Summary
Мы описываем протоколы для оценки степени трансдукции с помощью клеточно-проникающих пептидов с использованием ex vivo систем визуализации с последующим парафином встраивания, сечения, и конфокальной флуоресцентной микроскопии с использованием сердечного таргетинга пептид в качестве примера. В нашем протоколе, одно животное может быть использовано для приобретения обоих типов визуализации оценки одних и тех же органов, тем самым сокращая количество животных, необходимых для исследований в два раза.
Abstract
С момента первоначального описания доменов трансдукции белков, также известных как клеточные проникающие пептиды, более 25 лет назад, наблюдается большой интерес к разработке этих пептидов, особенно клеточных, как новых векторов для доставки диагностических и терапевтических материалов. Наша прошлая работа с участием фагового дисплея определила новый, ненасытно происходящих, 12 аминокислот длиной пептид, который мы назвали сердечной ориентации пептид (CTP) из-за его способности транснавировать нормальную сердечную ткань in vivo с пик поглощения видели всего за 15 мин после внутривенной инъекции. Мы провели подробные исследования биораспределения путем введения CTP помечены фторфора цианин5.5, что позволяет ему циркулировать в течение различных периодов времени, и эвтаназии, фиксации и сечения нескольких органов с последующим флуоресцентной микроскопии изображений. В этой публикации мы подробно описываем эти процессы, а также ex vivo-изображения собранных органов с помощью системы визуализации in vivo. Мы предоставляем подробные методологии и практики для проведения трансдукции, а также исследования биораспределения с использованием CTP в качестве примера.
Introduction
Мембрана плазмы клетки полупроницаемый барьер который необходим для герметичности клетки и выживания и служит для того чтобы отрегулировать внутреннюю часть клетки путем контролировать движение веществ в клетку. Хотя он имеет жизненно важное значение для выживания, он также представляет собой препятствие для доставки груза в ячейку. В 1988 году транс-активатор транскрипции (Tat) белка вируса иммунодефицита человека было показано, чтобы войти в культивируемые клетки и способствовать вирусному экспрессии генов1,2, с доменами, ответственными за эту трансдукции ограничивается аргинин и лизин богатых 13-амино кислотной области третьей спирали3 Эти были названы клетки проникающих пептидов (CPPs). За этим последовали исследования, показывающие способность пептида Tat нести функциональные q-galactosidase в несколько типов клеток4. С момента первоначального описания количество клеточно-проникающих пептидов резко возросло. Эти трансдукции доменов являются естественными или синтетические короткие пептиды, как правило, 6-20 аминокислот в длину, которые способны перевозить функциональные грузы через клеточные мембраны. Эти грузы могут варьироваться от других небольших пептидов, полнометражных белков, нуклеиновых кислот, наночастиц, вирусных частиц, флуоресцентных молекул и радиоизотопов5. Первоначальные CPPs описаны не были клеточной конкретной, с Tat принимаются несколько типов клеток и даже пересечения гематоэнцефалический барьер4, следовательно, ограничивая его терапевтический потенциал. Для того, чтобы определить ячейки конкретных CPPs, следователи предприняли фаг дисплей с использованием больших, коммерчески доступных библиотек фагов6. Наша собственная работа с использованием комбинаторных in vitro и in vivo фаговая методология привела к идентификации CPP имени сердечного таргетинга пептида (CTP)7, 12-аминокислоты, ненатурически происходящих пептид (NH2-APWHLSS-ISRT-COOH), что цели сердца с пиковым поглощением на 15 мин после периферийной внутривенной инъекции8. Используя иммунофлюоресцентный колокализацию с актином, внутриклеточным маркером, и исключение ламинина, маркера мембраны клетки, мы показали что CTP интернализирован в кардиомиоциты мыши после внутривенной инъекции7. Кроме того, мы инкубировали человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных избиения кардиомиоцитов с двойной этикеткой CTP, помечены 6-carboxyfluorescein на его C-термин и родамин на его N-термин через эфир связи, которые могут быть только расщепляется на внутриклеточных эстерас. Быстрое накопление родамина в избиение кардиомиоцитов наблюдалось в течение 15 мин на конфокальной микроскопии8.
В этой статье мы представляем две бесплатные методологии, которые могут быть использованы для отслеживания биораспределения и подтверждения тканевой интернализации CPPs с использованием CTP в качестве примера. Для этих методологий, CTP был синтезирован, флуоресцентно помечены на N-термин с cyanine5.5 (CY5.5), и amide-capped на C-термин для большей пептидной стабильности. Двумя используемыми методологиями являются флуоресцентные оптические системы визуализации vivo и флуоресцентная микроскопия секций тканей. Оба метода очень полезны в изучении биораспределения, поглощения и ликвидации флуоресцентно помеченных CPPs. Преимущество оценки биораспределения с использованием этих методов по сравнению с другими, такими как однофотонная эмиссионная томография (SPECT) или позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ), заключается в том, что нет необходимости в трудоемкой радиомаркировке КПП по сравнению с флуоресцентной маркировкой, которая является относительно простой и в обычном использовании на всех объектах пептидного синтеза. Использование in vivo изображений быстро производит данные биораспределения в контексте живой системы, в то время как раздел обеспечивает большую углубленную информацию о поглощении пептида и локализации в клетках путем сохранения морфологических деталей. Этот протокол может быть применен к широкому кругу органов и тканей, таких как сердце, легкие, печень, почки, мозг, селезенка, желудок, толстый кишечник, тонкий кишечник, скелетная мышца, кости, яички / яичники, и глаза.
Protocol
Институциональный комитет по уходу и использованию животных Университета Питтсбурга утвердил все протоколы на животных, указанные в этой публикации, до проведения любого из этих экспериментов на животных.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол подробно, как выполнить ex vivo биораспределивания исследований с использованием ex vivo оптической флуоресцентной визуализации следуют in vivo биораспределительности исследований путем встраивания органов в парафин, сечения, и выполнение флуоресцентной микроскопии. Хотя CTP используется в качестве примера, этот метод может быть применен к любой флуоресцентной маркировке CPP.
1. In vivo изображений
- Синтезировать CTP с использованием методов синтеза твердых фаз9,10 из пептидного синтеза объекта с использованием L-аминокислот с N-терминусом помечены Cy5.5 и C-термин amid для повышения стабильности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все синтезированные CPPs должны быть охарактеризованы с помощью высокопроизводительной жидкой хроматографии (HPLC) и / или матрицы при содействии лазерного desorption / ионизации (MALDI) до использования11. - Сделайте 1 мМ или 10 мМ стоковый раствор CTP в диметил-сульфоксид (DMSO), aliquot, и хранить при -80 градусов по Цельсию, свет защищены.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пептиды поставляются в виде лиофилизированного порошка. Лиофилизированный порошок может храниться длительно (6 месяцев-2 лет) при -20 градусов по Цельсию, светоощитом и в гигроскопических условиях. При аликвировании в DMSO и хранении следует избегать циклов замораживания-оттепели. - Взвешивание и анестезия 6-недельных CD1 самок мышей с использованием 2 мл/г веса ткани кетамина / ксилазина раствора (100 мг/кг кетамина и 20 мг/кг ксилазина) вводят внутримышечно (задняя нога) или внутриперитонально (нижний левый квадрант).
ПРИМЕЧАНИЕ: Кетамин / ксилазин решения должны быть сделаны свежие в день использования. Неиспользованный кетамин/ксиламин должен быть утилизирован надлежащим образом и объемы используются по сравнению с объемами отбрасываются записанные в журнале, как кетамин является контролируемым веществом. Адекватный уровень анестезии будет достигнут за 5–7 мин, о чем свидетельствует отсутствие реакции на щепотку ног. - Рассчитайте 10 мг/кг дозы Cy5.5-CTP, разбавляйте фосфатным буферным солевым раствором (PBS) не более чем до 200 мл, и введите либо ретро-орбитально, либо через инъекцию хвостовой вены с помощью шприца инсулина(рисунок 1A).
- Разрешить пептид циркулировать в течение предварительного времени, начиная от 15 мин-6 ч.
- Euthanize мыши с помощью высокого CO2 ингаляционный метод, как указано в Институциональный уход за животными и использования комитета и открыть грудную полость с помощью ножниц (Рисунок 1B).
- Используйте ножницы, чтобы поместить небольшой ник в боковой, свободной стенке правого предсердия и впрыснуть 3 мл 10% буферизированных формалин фосфат с помощью 26 G иглы для двойного назначения перфузии фиксации органов мыши и промывки красных кровяных клеток (Рисунок 1C).
- Рассекает сердце, легкие, печень, почки, селезенку, толстый кишечник, тонкий кишечник, мочевой пузырь, яичники / яички, и мозг и место в отдельные колодцы 12 хорошо пластины для ex vivo оптической визуализации (Рисунок 1D).
- Запустите программное обеспечение для получения изображений и нажмите кнопку Initialize, чтобы подготовить систему к образцам изображений. Откройте мастера визуализации, выберите флуоресценцию, затем отфильтруйте пару, затем выберите краситель Cy5.5 из списка красителей для применения 580 нм возбуждения и 620 нм фильтров выбросов. Выберите ручные настройки для параметров экспозиции, затем установите положение сцены до B, установите время экспозиции до 1 секунды, установите F/стоп до 8 и установите двоичную.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фильтры выбросов возбуждения будут меняться в зависимости от используемой метки. Возбуждение и эмиссия используемой метки может быть введена вручную для программного обеспечения для присвоения фильтров возбуждения и выбросов. Убедитесь, что количество голосов составляет от 600 до 60 000, чтобы избежать насыщения. В зависимости от используемой системы может быть доступна автоматическая оптимизация приобретения. Если система имеет компенсацию для сравнения изображений, приобретенных с различными настройками, можно использовать автоматические настройки. Если компенсация отсутствует, параметры должны быть определены, сохранены и последовательно использоваться в образцах. - Когда система полностью инициализирована, организовать органов, представляющих интерес в 12 хорошо пластины и поместить его внутри оптической камеры визуализации, гарантируя, что образцы расположены по желанию для изображений. Выберите приобретение, а затем выберите место сохранения для изображений. Информация о мыши может быть записана в всплывающем окне меток редактирования изображений.
- После визуализации удалите образцы из камеры и храните в 10% буферизированный формалин фосфат в объеме не менее чем в 20 раз больше объема ткани в сцинтилляционных флаконах со световой защитой при комнатной температуре (RT).
- Количественная оценка изображений путем установки единиц для Radiant Efficiency затем выбрав 4x3 ROI и настроить каждый колодец в один квадрат рентабельности инвестиций равномерно, а затем нажав меру. Откройте вкладку измерения рентабельности инвестиций сетки, выберите экспорт и сохраните измерения в виде файла .cvs.
2. Гистология
ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте шагам 1.1'1.8 для получения различных органов. Кроме того, те же органы, которые были изображены могут быть помещены в формалин немедленно и использовать для секций, как описано ниже.
- Храните каждый орган индивидуально в 10% буферизированных формалин фосфат для как минимум 48 ч до обработки для гистологии.
- Когда органы достаточно закреплены после 48 ч, перенесите органы в тканевую обработку и встраивание кассет и поместите в машину обработки тканей(рисунок 1E).
- Установите машину обработки для обезвоживания ткани в 70% этанола в течение 30 мин, а затем 80% этанола в течение 30 мин, 95% этанола за 30 мин, 95% этанола в течение 30 мин, 100% этанола за 15 мин, 100% этанола за 20 мин, и, наконец, 100% этанола за 20 мин.
- Очистите ткань в ксилен 2x, с 30 мин для каждого лечения ксиленом.
- Проникнуть очищенной ткани с парафином воск 4x при 60 градусов по Цельсию в течение 30 минут с каждым лечением.
- Вставлять в парафин с помощью металлических форм. Заполните форму расплавленным парафином (сохраняется при температуре 65 градусов по Цельсию) и перенесите на холодную тарелку. Как парафин в нижней части формы начинает затвердевать, поместите орган в парафин (Рисунок 1F).
- Поместите помеченную кассету поверх формы в качестве подпорки и заполните расплавленным парафином. Дайте остыть до твердого тела. Затем храните блок в морозильной камере -20 градусов на ночь, что позволяет воску сокращаться дальше для легкого удаления из форм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Блоки теперь могут храниться на RT с защитой от света. - Приготовьте водяную ванну с дистиллированной водой. Настроить микротом с углом лезвия 6 "и толщиной сечения 10 мкм.
- Установите тканевые блоки в микротоме и начните резать до тех пор, пока не будут получены секции, содержащие ткани. Затем поместите блоки лицом вниз в воду в течение 5 минут или до тех пор, пока ткань впитала в себя некоторую влагу (например, когда тонкий белый контур ткани появляется в блоке -рисунок 1G).
ПРИМЕЧАНИЕ: Лезвие должно быть заменено часто, чтобы обеспечить качество секций. - Поместите ткань на плоскую ледяную глыку на 10 минут, затем верните ее в микротом в той же ориентации, что и в шаге 2.9. Начните брать секции и дайте возможность усеченным секциям образовывать длинные ленты по 6–10 секций каждый. Откажитесь от неоптимальных парафиновых лент до тех пор, пока не будет изготовлена высококачественная лента достаточной длины для покрытия слайда. Оптимизация сечения путем регулировки скорости резки, увлажнения тканей, и температура водяной ванны, чтобы избежать стрижки или морщины ткани разделов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Разделы, которые имеют отверстия, где ткань выпала, рипы в ткани, или жесткие морщины и складки в ткани должны быть отброшены. - Тщательно выберите качественную ленту выбора с тупыми щипцами края и плавайте на поверхности водяной ванны 38 градусов по Цельсию. Пусть разделы сидеть на поверхности, пока они не сгладить, заботясь, чтобы не оставить их слишком долго, чтобы предотвратить парафин от распада и разрывая раздел друг от друга.
- Поплавайте сплющенными секциями на поверхность чистых стеклянных горок. Поместите горки в духовку с температурой 65 градусов в течение 30 минут, чтобы расплавить воск.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти слайды могут храниться на RT с защитой от света. - Deparaffinize слайды в ксилен 3x, 10 мин для каждого лечения.
- Регидратировать ткани в 100% этанола в течение 5 мин, а затем 95% этанола в течение 5 мин, 70% этанола в течение 5 мин, 50% этанола в течение 5 мин, и, наконец, 1x трис буферизированного солевого раствора (TBS) за 5 мин (Рисунок 1H). Дайте горкам высохнуть на ночь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти слайды могут храниться в течение длительного времени на RT до тех пор, пока они защищены светом. - Гора слайды с крышками с использованием 125 МЛ монтажа носителей, содержащих 4 ", 6-diamidino-2-фенилиндол (DAPI), ядерный флуоресцентный зонд (Рисунок 1I). Сухие горки на ночь на RT, свет защищены.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сушеные слайды могут храниться в долгосрочной перспективе при 4 градусах Цельсия, защищенном светом. - Слайды изображения с помощью флуоресцентной микроскопии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Насыщенные изображения следует избегать, так как они не являются количественно полезными. Корректировка настроек экспозиции и усиления может быть снижена, чтобы избежать насыщения. Позаботьтесь, чтобы использовать те же настройки в рамках сравниваемых образцов. Избегайте отбеливания ткани, ограничивая время экспозиции.
Representative Results
Используя этот протокол, мы обработали трех мышей с дозой 10 мг/кг Cy5.5-CTP с помощью ретро-орбитальной инъекции(рисунок 1A). После разрешения пептида циркулировать в течение 15 мин, мышей усыпили с помощью CO2 камеры, грудь открылась через средний разрез стернотомии, правое предсердие было nicked, и мыши перфузии фиксированной с использованием 3 mL 10% фосфат буфера формалин(рисунок 1B,C). После фиксации, сердце, легкие, печень, почки, селезенка, и мозг были вскрыты и расположены в 12 хорошо пластины для ex vivo оптической флуоресцентной визуализации (Рисунок 1D и рисунок 2A). Три контрольные мыши без инъекций были также перерос, рассечены и изображены(рисунок 1B-D и рисунок 2B). Данные о флуоресценции, полученные для каждого набора органов, можно сравнить из-за того, что количество данных преобразуется в радиантную эффективность, относительную флуоресценцию программного обеспечения для визуализации. Эти данные могут быть количественно дать как качественные изображения и количественные данные по каждому органу в вопросе (Рисунок 2C) в различных точках времени для биораспределения исследований. Аутофлюоресценция различных органов в ответ на различные длины волн возбуждения продемонстрирована на рисунке 3A-E. Более короткие длины волн возбуждения, такие как расширенный зеленый флуоресцентный белок (EGFP), связаны с более высокой аутофлюоресценцией, особенно в печени и мозге, чем далеко-красные (Cy5.5) или ближнего инфракрасного (Cy7) возбуждения длин волны(рисунок 3). Изображения органов были зафиксированы в 10% фосфат буферизированный формалин на RT как минимум 48 ч, а затем переход на обработку тканей и встраивание кассет(рисунок 1E). Органы были обработаны и парафинизованы в тканевом станке, расположены в формах, наполненных парафином, замороженные на стадии -20 градусов по Цельсию, и хранятся на ночь при -20 градусов по Цельсию(рисунок 1F). Образцы были разделены(Рисунок 1G) и обработаны с помощью раствора обменов для регидратации ткани (Рисунок 1H). Подготовленные слайды были затем установлены с DAPI флуоресцентной монтажной среды (Рисунок 1I). После высыхания, как правило, на ночь, слайды были изображены с помощью флуоресцентной микроскопии. Репрезентативные изображения каждого органа с мыши показаны на рисунке 4A. Изображения из разных органов были приобретены с использованием идентичных настроек для сравнения между мышами, и для обеспечения количественной оценки (Рисунок 4B).
Рисунок 1: Сбор органов мыши для эк vivo оптической флуоресцентной визуализации и сечения. (A) Мышь дикого типа вводили ретро-орбитально с CTP-Cy5.5. (B) Мышь вскрыли с грудью открыт, правое атриум snipped, для перфузии фиксации. (C) Сердце вводят с 3 мл 10% буферизированный формалин фосфат для перфузии фиксации животного. (D) Органы интереса собраны и расположены в 12 хорошо пластины для флуоресцентных оптических изображений. (E) Сердце загружается в кассету и обрабатывается с помощью процессора ткани. (F) Сердце, встроенное в парафин. (G) Сердце, секциву на микротоме. (H)Слайды deparaffinized через ряд обменов решений. (I) Секции, установленные с крышками с использованием DAPI. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Репрезентативные изображения из обработанных и контрольных органов. (A) Органы от мыши, обработанные 10 мг/кг CTP-Cy5.5. (B) Органы от необработанной мыши управления. (C) Количественная оценка флуоресценции для каждого набора органов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Необработанные органы мыши, изображенные на различных длинах волн выбросов возбуждения, чтобы продемонстрировать, как более длинные длины волн производят меньше аутофлюоресценции. (A) Cy7: 740-790. (B) Cy5.5: 660-710. (C) Cy5: 620-670. (D) Cy3: 520-570. (E) EGFP: 480-520. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Перенос сердца, легких, печени и почек после внутривенных инъекций у мышей. Мышам дикого типа вводили 10 мг/кг Cy5.5-CTP или случайного пептида (RAN-Cy5.5), и усыпляли в указанные временные точки. ()Пик трансдукции сердечной ткани было замечено на 15 мин с устойчивым снижением флуоресценции с течением времени. Некоторое поглощение капилляров было отмечено в легких с надежной трансдукции в печени, а также на почках гломерулярных капилляров, последний подразумевает почечный механизм выделения. (B) Количественная оценка флуоресцентной интенсивности показывает значительное увеличение поглощения сердца CTP-Cy5.5 над RAN-Cy5.5. Шкала бар No 500 мкм. Эта цифра была изменена с Qahid и др.8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
Модели животных имеют важное значение для разработки доклинических лекарственных средств на каждом этапе процесса от идентификации новых КП, исследований биораспределения, механизма трансдукции, до в конечном счете тестирования на эффективность доставленного груза с использованием этих новых КПП в качестве векторов. Есть много широко используемых методов для оценки биораспределения, таких как гистология, ядерная медицина изображений (SPECT и ПЭТ), и in vivo оптической визуализации12. Методы ядерной визуализации могут быть обременительными из-за ограниченности малых животных SPECT и ПЭТ-систем, а также способность производить радиолейбл-наркотики конъюгаты, которые требуют опыта радиохимика. В отличие от флуоресцентных этикеток гораздо проще и может быть экономически эффективным для работы. Протокол, описанный в настоящем документе, позволяет быстро анализировать биораспределение с помощью нескольких методов. Ex vivo весь орган флуоресцентной оптической визуализации позволяет немедленное сравнение флуоресценции между различными тканями и группами лечения и может определить поглощение органов и время, чтобы пик поглощения в органе, представляющих интерес в полуквантитивной манере. Количественная гистология тканей требует более обширной обработки для лечения, сечения, изображения и анализа тканей, но она предоставляет больше данных на микроскопическом уровне и является современным стандартным методом. Стоит отметить, что прямое, количественное сравнение между двумя методами не представляется возможным, потому что аутофлюоресценция рассматривается с каждым методом для различных органов и возбуждения длин волны значительно варьируется.
Важной частью этого протокола является выбор правильного фторфора для обозначения кандидатов CPPs для экспериментов. Одной из потенциальных проблем является перекрытие спектров, что может быть проблематичным при необходимости нескольких фторфоров. Флуоресцентные носители DAPI и Cy5.5 не имеют перекрывающихся спектров. Однако для некоторых приложений, где требуется несколько фторфоров, риск спектрального перекрытия должен быть тщательно рассмотрен. В зависимости от используемой системы, выбор фторфора может быть ограничен. Поэтому знание возможностей системы является ключевым фактором. Флуоресцентные оптические системы лучше всего использовать с дальнеиными или ближними инфракрасными фторфорами из-за высокой абсорбции тканей коротких длин волн13. Фторфоры в диапазоне расширенного зеленого флуоресцентного белка имеют серьезные ограничения, потому что есть значительные аутофлюоресценции органов видели на его возбуждение длины волны, в частности, в мозге и ткани печени. В зависимости от условий эксперимента, некоторые фторфоры лучше избегать. Некоторые водорастворимые органические фторфоры имеют сильное взаимодействие с липидными билайнами, что может вызвать ложные срабатывания. Следовательно, принимая меры, чтобы определить, если фторфор имеет сильное сродство к ткани интерес рекомендуется14. Еще одним фактором, чтобы рассмотреть это выбор соответствующего метода спряжения фторфора, который может быть важным параметром, влияющим на результаты. CPPs можно маркировать флуоресцентно на N- или C-терминусе через ковалентную связь между N-терминус пептида и группой carboxyl красителя such as Cy5.5-NHS. Следует проявлять осторожность, поскольку механизм трансдукции большинства КПД не понимается в деталях и спряжение на одном конце может повлиять на механизм поглощения в большей степени, чем на другом конце. Другая возможность для маркировки CPPs через биотинилирование N-термин для спряжения флуоресцентно помечены streptavidin. Использование этой стратегии имеет удобство позволяет различные флуоресцентные стрептавидин конъюгаты, которые будут использоваться. Однако возможным ограничением этой стратегии является то, что биотин-стрептавидин комплекс представляет собой крупную конструкцию, которая потенциально может помешать трансдукции.
Флуоресцентные оптические системы визуализации являются эффективной стратегией для генерации сравнения флуоресценции между различными органами и лечения эффективно, но не в состоянии производить количественный показатель абсолютных концентраций в тканях. Это связано с легкими эффектами рассеяния в ткани, которое еще больше усугубляется естественным разнообразием размеров тканей и плотности, а также различиями в сосудистости, с переменным рассеянием флуоресценции. Ткань аутофлюоресценция может быть фактором, а также, из-за естественных биохимических источников, таких как коллаген, или диетические источники, как хлорофилл в пище13.
Гистология является наиболее часто используемым методом измерения биораспределения и потенциально может быть использован для точного измерения и сравнения поглощения через различные ткани с течением времени. Свет рассеяния проблемы избежать с помощью этого метода, потому что все ткани разделены на одну толщину15. Основным преимуществом этого метода является возможность включения дополнительных флуоресцентных этикеток postectioning для иммуногистохимии. Хотя добавление другого фторфора может сделать визуализацию более сложной, использование флуоресцентных этикеток может быть полезным для локализации CPP для определенных внутриклеточных отсеков, таких как лизосомы или митохондрии. Антитела могут быть использованы в конфокальной микроскопии эксперимент, чтобы определить, если транс-кандидат CPP колокализирует со структурой интересов, которые могут показать потенциал CPP в качестве агента доставки. Одним из ограничений этого метода является то, что подготовка слайдов из образцов органов может занять много времени, трудоемким, и склонны к человеческой ошибке12,15. При слайдах изображений следует проявлять осторожность, чтобы не изображение одного и того же места слишком долго, чтобы избежать фотосъемки. Некоторые фотосъемки будут неизбежны, в зависимости от чувствительности фторфора. Следует проявлять осторожность на каждом шагу этого протокола, чтобы защитить образцы от окружающего света и хранить их должным образом16. Мы рекомендуем, чтобы слайды хранились при 4 градусах Цельсия, защищенном светом, для будущих изображений.
Существуют различные методы для измерения биораспределения кандидата CPP, которые требуют специализированного оборудования и могут производить сопоставимые результаты, хотя они могут потребовать более сложной маркировки CPP. Протокол, описанный в настоящем документе, использует два совместимых метода для эффективного производства данных биораспределения в контексте живой системы, позволяя при этом получить более подробную информацию о пептидной интернализации в клетках из одного образца, тем самым сокращая число животных, необходимых для исследования, вдвое. Эти методы были использованы для генерации вышеуказанных данных, которые свидетельствуют о том, что оба метода могут быть использованы последовательно в одном и том же животном, и качество данных, генерируемых каждым из них. Наши результаты также подчеркивают неспособность напрямую соотнести результаты между этими двумя методами в количественном порядке.
Disclosures
М. З. и Пол Д. Роббинс (Университет Миннесоты, штат Миннесота, MN, США) провести патент на использование сердечного таргетинга пептида в качестве сердечного вектора (сердечный конкретных белка ориентации домена, США патент серийный No 9,249,184). М.З. также является главным научным сотрудником и входит в совет директоров стартапа Vivasc Therapeutics Inc. и имеет значительный будущий капитал в нем.
Acknowledgments
М.З. и K.S.F. поддерживаются Американской ассоциацией кардиологов в области научного развития 17SDG33411180, а также грантом, присуждаемым в рамках Pitt Innovation Challenge (PInCh®), через Клинический и Переводческий Институт Науки в Университете Питтсбурга.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Buffered Formalin Phosphate | ThermoFisher | SF100-4 | |
| 10x Tris Buffered Saline (TBS) | ThermoFisher | BP2471-1 | |
| 12-well Cell Culture Plate | ThermoFisher | 353043 | |
| 1x TBS Solution | 10x TBS is diluted 1:10 with deionized water. This solution can be stored at room temperature. | ||
| 20 mL Scintillation Vials | Wheaton | 334173 | |
| 26G Needles | Becton Dickinson | 305110 | |
| 28G 0.5ml Insulin syringes | Becton Dickinson | 329461 | |
| 3mL Syringe | Becton Dickinson | 309657 | |
| CD1 Mice | Charles River | 022 | 6 to 12 week old albino, female mice |
| Cover Glass | ThermoFisher | 12-544-14 | |
| Cy5.5-CTP-amide | Prepared by peptide synthesis, conjugated with Cy5.5 fluorophore, and purified using HPLC. Lyophilized powder is reconstituted in DMSO at 10mM concentration. After reconstituting, store at -80 °C. | ||
| Dapi Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 99150-20 | |
| Ethanol | |||
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Ketamine HCl 100mg/mL | KetaVed | NDC 50989-161-06 | |
| Ketamine/Xylazine Solution | Ketamine HCl is mixed with Xylazine 1:1 to produce a stock solution containing 50mg/mL ketamine and 10mg/mL Xylazine. This solution is made fresh before each use. | ||
| Leica RM2235 Rotary Microtome | Leica | RM2235 | |
| Microscope Slides | ThermoFisher | B9992000TN | |
| Paraplast X-TRA | Sigma | P3808-1KG | |
| Perkin Elmer Lumina S5 IVIS | Perkin Elmer | CLS148588 | |
| Sparkle Optical Lens Cleaner | ThermoFisher | NC0090079 | |
| Tissue-Tek Processing/Embedding Cassettes | ThermoFisher | NC9499605 | |
| Tissue-Tek VIP Processing machine | Tissue-Tek | VIP 5A-F1 | |
| Xylazine 20 mg/mL | AnaSed | NDC 59399-110-20 | |
| Xylenes | ThermoFisher | X5-4 |
References
- Green, M., Loewenstein, P. M. Autonomous functional domains of chemically synthesized human immunodeficiency virus tat trans-activator protein. Cell. 55 (6), 1179-1188 (1988).
- Frankel, A. D., Pabo, C. O. Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus. Cell. 55 (6), 1189-1193 (1988).
- Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G., Prochiantz, A. The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. Journal of Biological Chemistry. 269 (14), 10444-10450 (1994).
- Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).
- Zahid, M., Robbins, P. D. Cell-type specific penetrating peptides: therapeutic promises and challenges. Molecules. 20 (7), 13055-13070 (2015).
- Zahid, M., Robbins, P. D. Identification and characterization of tissue-specific protein transduction domains using peptide phage display. Methods in Molecular Biology. 683, 277-289 (2011).
- Zahid, M., et al. Identification of a cardiac specific protein transduction domain by in vivo biopanning using a M13 phage peptide display library in mice. PLoS One. 5 (8), e12252 (2010).
- Zahid, M., et al. Cardiac Targeting Peptide, a Novel Cardiac Vector: Studies in Bio-Distribution, Imaging Application, and Mechanism of Transduction. Biomolecules. 8 (4), E147 (2018).
- Amblard, M., Fehrentz, J. A., Martinez, J., Subra, G. Methods and protocols of modern solid phase Peptide synthesis. Molecular Biotechnology. 33 (3), 239-254 (2006).
- Katritzky, A. R., Yoshioka, M., Narindoshvili, T., Chung, A., Johnson, J. V. Fluorescent labeling of peptides on solid phase. Organic and Biomolecular Chemistry. 6 (24), 4582-4586 (2008).
- Prabhala, B. K., Mirza, O., Hojrup, P., Hansen, P. R. Characterization of Synthetic Peptides by Mass Spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1348, 77-82 (2015).
- Arms, L., et al. Advantages and Limitations of Current Techniques for Analyzing the Biodistribution of Nanoparticles. Frontiers in Pharmacology. 9, 802 (2018).
- Leblond, F., Davis, S. C., Valdes, P. A., Pogue, B. W. Pre-clinical whole-body fluorescence imaging: Review of instruments, methods and applications. Journal of Photochemistry and Photobiology. 98 (1), 77-94 (2010).
- Hughes, L. D., Rawle, R. J., Boxer, S. G. Choose your label wisely: water-soluble fluorophores often interact with lipid bilayers. PLoS One. 9 (2), e87649 (2014).
- McGowan, J. W., Bidwell, G. L. 3rd The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules. Journal of Visualized Experiments. (118), e54987 (2016).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 185 (7), 1135-1148 (2009).
