Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Polielektrolit Kompleksi Misellerinin Montajı ve Karakterizasyonu

Published: March 2, 2020 doi: 10.3791/60894
Automatic Translation
1, 1, 1
1Pritzker School of Molecular Engineering, The University of Chicago

Summary

Polielektrolit kompleks misellerin, polielektrolitlerin ve hidrofilik yüklü blok kopolimerlerin oluşturduğu çekirdek kabuklu nano partiküllerin tasarımı, montajı ve karakterizasyonu için protokoller ve temsili veriler salıyoruz.

Abstract

Polielektrolit kompleks miseller (PCM'ler), sulu çözeltide yüklü polimerlerin kendi kendine biraraya toplanması yla oluşan çekirdek kabuğu nano tanecikleri, polielektrolit etkileşimlerinin fiziğinin araştırılması için güçlü bir platform sağlar ve aynı zamanda vivo terapötik oligonükleotid teslim acil sorun. PCM'ler için öngörülü yapı-özellik ilişkileri geliştirmek, kısmen nanopartikül kendi kendine montaj sırasında güçlü kinetik tuzakların varlığı nedeniyle zor olmuştur. Bu makalede, PCM yapısı için polimer seçimiiçin kriterler açıklanabilir ve tekrarlanabilir, düşük polidispersitlik nano tanecikleri montajı sağlayan tuz annealing dayalı protokoller sağlar. Ayrıca ışık saçılımı, küçük açılı X-ışını saçılımı ve elektron mikroskobu kullanarak PCM karakterizasyonu tartışılmaktadır.

Introduction

Karşı yüklenmiş polielektrolitler sulu çözeltide karıştırıldığında, karşıtlıklarının serbest bırakılmasından elde edilen entropi kazancı çözeltinin polimer açısından zengin yoğunlaştırılmış faza ve polimer-tükenmiş süpernatant1,2,3,4,5,polielektrolit kompleksi olarak bilinen bir fenomen haline karışmasına neden olur. Nötr bir hidrofilik blok polielektrolitlerden birine veya her ikisine konjuge edilirse, bunun yerine nanoölçekli faz ayrımı gerçekleşir (Şekil 1A). Ortaya çıkan kendi kendine monte çekirdek kabuğu nano tanecikleri çeşitli polielektrolit karmaşık micelles (PCMs), poliyon karmaşık micelles, blok iyonomer kompleksleri, ya da yüzey aktif micellizasyon benzetme ile koacervate çekirdekli micelles olarak adlandırılır, sistemin tüm bileşenleri hidrofilikolmasınarağmen6 ,7. Bir PCM yeteneği proteinler ve nükleik asitler gibi hidrofilik molekülleri kapsüllemek için, hem de blok kopolimer taşıyıcı mimarisi tarafından sunulan geniş alabilme onları vivo 8 terapötik molekülleri sunmak için cazip adaylar yapar8,9,10,11,12,13.

Hücresel hedeflere terapötik nükleik asitler indelivering özellikle önemli bir sorundur, ve pcms çeşitli avantajlar sunan biri. Terapötik nükleik asitler (genetik DNA, mRNA, ve siRNA gibi oligonükleotidler) insan sağlığını iyileştirmek için büyük bir potansiyele sahip, ancak bu potansiyel14gerçekleştirmek için çok sayıda biyolojik ve fiziksel engelleri aşmak gerekir14 ,15,16. Çıplak nükleik asitler serum ve hücresel nükleazlar tarafından bozulur, hızlı bir şekilde dolaşımdan temizlenir ve güçlü negatif yükleri, yardım almadan hücre zarlarına girmelerini zorlaştırır. Bu engelleri aşmak için mevcut yaklaşımlar hidrofobik etkileşimleri15,17,18ile monte çeşitli lipid nano tanecikleri içine çekirdekleri ve / veya kapsülleme hasarı önlemek için pahalı kimyasal değişiklikler içerir. Bu yöntemler lokal enjeksiyonlar ve karaciğer hedeflemeiçin etkili olduğu kanıtlansa da, sistemik kullanım toksisite, immünojenite ve sınırlı biyodağıtım önemli sınırlamalar sunar16. Buna karşılık, PCM'ler çekirdekasitlerin negatif yüklerini fazdan ayrılmış çekirdek içinde yoğunlaştırmak için kullanırken, nötr korona bozulmaya karşı sterik bariyerin yanı sıra hedefleme yi veya içselleştirmeyi artırmak için ligandları birleştirmek için bir platform sağlar11,19. In vitro ve hayvan çalışmaları PCM'ler etkili çeşitli nükleik asit yükleri teslim edebilirsiniz göstermiştir20,21,22,23,24, ama bizim yeteneğimizde zayıflıkları gibi PCM özellikleri tahmin etmek için boyut, şekil, ve kurucu polimerlerin özelliklerinden istikrar onların daha geniş benimsenmesini engelledi.

Bizim grup ve alanında diğerleri tarafından son çalışma yapısı-mülkiyet geliştirerek bu sorunu çözmek için başladı, ve bazı durumlarda nükleik asitler ve çeşitli katyonik-nötr polimerler7oluşan PCM'ler için yapı-özellik-fonksiyon ilişkileri 7,25,26,27. Bu çalışmalardan ortaya çıkan iki tutarlı tema, PCM montajı için iyi kontrol edilen, tekrarlanabilir protokoller geliştirmenin önemi ve ortaya çıkan nano parçacıkları karakterize etmek için birden fazla teknik kullanmanın yararıdır. Polielektrolitler, özellikle nükleik asitler gibi yüksek yük yoğunluğuna sahip olanlar, birbirleriyle çok güçlü bir şekilde etkileşime girerek karıştırma üzerine kolayca kInetik olarak kapana kısılmış gibi görünerek, işlemdeki küçük varyasyonlara karşı son derece hassas olan pcm preparatları ile sonuçlanır ve toplu iş lerden toplu işleme kadar yüksek polidispersit ve kötü tekrarlanabilirlik gösterir. PCM'lerin ayrıca bileşenlerinin atomik düzey yapılandırmalarına bağlı olarak çok çeşitli şekil ve boyutlarda benimsedikleri gösterilmiştir ve bu çeşitliliği herhangi bir bireysel karakterizasyon tekniğiyle yakalamak çok zordur, özellikle de dinamik ışık saçılımı (DLS) gibi bazı yaygın teknikler yorumlamaları için parçacık şekli hakkında varsayımlar gerektirdiğinden.

Bu makalede, oligonükleotidler ve katyonik-nötr diblok kopolimerler üzerinde odaklanarak, PCM'ler için malzeme tasarımı ve seçimi tartışılmaktadır. Daha sonra PCM montajı sırasında kinetik bindirmeönlemek için yavaş diyaliz ardından yüksek tuz konsantrasyonları kullanan bir tuz tavlama protokolü açıklar. Polielektrolitler elektrostatik konumlar taranır yüksek tuz koşullarında karıştırılır, daha sonra tuz konsantrasyonu yavaş yavaş polielektrolitler en enerjik uygun yapılandırmaları yerleşmek için izin indirilir, termal annealing yavaş soğutma sürecine benzer. Bu protokolü kullanarak, düzenli olarak oligonükleotid PCMs7,26için son derece düşük polidispersity ve yüksek tekrarlanabilirlik elde edebiliyoruz. Son olarak, pcm'leri dış morfolojiden iç yapıya kadar çok geniş bir uzunluk ölçeği nde karakterize etmek için dört ayrı ölçüm tekniğinin nasıl kullanılabileceğini anlatıyoruz: DLS, çok açılı ışık saçılımı (MALS), küçük açılı X-ışını saçılımı (SAXS) ve iletim elektron mikroskobu (TEM). Bu protokollerin daha fazla araştırmacının bu ilginç nano parçacıkların yeteneklerini etkili bir şekilde keşfetmesini sağlayacağını umuyoruz.

Polimer Seçimi ve Hazırlanması
PCM özellikleri, kurucu polimerlerin fiziksel ve kimyasal özelliklerinden güçlü bir şekilde etkilenerek polimer seçimini tasarım sürecinde kritik bir adım haline getirir. Nükleik asit PCM'ler için en iyi karakterize blok kopolimerler poli(lizin)-poli (etilen glikol) (pLys-PEG) gibi lineer bloklardır, ancak pcm'ler polielektrolitler ve yüksek işlenme usulünde üretilebilen çeşitli hidrofilik nötr yüklü polimerler arasında oluşturulabilir28. Yüklü grup seçimi güçlü iyon eşleştirme ve micelles şekli istikrarı etkiler26, ve PCM boyutu yüklü blok uzunluğu ile artırmak için gösterilmiştir5,7,26 (Şekil 2), böylece PCM özellikleri istenen bir uygulamanın gereksinimleri için ayarlanmasına izin. Doğrusal bloklar için, yüklü bloğun en az 10 şarjı olması ve istenilen pH'da güçlü bir şekilde şarj edilmesi gerektiğini bulduk. Daha uzun şarjlı bloklar, daha kısa bloklarla karmaşıkolması zor olan siRNA gibi oligonükleotidlerle PCM oluşumunu teşvik edebilir21. 200'e kadar blok uzunlukları ile PCM oluşumunu başarıyla gözlemledik ve literatürde daha uzun polimerler tanımlanmaktadır. Daha fazla esneklik nötr bloklar24seçiminde mevcuttur, ancak deneyim çok kısa nötr blokları nanofioluşumu yerine toplama yol göstermiştir, ve minimum nötr uzunluğu yüklü blok uzunluğu ile artar. PLys-PEG için, ~50'nin altındaki pLy'ler için en az 3.000-5.000 PEG MW gerekir ve şarj edilen blok daha da artırıldıkça daha uzun uzunluklar gereklidir. Nötr polimerlerin sterik kalabalıklığı nedeniyle, özellikle kabuk kalınlığı, artan PCM boyutu, artan nötr blok uzunluğu sonuçları.

Bu el yazması, pcm'lerin lyophilized yüksek saflıkta pLys-PEG ve bilinen miktarda oligonükleotidlerden hazırlanması için bir protokol sunar, ancak diğer sistemlere de kolayca uyarlanabilir olmalıdır. Biz başarılı polyarginin ve poliglutamik asit de dahil olmak üzere çeşitli yüklü polipeptidler ile test ettik, yanı sıra çeşitli sentetik polielektrolitler, poliakrilik asit ve poli (vinilbenzyl trimethylammonium) gibi. Ayrıca polielektrolit ücretlerise stokiyometrik oranı ile PCM'ler hazırlanması açıklar, ama bu kolayca değiştirilebilir. Biz de doğal olarak tam olarak şarj olmayan polimerler barındıran şarj konsantrasyon üniteleri (c.c.), çalışmak için en kolay bulabilirsiniz. Eğer her iki polimer de iyi karakterize değilse, polimer uzunluklarını/kütlelerini doğru bir şekilde belirlemeye ve örneğin diyaliz ile şarj nötralizasyonu için gerekenin ötesinde fazla tuz bulunmadığından emin olmaya özen verilmelidir. Konsantrasyonlar hesaplandığında herhangi bir korunan suyun varlığı da hesaba katılmalıdır. Nükleik asit konsantrasyonu 260 nm'de absorbance ile uygun bir şekilde ölçülebilir ve c.c hesaplanırken terminal fosfatların varlığı veya yokluğu göz önünde bulundurulmalıdır.

Polianiyonlar olarak oligonükleotid kullanırken, hibridizasyon durumu ve kimyasal yapı kendi kendine montaj eğilimi ni ve ortaya çıkan PCM5,7,26özelliklerini belirlemeye yardımcı olur. Bunların, teslimat için PCM'ler kullanılması durumunda biyolojik etkinlik gereksinimleri dahilinde optimize etmek, istenilen yapıların oluşma olasılığını artıracaktır. Hibridizasyon analiz etmek için yararlı araçlar nükleik asitler için MATLAB fonksiyonları, NUPACK29ve IDT OligoAnalyzer içerir. Bir saç tokası oluşumunda 1) kendisine bağlanmanın gücünü anlamak için bir aday dizisini analiz etmenizi öneririz; 2) aynı sıranın başka bir kopyası (self-dimer); ve 3) sistemde bulunan diğer oligonükleotidlere. Belirli bir dizi için DNA ve RNA erime sıcaklıkları da en yakın komşu yöntemi 30 ,31kullanılarak hesaplanabilir. Nükleik asitlerin Termal annealing (adım 2.3) bireysel nükleotitler herhangi bir kalıntı ikincil yapı denatüre ve denge katlama teşvik.

PCM Karakterizasyonu ve Analizi
Statik ve dinamik ışık saçılımı, elektron veya nötron ların küçük açı saçılımı ve elektron mikroskobu gibi nano partikülleri karakterize etmek için çok çeşitli teknikler mevcuttur. Bu makalede, iki ışık saçılma teknikleri, küçük açılı X-ışını saçılımı ve iki elektron mikroskobu teknikleri için protokoller salıyoruz.

DLS, numunenin Brownian hareketinden bir açıyla saçılma yoğunluğundaki zamansal dalgalanmaların otokorelasyonuna göre ölçer. Bu verilerin takılması küresel miseller için hidrodinamik yarıçap ve polidispersitlik sağlayabilir(Şekil 3). Çoklu açılı ışık saçılımı (MALS) statik saçılma yoğunluğunu birçok açıda ölçer. Bu açısal bağımlılık nanopartikülün şeklini açıklar, ancak görünür ışık için ~50 nm'den daha uzun uzunluk ölçekleri ile sınırlıdır, bu da küçük nano taneciklerin etkinliğini sınırlar. Her iki teknik de kırılma indisi uyuşmazlığı temel alır ve öncelikle nanopartikülün dış boyutlarını açıklar.

Küçük açılı X-ışını saçılımı (SAXS) x-ışını'nı saçılma sondası olarak kullanır ve daha kısa dalga boyu ~0.1-100 nm aralığında ölçüm yapılmasına olanak tanır. Gözlemlenen saçılma yoğunluğu ve açısının (geleneksel olarak momentum transferi qolarak ifade edilmesi) montajı, PCM morfolojisi (yani boyut ve şekil) ve iç yapısı hakkında bilgi sağlar. Mutlak yoğunluk kalibrasyonu varsa ve saçılma yoğunluğu sıfır açıya çıkarılabilirse, PCM kütlesi ve toplama sayısı da32olarak tahmin edilebilir ve bu da SAXS'ı son derece çok yönlü ve değerli bir yöntem haline getirir. Küçük açı nötron saçılma (SANS) uzunluk ölçekleri benzer bir dizi üzerinde duyarlı dır ama sadece özel tesislerde mevcuttur ve açıkça bu makalede ele alınmayacaktır33,34,35.

Son yıllarda benchtop SAXS aletleri gelişini gördük, ama biz senkrotron kaynakları daha iyi PCM karakterizasyonu için uygun olduğunu bulmak, onların yüksek yoğunluklu veri bu düşük kontrastlı örnekler için çok daha hızlı toplanması için izin verir gibi. Kullanıcı açısından Gelişmiş Foton Kaynağı'nda (Argonne National Laboratory, ABD) Beamline 12-ID-B'de PCM SAXS verilerinin elde etmek için kısa bir protokol salıyoruz. Bu protokol çoğu senkrotron kaynağı için geçerli olmalıdır, ancak bir deneme önermeden önce yerel personele danışmak şiddetle tavsiye edilir. Igor Pro için yazılmış ücretsiz bir makro kümesi olan Irena36'yıkullanarak veri azaltma ve analiz protokolü de salıyoruz. Irena, SAXS verilerini modellemek için çok yönlü bir form faktörü kümesi içerir ve PCM'lerin karmaşık saçılma profilini tanımlama yeteneğine sahip çok bileşenli modellerin yapımına olanak tanır (Bkz. Temsili Sonuçlar, Şekil 4). Irena da kapsamlı belgeler ve öğreticiler online mevcuttur. Aşağıdaki yordamları denemeden önce, özellikle "SAXS verilerinin iki ana saçılım popülasyonuyla modellenmesi" öğreticisi olan bu yordamlara aşina lığı öneririz.

Radyasyon hasarı X-ışını saçılma için bir endişe, ama çeşitli önlemler bunu en aza indirmek için kullanılabilir. Özellikle, bir şırınga pompası ve PCM örnek veri toplama sırasında akan bir akış hücresi kurulum kullanmanızı öneririz, yerine kapalı bir kılcal. Bu da büyük ölçüde arka plan çıkarma kolaylaştırır. Ayrıca, herhangi bir örnek hacminin gördüğü akışı sınırlamak ve herhangi bir hasarı belirlemek için pozlama verilerinin karşılaştırılmasına olanak sağlamak için, akan numunenin daha uzun bir numune yerine birden fazla pozlama sını almanızı öneririz.

Genellikle yorumlamak için uygun gerektiren saçılma tekniklerinin aksine, iletim elektron mikroskobu (TEM), numunenin içinden bir elektron ışını geçirerek ve bir görüntüyü bir ışıltı ekranına yansıtarak nano taneciklerin gerçek bir uzay görsel görüntüsünü sağlar(Şekil 5). Bu makalede iki TEM tekniği için protokoller salıyoruz. Cryo TEM, mikel örneklerini ince bir vitreus buz tabakasında dondurarak, en az yabancı maddelerle yapısal konformasyonu korur, yarıçaptaki miseller ≤~10-100 nm için en uygun. Negatif leke TEM, bir ızgara yüzeyinde kuruduktan sonra numuneyi çevrelemek için ağır metal tuzu (örneğin, uranyum) kullanır. Yoğun leke, kontrast ekleyerek ve numunenin negatif bir görüntü üreten, örnek daha fazla elektron dağılım olacaktır. Yüksek kaliteli görüntüler için Cryo TEM önerilir. Ancak, daha pahalı, zaman alıcı ve yeterli kontrast sağlamayabilir. Bu bir sorun olduğunda negatif lekeli numuneler kullanılmalıdır. Her birinin örnekleri Şekil 5'tegösterilmiştir.

Bu tekniklerin her biri farklı güçlü ve sınırlamaları ile, nano tanecikleri biraz farklı yönlerini raporlar. Işık saçılma kolayca kullanılabilir ve genellikle en hızlı yaklaşımdır, ancak boyut ve şekil çözünürlüğü önemli sınırlamaları vardır. SAXS, oldukça yüksek iş gücünde çok çeşitli uzunluk ölçekleri üzerinden bilgi sağlayabilir, ancak verileri elde etmek için özel ekipman ın yanı sıra yorumlamak için modelleme gerektirir. TEM görüntüleri yorumlamak kolaydır ancak kontrast olarak sınırlı olabilir ve doğal olarak düşük iş kolu vardır. Deneyimlerimiz, karakterizasyon için birden fazla teknik kullanmanın PCM özellikleri hakkında elde edilebilen bilgileri büyük ölçüde artırdığını ve yalnızca her birinden elde edilen veri kümelerinin yorumlanmasını kolaylaştırdığını göstermiştir. Örneğin, SAXS ve TEM öncelikle bir PCM'nin yoğun çekirdeğini incelerken, ışık saçılma raporları nanoparçacığın genel boyutları hakkında dır. Böylece, bunları birleştirerek hem çekirdek hem de korona boyutu ölçümü sağlar. TEM'in gerçek alan görüntüleri elde etme becerisi, aksi takdirde belirsiz olabilecek SAXS verilerinin modelalınması için uygun form faktörlerinin seçilmesini sağlamak için zemin gerçeği verileri sağlayabilir. Bu makalede, dört tekniğin protokolleri açıklanır ve bilinmeyen bir örneği karakterize etmek için bunları kullanmak için örnek bir işlem Tartışma bölümünde verilmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Malzemelerin Hazırlanması

  1. Lyophilized diblock polimeri tartın ve 10 mg/mL son konsantrasyondaki stok çözeltisi için gereken hacmin neredeyse üzerine su ekleyin. 2 dakika maksimum hızda girdap.
  2. Sonicate için 5 dk. Çok uzun diblocks ek sonication gerektirebilir. Stok çözeltisi tamamen saydam ve homojen görünmelidir.
  3. Gerektiğinde NaOH veya HCl kullanarak pH'ı 7,4'e ayarlayın. Son hacme su ekleyin. pLys-PEG çözeltileri oldukça kararlıdır ancak uzun süreli depolama için soğutulmalı ve pH kullanılmadan önce kontrol edilmelidir. Lyophilization donma için tercih edilir.
  4. İstenilen stok konsantrasyonunda liyofilize oligonükleotid(ler) resuspend lyophilized oligonükleotid(ler) genellikle 50 nt veya altında uzunlukları için 2-5 mM moleküler konsantrasyon. Girdap iyice tam çözünme sağlamak için.
  5. Giriş'te açıklandığı gibi molekül ağırlığı veya uzunluğu kullanarak molar konsantrasyonlarını hesaplayın.
  6. Azı azı yükü konsantrasyonlarını (c.c.) hesapla, burada

Equation 1

Polielektrolit yükü yüklü monomer lerin sayısıdır, nükleik asit yükü ise fosforilasyon olmadığını varsayarak eksi 1 baz sayısıdır. Çift iplikli DNA'nın molekül başına tek iplikçikli DNA'ya göre iki kat daha fazla yükolacağını unutmayın.

  1. Her polimer için 20 mM c.c. seyreltilmiş stok oluşturun.

2. Nükleik Asit Polielektrolit Micelle Hazırlama

  1. 1,5 mL mikrosantrifüj tüpte, aşağıdakileri toplam 280 μL hacmine karıştırın:
    1. 200 μL nükleaz içermeyen su (nükleik asit içermeyen PCM'ler için ultra saf su).
    2. 40 μL 10x fosfat tamponlu salin (PBS, 137 mM sodyum klorür, 10 mM fosfat, pH 7.4 1x seyreltilmiş) veya diğer uygun tampon37.
    3. 40 μL 20 mM c.c. oligonükleotid. Çift iplikli oligonükleotidler için, 20 mM c.c'de her iplikçikten 20 μL ekleyin.
  2. Oligonükleotid çözeltisini 70 °C'de 5 dk kuluçkaya yatırın. Oligonükleotidler için hesaplanan erime sıcaklığı daha yüksekse, sıcaklık buna göre artırılmalıdır. RNA'nın yüksek sıcaklıklarda bozulacağını unutmayın, bu nedenle bu veya diğer hassas bileşenler varsa bu adım daha uzun olmamalıdır.
  3. 15 dk. 20 mM c.c diblock 40 μL ekleyin, sonra maksimum hızda 20 s için hemen girdap ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dk kuluçka (RT).
  4. Tuz anneal gerçekleştirin.
    1. 1 M NaCl ve 400 μL'lik son hacim için 80 μL 5 M sodyum klorür ekleyin. Maksimum hızda 10 s için girdap.
    2. Oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka, sonra diyaliz kartuşları içine yükleyin. Listelenen moleküler ağırlık kesiklerinin küresel proteinler için belirlendiğini ve lineer polimerler için doğru olmayacağını unutmayın. 2k MWCO kartuşunnumune kaybını önlüyor ve iyonik mukavemette kademeli değişiklikler sağlıyor.
    3. Diyaliz banyoları hazırlayın.
      1. Gerekli diyaliz banyosu hacmini hesaplayın:
        Equation 2
      2. 10x PBS (veya diğer istenilen tampon), 5 M NaCl ve 1x PBS ve 0.5M NaCl'nin nihai çözeltisi için ultra saf suyu ve 1x PBS'nin iki çözeltisini karıştırın.
    4. Diyaliz kartuşları yükleyin.
      1. Kartuşları kalıcı işaretleyiciyle etiketleyin. Membranları nemlendirmek için kartuşları en az 2 dakika tamponda bekletin.
      2. Saat yönünün tersine bükülerek kapağı çıkarın. Jel yükleme pipet ucu kullanarak numune yükleyin. Membranları hafifçe sıkarak fazla havayı çıkarın. Kapağı değiştirin.
      3. 1x PBS, 0,5 M sodyum klorür diyaliz banyosukartuşları koyun. Kartuşlar, her iki membran banyoya maruz kalan, yüzen olmalıdır. Gerekirse köpük şamandıralar kullanılabilir.
    5. Diyaliz
      1. 24 saat boyunca inkübat bir manyetik karıştırma çubuğu ile yavaş yavaş karıştırarak.
      2. Kartuşları 1x PBS veya diğer istenilen çalışma arabelleği yeni bir banyoya taşıyın. 24 saat kuluçka, manyetik bir karıştırma çubuğu ile yavaş yavaş karıştırarak. Bu adımı tekrarlayın.
    6. Örneği kurtarın.
      1. Kartuşları banyodan çıkarın. Jel yükleme pipet ucu kullanarak kapağı çıkarın ve numuneyi geri alın. Kurtarılan hacmin membran şişmesi nedeniyle ilk 400 μL'den daha yüksek olabileceğini unutmayın. Hafif seyreltme bir sorun ise kaydedilen hacim.
      2. Numuneyi temiz bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe yerleştirin. Bu şekilde hazırlanan PCM'ler, nükleaz kontaminasyonundan kaçınılması koşuluyla, soğutulduğunda birkaç ay stabil olmalıdır.

3. Dinamik ışık saçılımı

  1. Tozsuz koşullar sağlamak için tamponlar dikkatle filtre edilmeli (0,22 μm şırınga veya vakum filtresi ile 3 kat filtrelenmiş) ve numuneler arasında iyice temizlenmiş cam eşyalar. Numunenin ölçümü yapmadan önce termal dengeye ulaştığından emin olmak da önemlidir.
  2. PCM numunesini istenilen çalışma tamponu ile 0,2 mM c.c.'ye (yukarıda açıklanan protokolü kullanıyorsanız 10 x) seyreltin ve uygun bir cuvette yükleyin. Seyreltme den sonra ~200 μL numune gerektiren küçük hacimli bir cuvette kullanıyoruz.
  3. DLS dedektör pozisyonunu 90°'ye ayarlayın.
  4. Lazer gücünü ve/veya zayıflatıcıyı, mümkünse sayım oranı saniyede 100.000-200.000 sayar (cps) olacak şekilde ayarlayın. 10 kcps gibi düşük sayma oranları kullanılabilir, ancak iyi istatistikler elde etmek için ölçüm sürelerinin uzatılması gerekebilir (adım 4.1). Birden fazla saçılma ölçümü bozacağı için daha yüksek sayım oranlarından kaçınılmalıdır.
  5. 1 dk veri edinin. Sayım oranı tüm satın alma süresi boyunca sabit olmalıdır; değilse, bu örnek veya enstrümanın bazı bileşeninin henüz denmediğini gösterir.
  6. Otomatik korelasyon verilerini inceleyin. Uzun süreli taban çizgisi çok düz olmalı ve otokorelasyon eğrisi Şekil 3 A'dagösterildiği gibi, en az dağılımla düzgün olmalıdır. Temel sürüklenme denge eksikliğini gösterir ve verilerdeki gürültü daha fazla veri edinilerek geliştirilebilir.
  7. Otomatik korelasyon işlevini sığdırın.
    1. RePESkullanın 38,39 gevşeme süreleri ve difüzyon katsayısı, Dbir dağıtım sunmak için düzenli ters Laplace dönüşüm gerçekleştirmek için . Bu yöntem daha sonra Hidrodinamik yarıçapı hesaplar, Rh, Stokes-Einstein denklemi kullanarak:
      Equation 3
      Şekil 1B, Rh'nin bir temsilini, Şekil 3B ise REPES sonucunu gösterir.
    2. Alternatif olarak, CONTIN40,41 (alternatif bir düzenlileştirme algoritması) veya negatif olmayan en küçük kareler uydurma (NNLS) dahil olmak üzere diğer yöntemleri kullanın. Birden çok montaj yönteminden elde edilen tutarlı sonuçlar, yüksek kaliteli verilerin imzasıdır. Cumulant analizinin (birçok enstrümanda standart) multimodal boyut/uzunluk dağılımları için fiziksel olmayan değerler verdiğini unutmayın.

4. Çok açılı ışık saçılımı

NOT: Işık saçılma yoğunluğu ve açısı çeşitli aletlerüzerinde ölçülebilir. Hem goniyometre tabanlı aletleri hem de çoklu dedektör aletleri kullanarak toplu modda çalışan iyi sonuçlar elde ettik.

  1. PcM konsantrasyonunu ve aydınlatma yoğunluğunu ayarlayarak herhangi bir dedektörü doyurmadan tüm açılardan yalnızca tampon numuneye karşı yeterli sinyal/gürültü yü sağlamak için ayarlayın. İkincisi çeşitli seyreltme faktörlerinde numuneler hazırlayarak ve yoğunluk vs konsantrasyon doğrusallık kontrol ederek test edilebilir (PCM'ler arasında en az etkileşim varsayarak).
  2. Açı başına 1 dk için ışık saçılma hızını 15° den 135°'ye kaydedin. Numune ve alet düzgün bir şekilde dengelenirse, saçılma hızı ölçüm süresi boyunca sabit olacaktır.
  3. Arsa normalleştirilmiş saçılma oranı, bengünah(ί), vs q, nerede saçılma oranıdır. q tarafından tanımlanan saçılma vektörüdür (foton momentum transferi)

Equation 4

where η = çözücü kırılma indisi, π = ölçüm açısı ve λ = ışık kaynağının dalga boyu. Şekil 4 MALS saçılma yoğunluğu bir arsa gösterir.

5. Küçük açılı X-ışını saçılımı

  1. Veri toplama
    1. Yukarıda açıklandığı gibi, arka plan üzerinde geniş saçılma için oligonükleotid PCM'ler için 2 mM şarj konsantrasyonunda PCM numuneleri hazırlayın. Ağır atomlardan yoksun PCM'ler için (örneğin, nükleik asitlerdeki fosfor) daha yüksek konsantrasyonlarda gerekebilir. Saçılma uzunluğu yoğunlukları SASSIE42gibi hesap makineleri kullanılarak tahmin edilebilir.
    2. Serbest radikalleri atarak radyasyon hasarını en aza indirmek için, konsantre bir gliserol ekleyin (örneğin, 50%) stok çözeltisi böylece micelle çözeltisi içerir 1% (v / v) gliserol. Düzgün gliserol son derece viskoz ve doğru ölçmek zor olduğunu unutmayın. Su veya tampon ile seyreltme şiddetle tavsiye edilir.
    3. Bir arka plan monitörolarak kullanılmak üzere% 1 gliserol ile çalışma tampon büyük bir hacim hazırlayın.
    4. Beamline özel akış hücresi aparatını hazırlayın ve dedektörü kalibre edin. Protokol, küçük çaplı bilgisayar kontrollü şırınga pompasına bağlı 3 mm çapında kuvars kılcal ve minimum uzunlukta polietilen tüp kullanır. Bu kurulumda numune başına en az ~140 μL hacim gereklidir.
    5. Örnek pozlama parametrelerini belirleyin. Optimum pozlama, ışın yoğunluğuna, dedektör hassasiyetine ve numunenin konsantrasyonuna, saçılma gücüne ve hasara bağlı olarak değişir, ancak amaç numuneyi q ilgi aralığında yeterli dağılım yoğunluğu elde etmek için gereken minimum akışa maruz bırakmaktır.
    6. Oligonükleotid/pLys-PEG PCM'ler için, 1 Hz tekrarlama hızında 30x 0.2 s pozlama, algılanabilir hasar oranı nın çok az olduğu iyi veri kalitesi sağlar. Yeni örnekler için aşağıdaki yordam yararlı olabilir:
      1. PCM örneklerini çeşitli konsantrasyonlarda hazırlayın (örn. 10-10.000 μM c.c.).
      2. Bir ara konsantrasyon, alternatif PCM ve tampon sadece örnekleri değişen pozlama süreleri ile başlayarak. Veri toplama ve azaltma prosedürü için aşağıya bakın. Örnek sinyal iyi istatistiklere sahip olmalıdır (küçük istatistiksel hata veya qarasında düzgün varyasyon). İstatistikler zayıfsa, maruz kalma süresi artırılabilir.
      3. Örnek sinyal de açıkça ilgi q aralığı üzerinde arka plan ayırt edilebilir olmalıdır. Sinyal/arka plan oranını belirlemek için (sinyal-arka plan)/arka plan oranını q'ya karşı hesapla ve çiz. Sinyal/arka plan oranı düşükse, numune konsantrasyonu artırılmalıdır.
      4. Saçılma yoğunluğunun (konsantrasyona normalleştirilmiş) daha yüksek ve daha düşük konsantrasyonlarda veri elde ederek numune konsantrasyonundan bağımsız olduğunu, gerekirse pozlama süresini azaltın. İnterparçacık etkileşimleri (konsantrasyon bağımlılığının en olası nedeni) en düşük q aralığında belirgin olacaktır.
    7. PCM örnekleri ve arka plan (yani, gliserol ile tampon) için veri edinin.
      1. Numuneyi kılcal damardan geçirmek için şırınga pompasını tetikle. Çift yönlü veya bir kez hareket kabul edilebilir, ancak her numuneyi izole etmeye özen dilmelidir (örn. numuneler arasına bir hava kabarcığı yerleştirerek). Örnekler geri kazanılabilir ve radyasyon hasarı görülmezse yeniden kullanılabilir.
      2. Akış başladıktan sonra, yukarıda açıklanan X-ışını pozlama ve veri toplama programını tetikler. Akışkan akışı ndan önce ışına maruz kalmanın sona erdiğine dikkat edilmelidir.
    8. Her örnekten sonra, azimuthal ortalamasını gerçekleştirin ve her pozlama için 1D profilleri (yani yoğunluk vs. q)birlikte çizin. Bunlar istatistiksel hata içinde aynı olmalıdır. Sinyalin zaman içinde değiştirilmesi radyasyon hasarına işaret edebilir.
      1. İzole anormal profiller mikrokabarcıkların varlığını gösterebilir. Kabarcıklar sık sık görülürse, akış hızının azaltılması yardımcı olabilir.
    9. 1B saçılma profillerinin ortalamasını aldı.
    10. Arabellek örnekleri için sık sık veri edinin (her 4-5 PCM örneğinde bir kez) ve bunları zaman içinde karşılaştırın. Tampon sadece örneklerden artan sinyal kılcal radyasyon hasarlı örnek ile kontamine olabileceğini gösterir.
      1. Kontaminasyon fark edildiğinde, kılcal damarı çamaşır suyuyla yıkayın ve mümkünse maruz kalma süresini azaltmayı düşünün.
  2. Irena kullanarak veri azaltma ve analiz
    1. Micelle ve arka plan ASCII veri kümelerini alma(SAS/Data alma ve verme/alma ASCII SAS verileri).
    2. Örnek verilerden arka plan saçılımlarını çıkarın. Tipik olarak, en yüksek q değerleri (örneğin q > 0,5) çözücüden sinyale hakim tutarsız saçılma gösterir. Bu q aralığı üzerinde örnek verileri eşleştirmek için arka plan verileri ölçekleme, ışın yoğunluğu değişimi ve örnek konsantrasyonu nedeniyle herhangi bir varyasyon kaldırır.
      1. Örneği ve arka planı günlük günlüğü ölçeğinde birlikte çizin. Yüksek q düz yoğunluğu doğrulayın (SAS / Veri Işleme / Veri Manipülasyon I). Örnek/arka plan oranını(Data1/Data 2)hesaplayın , doğrusal günlük ölçeğinde çizin veyüksek-q asimptot'u doğrulayın.
      2. Bu q aralığındaki ortalama (örnek/arka plan) oranını hesaplayın (özel bir makro kullanın veya veri tarayıcısından bir elektronik tabloya kopyalayın/yapıştırın).
      3. Veri Düzenleme makrosunu kullanarak, yukarıda hesaplanan oranı kullanarak arka planı ölçeklendirin (örn. Veri 2 değiştirin)ve arka plan dan çıkarılan sinyalin arka plan adedine oranını planla çizin q ( [Data1-Data2]/Data2),şimdi yüksek q'dasıfıra asimptots olduğunu doğrulayın . Bu oranı kaydedin; her örnek için 1,0'dan %1-2 uzakta olmalıdır.
      4. Arka plandan çıkarılan sinyali(Data1-Data2) ve yeni bir adla verileri kaydedin. Orijinal verilerin üzerine yazmayın.
      5. Yüksekq veri satılamazsa, arka plan çıkarma için 1 ölçekleme faktörü kullanın, ancak sinyal/arka plan oranının küçük olduğu q aralıklarında yanlışlıklar ın ortaya çıkabileceğini unutmayın.
    3. Modelleme makrosunun(SAS/Modelleme)açın, ardından arka plandan çıkarılan verileri yükleyin ve çizin(Veri cntrls/Veri Ekle). Bu makroda ölçeklendirmeyapmayın.
    4. İlk olarak, PCM'nin dış yüzeyi için yaklaşık bir model bulun (micelle boyutu/şekli):
      1. Veri cntrlsolarak, düşük ve orta q aralığı (örneğin, ~ 0.003ş-1 < q < ~0.1ş-1)seçin. Salınımlar görünürse, bunları ekleyin.
      2. Verilere uygun bir form faktörü seçin. Düşük q eğimi, TEM ve/veya MALS ile de doğrulanabilen nanopartikül şeklinin göstergesidir. Schulz-Zimm spheroid (q0), silindir (q-1), veya esnek silindir(q-2) modellerini kullanın. Irena güç yasaları(SAS / Destek Araçları arsalar ve tablolar için)uydurma için araçlar sağlar.
      3. Model cntrls'te,ilk saçılma popülasyonunu(1P)seçin ve yalnızca kullanımda olduğundan emin olun (Kullanım? onay kutusunu seçin).
      4. Model için Boyut dist. seçeneğini belirleyin ve istenilen Dağıtım türünü ve Form Faktörünüseçin. Ölçek, Ortalama Boyutve Genişlik alanlarına değerleri girerek aramanın ilk parametrelerini ayarlayın ve elde edilen form faktörlerini çizmek için Modeli Hesapla'yı tıklatın.
        NOT: Esnek Silindir form faktörü Kullanıcı Formu Faktörü olarak eklenebilir ve https://usaxs.xray.aps.anl.gov/software/irenaindirilebilir. Parametreler 1 ve 2 silindir ve Kuhn uzunluğu uzunluğu, sırasıyla uzunluğu karşılık gelir.
      5. Makul parametreler bulunduktan sonra, verilere uygun doğrusal olmayan en küçük kareler gerçekleştirmek için Uygun Model'i tıklatın. Boyut dağılım modeli ortalama yarıçap ve genişlik verir.
        Polidispersity (PDI) kullanımını hesaplamak için
        Equation 5
        Doğrusal olmayan herhangi bir montaj prosedüründe olduğu gibi, istikrarlı, fiziksel olarak makul bir uyum elde etmek için veri aralığını(q bölgesi) ve başlangıç parametrelerini ayarlamak gerekebilir.
      6. Makul bir uyum sağlandıktan sonra kaydedin (Not Defterinde Depola/Klasörde Depolayın).
    5. Ardından, PCM çekirdeğiiçindeki polimerlerin ayrı ayrı saçılmasını modellendirin. Bu bir güç yasası modeli (örneğin, ideal zincirler için q-2, şişmiş zincirler için q-5/3, vb) tarafından yakalanabilir. Irena beaucage modeli43ile uygular:
      Equation 6
      Nerede P güç yasası ve G ve B prefactors vardır.
      1. Tüm q aralığını kapsayacak şekilde veri denetimlerini ayarlayın ve modeli yeniden çizin(Modeli Hesapla). Tipik olarak, aşırı saçılma orta-yüksek q aralığında gözlenir (örneğin, q > ~0.1ş-1).
      2. Fazla dağılım (>10x form faktörü modeli) gözlenen q aralığını seçmek için veri denetimlerini kullanın.
      3. İkinci bir saçılma popülasyonu(2P)ekleyin ve yalnızca kullanımda olduğundan emin olun (1Piçin Kullanım'ı seçin).
      4. Model için Birleşik düzey'i seçin. B ve P ilgili parametrelerdir. Bu parametreler için ilk tahmin elde etmek için csr makrosu arasındaki çizim destek araçlarını veya Fit P/B'yi kullanın ve modelin düşük q'daaşırı saçılmayı öngörmemesini sağlamak için Guinier faktörleri G ve Rg'yi ayarlayın.
      5. Form faktörüne gelince, doğrusal olmayan bir uyum gerçekleştirin ve parametreleri ve modeli kaydedin.
    6. Daha sonra, Şekil 4'teolduğu gibi bir kırınım zirvesi varsa, q ilgi aralığındaki kırınım zirvesi için üçüncü bir model ekleyin(q = ~0.22 ş-1 bu durumda).
    7. Tek tek saçılma popülasyonları için yaklaşık uygun değerler elde edildikten sonra, üçünü birlikte açın (her biri için Kullanım'ı seçin) ve birleştirilmiş uyumu optimize edin.
    8. Her değerin fiziksel olarak makul olup olmadığını kontrol edin. Bu yordamın sonucu, Şekil 4'tegösterildiği gibi, saxs verilerini çok çeşitli boyut ölçekleri üzerinde açıklayan bir bileşik model olmalıdır. İgor içinde depolamak için Klasörde Depola düğmesini kullanarak sığmayı kaydedin.

6. İletim Elektron Mikroskobu (TEM)

  1. Cryo TEM
    1. Izgarayı seçin. Alternatif olarak standart TEM ızgarası veya dantel karbon üzerinde delikli karbon destek filmi öneriyoruz. Her iki durumda da, karbon arasındaki delikler saf vitreus buz ve örnek bir görüntüleme alanı sağlayacak ve hiçbir film.
    2. Izgara karbon tarafını temiz bir cam kaydırak üzerinde parlayan bir boşaltma aparatına yerleştirin. Slaytı laboratuvar filminde sarmak ızgara işlemeye yardımcı olabilir. Cımbızla ızgaranın merkezine dokunmaktan kaçının ve her zaman ızgaranın kenarına yakın çimdikleme.
    3. 30 s için ızgara açığa.
    4. Numune birikimi için bir vitrifikasyon robotu hazırlayın.
      1. % 100 nem ve RT ayarlayın ve lekeleme kağıt ekleyin. Robotun tabanında sıvı etan ve sıvı nitrojen banyoları hazırlayın. Vitrifikasyon robot hazırlama ve kullanımı ile ek yardım için çevrimiçi eğitimler ve videolara bakın.
    5. Seyreltik örnek 5x.
    6. Vitrifikasyon robotu ile sağlanan negatif eylem cımbız kullanarak, bir ızgara almak, sonra robota cımbız takın ve odaya cımbız hareket ettirin.
    7. Robottayken, makinenin yan tarafındaki delikten bir pipet kullanarak numunenin 4 μL'sini ızgaranın karbon tarafına ekleyin.
    8. 4 dk kuluçka.
    9. Robotu kullanarak, filtre kağıdı ile 3-5 s blot.
    10. Vitrifikasyon robotu ızgarayı sıvı etan içine daldıracak.
    11. Cımbız çıkarın ve sıvı nitrojen ızgara taşımak ve bir depolama konteyner içine, aynı zamanda sıvı azot altında olmalıdır. Bu işlem, numuneyi ince bir vitreus buz tabakasına dönüştürür. Bu adımda ızgaranın sıvı etan veya sıvı nitrojen dışında harcadığı zamanı en aza indirin.
    12. Sıvı nitrojen kullanarak kriyo numune tutucuyu soğutun. Bir Dewar ve rezervuar dolu tutun.
    13. Görüntüye hazır olduğunuzda, ızgarayı kriyo numune tutucuya yükleyin. Numuneyi sıvı nitrojen altında veya sıvı yüzeyin hemen üzerinde son derece soğuk nitrojen buharında tutun.
    14. Farklı boyutlu micelles belirli bir buz kalınlığı tercih edebilir, çünkü ince ve kalın buz 75kx ve 150kx arasında 120 kV ızgara görüntü.
      1. Eriyen buzları ve numuneye zarar vermemek için Kiriş maruziyetini sınırlayın. Görüntü planlama doğrudan nerede odaklanmayın; yakın odaklanmak. Yalnızca bir görüntüyü yakalarken ilgi alanını ortaya çıkarın.
      2. Görüntüleri görüntülerken sıvı etan damlalarını örnekten ayırt ettiğinizden emin olun (Bkz. Şekil 5).
  2. Negatif boyama kullanarak konvansiyonel TEM
    1. Lekeyi hazırlayın.
      1. ~ 10 mL ultrasaf su kaynatın. 15 mL konik tüp içine 0,1 g uranyl formate (UFo) tartın.
      2. %2'lik bir çözelti için UFo tozuna 5 mL sıcak su ekleyin. Sıkıca kapatın ve ışığı engellemek için alüminyum folyo sarın. % 1 uranyal asetat leke de yaygın olarak kullanılır.
      3. Girdap veya 5 dakika boyunca şiddetle sallamak. 0,2 μm'lik şırınga filtresini temiz bir konik tüpe süzün.
      4. 10 dk'dan RT'ye soğumaya bırakın. 2m NaOH 25 μL ekleyin ve girdap hemen 2 dk.
        1. Alternatif olarak, 200 μL aliquots% 2 UFo dondurun. Kullanıma hazır olduğunuzda, bir aliquot eritin, 5 M NaOH 1 μL ekleyin ve 2 dakika girdap.
      5. Lekeyi folyoya veya ışıktan uzak tutun.
    2. 1x PBS (veya istenilen tampon) seyreltilmiş örnek 10x.
    3. Izgara'yı seçin. Bakır ızgaralarda karbon destek filmi öneririz. Izgaranın daha koyu ve parlak tarafı, numunenin birikeceği ve lekeleneceği karbon kaplı tarafıdır.
    4. Izgara karbon tarafını temiz bir cam kaydırak üzerinde parlayan bir boşaltma aparatına yerleştirin. Bkz. adım 6.1.2.
    5. 30 s için ızgara açığa.
    6. Karbon tarafı hala yukarı bakan ızgara almak ve merkezinde görüntüleme alanı yırtılma önlemek için ızgara kenarında negatif eylem cımbız ile tutun. Izgara hala karbon tarafı kadar tutulan cımbız aşağı ayarlayın.
    7. Bir pipet ile ızgaranın üst (karbon tarafına) 4 μL'lik bir numune damlası uygulayın.
    8. Kuluçka 4 dk.
    9. ~1 dk sol, pipet bir 10 μL ve temiz laboratuvar filmi bir parça üzerine UFo çözeltisi 20 μL damla.
    10. Görüntüleme yüzeyi ile herhangi bir temas önlemek için ızgara (dik temas) kenarından örnek wick filtre kağıdı kullanın.
    11. Cımbız (hala ızgara tutan) kullanarak, hemen 10 μL UFo damlacık aşağı ızgara örnek tarafı yerleştirin, sonra hemen sıvı kapalı wick (yıkama adımı). Izgaranın kurumasına izin vermemek önemlidir, bu nedenle adımlar arasında durmayın.
    12. Benzer şekilde, ızgara 20 μL UFo damlacık uygulayın. 40 s. Wick sıvı kapalı ve ızgara kuru izin için UFo üzerinde ızgara tutun.
    13. 20.000x ve 100.000x arasında 120 kV kuru ızgara görüntü.
    14. Radyoaktif atıklar için kurumun güvenlik hizmetini kullanarak ufo-kontamine olmuş tüm malzemeleri düzgün bir şekilde imha edin.
    15. Gerektiğinde, arka plan gürültüsünü azaltmak için ImageJ'deki TEM görüntülerine parlaklık/kontrast geliştirme ve medyan filtre uygulanabilir. Post processing düzgün yapılmalıdır, sadece yoğunluk gibi nicel ölçümler için kullanılmayan görüntüler için, ve her zaman rapor edilmelidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Yukarıda açıklanan karakterizasyon yöntemlerini göstermek için, oligonükleotidlerden biraraya getirilen PCM'ler ve çeşitli uzunluklarda ve kimyalardan blok kopolimerler için tipik sonuçlar gösteririz(Şekil 1). Şekil 2, PCM çekirdek boyutunun (SAXS ve TEM, Şekil 4 ve Şekil 5'tenbelirlendiği gibi) yüklü blok uzunluğuyla nasıl değiştiğini niçin bir örnek olarak sunmaktadır. Şekil 3, nispeten uzun blok kopolimerler ve kısa tek telli oligonükleotitlerden oluşan küresel PCM'ler için DLS verilerini ve montaj sonuçlarını göstermektedir. Şekil 4, mevcut birden fazla uzamsal korelasyon (dış yüzey, çekirdek içi saçılma, sarmal arası sıralama) için modelleri birleştirerek karmaşık SAXS yoğunluk spektrumlarının nasıl doğru bir şekilde sığabileceğini ve MALS'nin saçılma ölçümlerini daha uzun uzunluk ölçeklerine genişletmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Son olarak, Şekil 5 değişen morfolojipcm'ler için temsili elektron mikroskobu verilerini gösterir.

Figure 1
Şekil 1: Nükleik asit PCM'lerinin montajı ve karakterizasyonu. (A) Oligonükleotidler gibi anyonik polimerler, diblok kopolimerlerin katyonik bölgeleri ile fazdan ayrılmış kompleksler oluşturmuştur. Hidrofilik nötr bloğun (gri) varlığı, kararlı PCM nano partiküllerinin oluşmasına neden oldu. (B) PCM'ler, karakterize edilecek birden fazla parametreye sahip çekirdek kabuğu nano tanecikleriydi. Genel boyut (hidrodinamik yarıçap, Rh)DLS kullanılarak belirlenebilir, çekirdek yarıçapı (Rc)SAXS ve TEM kullanılarak bulunabilir, korona boyutu Rh-Rcolarak hesaplanabilir ve morfoloji SAXS, MALS ve TEM birleştirilerek birden fazla uzunluk ölçeği nde belirlenebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Micelle boyut bağımlılığı. Micelle çekirdek boyutu öncelikle blok kopolimer yüklü blok uzunluğu tarafından belirlenir, ve büyük ölçüde homopolimer uzunluğu bağımsız7,26. Bu blok polimer seçimi ile PCM boyutu kontrolü sağlar. Burada gösterilen veriler 88 nt/bp DNA'lı pLys-PEG içindir ve daha önce26rapor edilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Dinamik ışık saçılımı. (A) 10 nt tek iplikli DNA + pLys(100)-PEG(10k) PCM için otomatik korelasyon fonksiyonu (rasgele birimler). (B) REPES'ten hidrodinamik yarıçap dağılımı (histogram). Otomatik korelasyon işlevi tek bir zaman ölçeği ile düz bir değere bozunarak REPES boyut dağılımında tek boyutlu bir tepe noktası elde etti. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Temsilci SAXS ve MALS verileri ve silindirik bir micelle için uygun. SAXS verileri (gri daireler) pLys(50)-PEG(5k) ve 88 bp çift iplikli DNA'dan monte edilen PCM'ler için gösterilir. Düşük q (< 10-2 ş-1),yoğunluğu momentum transferi yaklaşık q-2 bağımlılığı gösterdi, esnek bir silindir şekli ima (solucan gibi micelle). MALS verileri (açık siyah daireler) aynı bağımlılığı gösterir, misellerin en az birkaç mikrometre uzunluğunda olduğunu gösterir (TEM görüntüleme ile doğrulanmış, Şekil 5C,D). Küresel miseller bu aralıkta q'da düz bir bağımlılık (q0)gösterir. Renkli çizgiler, bölüm 5'te açıklanan PCM SAXS verileri için çok bileşenli montaj prosedürünü göstermektedir. Düşük q (büyük mesafe ölçekleri) saçılma PCM dış yüzeyi hakim oldu ve esnek bir silindir modeli (kırmızı) tarafından iyi uyum. Daha yüksek q değerlerinde (daha küçük uzunluk ölçeğinde), saçılma PCM çekirdeğiiçinde bireysel polimerler tarafından hakim, düşük q kesme ile bir güç yasası (yeşil) tarafından buraya uygun. Ayrıca PCM çekirdeği içinde çift iplikli DNA heliklerinin paralel ambalajını gözlemledik ve bu da yarı-Bragg kırınım tepe noktası (mavi) ile sonuçlandı. Siyah kesik çizgi, bu modelleri birleştirerek SAXS verilerini doğru bir şekilde tanımladığını ve ışık saçılımı verilerinin (açık daireler) eklenmesinin boyut aralığını yaklaşık dört büyüklük sırası üzerinde genişlettiğini göstermektedir. Uygun sonuçlar ortalama yarıçapı = 11.0 nm ve PDI = 0.03 olan bir PCM popülasyonu, yüksek q = 1.81'de güç yasası ve kırınım zirvesi 2.71 nm inter-sarmal aralığını temsil eder. SAXS verileri daha önce26 bildirilmiştir ve genel kullanıma sunulmuştur44. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: NÜKLEIk ASIt PCM'lerin TEM görüntüleri. (A–B) Cryo TEM 22 nt tek iplikli DNA + pLys(50)-PEG(5k) PCMs, ağırlıklı olarak küresel morfoloji gösteren. Mavi oklar, PCM'lerle (dokulu küresel nesneler) karıştırılmamalıdır sıvı etan damlacıkları gösterir. (A) biraz az odaklanmış, çözünürlük korurken hafif kontrast ekleyerek. (B) önemli ölçüde az odaklanmış, daha fazla kontrast ekleyerek ama netlik ödün. Her iki görüntüye de parlaklık ve kontrast ayarlamaları ve iki piksel ortanca filtre uygulandı. (C-D) Negatif lekeli TEM 88 bp çift iplikli DNA + pLys(50)-PEG(5k) PCMs, uzun esnek silindirler vardır. Her iki durumda da TEM'den gelen çekirdek yarıçapları SAXS verilerinin takılmasından elde edilen değerlerle uyumluidi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Yukarıda da belirtildiği gibi, burada sunulan protokoller, poliyanion bileşeni olarak oligonükleotidlere ve katyonik-nötr blok kopolimer olarak pLys-PEG'e odaklanarak yazılmıştır, ancak bunları polikonik asit, poliglutamat ve PEG(vinilbenzyl trimethylammonium) gibi çeşitli polimerlerle test ettik ve bunların çoğu polielektrolit çifti için genel olarak geçerli olacağına inanıyoruz. Optimize edilmesi gereken bir parametre, annealing için kullanılan tuz konsantrasyonudur, çünkü PCM'lerin anneal'ın başında oluşmaması için yeterince yüksek olmalıdır. Bu durum DLS tarafından deneysel olarak kontrol edilebilir veya tek başına polielektrolitlerle faz ayrımı nın gözlemi ile karşılaştırıldığında (nötr blok yoktur). Elde edilen polidispersitler daha büyük olmasına rağmen, tuz tavlama istenmeyen ise Termal tavlama kullanılabilir7. Karakterizasyon için kullanılan konsantrasyonların da optimize edilmesi gerekebilir, çünkü daha büyük nano tanecikleri küçük parçacıklardan daha fazla ışık saçar ve nükleik asitler omurgadaki elektron yoğun fosfor atomlarının varlığı nedeniyle X-ışınlarının saçılmasında diğer polimerlere göre daha etkilidir. Ayrıca, polielektrolitin çalışma durumuna yakın bir pKa'sı varsa tamponun pH'ını daha yakından kontrol etmek gerekebilir.

Bu makalede, iki ışık saçılımı teknikleri (yani, çok açılı/statik ışık saçılımı ve dinamik ışık saçılımı) ve küçük açılı X-ışını saçılımı ve hem kriyo hem de konvansiyonel negatif leke iletimli elektron mikroskopisi için protokoller sunmaktayız. Tüm teknikler tüm senaryolar için gerekli değildir ve diğerleri de mevcuttur, bu da hangi zaman istihdam edilmelidir sorusunu gündeme getirerek. Geniş inceleme literatür bu konuda var45,46, ama biz yeni bir PCM veya benzer bir nanoparçacık karakterize ederken aşağıdaki öneririz. Hem bulanıklık için görsel inceleme hem de optik mikroskopi ile agregasyon kontrolü ile başlayın. Hiçbir toplama gözlenmezse, bir sonraki adım herhangi bir nano tanecikleri var olup olmadığını belirlemektir. DLS, PCM'ler ışığı şiddetle dağıttığı ndan ve zayıf veya var olmayan ışık saçılımı zayıf nanopartikül oluşumunun güçlü bir göstergesi olduğundan, bunu belirlemenin hızlı bir yoludur. DLS nano taneciklerin varlığını doğrulayabilirken, çoğu analiz yöntemi küresel parçacıkları varsayan Stokes-Einstein ilişkisine dayandığından, diğer verilere başvurmadan boyutlarını ve şekillerini belirlemek zordur. MALS küresel şekilleri (düz normalleştirilmiş yoğunluk vs açı) doğrulayabilir, ancak boyut dağılımı hem dar ve çözünürlük için doğru aralıkta düşmek olur sürece nonsferik parçacıkların şeklini belirlemek mümkün olmayabilir. Sonuç olarak, özelliklerini tam olarak karakterize etmek için TEM, SAXS veya her ikisini de herhangi bir PCM numunesinde gerçekleştirmenizi öneririz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Chicago Üniversitesi'ndeki Yumuşak Madde Karakterizasyon Tesisi ve İleri Elektron Mikroskobu Tesisi'nden Phil Griffin ve Tera Lavoie'ye teşekkür ederiz. Ayrıca Xiaobing Zuo ve Soenke Seifert Gelişmiş Foton Kaynak Argonne Ulusal Laboratuvarı ve NIST Merkezi Hiyerarşik Malzeme Tasarımı (CHiMaD) destek için teşekkür ederiz. Jeff Ting ve Michael Lueckheide'ye bu işe yaptıkları katkılar için teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70 mm circle filter paper Whatman 1001-070 Filter paper for wicking during grid prep
Carbon Film TEM grid Electron Microscopy Sciences CF200-Cu TEM grid
DAWN Wyatt Technology DAWN MALS instrument
DNA oligonucleotide Integrated DNA Nanotechnologies Inc Custom oligonucleotide
Lacey Carbon TEM grid Electron Microscopy Sciences LC200-Cu TEM grid
Methoxy-poly(ethylene glycol)-block-poly(l-lysine hydrochloride) PEG5k - PLKC50 Alamanda Polymers Inc mPEG5K-b-PLKC50 Example block copolymer
Milli-Q Millipore Sigma Ultrapure water
NanoDrop Thermo Scientific For measuring nucleic acid concentration
negative-action tweezers Dumont N7 Tweezers for grid preparation
Parafilm "M" Bemis Company Inc PM996 Laboratory film
Quantifoil Holey Carbon TEM grid Electron Microscopy Sciences Q210CR1.3 TEM grid
Research Goniometer and Laser Light Scattering System Brookhaven Instruments BI-200SM DLS/MALS instrument
Slide-A-Lyzer G2 2K 0.5 mL Thermo Scientific Pierce Protein Biology 87723 Dialysis cartridge
small volume cuvette Brookhaven Instruments BI-SVC Cuvette for DLS/MALS
Solarus 950 Advanced Plasma System Gatan Solarus 950 Plasma system for TEM grids
Talos TEM FEI Talos TEM used for cryo samples
Tecnai Spirit TEM FEI Spirit TEM used for dry samples
Uranyl Formate SPI-Chem 16984-59-1 For negative staining samples for TEM
Vitrobot FEI Vitrobot Vitrification robot for cryo grid preparation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Spruijt, E., Westphal, A. H., Borst, J. W., Cohen Stuart, M. A., van der Gucht, J. Binodal compositions of polyelectrolyte complexes. Macromolecules. 43 (15), 6476-6484 (2010).
  2. van der Gucht, J., Spruijt, E., Lemmers, M., Cohen Stuart, M. A. Polyelectrolyte complexes: bulk phases and colloidal systems. Journal of Colloid and Interface Science. 361 (2), 407-422 (2011).
  3. Priftis, D., Laugel, N., Tirrell, M. Thermodynamic characterization of polypeptide complex coacervation. Langmuir. 28 (45), 15947-15957 (2012).
  4. Fu, J., Schlenoff, J. B. Driving Forces for Oppositely Charged Polyion Association in Aqueous Solutions: Enthalpic, Entropic, but Not Electrostatic. Journal of the American Chemical Society. 138 (3), 980-990 (2016).
  5. Vieregg, J. R., et al. Oligonucleotide-Peptide Complexes: Phase Control by Hybridization. Journal of the American Chemical Society. 140 (5), 1632-1638 (2018).
  6. Voets, I. K., de Keizer, A., Cohen Stuart, M. A. Complex coacervate core micelles. Advances in Colloid and Interface Science. 147-148, 300-318 (2009).
  7. Lueckheide, M., Vieregg, J. R., Bologna, A. J., Leon, L., Tirrell, M. V. Structure-Property Relationships of Oligonucleotide Polyelectrolyte Complex Micelles. Nano Letters. 18 (11), 7111-7117 (2018).
  8. De Kruif, C. G., Weinbreck, F., de Vries, R. Complex coacervation of proteins and anionic polysaccharides. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 9 (5), 340-349 (2004).
  9. Vieregg, J. R., Tang, T. Y. D. Polynucleotides in cellular mimics: Coacervates and lipid vesicles. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 26, 50-57 (2016).
  10. Marciel, A. B., Chung, E. J., Brettmann, B. K., Leon, L. Bulk and nanoscale polypeptide based polyelectrolyte complexes. Advances in Colloid and Interface Science. 239, 187-198 (2017).
  11. Cabral, H., Miyata, K., Osada, K., Kataoka, K. Block Copolymer Micelles in Nanomedicine Applications. Chemical Reviews. 118 (14), 6844-6892 (2018).
  12. Tan, Z., et al. Block Polymer Micelles Enable CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein Delivery: Physicochemical Properties Affect Packaging Mechanisms and Gene Editing Efficiency. Macromolecules. 52 (21), 8197-8206 (2019).
  13. Horn, J. M., Kapelner, R. A., Obermeyer, A. C. Macro- and Microphase Separated Protein-Polyelectrolyte Complexes: Design Parameters and Current Progress. Polymers. 11 (4), 578 (2019).
  14. Juliano, R. L. The delivery of therapeutic oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 44 (14), 6518-6548 (2016).
  15. Kanasty, R., Dorkin, J. R., Vegas, A., Anderson, D. Delivery materials for siRNA therapeutics. Nature Materials. 12 (11), 967-977 (2013).
  16. Lorenzer, C., Dirin, M., Winkler, A. M., Baumann, V., Winkler, J. Going beyond the liver: progress and challenges of targeted delivery of siRNA therapeutics. Journal of Controlled Release. 203, 1-15 (2015).
  17. Allen, T. M., Cullis, P. R. Liposomal drug delivery systems: from concept to clinical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (1), 36-48 (2013).
  18. Li, W., Szoka, F. C. Lipid-based nanoparticles for nucleic acid delivery. Pharmaceutical Research. 24 (3), 438-449 (2007).
  19. Miyata, K., Nishiyama, N., Kataoka, K. Rational design of smart supramolecular assemblies for gene delivery: chemical challenges in the creation of artificial viruses. Chemical Society Reviews. 41 (7), 2562-2574 (2012).
  20. Oishi, M., Nagasaki, Y., Itaka, K., Nishiyama, N., Kataoka, K. Lactosylated poly(ethylene glycol)-siRNA conjugate through acid-labile ss-thiopropionate linkage to construct pH-sensitive polyion complex micelles achieving enhanced gene silencing in hepatoma cells. Journal of the American Chemical Society. 127 (6), 1624-1625 (2005).
  21. Christie, R. J., et al. Targeted polymeric micelles for siRNA treatment of experimental cancer by intravenous injection. ACS Nano. 6 (6), 5174-5189 (2012).
  22. Kuo, C. H., et al. Inhibition of atherosclerosis-promoting microRNAs via targeted polyelectrolyte complex micelles. Journal of Materials Chemistry B. 2 (46), 8142-8153 (2014).
  23. Ge, Z., et al. Targeted gene delivery by polyplex micelles with crowded PEG palisade and cRGD moiety for systemic treatment of pancreatic tumors. Biomaterials. 35 (10), 3416-3426 (2014).
  24. Van Bruggen, C., Hexum, J. K., Tan, Z., Dalai, R. J., Reineke, T. M. Nonviral Gene Delivery with Cationic Glycopolymers. Accounts of Chemical Research. 52 (5), 1347-1358 (2019).
  25. Hayashi, K., et al. Influence of RNA Strand Rigidity on Polyion Complex Formation with Block Catiomers. Macromolecular Rapid Communications. 37 (6), 486-493 (2016).
  26. Marras, A. E., Vieregg, J. R., Ting, J. M., Rubien, J. D., Tirrell, M. V. Polyelectrolyte Complexation of Oligonucleotides by Charged Hydrophobic-Neutral Hydrophilic Block Copolymers. Polymers. 11 (1), 83 (2019).
  27. Phillips, H. R., et al. Glycopolycation-DNA Polyplex Formulation N/P Ratio Affects Stability, Hemocompatibility, and in Vivo Biodistribution. Biomacromolecules. 20 (4), 1530-1544 (2019).
  28. Ting, J. M., Wu, H., Herzog-Arbeitman, A., Srivastava, S., Tirrell, M. V. Synthesis and Assembly of Designer Styrenic Diblock Polyelectrolytes. ACS Macro Letters. 7 (6), 726-733 (2018).
  29. Zadeh, J. N., et al. NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems. Journal of Computational Chemistry. 32 (1), 170-173 (2011).
  30. Santa Lucia, J. A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (4), 1460-1465 (1998).
  31. Xia, T., et al. Thermodynamic parameters for an expanded nearest-neighbor model for formation of RNA duplexes with Watson-Crick base pairs. Biochemistry. 37 (42), 14719-14735 (1998).
  32. Orthaber, D., Bergmann, A., Glatter, O. SAXS experiments on absolute scale with Kratky systems using water as a secondary standard. Journal of Applied Crystallography. 33 (2), 218-225 (2000).
  33. Srivastava, S., et al. Gel phase formation in dilute triblock copolyelectrolyte complexes. Nature Communications. 8, 14131 (2017).
  34. Lindhoud, S., et al. Salt-induced disintegration of lysozyme-containing polyelectrolyte complex micelles. Langmuir. 25 (19), 11425-11430 (2009).
  35. Lindhoud, S., de Vries, R., Schweins, R., Stuart, M. A. C., Norde, W. Salt-induced release of lipase from polyelectrolyte complex micelles. Soft Matter. 5 (1), 242-250 (2009).
  36. Ilavsky, J., Jemian, P. R. Irena: tool suite for modeling and analysis of small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 42 (2), 347-353 (2009).
  37. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  38. Jakeš, J. Regularized positive exponential sum (REPES) program-A way of inverting laplace transform data obtained by dynamic light scattering. Collection of Czechoslovak Chemical Communications. 60 (11), 1781-1797 (1995).
  39. Schillen, K., Brown, W., Johnsen, R. M. Micellar Sphere-to-Rod Transition in an Aqueous Triblock Copolymer System - a Dynamic Light-Scattering Study of Translational and Rotational Diffusion. Macromolecules. 27 (17), 4825-4832 (1994).
  40. Provencher, S. W. Contin - a General-Purpose Constrained Regularization Program for Inverting Noisy Linear Algebraic and Integral-Equations. Computer Physics Communications. 27 (3), 229-242 (1982).
  41. Provencher, S. W. A Constrained Regularization Method for Inverting Data Represented by Linear Algebraic or Integral-Equations. Computer Physics Communications. 27 (3), 213-227 (1982).
  42. Sarachan, K. L., Curtis, J. E., Krueger, S. Small-angle scattering contrast calculator for protein and nucleic acid complexes in solution. Journal of Applied Crystallography. 46 (6), 1889-1893 (2013).
  43. Beaucage, G. Approximations leading to a unified exponential power-law approach to small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 28 (6), 717-728 (1995).
  44. Marras, A. E., Vieregg, J. R., Ting, J. M., Rubien, J. D., Tirrell, M. V. Materials Data Facility. , 10.18126/M2QW8R (2018).
  45. Modena, M. M., Rühle, B., Burg, T. P., Wuttke, S. Nanoparticle Characterization: What to Measure. Advanced Materials. , (2019).
  46. Mourdikoudis, S., Pallares, R. M., Thanh, N. T. K. Characterization techniques for nanoparticles: comparison and complementarity upon studying nanoparticle properties. Nanoscale. 10 (27), 12871-12934 (2018).

Tags

Kimya Sayı 157 nükleik asit iletimi polielektrolit kompleksi micelle nano tanecikler faz ayırma oligonükleotidler
Polielektrolit Kompleksi Misellerinin Montajı ve Karakterizasyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marras, A. E., Vieregg, J. R.,… More

Marras, A. E., Vieregg, J. R., Tirrell, M. V. Assembly and Characterization of Polyelectrolyte Complex Micelles. J. Vis. Exp. (157), e60894, doi:10.3791/60894 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter