av DLS, eller i jämförelse med observation av fasseparation med polyelektrolyterna ensam (inget neutralt block). Termisk glödgning kan användas om saltglödgning är oönskad, även om de resulterande polydispersities är större7. De koncentrationer som används för karakterisering kan också behöva optimeras, eftersom större nanopartiklar sprider mer ljus än små, och nukleinsyror är effektivare vid spridning röntgenbilder än många andra polymerer på grund av närvaron av elektrontäta fosforatomer i ryggraden. Det kan också vara nödvändigt att närmare kontrollera buffertens pH om antingen polyelektrolyt har en pKa nära funktionsdugliga skick.

I den här artikeln presenterar vi protokoll för två ljusspridningstekniker (dvs. multivinkel/statisk ljusspridning och dynamisk ljusspridning), samt liten vinkelröntgenspridning, och både kryo och konventionell negativ fläcköverföring elektronmikroskopi, med representativa data för varje. Alla tekniker är inte nödvändiga för alla scenarier, och andra finns också tillgängliga, vilket väcker frågan om vilka bör användas när. Gott om granskning litteratur finns på detta ämne45,46, men vi föreslår följande när karakterisera en ny PCM eller liknande nanopartikel. Börja med att kontrollera aggregering, både genom visuell inspektion för grumlighet och optisk mikroskopi. Om ingen aggregering observeras är nästa steg att avgöra om det finns några nanopartiklar. DLS är ett snabbt sätt att avgöra detta eftersom PCMs sprida ljus kraftigt, och svag eller obefintlig ljusspridning är en stark indikator på dålig nanopartikelbildning. Medan DLS kan bekräfta förekomsten av nanopartiklar, är det svårt att bestämma deras storlek och form utan hänvisning till andra data, eftersom de flesta analysmetoder är beroende av Stokes-Einstein relation, som förutsätter sfäriska partiklar. MALS kan bekräfta sfäriska former (platt normaliserad intensitet kontra vinkel) men kanske inte kan bestämma formen på icke-sfäriska partiklar om inte storleksfördelningen är både smal och råkar falla i rätt intervall för upplösning. Som ett resultat rekommenderar vi att du utför TEM, SAXS eller båda på ett PCM-prov för att helt karakterisera dess egenskaper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar Phil Griffin och Tera Lavoie från Soft Matter Characterization Facility och Advanced Electron Microscopy Facility, respektive vid University of Chicago. Vi tackar också Xiaobing Zuo och Soenke Seifert av Advanced Photon Source på Argonne National Laboratory och NIST Center for Hierarchical Materials Design (CHiMaD) för stöd. Vi tackar Jeff Ting och Michael Lueckheide för deras bidrag till detta arbete.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70 mm circle filter paper Whatman 1001-070 Filter paper for wicking during grid prep
Carbon Film TEM grid Electron Microscopy Sciences CF200-Cu TEM grid
DAWN Wyatt Technology DAWN MALS instrument
DNA oligonucleotide Integrated DNA Nanotechnologies Inc Custom oligonucleotide
Lacey Carbon TEM grid Electron Microscopy Sciences LC200-Cu TEM grid
Methoxy-poly(ethylene glycol)-block-poly(l-lysine hydrochloride) PEG5k - PLKC50 Alamanda Polymers Inc mPEG5K-b-PLKC50 Example block copolymer
Milli-Q Millipore Sigma Ultrapure water
NanoDrop Thermo Scientific For measuring nucleic acid concentration
negative-action tweezers Dumont N7 Tweezers for grid preparation
Parafilm "M" Bemis Company Inc PM996 Laboratory film
Quantifoil Holey Carbon TEM grid Electron Microscopy Sciences Q210CR1.3 TEM grid
Research Goniometer and Laser Light Scattering System Brookhaven Instruments BI-200SM DLS/MALS instrument
Slide-A-Lyzer G2 2K 0.5 mL Thermo Scientific Pierce Protein Biology 87723 Dialysis cartridge
small volume cuvette Brookhaven Instruments BI-SVC Cuvette for DLS/MALS
Solarus 950 Advanced Plasma System Gatan Solarus 950 Plasma system for TEM grids
Talos TEM FEI Talos TEM used for cryo samples
Tecnai Spirit TEM FEI Spirit TEM used for dry samples
Uranyl Formate SPI-Chem 16984-59-1 For negative staining samples for TEM
Vitrobot FEI Vitrobot Vitrification robot for cryo grid preparation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Spruijt, E., Westphal, A. H., Borst, J. W., Cohen Stuart, M. A., van der Gucht, J. Binodal compositions of polyelectrolyte complexes. Macromolecules. 43 (15), 6476-6484 (2010).
  2. van der Gucht, J., Spruijt, E., Lemmers, M., Cohen Stuart, M. A. Polyelectrolyte complexes: bulk phases and colloidal systems. Journal of Colloid and Interface Science. 361 (2), 407-422 (2011).
  3. Priftis, D., Laugel, N., Tirrell, M. Thermodynamic characterization of polypeptide complex coacervation. Langmuir. 28 (45), 15947-15957 (2012).
  4. Fu, J., Schlenoff, J. B. Driving Forces for Oppositely Charged Polyion Association in Aqueous Solutions: Enthalpic, Entropic, but Not Electrostatic. Journal of the American Chemical Society. 138 (3), 980-990 (2016).
  5. Vieregg, J. R., et al. Oligonucleotide-Peptide Complexes: Phase Control by Hybridization. Journal of the American Chemical Society. 140 (5), 1632-1638 (2018).
  6. Voets, I. K., de Keizer, A., Cohen Stuart, M. A. Complex coacervate core micelles. Advances in Colloid and Interface Science. 147-148, 300-318 (2009).
  7. Lueckheide, M., Vieregg, J. R., Bologna, A. J., Leon, L., Tirrell, M. V. Structure-Property Relationships of Oligonucleotide Polyelectrolyte Complex Micelles. Nano Letters. 18 (11), 7111-7117 (2018).
  8. De Kruif, C. G., Weinbreck, F., de Vries, R. Complex coacervation of proteins and anionic polysaccharides. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 9 (5), 340-349 (2004).
  9. Vieregg, J. R., Tang, T. Y. D. Polynucleotides in cellular mimics: Coacervates and lipid vesicles. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 26, 50-57 (2016).
  10. Marciel, A. B., Chung, E. J., Brettmann, B. K., Leon, L. Bulk and nanoscale polypeptide based polyelectrolyte complexes. Advances in Colloid and Interface Science. 239, 187-198 (2017).
  11. Cabral, H., Miyata, K., Osada, K., Kataoka, K. Block Copolymer Micelles in Nanomedicine Applications. Chemical Reviews. 118 (14), 6844-6892 (2018).
  12. Tan, Z., et al. Block Polymer Micelles Enable CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein Delivery: Physicochemical Properties Affect Packaging Mechanisms and Gene Editing Efficiency. Macromolecules. 52 (21), 8197-8206 (2019).
  13. Horn, J. M., Kapelner, R. A., Obermeyer, A. C. Macro- and Microphase Separated Protein-Polyelectrolyte Complexes: Design Parameters and Current Progress. Polymers. 11 (4), 578 (2019).
  14. Juliano, R. L. The delivery of therapeutic oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 44 (14), 6518-6548 (2016).
  15. Kanasty, R., Dorkin, J. R., Vegas, A., Anderson, D. Delivery materials for siRNA therapeutics. Nature Materials. 12 (11), 967-977 (2013).
  16. Lorenzer, C., Dirin, M., Winkler, A. M., Baumann, V., Winkler, J. Going beyond the liver: progress and challenges of targeted delivery of siRNA therapeutics. Journal of Controlled Release. 203, 1-15 (2015).
  17. Allen, T. M., Cullis, P. R. Liposomal drug delivery systems: from concept to clinical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (1), 36-48 (2013).
  18. Li, W., Szoka, F. C. Lipid-based nanoparticles for nucleic acid delivery. Pharmaceutical Research. 24 (3), 438-449 (2007).
  19. Miyata, K., Nishiyama, N., Kataoka, K. Rational design of smart supramolecular assemblies for gene delivery: chemical challenges in the creation of artificial viruses. Chemical Society Reviews. 41 (7), 2562-2574 (2012).
  20. Oishi, M., Nagasaki, Y., Itaka, K., Nishiyama, N., Kataoka, K. Lactosylated poly(ethylene glycol)-siRNA conjugate through acid-labile ss-thiopropionate linkage to construct pH-sensitive polyion complex micelles achieving enhanced gene silencing in hepatoma cells. Journal of the American Chemical Society. 127 (6), 1624-1625 (2005).
  21. Christie, R. J., et al. Targeted polymeric micelles for siRNA treatment of experimental cancer by intravenous injection. ACS Nano. 6 (6), 5174-5189 (2012).
  22. Kuo, C. H., et al. Inhibition of atherosclerosis-promoting microRNAs via targeted polyelectrolyte complex micelles. Journal of Materials Chemistry B. 2 (46), 8142-8153 (2014).
  23. Ge, Z., et al. Targeted gene delivery by polyplex micelles with crowded PEG palisade and cRGD moiety for systemic treatment of pancreatic tumors. Biomaterials. 35 (10), 3416-3426 (2014).
  24. Van Bruggen, C., Hexum, J. K., Tan, Z., Dalai, R. J., Reineke, T. M. Nonviral Gene Delivery with Cationic Glycopolymers. Accounts of Chemical Research. 52 (5), 1347-1358 (2019).
  25. Hayashi, K., et al. Influence of RNA Strand Rigidity on Polyion Complex Formation with Block Catiomers. Macromolecular Rapid Communications. 37 (6), 486-493 (2016).
  26. Marras, A. E., Vieregg, J. R., Ting, J. M., Rubien, J. D., Tirrell, M. V. Polyelectrolyte Complexation of Oligonucleotides by Charged Hydrophobic-Neutral Hydrophilic Block Copolymers. Polymers. 11 (1), 83 (2019).
  27. Phillips, H. R., et al. Glycopolycation-DNA Polyplex Formulation N/P Ratio Affects Stability, Hemocompatibility, and in Vivo Biodistribution. Biomacromolecules. 20 (4), 1530-1544 (2019).
  28. Ting, J. M., Wu, H., Herzog-Arbeitman, A., Srivastava, S., Tirrell, M. V. Synthesis and Assembly of Designer Styrenic Diblock Polyelectrolytes. ACS Macro Letters. 7 (6), 726-733 (2018).
  29. Zadeh, J. N., et al. NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems. Journal of Computational Chemistry. 32 (1), 170-173 (2011).
  30. Santa Lucia, J. A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (4), 1460-1465 (1998).
  31. Xia, T., et al. Thermodynamic parameters for an expanded nearest-neighbor model for formation of RNA duplexes with Watson-Crick base pairs. Biochemistry. 37 (42), 14719-14735 (1998).
  32. Orthaber, D., Bergmann, A., Glatter, O. SAXS experiments on absolute scale with Kratky systems using water as a secondary standard. Journal of Applied Crystallography. 33 (2), 218-225 (2000).
  33. Srivastava, S., et al. Gel phase formation in dilute triblock copolyelectrolyte complexes. Nature Communications. 8, 14131 (2017).
  34. Lindhoud, S., et al. Salt-induced disintegration of lysozyme-containing polyelectrolyte complex micelles. Langmuir. 25 (19), 11425-11430 (2009).
  35. Lindhoud, S., de Vries, R., Schweins, R., Stuart, M. A. C., Norde, W. Salt-induced release of lipase from polyelectrolyte complex micelles. Soft Matter. 5 (1), 242-250 (2009).
  36. Ilavsky, J., Jemian, P. R. Irena: tool suite for modeling and analysis of small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 42 (2), 347-353 (2009).
  37. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  38. Jakeš, J. Regularized positive exponential sum (REPES) program-A way of inverting laplace transform data obtained by dynamic light scattering. Collection of Czechoslovak Chemical Communications. 60 (11), 1781-1797 (1995).
  39. Schillen, K., Brown, W., Johnsen, R. M. Micellar Sphere-to-Rod Transition in an Aqueous Triblock Copolymer System - a Dynamic Light-Scattering Study of Translational and Rotational Diffusion. Macromolecules. 27 (17), 4825-4832 (1994).
  40. Provencher, S. W. Contin - a General-Purpose Constrained Regularization Program for Inverting Noisy Linear Algebraic and Integral-Equations. Computer Physics Communications. 27 (3), 229-242 (1982).
  41. Provencher, S. W. A Constrained Regularization Method for Inverting Data Represented by Linear Algebraic or Integral-Equations. Computer Physics Communications. 27 (3), 213-227 (1982).
  42. Sarachan, K. L., Curtis, J. E., Krueger, S. Small-angle scattering contrast calculator for protein and nucleic acid complexes in solution. Journal of Applied Crystallography. 46 (6), 1889-1893 (2013).
  43. Beaucage, G. Approximations leading to a unified exponential power-law approach to small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 28 (6), 717-728 (1995).
  44. Marras, A. E., Vieregg, J. R., Ting, J. M., Rubien, J. D., Tirrell, M. V. Materials Data Facility. , 10.18126/M2QW8R (2018).
  45. Modena, M. M., Rühle, B., Burg, T. P., Wuttke, S. Nanoparticle Characterization: What to Measure. Advanced Materials. , (2019).
  46. Mourdikoudis, S., Pallares, R. M., Thanh, N. T. K. Characterization techniques for nanoparticles: comparison and complementarity upon studying nanoparticle properties. Nanoscale. 10 (27), 12871-12934 (2018).

Tags

Kemi Utgåva 157 nukleinsyra leverans polyelektrolyt komplex micelle nanopartiklar fasseparation oligonucleotider
Montering och karakterisering av Polyelektrolyt Complex Micelles
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marras, A. E., Vieregg, J. R.,… More

Marras, A. E., Vieregg, J. R., Tirrell, M. V. Assembly and Characterization of Polyelectrolyte Complex Micelles. J. Vis. Exp. (157), e60894, doi:10.3791/60894 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter