Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Montage und Charakterisierung von Polyelektrolyt-Komplexmizellen

Published: March 2, 2020 doi: 10.3791/60894
Automatic Translation
1, 1, 1
1Pritzker School of Molecular Engineering, The University of Chicago

Summary

Wir liefern Protokolle und repräsentative Daten für die Gestaltung, Montage und Charakterisierung von Polyelektrolyt-Komplexen Mizellen, Kernschalen-Nanopartikeln aus Polyelektrolyten und hydrophilen geladenen Blockcopolymeren.

Abstract

Polyelektrolyt-Komplexmizellen (PCMs), Kernschalen-Nanopartikel, die durch Selbstmontage geladener Polymere in wässriger Lösung entstehen, bieten eine leistungsstarke Plattform für die Erforschung der Physik von Polyelektrolyt-Wechselwirkungen und bieten zudem eine vielversprechende Lösung für das drängende Problem der Bereitstellung von therapeutischen Oligonukleotiden in vivo. Die Entwicklung prädiktiver Struktur-Eigenschaft-Beziehungen für PCMs hat sich als schwierig erwiesen, zum Teil aufgrund des Vorhandenseins starker kinetischer Fallen während der Nanopartikel-Selbstmontage. Dieser Artikel behandelt Kriterien für die Auswahl von Polymeren für die PCM-Konstruktion und bietet Protokolle auf der Grundlage von Salzglühen, die die Montage von wiederholbaren, polydispersitätsarmen Nanopartikeln ermöglichen. Wir diskutieren auch die PCM-Charakterisierung mittels Lichtstreuung, Kleinwinkel-Röntgenstreuung und Elektronenmikroskopie.

Introduction

Wenn entgegengesetzt geladene Polyelektrolyte in wässriger Lösung gemischt werden, bewirkt der Entropiegewinn aus der Freisetzung ihrer Gegensätze eine Demischung der Lösung in eine polymerreiche kondensierte Phase und einen polymeren abbauten Überstand1,2,3,4,5, ein Phänomen, das als Polyelektrolytkomplexierung bekannt ist. Wenn ein neutraler hydrophiler Block mit einem oder beiden Polyelektrolyten konjugiert wird, erfolgt stattdessen eine nanoskalige Phasentrennung (Abbildung 1A). Die resultierenden selbstzusammengesetzten Kernschalen-Nanopartikel werden verschiedentlich als Polyelektrolyt-Komplexmizellen (PCMs), Polyionenkomplex-Mizellen, Blockionomerkomplexe oder Coacervat-Kern-Mizellen analog zur Tensid-Micellisierung bezeichnet, obwohl alle Komponenten des Systems hydrophil6,7sind. Die Fähigkeit eines PCM, hydrophile Moleküle wie Proteine und Nukleinsäuren zu verkapseln, sowie die umfangreiche Tunabilität, die die Blockcopolymerträgerarchitektur bietet, machen sie zu attraktiven Kandidaten für die Lieferung von therapeutischen Molekülen in vivo8,9,10,11,12,13.

Die Bereitstellung von therapeutischen Nukleinsäuren für zelluläre Targets ist eine besonders wichtige Herausforderung, für die PCMs mehrere Vorteile bieten. Therapeutische Nukleinsäuren (genetische DNA, mRNA und Oligonukleotide wie siRNA) haben ein immenses Potenzial zur Verbesserung der menschlichen Gesundheit, müssen aber zahlreiche biologische und physikalische Barrieren überwinden, um dieses Potenzial14,15,16zu erkennen. Nackte Nukleinsäuren werden durch Serum abgebaut und Zellkerne werden schnell aus dem Kreislauf entfernt, und ihre starke negative Ladung macht es ihnen schwer, Zellmembranen ohne Hilfe zu durchdringen. Zu den aktuellen Ansätzen zur Überwindung dieser Barrieren gehören kostspielige chemische Modifikationen, um Schäden durch Nukleasen und/oder Verkapselung in verschiedene Lipid-Nanopartikel zu verhindern, die über hydrophobe Wechselwirkungen15,17,18zusammengesetzt werden. Während sich diese Methoden für lokale Injektionen und Lebertargeting als wirksam erwiesen haben, stellt die systemische Anwendung erhebliche Einschränkungen der Toxizität, Immunogenität und begrenzten Bioverteilung16dar. Im Gegensatz dazu verwenden PCMs die negative Ladung von Nukleinsäuren, um sie innerhalb des phasengetrennten Kerns zu kondensieren, während die neutrale Korona eine serische Barriere gegen Abbau sowie eine Plattform für die Integration von Liganden zur Verbesserung des Targetings oder der Internalisierung11,19bietet. In-vitro- und Tierstudien haben gezeigt, dass PCMs effektiv verschiedene Nukleinsäuren-Nutzlasten liefern können20,21,22,23,24, aber Schwächen in unserer Fähigkeit, PCM-Eigenschaften wie Größe, Form und Stabilität aus den Eigenschaften der konstituierenden Polymere vorherzusagen, haben ihre breitere Akzeptanz behindert.

Jüngste Arbeiten unserer Gruppe und anderer auf diesem Gebiet haben begonnen, dieses Problem durch die Entwicklung von Struktur-Eigenschaft, und in einigen Fällen Struktur-Eigenschaft-Funktions-Beziehungen für PCMs aus Nukleinsäuren und verschiedenen kationisch-neutralen Polymeren7,25,26,27. Zwei konsistente Themen, die aus diesen Studien hervorgegangen sind, sind die Bedeutung der Entwicklung gut kontrollierter, wiederholbarer Protokolle für die PCM-Montage und der Vorteil der Verwendung mehrerer Techniken, um die resultierenden Nanopartikel zu charakterisieren. Polyelektrolyte, insbesondere solche mit hoher Ladungsdichte wie Nukleinsäuren, interagieren sehr stark miteinander und scheinen beim Mischen leicht kinetisch gefangen zu werden, was zu PCM-Präparaten führt, die sehr empfindlich auf kleine Verfahrensschwankungen reagieren und eine hohe Polydispersität und schlechte Wiederholbarkeit von Charge zu Charge aufweisen. PCMs haben auch gezeigt, dass eine breite Palette von Formen und Größen in Abhängigkeit von den atomaren Konfigurationen ihrer Komponenten zu übernehmen, und diese Vielfalt mit jeder individuellen Charakterisierungstechnik zu erfassen ist sehr schwierig, zumal einige gängige Techniken wie dynamische Lichtstreuung (DLS) Annahmen über die Partikelform für ihre Interpretation erfordern.

In diesem Artikel diskutieren wir Materialdesign und -auswahl für PCMs mit schwerpunkt auf Oligonukleotiden und kationisch-neutralen Diblock-Copolymeren. Wir beschreiben dann ein Salzglühprotokoll, das hohe Salzkonzentrationen verwendet, gefolgt von einer langsamen Dialyse, um kinetisches Fangen während der PCM-Montage zu vermeiden. Die Polyelektrolyte werden unter hohen Salzbedingungen gemischt, wo elektrostatische Attraktionen gesiebt werden, dann wird die Salzkonzentration langsam abgesenkt, damit sich die Polyelektrolyte in ihre energetisch günstigsten Konfigurationen einsiedeln können, analog zum langsamen Kühlprozess des thermischen Glühens. Mit diesem Protokoll sind wir regelmäßig in der Lage, eine außergewöhnlich geringe Polydispersität und eine hohe Wiederholbarkeit für Oligonukleotid-PCMs7,26zu erreichen. Schließlich beschreiben wir, wie vier separate Messtechniken verwendet werden können, um PCMs über einen sehr breiten Bereich von Längenskalen zu charakterisieren, von der externen Morphologie bis zur internen Struktur: DLS, Multi-Winkel-Lichtstreuung (MALS), Kleinwinkel-Röntgenstreuung (SAXS) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM). Wir hoffen, dass diese Protokolle es mehr Forschern ermöglichen werden, die Fähigkeiten dieser interessanten Nanopartikel effektiv zu erforschen.

Polymerauswahl und -vorbereitung
Die PCM-Eigenschaften werden stark von den physikalischen und chemischen Eigenschaften der konstituierenden Polymere beeinflusst, was die Polymerauswahl zu einem entscheidenden Schritt im Designprozess macht. Die am besten charakterisierten Blockcopolymere für Nukleinsäure-PCMs sind lineare Diblöcke wie Poly(Lysin)-Poly(Ethylenglykol) (pLys-PEG), aber PCMs können zwischen Polyelektrolyten und einer Vielzahl hydrophiler neutral geladener Polymere gebildet werden, die in hoher Durchsatzweise erzeugt werden können28. Die Wahl der geladenen Gruppe wirkt sich stark auf die Stabilität der Ionenpaarung und Form der Mizellen26, und PCM-Größe hat gezeigt, dass mit der Länge des geladenen Blocks5,7,26 ( Abbildung2) zu erhöhen, so dass PCM-Eigenschaften auf die Anforderungen einer gewünschten Anwendung abgestimmt werden. Bei linearen Diblocks haben wir festgestellt, dass der geladene Block mindestens 10 Ladungen haben und beim gewünschten pH-Wert stark aufgeladen sein sollte. Länger geladene Blöcke können die PCM-Bildung mit Oligonukleotiden wie siRNA fördern, die mit kürzeren Blöcken schwer zu komplex sind21. Wir haben erfolgreich PCM-Bildung mit Blocklängen bis zu 200 beobachtet, und die Literatur beschreibt längere Polymere. Bei der Wahl der neutralen Blöcke24ist mehr Flexibilität möglich, aber die Erfahrung hat gezeigt, dass sehr kurze neutrale Blöcke eher zur Aggregation als zur Nanopartikelbildung führen und dass die minimale neutrale Länge mit geladener Blocklänge zunimmt. Für pLys-PEG wird eine PEG MW von mindestens 3.000–5.000 für PLys-Längen unter 50 € benötigt, und längere Längen sind erforderlich, da der geladene Block weiter erhöht wird. Erhöhte neutrale Blocklänge führt zu einer erhöhten PCM-Größe, insbesondere schalendicke, aufgrund der serischen Verdrängung der neutralen Polymere.

Dieses Manuskript enthält ein Protokoll zur Herstellung von PCMs aus lyophilisierten Hochreinheits-PLys-PEG und Oligonukleotiden bekannter Menge, sollte aber auch leicht an andere Systeme angepasst werden können. Wir haben es erfolgreich mit mehreren geladenen Polypeptiden getestet, einschließlich Polyarginin und Polyglutaminsäure, sowie mehreren synthetischen Polyelektrolyten, wie Polyacrylsäure und Poly (Vinylbenzyltrimethylammonium). Wir beschreiben auch die Vorbereitung von PCMs mit einem stoichiometrischen Verhältnis von Polyelektrolytladungen, aber dies kann leicht geändert werden. Wir finden es am einfachsten, in Ladekonzentrationseinheiten (c.c.) zu arbeiten, die natürlich auch Polymere aufnehmen, die nicht vollständig geladen sind. Wenn eines der Polymere nicht gut charakterisiert ist, ist darauf zu achten, dass die Polymerlängen/-massen genau bestimmt werden und dass überschüssiges Salz nicht über das hinaus vorhanden ist, was beispielsweise für die Ladungsneutralisation durch Dialyse erforderlich ist. Bei der Berechnung der Konzentrationen sollte auch das Vorhandensein von zurückgehaltenem Wasser berücksichtigt werden. Die Nukleinsäurekonzentration kann durch Absorption bei 260 nm bequem quantifiziert werden, und das Vorhandensein oder Fehlen von terminalen Phosphaten sollte bei der Berechnung der c.c. berücksichtigt werden.

Bei der Verwendung von Oligonukleotiden als Polyanionen helfen der Hybridisierungszustand und die chemische Struktur, die Neigung zur Selbstmontage und die Eigenschaften des resultierenden PCM5,7,26zu bestimmen. Die Optimierung dieser, innerhalb der Anforderungen an die biologische Wirksamkeit, wenn PCMs für die Lieferung verwendet werden, erhöht die Wahrscheinlichkeit, die gewünschten Strukturen zu bilden. Hilfreiche Werkzeuge zur Analyse der Hybridisierung sind MATLAB-Funktionen für Nukleinsäuren, NUPACK29und IDT OligoAnalyzer. Wir empfehlen, eine Kandidatensequenz zu analysieren, um die Stärke der Bindung an 1) selbst in einer Haarnadelbildung zu verstehen; 2) eine weitere Kopie derselben Sequenz (Selbstanzeige); und 3) an andere oligonukleotide, die im System vorhanden sind. DNA- und RNA-Schmelztemperaturen für eine bestimmte Sequenz können auch mit der Nächsten-Nachbar-Methode30,31berechnet werden. Thermisches Glühen von Nukleinsäuren (Schritt 2.3) denaturiert jede restliche Sekundärstruktur in den einzelnen Nukleotiden und fördert die Gleichgewichtsfaltung.

PCM-Charakterisierung und -analyse
Für die Charakterisierung von Nanopartikeln stehen eine breite Palette von Techniken zur Verfügung, einschließlich statischer und dynamischer Lichtstreuung, kleinwinkeliger Streuung von Elektronen oder Neutronen und Elektronenmikroskopie. In diesem Artikel stellen wir Protokolle für zwei Lichtstreuungstechniken, kleine Winkel-Röntgenstreuung und zwei Elektronenmikroskopietechniken bereit.

DLS misst die Autokorrelation zeitlicher Schwankungen der Streuintensität in einem Winkel von der Brownschen Bewegung der Probe. Das Anpassen dieser Daten kann hydrodynamischen Radius und Polydispersität für kugelförmige Mizellen liefern (Abbildung 3). Die Mehrfachwinkellichtstreuung (MALS) misst die statische Streuintensität in vielen Winkeln. Diese Winkelabhängigkeit beschreibt die Form des Nanopartikels, ist aber für sichtbares Licht auf Längenskalen von mehr als 50 nm begrenzt, was seine Wirksamkeit für kleinere Nanopartikel einschränkt. Beide Techniken basieren auf refraktiven Index-Inzimcierungen und beschreiben in erster Linie die äußeren Dimensionen des Nanopartikels.

Die Röntgenstreuung mit kleinen Winkeln (SAXS) verwendet Röntgenstrahlen als Streusonde, und ihre kürzere Wellenlänge ermöglicht Messungen über einen Bereich von 0,1 bis 100 nm. Die Anpassung der beobachteten Streuintensität vs. Winkel (konventionell ausgedrückt als Impulsübertragung q) liefert Informationen über die PCM-Morphologie (d.h. Größe und Form) und auch die interne Struktur. Wenn eine absolute Intensitätskalibrierung verfügbar ist und die Streuintensität auf Nullwinkel extrapoliert werden kann, können PCM-Masse und Aggregationsnummer ebenfallsauf 32geschätzt werden, was SAXS zu einer äußerst vielseitigen und wertvollen Methode macht. Die Kleinwinkel-Neutronenstreuung (SANS) ist über einen ähnlichen Bereich von Längenskalen empfindlich, ist aber nur in spezialisierten Einrichtungen verfügbar und wird in diesem Artikel33,34,35nicht explizit behandelt.

In den letzten Jahren kam es zu SAXS-Instrumenten, aber wir stellen fest, dass Synchrotronquellen besser für die PCM-Charakterisierung geeignet sind, da ihre höhere Intensität es ermöglicht, Daten für diese kontrastreichen Samples viel schneller zu sammeln. Wir bieten ein kurzes Protokoll zum Erfassen von PCM SAXS-Daten bei Beamline 12-ID-B am Advanced Photon Source (Argonne National Laboratory, USA) aus Anwendersicht. Dieses Protokoll sollte für die meisten Synchrotronquellen gelten, aber die Konsultation der lokalen Mitarbeiter vor dem Vorschlag eines Experiments wird dringend empfohlen. Wir bieten auch ein Datenreduktions- und Analyseprotokoll mit Irena36, einem kostenlosen Satz von Makros, die für Igor Pro geschrieben wurden. Irena enthält einen vielseitigen Satz von Formfaktoren für die Modellierung von SAXS-Daten und ermöglicht die Erstellung von Mehrkomponentenmodellen, die in der Lage sind, das komplexe Streuprofil von PCMs zu beschreiben (siehe Repräsentative Ergebnisse, Abbildung 4). Irena hat auch umfassende Dokumentation und Tutorials online zur Verfügung. Bevor Wir die folgenden Verfahren versuchen, empfehlen wir, sich mit diesen vertraut zu machen, insbesondere dem Tutorial "Modellierung von SAXS-Daten mit zwei Hauptstreuerpopulationen".

Strahlenschäden sind ein Problem für die Röntgenstreuung, aber es können mehrere Maßnahmen ergriffen werden, um sie zu minimieren. Insbesondere empfehlen wir die Verwendung eines Durchflusszellenaufbaus mit spritzenpumpe und PCM-Probe, die während der Datenerfassung fließt, anstatt einer versiegelten Kapillare. Dies vereinfacht auch die Hintergrundsubtraktion erheblich. Wir schlagen auch vor, mehrere Expositionen der fließenden Probe anstelle einer längeren zu nehmen, um den Fluss fluss, den jedes einzelne Volumen der Probe sieht, zu begrenzen und einen Vergleich der Expositionsdaten zu ermöglichen, um Schäden zu identifizieren.

Im Gegensatz zu den Streutechniken, die in der Regel eine Interpretation erfordern, liefert die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) ein reales Raumbild der Nanopartikel, indem sie einen Elektronenstrahl durch die Probe passieren und ein Bild auf einen Szintillationsbildschirm projizieren (Abbildung 5). In diesem Artikel stellen wir Protokolle für zwei TEM-Techniken vor. Cryo TEM friert Micelle-Proben in eine dünne Schicht aus Glaseis ein und bewahrt die strukturelle Konformation mit minimalen Fremdstoffen, optimal für Mizellen im Radius von 10-100 nm. Negativer Fleck TEM verwendet ein Schwermetallsalz (z. B. Uran), um die Probe zu umgeben, nachdem sie auf der Oberfläche eines Gitters getrocknet wurde. Der dichte Fleck wird mehr Elektronen als die Probe streuen, Kontrast hinzufügen und ein negatives Bild der Probe erzeugen. Cryo TEM wird für hochwertige Bilder empfohlen. Es ist jedoch kostspieliger, zeitaufwändiger und bietet möglicherweise keinen ausreichenden Kontrast. Wenn dies ein Problem ist, sollten negative gebeizte Proben verwendet werden. Die beispiele sind in Abbildung 5dargestellt.

Jede dieser Techniken berichtet über leicht unterschiedliche Aspekte der Nanopartikel mit unterschiedlichen Stärken und Einschränkungen. Die Lichtstreuung ist leicht verfügbar und ist oft der schnellste Ansatz, hat jedoch erhebliche Größen- und Formeinschränkungen. SAXS kann Informationen über eine große Anzahl von Längenskalen bei einem relativ hohen Durchsatz bereitstellen, erfordert jedoch spezielle Geräte, um die Daten zu erfassen, sowie die Modellierung, um sie zu interpretieren. TEM-Bilder sind einfach zu interpretieren, können aber im Kontrast begrenzt sein und haben von Natur aus einen niedrigen Durchsatz. Unsere Erfahrung hat gezeigt, dass die Verwendung mehrerer Techniken für die Charakterisierung die Informationen, die über PCM-Eigenschaften erhalten werden können, erheblich erhöht und die Interpretation von Datensätzen vereinfacht, die von jedem einzelnen allein erhalten wurden. So untersuchen SAXS und TEM in erster Linie den dichten Kern eines PCM, während Lichtstreuung über die Gesamtabmessungen des Nanopartikels berichtet. So ermöglicht die Kombination von ihnen die Messung sowohl der Kern- als auch der Koronagröße. Die Fähigkeit von TEM, reale Raumbilder zu erfassen, kann Bodenwahrheitsdaten liefern, um die Auswahl geeigneter Formfaktoren für die Modellierung von SAXS-Daten zu ermöglichen, die andernfalls mehrdeutig sein könnten. In diesem Artikel werden Protokolle für alle vier Techniken beschrieben, und ein Beispielprozess für die Verwendung dieser Methoden zum Charakterisieren eines unbekannten Beispiels ist im Abschnitt Diskussion aufgeführt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Herstellung von Materialien

  1. Wiegen Sie lyophilisiertes Diblockpolymer aus und fügen Sie Wasser bis zu fast dem Volumen hinzu, das für eine Lagerlösung von 10 mg/ml Endkonzentration erforderlich ist. Wirbel mit maximaler Geschwindigkeit für 2 min.
  2. Beschallen für 5 min. Sehr lange Diblocks können zusätzliche Beschallung erfordern. Die Lagerlösung sollte völlig transparent und homogen erscheinen.
  3. Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH oder HCl nach Bedarf auf 7,4 ein. Fügen Sie dem endigen Volumen Wasser hinzu. pLys-PEG-Lösungen sind relativ stabil, sollten aber längerfristig gekühlt werden und der pH-Wert muss vor der Verwendung überprüft werden. Lyophilisierung ist dem Einfrieren vorzuziehen.
  4. Resuspend lyophilisiertes Oligonukleotid(e) bei gewünschter Lagerkonzentration, typischerweise 2–5 mM molekulare Konzentration für Längen von 50 nt oder darunter. Wirbel gründlich, um die vollständige Auflösung zu gewährleisten.
  5. Berechnen Sie die Molkonzentrationen anhand des Molekulargewichts oder der Molekularlänge, wie in der Einleitung beschrieben.
  6. Berechnen Sie die Molarenladungskonzentrationen (c.c.), wobei

Equation 1

Die Polyelektrolytladung ist die Anzahl der geladenen Monomere, während die Nukleinsäureladung die Anzahl der Basen minus 1 ist, unter der Annahme, dass keine Phosphorylierung erfolgt. Denken Sie daran, dass doppelsträngige DNA doppelt so viele Ladungen pro Molekül haben wird als einsträngige DNA.

  1. Erstellen Sie einen verdünnten Vorrat bei 20 mM c.c. für jedes Polymer.

2. Nukleinsäure-Polyelektrolyt-Micelle-Präparat

  1. In einem 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr folgendes auf ein Gesamtvolumen von 280 l mischen:
    1. 200 l nukleasefreies Wasser (Reinstwasser für PCMs ohne Nukleinsäuren).
    2. 40 l 10x phosphatgepufferte Saline (PBS, 137 mM Natriumchlorid, 10 mM Phosphat, pH 7,4 bei Verdünnung auf 1x) oder einem anderen geeigneten Puffer37.
    3. 40 l von 20 mM c.c. Oligonukleotid. Bei doppelsträngigen Oligonukleotiden 20 l pro Strang bei 20 mM c.c. hinzufügen.
  2. Inkubieren Sie die Oligonukleotid-Lösung für 5 min bei 70 °C. Wenn die berechnete Schmelztemperatur für die Oligonukleotide höher ist, sollte die Temperatur entsprechend erhöht werden. Beachten Sie, dass rna bei erhöhten Temperaturen abgebaut wird, daher sollte dieser Schritt nicht länger dauern, wenn diese oder andere empfindliche Komponenten vorhanden sind.
  3. Abkühlen für 15 min. 40 l von 20 mM c.c. diblock hinzufügen, dann sofort wirbeln für 20 s bei maximaler Geschwindigkeit. Inkubieren Sie 5 min bei Raumtemperatur (RT).
  4. Führen Sie das Salz-Anneal.
    1. Fügen Sie 80 l 5 M Natriumchlorid für eine Endkonzentration von 1 M NaCl und ein Endvolumen von 400 l hinzu. Vortex für 10 s bei maximaler Geschwindigkeit.
    2. 10 min bei Raumtemperatur inkubieren und dann in Dialysepatronen laden. Beachten Sie, dass die aufgeführten Molekulargewichts-Cutoffs für Kugelproteine bestimmt werden und für lineare Polymere nicht genau sind. Wir stellen fest, dass eine 2k MWCO-Patrone Probenverluste vermeidet und auch für allmähliche Veränderungen der Ionenstärke sorgt.
    3. Bereiten Sie Dialysebäder vor.
      1. Berechnen Sie das Volumen des benötigten Dialysebades:
        Equation 2
      2. Mischen Sie 10x PBS (oder einen anderen gewünschten Puffer), 5 M NaCl und Reinstwasser für eine von 1x PBS und 0.5M NaCl, sowie zwei Lösungen von 1x PBS.
    4. Dialysepatronen laden.
      1. Etikettenpatronen mit permanentem Marker. Einweichen Patronen im Puffer für mindestens 2 min, um Membranen zu hydratisieren.
      2. Entfernen Sie die Kappe, indem Sie sich gegen den Uhrzeigersinn verdrehen. Belastungsprobe mit Gel-Ladepipettenspitze. Entfernen Sie überschüssige Luft, indem Sie die Membranen sanft drücken. Ersetzen Sie die Kappe.
      3. Legen Sie Patronen in das 1x PBS, 0,5 M Natriumchlorid-Dialysebad. Kartuschen sollten schwimmen, wobei beide Membranen dem Bad ausgesetzt sind. Schaumschwimmer können bei Bedarf verwendet werden.
    5. Dialyse
      1. 24 h langsam mit einem magnetischen Rührstab bebrüten.
      2. Bewegen Sie die Patronen in ein neues Bad mit 1x PBS oder einem anderen gewünschten Arbeitspuffer. 24 stunden lang bebrüten, langsam mit einem magnetischen Rührstab rühren. Wiederholen Sie diesen Schritt.
    6. Stellen Sie die Probe wieder her.
      1. Entfernen Sie die Patronen aus dem Bad. Entfernen Sie die Kappe und bergen Sie die Probe mit einer Gel-Ladepipettenspitze. Beachten Sie, dass das wiedergewonnene Volumen aufgrund der Membranschwellung höher als die anfänglichen 400 l sein kann. Rekord-Wiederherstellungsvolumen, wenn eine leichte Verdünnung ein Problem ist.
      2. Legen Sie die Probe in ein sauberes 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr. PCMs, die auf diese Weise hergestellt werden, sollten bei der Kühlung für mehrere Monate stabil sein, sofern eine Nukleasekontamination vermieden wurde.

3. Dynamische Lichtstreuung

  1. Um staubfreie Bedingungen zu gewährleisten, sollten Puffer sorgfältig gefiltert (3x durch eine 0,22-mm-Spritze oder vakuumfilter) gefiltert und Glaswaren zwischen den Proben gründlich gereinigt werden. Es ist auch wichtig, sicherzustellen, dass die Probe das thermische Gleichgewicht erreicht hat, bevor die Messung durchgeführt wird.
  2. Die PCM-Probe mit dem gewünschten Arbeitspuffer auf 0,2 mM c.c. (10x bei Verwendung des oben beschriebenen Protokolls) verdünnen und in eine geeignete Küvette laden. Wir verwenden eine kleine Küvette, die nach der Verdünnung eine Probe mit einem Volumen von 200 l erfordert.
  3. Stellen Sie die DlS-Detektorposition auf 90° ein.
  4. Stellen Sie die Laserleistung und/oder den Dämpfer so ein, dass die Zählrate nach Möglichkeit 100.000–200.000 Zählungen pro Sekunde (cps) beträgt. Zählraten von bis zu 10 km/h können verwendet werden, aber die Messzeiten müssen möglicherweise verlängert werden, um gute Statistiken zu erhalten (Schritt 4.1). Höhere Zählraten sollten vermieden werden, da mehrfache Streuung die Messung verwirrt.
  5. Erfassen Sie Daten für 1 min. Die Zählrate sollte über die gesamte Anschaffungszeit konstant sein. wenn nicht, deutet dies darauf hin, dass eine Komponente der Probe oder des Instruments noch nicht ausgeglichen wurde.
  6. Untersuchen Sie die Autokorrelationsdaten. Die langfristige Basislinie sollte sehr flach sein, und die Autokorrelationskurve sollte glatt sein, mit minimaler Streuung, wie in Abbildung 3Adargestellt. Die Basisdrift weist auf einen Mangel an Gleichgewicht hin, und das Rauschen in den Daten kann durch die Erfassung weiterer Daten verbessert werden.
  7. Anpassen der Autokorrelationsfunktion.
    1. Verwenden Sie REPES38,39, um eine regulierte inverse Laplace-Transformation durchzuführen, um eine Verteilung der Entspannungszeiten und einen Diffusionskoeffizienten Dzu liefern. Diese Methode berechnet dann den hydrodynamischen Radius Rhmit der Stokes-Einstein-Gleichung:
      Equation 3
      Abbildung 1B zeigt eine Darstellung von Rh und Abbildung 3B zeigt das Ergebnis von REPES.
    2. Alternativ können Sie auch andere Methoden verwenden, z. B. CONTIN40,41 (ein alternativer Regularisierungsalgorithmus) oder nicht-negative Kleinste Quadrate (NNLS). Konsistente Ergebnisse aus mehreren Fitting-Methoden sind eine Signatur hochwertiger Daten. Beachten Sie, dass die cumulant-Analyse (Standard bei vielen Instrumenten) nichtphysikalische Werte für multimodale Größen-/Längenverteilungen liefert.

4. Multi-Winkel-Lichtstreuung

HINWEIS: Lichtstreuungsintensität vs. Winkel kann auf einer Vielzahl von Instrumenten gemessen werden. Wir haben gute Ergebnisse mit Goniometer-basierten Instrumenten und Multidetektor-Instrumenten erzielt, die im Batch-Modus ausgeführt werden.

  1. Passen Sie die PCM-Konzentration und Beleuchtungsintensität an, um eine ausreichende Signal-/Rausch-Bewertung im Vergleich zu einer nur Pufferprobe in allen Winkeln bereitzustellen, ohne einen Detektor zu sättigen. Letzteres kann getestet werden, indem Proben an verschiedenen Verdünnungsfaktoren vorbereitet und auf Linearität der Intensität vs. Konzentration überprüft werden (unter der Annahme einer minimalen Wechselwirkung zwischen den PCMs).
  2. Zeichnen Sie die Lichtstreuungsrate von 15° bis 135° für 1 min pro Winkel auf. Wenn die Probe und das Instrument ordnungsgemäß ausgeglichen sind, ist die Streurate über die Messzeit konstant.
  3. Zeichnen Sie die normalisierte Streurate, Isin(a), vs. q, wobei ich die Streurate bin. q ist der Streuvektor (Photonenimpulsübertragung), wie er von

Equation 4

wobei der Brechungsindex des Lösungsmittels, der Messwinkel und die Wellenlänge der Lichtquelle. Abbildung 4 zeigt ein Diagramm der MALS-Streuintensität.

5. Kleine Winkel-Röntgenstreuung

  1. Datenerfassung
    1. Bereiten Sie PCM-Proben wie oben beschrieben bei 2 mM Ladungskonzentration für Oligonukleotid-PCMs für eine ausreichende Streuung über dem Hintergrund vor. Bei PCMs ohne schwere Atome (z. B. Phosphor in Nukleinsäuren) können höhere Konzentrationen erforderlich sein. Streulängendichten können mit Rechnern wie SASSIE42geschätzt werden.
    2. Um Strahlenschäden durch Aufräumen freier Radikale zu minimieren, fügen Sie Glycerin aus einem konzentrierten (z.B. 50%) So dass die Micelle-Lösung 1% (v/v) Glycerin enthält. Beachten Sie, dass sauberes Glycerin hochviskos und schwer genau zu messen ist. Verdünnung mit Wasser oder Puffer ist sehr zu empfehlen.
    3. Bereiten Sie eine große Menge arbeitspuffer mit 1% Glycerin für die Verwendung als Hintergrundmonitor vor.
    4. Bereiten Sie das beamlinespezifische Durchflusszellengerät vor und kalibrieren Sie den Detektor. Das Protokoll verwendet eine Quarzkapillare mit einem Durchmesser von 3 mm, die mit einer computergesteuerten Spritzenpumpe mit kleinem Durchmesser verbunden ist, und einer Polyethylen-Schläuche mit minimaler Länge. Bei diesem Setup wird ein Mindestvolumen von 140 L pro Probe benötigt.
    5. Bestimmen Sie die Parameter für die Probenexposition. Die optimale Belichtung variiert je nach Strahlintensität, Detektorempfindlichkeit und Konzentration, Streufestigkeit und Schadensanfälligkeit der Probe, aber das Ziel ist es, die Probe dem minimalen Fluss zu verleihen, der erforderlich ist, um eine ausreichende Streuintensität über den q-Interessenbereich zu erhalten.
    6. Bei Oligonukleotid/PLys-PEG-PCMs ergeben 30x 0,2 s Belichtungen mit einer Wiederholungsrate von 1 Hz eine gute Datenqualität bei geringem spürbaren Schaden. Bei neuen Beispielen kann das folgende Verfahren hilfreich sein:
      1. Bereiten Sie PCM-Proben über einen Bereich von Konzentrationen vor (z. B. 10–10.000 m c.c.).
      2. Ab einer Zwischenkonzentration wechseln pcM- und Pufferproben mit unterschiedlichen Belichtungszeiten. Siehe unten für Datenerfassung und -reduzierung. Beispielsignal sollte gute Statistiken aufweisen (kleiner statistischer Fehler oder glatte Variation über q). Wenn die Statistiken schlecht sind, kann die Expositionszeit erhöht werden.
      3. Das Sample-Signal sollte auch deutlich vom Hintergrund über den q-Interessenbereich unterschieden werden. Berechnen und plotten Sie das (Signal-Hintergrund)/Hintergrundverhältnis im Vergleich zu q, um das Signal-Hintergrund-Verhältnis zu bestimmen. Wenn das Signal-Hintergrund-Verhältnis niedrig ist, sollte die Probenkonzentration erhöht werden.
      4. Stellen Sie sicher, dass die Streuintensität (normalisiert zur Konzentration) unabhängig von der Probenkonzentration ist, indem Sie Daten bei höheren und niedrigeren Konzentrationen erfassen und die Belichtungszeit bei Bedarf skalieren. Interpartikelwechselwirkungen (die wahrscheinlichste Ursache für Konzentrationsabhängigkeit) werden im niedrigen q-Bereich am ausgeprägtesten sein.
    7. Erfassen Sie Daten für PCM-Proben und Hintergrund (d. h. Puffer mit Glycerin).
      1. Lösen Sie die Spritzenpumpe aus, um die Probe durch die Kapillare zu bewegen. Entweder bidirektionale oder einmalige Bewegung ist akzeptabel, aber es sollte darauf geachtet werden, jede Probe zu isolieren (z. B. durch Einsetzen einer Luftblase zwischen Proben). Proben können wiederverwertet und wiederverwendet werden, wenn keine Strahlenschäden auftreten.
      2. Sobald der Flow gestartet wurde, lösen Sie das oben beschriebene Röntgenbelichtungs- und Datenerfassungsprogramm aus. Es sollte darauf geachtet werden, dass die Strahlexposition endet, bevor der Flüssigkeitsfluss dies tut.
    8. Führen Sie nach jeder Probe eine azimutale Mittelung durch und zeichnen Sie die 1D-Profile (d. h. Intensität vs. q) für jede Belichtung zusammen. Sie sollten innerhalb statistischer Fehler identisch sein. Ein Signalwechsel im Laufe der Zeit kann auf Strahlungsschäden hinweisen.
      1. Isolierte anomale Profile können auf das Vorhandensein von Mikroblasen hinweisen. Wenn Blasen häufig beobachtet werden, kann eine Verringerung der Durchflussrate helfen.
    9. Durchschnittlich die 1D-Streuprofile.
    10. Erfassen Sie häufig Daten für nur Pufferbeispiele (einmal pro 4–5 PCM-Samples) und vergleichen Sie diese im Zeitverlauf. Erhöhtes Signal von nur Pufferproben deutet darauf hin, dass die Kapillare mit strahlungsgeschädigten Proben kontaminiert sein kann.
      1. Wenn eine Kontamination festgestellt wird, waschen Sie die Kapillare mit Bleichmittel und erwägen Sie, die Belichtungszeit nach Möglichkeit zu reduzieren.
  2. Datenreduktion und -analyse mit Irena
    1. Importieren von MICelle- und Hintergrund-ASCII-Datensätzen (SAS/Datenimport & Export/Import ASCII SAS-Daten).
    2. Subtrahieren Sie die Hintergrundstreuung von Beispieldaten. Typischerweise zeigen die höchsten q-Werte (z. B. q > 0,5) eine inkohärente Streuung des Lösungsmittels, das das Signal dominiert. Durch das Skalieren der Hintergrunddaten, um die Stichprobendaten über diesen q-Bereich abzugleichen, werden alle Abweichungen aufgrund von Balkenintensitätsvariationen und Stichprobenkonzentration entfernt.
      1. Zeichnen Sie das Beispiel und den Hintergrund zusammen auf einer Protokoll-Protokollskala. Überprüfen Sie die flache Intensität bei hohen q (SAS/Datenmanipulation/Datenmanipulation I). Berechnen Sie das Beispiel-Hintergrund-Verhältnis (Data1/Daten 2), zeichnen Sie auf einer linearen Log-Skala, und überprüfen Sie die High-q-Asymptote.
      2. Berechnen Sie das durchschnittliche Verhältnis (Beispiel/Hintergrund) über diesen q-Bereich (verwenden Sie ein benutzerdefiniertes Makro oder kopieren/einfügen sie in eine Kalkulationstabelle aus dem Datenbrowser).
      3. Mit dem Makro Datenmanipulation skalieren Sie den Hintergrund (z. B. Daten ändern 2) mit dem oben berechneten Verhältnis und zeichnen Sie das Verhältnis von Hintergrundsubtrahiertem Signal zu Hintergrund vs. q ([Data1-Data2]/Data2) auf, um zu überprüfen, ob er jetzt bei hohem qauf Null abruft. Zeichnen Sie dieses Verhältnis auf; sie sollte <1–2% von 1,0 für jede Probe entfernt sein.
      4. Zeichnen Sie das Hintergrund-subtrahierte Signal (Data1-Data2) im Vergleich zu q und speichern Sie die Daten unter einem neuen Namen. Überschreiben Sie die ursprünglichen Daten nicht.
      5. Wenn keineHoch-q-Daten verfügbar sind, verwenden Sie einen Skalierungsfaktor von 1 für die Hintergrundsubtraktion, aber beachten Sie, dass Ungenauigkeiten in q-Bereichen auftreten können, in denen das Signal-Hintergrund-Verhältnis klein ist.
    3. Öffnen Sie das Modellierungsmakro (SAS/Modellierung), und laden Sie dann die hintergrundsubtrahierten Daten (Daten cntrls/Daten hinzufügen). In diesem Makro nicht skalieren.
    4. Suchen Sie zunächst nach einem ungefähren Modell für die Außenfläche des PCM (Micelle-Größe/-form):
      1. Wählen Sie unter Daten-cntrlseinen niedrigen bis moderaten q-Bereich aus (z. B. 0,003- -1 < q < 0,1 x-1). Wenn Schwingungen sichtbar sind, schließen Sie sie ein.
      2. Wählen Sie einen Formfaktor aus, der für die Daten geeignet ist. Die Steigung bei niedrigem q ist bezeichnend für die Nanopartikelform, die auch durch TEM und/oder MALS verifiziert werden kann. Verwenden Sie die Modelle Schulz-Zimm spheroid (q0), zylinder (q-1) oder flexible zylinder (q-2). Irena bietet Werkzeuge zum Anpassen von Energiegesetzen (SAS/Support Tools für Plots und Tabellen).
      3. Wählen Sie unter Modell-cntrlsdie erste Streuungspopulation (1P) aus und stellen Sie sicher, dass sie die einzige ist, die verwendet wird (Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Verwenden? ).
      4. Wählen Sie Größe dist. für Modell und wählen Sie den gewünschten Verteilungstyp und Formfaktor. Legen Sie die Anfangsparameter für die Suche fest, indem Sie Werte in die Felder Skalierung, Mittlere Größeund Breite eingeben, und klicken Sie auf Modell berechnen, um den resultierenden Formfaktor zu zeichnen.
        HINWEIS: Der Formfaktor "Flexibler Zylinder" kann als Benutzerformfaktor hinzugefügt und von https://usaxs.xray.aps.anl.gov/software/irenaheruntergeladen werden. Die Parameter 1 und 2 entsprechen der Zylinderlänge bzw. der Kuhn-Länge.
      5. Sobald vernünftige Parameter gefunden wurden, klicken Sie auf Modell anpassen, um eine nichtlineare kleinste Quadrate anpassung an die Daten auszuführen. Das Größenverteilungsmodell gibt den mittleren Radius und die breite an.
        Zur Berechnung der Polydispersität (PDI)
        Equation 5
        Wie bei jedem nichtlinearen Fitting-Verfahren kann es erforderlich sein, den Datenbereich ( q-Bereich) und die Startparameter anzupassen, um eine stabile, physikalisch vertretbare Passform zu erhalten.
      6. Sobald eine angemessene Passform erhalten ist, speichern Sie sie (Speichern sie im Notizbuch/Store im Ordner).
    5. Als nächstes modellieren Sie die Streuung der einzelnen Polymere innerhalb des PCM-Kerns. Dies kann durch ein Power Law-Modell erfasst werden (z.B. q-2 für ideale Ketten, q-5/3 für geschwollene Ketten, etc.). Irena setzt dies durch ein Beaucage Modell43um :
      Equation 6
      wobei P das Machtgesetz ist und G und B Vorfaktoren sind.
      1. Passen Sie die Datensteuerelemente an, um den gesamten q-Bereich abzudecken, und zeichnen Sie das Modell neu auf (Modell berechnen). In der Regel wird eine übermäßige Streuung im mittleren bis hohen q-Bereich beobachtet (z. B. q > 0,1- -1).
      2. Verwenden Sie die Datensteuerelemente, um den q-Bereich auszuwählen, in dem überschüssige Streuung (>10x des Formfaktormodells) beobachtet wird.
      3. Fügen Sie eine zweite Streuungspopulation (2P) hinzu und stellen Sie sicher, dass sie die einzige ist, die verwendet wird (verwenden Sie verwenden? für 1P).
      4. Wählen Sie Einheitliche Ebene für das Modell aus. B und P sind die relevanten Parameter. Verwenden Sie die Unterstützungswerkzeuge für das Plotten oder das Anpassungs-P/B zwischen csrs-Makro, um eine erste Schätzung für diese Parameter zu erhalten, und passen Sie die Guinier-Faktoren G und Rg an, um sicherzustellen, dass das Modell keine übermäßige Streuung bei niedrigen qvorhersagt.
      5. Führen Sie eine nichtlineare Anpassung aus, und zeichnen Sie die Parameter und das Modell auf.
    6. Als nächstes, Wenn eine Beugung Spitze vorhanden ist, wie in Abbildung 4, fügen Sie ein drittes Modell für eine Beugung Spitze im q-Bereich des Interesses (q = 0,22x -1 in diesem Fall).
    7. Sobald ungefähre Anpassungswerte für die einzelnen Streuungspopulationen ermittelt wurden, aktivieren Sie alle drei zusammen (wählen Sie für jeden verwenden) und optimieren Sie die kombinierte Passung.
    8. Überprüfen Sie, ob jeder Wert physisch angemessen bleibt. Das Ergebnis dieses Verfahrens sollte ein zusammengesetztes Modell sein, das die SAXS-Daten weit über einen großen Bereich von Größenmaßstäben beschreibt, wie in Abbildung 4dargestellt. Speichern Sie die Anpassung mit der Schaltfläche Ordner speichern, um sie in Igor zu speichern.

6. Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)

  1. Cryo TEM
    1. Wählen Sie das Raster aus. Als Alternative empfehlen wir löchrige Carbon-Stützfolien auf einem Standard-TEM-Gitter oder Spitzencarbon. In beiden Fällen bieten die Löcher zwischen dem Kohlenstoff einen bildgebenden Bereich aus reinem Glaseis und Probe und keine Folie.
    2. Legen Sie die Gittercarbonseite in einem Glühvorrichtung auf einem sauberen Glasschlitten. Das Einwickeln der Folie in Laborfolie kann bei der Gitterhandhabung helfen. Vermeiden Sie es, die Mitte des Gitters mit einer Pinzette zu berühren und immer in der Nähe des Rands des Gitters zu kneifen.
    3. Stellen Sie das Raster für 30 s zur Macht.
    4. Bereiten Sie einen Verglasungsroboter für die Probenabscheidung vor.
      1. Stellen Sie auf 100% Luftfeuchtigkeit und RT und fügen Sie Blotting-Papier hinzu. Bereiten Sie flüssiges Ethan und flüssige Stickstoffbäder an der Basis des Roboters vor. Weitere Hilfe zur Vorbereitung und Verwendung von Verglasungsrobotern finden Sie in Online-Tutorials und Videos.
    5. Probe 5x verdünnen.
    6. Mit der negativen Aktionspinzette, die mit dem Verglasungsroboter versehen ist, nehmen Sie ein Gitter auf, befestigen Sie dann die Pinzette am Roboter und bewegen Sie die Pinzette in die Kammer.
    7. Fügen Sie im Roboter 4 l der Probe mit einer Pipette durch das Loch in der Seite der Maschine auf die Kohlenstoffseite des Gitters.
    8. Inkubieren Sie für 4 min.
    9. Mit dem Roboter, blot 3-5 s mit Filterpapier.
    10. Der Verglasungsroboter wird das Gitter in flüssiges Ethan stürzen.
    11. Entfernen Sie die Pinzette und verschieben Sie das Netz zu flüssigem Stickstoff und in einen Lagerbehälter, der auch unter flüssigem Stickstoff sein sollte. Dieser Prozess fixiert die Probe in eine dünne Schicht Glaskörpereis. Minimieren Sie die Zeit, die das Netz in diesem Schritt aus dem flüssigen Ethan oder flüssigem Stickstoff verbringt.
    12. Kühlen Sie den Kryoprobenhalter mit flüssigem Stickstoff. Halten Sie einen Dewar und Reservoir voll.
    13. Wenn Sie bereit zum Abbilden sind, laden Sie das Raster auf den Kryoprobenhalter. Die Probe unter flüssigem Stickstoff oder kurz im extrem kalten Stickstoffdampf direkt über der flüssigen Oberfläche aufbewahren.
    14. Stellen Sie das Gitter bei 120 kV zwischen 75kx und 150kx in dünnem und dickem Eis vor, da unterschiedlich große Mizellen eine bestimmte Eisdicke bevorzugen können.
      1. Begrenzen Sie die Strahlexposition, um das Schmelzen von Eis zu vermeiden und die Probe zu beschädigen. Konzentrieren Sie sich nicht direkt auf die Planung des Bildes; Fokus in der Nähe. Stellen Sie den Interessenbereich nur beim Erfassen eines Bildes zur Auswahl.
      2. Achten Sie darauf, flüssige Ethantropfen von der Probe zu unterscheiden, wenn Sie Bilder anzeigen (siehe Abbildung 5).
  2. Konventionelles TEM mit negativer Färbung
    1. Bereiten Sie den Fleck vor.
      1. Kochen Sie 10 ml Reinstwasser. 0,1 g Uranylformat (UFo) in ein 15 ml konisches Rohr wiegen.
      2. Fügen Sie 5 ml des heißen Wassers in das UFo-Pulver für eine 2%-Lösung. Dicht schließen und in Aluminiumfolie wickeln, um Licht zu blockieren. Ein 1% Uranylacetat-Färbung wird ebenfalls häufig verwendet.
      3. Wirbel oder kräftig schütteln für 5 min. Befestigung der Röhre an den Wirbel. Filtern Sie durch einen 0,2-mm-Spritzenfilter in ein sauberes konisches Rohr.
      4. Lassen Sie 10 min zu RT abkühlen. Fügen Sie 25 l 5M NaOH und Wirbel sofort für 2 min.
        1. Alternativ können Sie 200 L Aliquots von 2% UFo einfrieren. Wenn Sie einsatzbereit sind, tauen Sie ein Aliquot auf, fügen Sie 1 L von 5 M NaOH hinzu und wirbeln Sie 2 min.
      5. Flecken in Folie oder weg vom Licht einwickeln.
    2. Probe 10x in 1x PBS (oder gewünschtem Puffer) verdünnen.
    3. Wählen Sie Raster aus. Wir empfehlen Kohlenstoffstützfolie auf Kupfergittern. Die dunklere, glänzendere Seite des Gitters ist die kohlenstoffbeschichtete Seite, auf der die Probe abgelagert und befleckt wird.
    4. Legen Sie die Gittercarbonseite in einem Glühvorrichtung auf einem sauberen Glasschlitten. Siehe Schritt 6.1.2.
    5. Stellen Sie das Raster für 30 s zur Macht.
    6. Nehmen Sie das Gitter mit der Kohlenstoffseite noch nach oben und halten Sie mit negativer Aktion Pinzette am Rand des Gitters, um zu verhindern, dass der Bildbereich in der Mitte reißt. Legen Sie die Pinzette mit dem Gitter noch Kohlenstoff Seite nach oben.
    7. Tragen Sie mit einer Pipette ein 4-L-Tröpfchen der Probe auf die Oberseite (Kohlenstoffseite) des Gitters auf.
    8. Inkubieren 4 min.
    9. Mit einer L2-Nr. 1 min l, Pipette eine 10 l und ein 20-L-Tropfen UFo-Lösung auf ein Stück saubere Laborfolie.
    10. Verwenden Sie Filterpapier, um die Probe vom Rand des Gitters (senkrechter Kontakt) abzuleiten, um jeglichen Kontakt mit der Bildfläche zu vermeiden.
    11. Mit der Pinzette (noch das Gitter halten), legen Sie sofort die Probenseite des Gitters nach unten auf den 10 L UFo Tröpfchen, dann sofort ableiten die Flüssigkeit (Waschschritt). Es ist wichtig, das Gitter nicht trocknen zu lassen, also nicht zwischen den Stufen anhalten.
    12. In ähnlicher Weise wenden Sie das 20-L-UFo-Tröpfchen auf das Raster an. Halten Sie das Gitter auf dem UFo für 40 s. Wick die Flüssigkeit aus und lassen Sie das Gitter trocknen.
    13. Stellen Sie das Trockennetz bei 120 kV zwischen 20.000x und 100.000x auf.
    14. Achten Sie darauf, alle UFo-kontaminierten Materialien mit dem Sicherheitsdienst der Institution für radioaktive Abfälle ordnungsgemäß zu entsorgen.
    15. Bei Bedarf können Helligkeits-/Kontrastverbesserungen und ein Medianfilter auf TEM-Bilder in ImageJ angewendet werden, um Hintergrundgeräusche zu reduzieren. Die Nachbearbeitung sollte einheitlich erfolgen, nur für Bilder, die nicht für quantitative Messungen wie Intensität verwendet werden, und sollte immer gemeldet werden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Um die oben beschriebenen Charakterisierungsmethoden zu veranschaulichen, zeigen wir typische Ergebnisse für PCMs, die aus Oligonukleotiden und Blockcopolymeren unterschiedlicher Länge und Chemie zusammengesetzt sind (Abbildung 1). Abbildung 2 zeigt ein Beispiel dafür, wie die PCM-Kerngröße (wie aus SAXS und TEM ermittelt, Abbildung 4 und Abbildung 5)mit der geladenen Blocklänge variiert e.V. Abbildung 3 zeigt DLS-Daten und Anpassungsergebnisse für sphärische PCMs, die aus relativ langen Blockcopolymeren und kurzen einsträngigen Oligonukleotiden gebildet werden. Abbildung 4 zeigt, wie komplexe SAXS-Intensitätsspektren genau passen können, indem Modelle für die vorhandenen multiplen räumlichen Korrelationen kombiniert werden (externe Oberfläche, Intra-Core-Streuung, Interhelix-Reihenfolge) und wie MALS verwendet werden könnte, um Streumessungen auf längere Längenskalen zu erweitern. Schließlich zeigt Abbildung 5 repräsentative Elektronenmikroskopiedaten für PCMs unterschiedlicher Morphologie.

Figure 1
Abbildung 1: Montage und Charakterisierung von Nukleinsäure-PCMs. (A) Anionische Polymere, wie Oligonukleotide, bildeten phasengetrennte Komplexe mit kationischen Regionen von Diblock-Copolymeren. Das Vorhandensein eines hydrophilen neutralen Blocks (grau) führte zur Bildung stabiler PCM-Nanopartikel. (B) PCMs waren Kernschalen-Nanopartikel mit mehreren Parametern, die charakterisiert werden sollten. Die Gesamtgröße (hydrodynamischer Radius, Rh) konnte mit DLS bestimmt werden, der Kernradius (Rc) konnte mit SAXS und TEM ermittelt werden, die Koronagröße konnte als Rh-Rcberechnet werden, und die Morphologie konnte über mehrere Längenskalen durch Kombination von SAXS, MALS und TEM bestimmt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Abhängigkeit von der Micelle-Größe. Die Micelle-Kerngröße wurde in erster Linie durch die Länge des geladenen Blocks des Blockcopolymers bestimmt und war weitgehend unabhängig von der Länge des Homopolymers7,26. Dies ermöglicht die Kontrolle der PCM-Größe durch Wahl des Blockpolymers. Die hier gezeigten Daten sind für pLys-PEG mit 88 nt/bp DNA und wurden zuvorberichtet 26. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Dynamische Lichtstreuung. (A) Autokorrelationsfunktion (willkürliche Einheiten) für 10 nt einsträngige DNA + pLys(100)-PEG(10k) PCM. (B) Hydrodynamische Radiusverteilung (Histogramm) von REPES fit. Die Autokorrelationsfunktion ist auf einen flachen Wert mit einer einzelnen Zeitskala zerfallen, was zu einem Spitzenwert einer einzelnen Größe in der REPES-Größenverteilung führt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Repräsentative SAXS- und MALS-Daten und passend für eine zylindrische Micelle. SAXS-Daten (graue Kreise) werden für PCMs angezeigt, die aus pLys(50)-PEG(5k) und 88 bp doppelsträngiger DNA zusammengesetzt sind. Bei niedrigen q (< 10-2 --1) zeigte die Intensität eine ungefähr q-2 Abhängigkeit von der Impulsübertragung, was eine flexible Zylinderform (wurmartige Micelle) impliziert. MALS-Daten (offene schwarze Kreise) zeigen die gleiche Abhängigkeit, was darauf hindeutet, dass die Mizellen mindestens mehrere Mikrometer lang waren (bestätigt durch TEM-Bildgebung, Abbildung 5C,D). Sphäroide Mizellen würden in diesem Bereich eine flache Abhängigkeit (q0) der Intensität von q aufweisen. Die farbigen Linien veranschaulichen das in Abschnitt 5 beschriebene Mehrkomponenten-Fittingverfahren für PCM SAXS-Daten. Die Streuung bei niedrigen q (großen Abstandsskalen) wurde von der Außenfläche des PCM dominiert und passte gut zu einem flexiblen Zylindermodell (rot). Bei höheren q-Werten (kleinere Längenskala) wurde die Streuung von den einzelnen Polymeren im PCM-Kern dominiert, die hier durch ein Power Law (grün) mit niedrigem q-Cutoff passen. Wir beobachteten auch die parallele Verpackung von doppelsträngigen DNA-Helices innerhalb des PCM-Kerns, was zu einem Quasi-Bragg-Beugungsspitzen (blau) führte. Die schwarze gestrichelte Linie zeigt, dass die Kombination dieser Modelle die SAXS-Daten genau beschrieb, und das Hinzufügen von Lichtstreudaten (offene Kreise) erweiterte den Größenbereich um fast vier Größenordnungen. Die Anpassungsergebnisse ergaben eine PCM-Population mit einem mittleren Radius = 11,0 nm und PDI = 0,03, das Leistungsrecht bei hohem q = 1,81 und der Beugungsspitzen entspricht einem Interhelixabstand von 2,71 nm. SAXS-Daten wurden bereitsgemeldet 26 und sind öffentlich zugänglich44. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: TEM-Bilder von Nukleinsäure-PCMs. (A–B) Cryo TEM von 22 nt einsträngigen DNA + pLys(50)-PEG(5k) PCMs, die überwiegend sphärische Morphologie zeigen. Blaue Pfeile zeigen flüssige Ethantröpfchen an, die nicht mit den PCMs (texturierte sphäroidale Objekte) zu verwechseln sind. (A) ist leicht unterfokussiert, fügt einen leichten Kontrast hinzu, während die Auflösung erhalten bleibt. (B) ist im Wesentlichen unterfokussiert, was mehr Kontrast hinzufügt, aber Klarheit opfert. Helligkeits- und Kontrastanpassungen sowie ein Zwei-Pixel-Medianfilter wurden auf beide Bilder angewendet. (C-D) Negativ gebeiztTEM von 88 bp doppelsträngigen DNA + pLys(50)-PEG(5k) PCMs, die lange flexible Zylinder sind. In beiden Fällen entsprachen die Kernradien von TEM den Werten, die aus der Anpassung der SAXS-Daten ermittelt wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Wie oben erwähnt, werden die hier vorgestellten Protokolle mit einem Schwerpunkt auf Oligonukleotiden als Polyanionskomponente und pLys-PEG als kationisch-neutrales Blockcopolymer geschrieben, aber wir haben sie mit einer Vielzahl von Polymeren getestet, wie Poly(Acrylsäure), Polyglutamat und PEG-Poly (Vinylbenzyltrimethylammonium), und glauben, dass sie allgemein für die meisten Polyelektrolytenpaare anwendbar sein werden. Ein Parameter, der möglicherweise optimiert werden muss, ist die Salzkonzentration, die zum Glühen verwendet wird, da sie hoch genug sein sollte, dass pcMs sich zu Beginn des Annealen nicht bilden. Dies kann experimentell durch DLS oder im Vergleich zur Beobachtung der Phasentrennung mit den Polyelektrolyten allein (kein neutraler Block) überprüft werden. Thermisches Glühen kann verwendet werden, wenn Salzglühen unerwünscht ist, obwohl die resultierenden Polydispersitäten größer sind7. Die für die Charakterisierung verwendeten Konzentrationen müssen möglicherweise auch optimiert werden, da größere Nanopartikel mehr Licht streuen als kleine, und Nukleinsäuren sind effizienter bei der Streuung von Röntgenstrahlen als viele andere Polymere aufgrund des Vorhandenseins elektronendichter Phosphoratome im Rückgrat. Es kann auch notwendig sein, den pH-Wert des Puffers genauer zu kontrollieren, wenn entweder Polyelektrolyt ein pKa in der Nähe des Arbeitszustands hat.

In diesem Artikel stellen wir Protokolle für zwei Lichtstreuungstechniken (z. B. Multi-Winkel/statische Lichtstreuung und dynamische Lichtstreuung) sowie für die Röntgenstreuung mit kleinen Winkeln sowie sowohl für die Kryo- als auch für die konventionelle negative Fleckenübertragungselektronenmikroskopie mit jeweils repräsentativen Daten vor. Nicht alle Techniken sind für alle Szenarien notwendig, und auch andere sind verfügbar, was die Frage aufwirft, welche wann verwendet werden sollte. Es gibt umfangreiche Rezensionsliteratur zu diesem Thema45,46, aber wir empfehlen Folgendes, wenn ein neues PCM oder ähnliches Nanopartikel charakterisiert wird. Beginnen Sie mit der Überprüfung auf Aggregation, sowohl durch visuelle Inspektion auf Trübung als auch durch optische Mikroskopie. Wenn keine Aggregation beobachtet wird, besteht der nächste Schritt darin, festzustellen, ob Nanopartikel vorhanden sind. DLS ist eine schnelle Möglichkeit, dies zu bestimmen, da PCMs Licht kräftig streuen und schwache oder nicht vorhandene Lichtstreuung ein starker Indikator für eine schlechte Nanopartikelbildung ist. Während DLS das Vorhandensein von Nanopartikeln bestätigen kann, ist es schwierig, ihre Größe und Form ohne Bezugnahme auf andere Daten zu bestimmen, da die meisten Analysemethoden auf der Stokes-Einstein-Beziehung basieren, die von sphärischen Partikeln ausgeht. MALS kann sphärische Formen bestätigen (flache normalisierte Intensität vs. Winkel), kann aber möglicherweise nicht in der Lage sein, die Form von nicht sphärischen Partikeln zu bestimmen, es sei denn, die Größenverteilung ist sowohl schmal als auch tritt zufällig in den richtigen Bereich für die Auflösung. Daher empfehlen wir, TEM, SAXS oder beides auf jedem PCM-Beispiel auszuführen, um seine Eigenschaften vollständig zu charakterisieren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Wir danken Phil Griffin und Tera Lavoie von der Soft Matter Characterization Facility bzw. Advanced Electron Microscopy Facility an der University of Chicago. Wir danken auch Xiaobing Zuo und Soenke Seifert von der Advanced Photon Source am Argonne National Laboratory und NIST Center for Hierarchical Materials Design (CHiMaD) für die Unterstützung. Wir danken Jeff Ting und Michael Lueckheide für ihre Beiträge zu dieser Arbeit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70 mm circle filter paper Whatman 1001-070 Filter paper for wicking during grid prep
Carbon Film TEM grid Electron Microscopy Sciences CF200-Cu TEM grid
DAWN Wyatt Technology DAWN MALS instrument
DNA oligonucleotide Integrated DNA Nanotechnologies Inc Custom oligonucleotide
Lacey Carbon TEM grid Electron Microscopy Sciences LC200-Cu TEM grid
Methoxy-poly(ethylene glycol)-block-poly(l-lysine hydrochloride) PEG5k - PLKC50 Alamanda Polymers Inc mPEG5K-b-PLKC50 Example block copolymer
Milli-Q Millipore Sigma Ultrapure water
NanoDrop Thermo Scientific For measuring nucleic acid concentration
negative-action tweezers Dumont N7 Tweezers for grid preparation
Parafilm "M" Bemis Company Inc PM996 Laboratory film
Quantifoil Holey Carbon TEM grid Electron Microscopy Sciences Q210CR1.3 TEM grid
Research Goniometer and Laser Light Scattering System Brookhaven Instruments BI-200SM DLS/MALS instrument
Slide-A-Lyzer G2 2K 0.5 mL Thermo Scientific Pierce Protein Biology 87723 Dialysis cartridge
small volume cuvette Brookhaven Instruments BI-SVC Cuvette for DLS/MALS
Solarus 950 Advanced Plasma System Gatan Solarus 950 Plasma system for TEM grids
Talos TEM FEI Talos TEM used for cryo samples
Tecnai Spirit TEM FEI Spirit TEM used for dry samples
Uranyl Formate SPI-Chem 16984-59-1 For negative staining samples for TEM
Vitrobot FEI Vitrobot Vitrification robot for cryo grid preparation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Spruijt, E., Westphal, A. H., Borst, J. W., Cohen Stuart, M. A., van der Gucht, J. Binodal compositions of polyelectrolyte complexes. Macromolecules. 43 (15), 6476-6484 (2010).
  2. van der Gucht, J., Spruijt, E., Lemmers, M., Cohen Stuart, M. A. Polyelectrolyte complexes: bulk phases and colloidal systems. Journal of Colloid and Interface Science. 361 (2), 407-422 (2011).
  3. Priftis, D., Laugel, N., Tirrell, M. Thermodynamic characterization of polypeptide complex coacervation. Langmuir. 28 (45), 15947-15957 (2012).
  4. Fu, J., Schlenoff, J. B. Driving Forces for Oppositely Charged Polyion Association in Aqueous Solutions: Enthalpic, Entropic, but Not Electrostatic. Journal of the American Chemical Society. 138 (3), 980-990 (2016).
  5. Vieregg, J. R., et al. Oligonucleotide-Peptide Complexes: Phase Control by Hybridization. Journal of the American Chemical Society. 140 (5), 1632-1638 (2018).
  6. Voets, I. K., de Keizer, A., Cohen Stuart, M. A. Complex coacervate core micelles. Advances in Colloid and Interface Science. 147-148, 300-318 (2009).
  7. Lueckheide, M., Vieregg, J. R., Bologna, A. J., Leon, L., Tirrell, M. V. Structure-Property Relationships of Oligonucleotide Polyelectrolyte Complex Micelles. Nano Letters. 18 (11), 7111-7117 (2018).
  8. De Kruif, C. G., Weinbreck, F., de Vries, R. Complex coacervation of proteins and anionic polysaccharides. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 9 (5), 340-349 (2004).
  9. Vieregg, J. R., Tang, T. Y. D. Polynucleotides in cellular mimics: Coacervates and lipid vesicles. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 26, 50-57 (2016).
  10. Marciel, A. B., Chung, E. J., Brettmann, B. K., Leon, L. Bulk and nanoscale polypeptide based polyelectrolyte complexes. Advances in Colloid and Interface Science. 239, 187-198 (2017).
  11. Cabral, H., Miyata, K., Osada, K., Kataoka, K. Block Copolymer Micelles in Nanomedicine Applications. Chemical Reviews. 118 (14), 6844-6892 (2018).
  12. Tan, Z., et al. Block Polymer Micelles Enable CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein Delivery: Physicochemical Properties Affect Packaging Mechanisms and Gene Editing Efficiency. Macromolecules. 52 (21), 8197-8206 (2019).
  13. Horn, J. M., Kapelner, R. A., Obermeyer, A. C. Macro- and Microphase Separated Protein-Polyelectrolyte Complexes: Design Parameters and Current Progress. Polymers. 11 (4), 578 (2019).
  14. Juliano, R. L. The delivery of therapeutic oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 44 (14), 6518-6548 (2016).
  15. Kanasty, R., Dorkin, J. R., Vegas, A., Anderson, D. Delivery materials for siRNA therapeutics. Nature Materials. 12 (11), 967-977 (2013).
  16. Lorenzer, C., Dirin, M., Winkler, A. M., Baumann, V., Winkler, J. Going beyond the liver: progress and challenges of targeted delivery of siRNA therapeutics. Journal of Controlled Release. 203, 1-15 (2015).
  17. Allen, T. M., Cullis, P. R. Liposomal drug delivery systems: from concept to clinical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (1), 36-48 (2013).
  18. Li, W., Szoka, F. C. Lipid-based nanoparticles for nucleic acid delivery. Pharmaceutical Research. 24 (3), 438-449 (2007).
  19. Miyata, K., Nishiyama, N., Kataoka, K. Rational design of smart supramolecular assemblies for gene delivery: chemical challenges in the creation of artificial viruses. Chemical Society Reviews. 41 (7), 2562-2574 (2012).
  20. Oishi, M., Nagasaki, Y., Itaka, K., Nishiyama, N., Kataoka, K. Lactosylated poly(ethylene glycol)-siRNA conjugate through acid-labile ss-thiopropionate linkage to construct pH-sensitive polyion complex micelles achieving enhanced gene silencing in hepatoma cells. Journal of the American Chemical Society. 127 (6), 1624-1625 (2005).
  21. Christie, R. J., et al. Targeted polymeric micelles for siRNA treatment of experimental cancer by intravenous injection. ACS Nano. 6 (6), 5174-5189 (2012).
  22. Kuo, C. H., et al. Inhibition of atherosclerosis-promoting microRNAs via targeted polyelectrolyte complex micelles. Journal of Materials Chemistry B. 2 (46), 8142-8153 (2014).
  23. Ge, Z., et al. Targeted gene delivery by polyplex micelles with crowded PEG palisade and cRGD moiety for systemic treatment of pancreatic tumors. Biomaterials. 35 (10), 3416-3426 (2014).
  24. Van Bruggen, C., Hexum, J. K., Tan, Z., Dalai, R. J., Reineke, T. M. Nonviral Gene Delivery with Cationic Glycopolymers. Accounts of Chemical Research. 52 (5), 1347-1358 (2019).
  25. Hayashi, K., et al. Influence of RNA Strand Rigidity on Polyion Complex Formation with Block Catiomers. Macromolecular Rapid Communications. 37 (6), 486-493 (2016).
  26. Marras, A. E., Vieregg, J. R., Ting, J. M., Rubien, J. D., Tirrell, M. V. Polyelectrolyte Complexation of Oligonucleotides by Charged Hydrophobic-Neutral Hydrophilic Block Copolymers. Polymers. 11 (1), 83 (2019).
  27. Phillips, H. R., et al. Glycopolycation-DNA Polyplex Formulation N/P Ratio Affects Stability, Hemocompatibility, and in Vivo Biodistribution. Biomacromolecules. 20 (4), 1530-1544 (2019).
  28. Ting, J. M., Wu, H., Herzog-Arbeitman, A., Srivastava, S., Tirrell, M. V. Synthesis and Assembly of Designer Styrenic Diblock Polyelectrolytes. ACS Macro Letters. 7 (6), 726-733 (2018).
  29. Zadeh, J. N., et al. NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems. Journal of Computational Chemistry. 32 (1), 170-173 (2011).
  30. Santa Lucia, J. A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (4), 1460-1465 (1998).
  31. Xia, T., et al. Thermodynamic parameters for an expanded nearest-neighbor model for formation of RNA duplexes with Watson-Crick base pairs. Biochemistry. 37 (42), 14719-14735 (1998).
  32. Orthaber, D., Bergmann, A., Glatter, O. SAXS experiments on absolute scale with Kratky systems using water as a secondary standard. Journal of Applied Crystallography. 33 (2), 218-225 (2000).
  33. Srivastava, S., et al. Gel phase formation in dilute triblock copolyelectrolyte complexes. Nature Communications. 8, 14131 (2017).
  34. Lindhoud, S., et al. Salt-induced disintegration of lysozyme-containing polyelectrolyte complex micelles. Langmuir. 25 (19), 11425-11430 (2009).
  35. Lindhoud, S., de Vries, R., Schweins, R., Stuart, M. A. C., Norde, W. Salt-induced release of lipase from polyelectrolyte complex micelles. Soft Matter. 5 (1), 242-250 (2009).
  36. Ilavsky, J., Jemian, P. R. Irena: tool suite for modeling and analysis of small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 42 (2), 347-353 (2009).
  37. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  38. Jakeš, J. Regularized positive exponential sum (REPES) program-A way of inverting laplace transform data obtained by dynamic light scattering. Collection of Czechoslovak Chemical Communications. 60 (11), 1781-1797 (1995).
  39. Schillen, K., Brown, W., Johnsen, R. M. Micellar Sphere-to-Rod Transition in an Aqueous Triblock Copolymer System - a Dynamic Light-Scattering Study of Translational and Rotational Diffusion. Macromolecules. 27 (17), 4825-4832 (1994).
  40. Provencher, S. W. Contin - a General-Purpose Constrained Regularization Program for Inverting Noisy Linear Algebraic and Integral-Equations. Computer Physics Communications. 27 (3), 229-242 (1982).
  41. Provencher, S. W. A Constrained Regularization Method for Inverting Data Represented by Linear Algebraic or Integral-Equations. Computer Physics Communications. 27 (3), 213-227 (1982).
  42. Sarachan, K. L., Curtis, J. E., Krueger, S. Small-angle scattering contrast calculator for protein and nucleic acid complexes in solution. Journal of Applied Crystallography. 46 (6), 1889-1893 (2013).
  43. Beaucage, G. Approximations leading to a unified exponential power-law approach to small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 28 (6), 717-728 (1995).
  44. Marras, A. E., Vieregg, J. R., Ting, J. M., Rubien, J. D., Tirrell, M. V. Materials Data Facility. , 10.18126/M2QW8R (2018).
  45. Modena, M. M., Rühle, B., Burg, T. P., Wuttke, S. Nanoparticle Characterization: What to Measure. Advanced Materials. , (2019).
  46. Mourdikoudis, S., Pallares, R. M., Thanh, N. T. K. Characterization techniques for nanoparticles: comparison and complementarity upon studying nanoparticle properties. Nanoscale. 10 (27), 12871-12934 (2018).

Tags

Chemie Ausgabe 157 Nukleinsäureabgabe Polyelektrolytkomplex Micelle Nanopartikel Phasentrennung Oligonukleotide
Montage und Charakterisierung von Polyelektrolyt-Komplexmizellen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marras, A. E., Vieregg, J. R.,… More

Marras, A. E., Vieregg, J. R., Tirrell, M. V. Assembly and Characterization of Polyelectrolyte Complex Micelles. J. Vis. Exp. (157), e60894, doi:10.3791/60894 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter