Summary
Nous décrivons des protocoles pour évaluer le degré de transduction par des peptides cellulaires pénétrant utilisant des systèmes d’imagerie ex vivo suivis de l’incorporation de paraffine, de section et de microscopie fluorescente confocale utilisant le peptide de ciblage cardiaque comme exemple. Dans notre protocole, un seul animal peut être utilisé pour acquérir les deux types d’évaluation d’imagerie des mêmes organes, réduisant ainsi de moitié le nombre d’animaux nécessaires aux études.
Abstract
Depuis la description initiale des domaines de transduction de protéines, également connus sous le nom de peptides pénétrants cellulaires, il y a plus de 25 ans, il y a eu un vif intérêt pour le développement de ces peptides, en particulier spécifiques aux cellules, comme nouveaux vecteurs pour la fourniture de matériaux diagnostiques et thérapeutiques. Nos travaux passés impliquant l’affichage de phage ont identifié un nouveau, non nonaturally se produisant, 12 peptide d’acide aminé-long que nous avons nommé peptide de ciblage cardiaque (CTP) en raison de sa capacité à transduce le tissu cardiaque normal in vivo avec l’absorption de crête vue dans aussi peu que 15 min après une injection intraveineuse. Nous avons entrepris des études détaillées de biodistribution en injectant CTP étiqueté avec la cyanine de fluorophore5.5, lui permettant de circuler pendant diverses périodes de temps, et l’euthanasie, la fixation, et la section des organes multiples suivis par l’imagerie fluorescente de microscopie. Dans cette publication, nous décrivons ces processus ainsi que l’imagerie ex vivo des organes récoltés à l’aide d’un système d’imagerie in vivo en détail. Nous fournissons des méthodologies et des pratiques détaillées pour entreprendre des études de transduction ainsi que des études de biodistribution en utilisant CTP comme exemple.
Introduction
La membrane plasmatique cellulaire est une barrière semi-perméable qui est essentielle pour l’intégrité et la survie des cellules et sert à réguler l’intérieur de la cellule en contrôlant le mouvement des substances dans la cellule. Bien que vitale pour la survie, il présente également un obstacle à la livraison de la cargaison à la cellule. En 1988, le trans-activateur de la protéine de transcription (Tat) du virus de l’immunodéficience humaine a été montré pour entrer dans les cellules cultivées et promouvoir l’expression virale des gènes1,2, avec les domaines responsables de cette transduction limitée à une région riche en 13 acides aminés riches en arginine et lysine de la troisième hélice3 Ceux-ci ont été ainsi nommés peptides cellulaires pénétrants (PPC). Ceci a été suivi par la recherche montrant la capacité du peptide de Tat de transporter le β-galactosidase fonctionnel dans plusieurs types de cellules4. Depuis la description initiale, le nombre de peptides pénétrant dans les cellules a augmenté de façon spectaculaire. Ces domaines de transduction sont des peptides courts d’origine naturelle ou synthétique, généralement de 6 à 20 acides aminés de long, qui sont capables de transporter des cargaisons fonctionnelles à travers les membranes cellulaires. Ces cargaisons peuvent s’étendent d’autres petits peptides, protéines pleine longueur, acides nucléiques, nanoparticules, particules virales, molécules fluorescentes, et radioisotopes5. Les premiers CPP décrits n’étaient pas spécifiques aux cellules, tat étant pris par plusieurs types de cellules et même en traversant la barrière hémato-encéphalique4, limitant ainsi son potentiel thérapeutique. Afin d’identifier les CPP spécifiques aux cellules, les chercheurs ont entrepris l’affichage phage en utilisant de grandes bibliothèques de phages disponibles dans le commerce6. Notre propre travail utilisant une méthodologie d’affichage de phage in vitro et in vivo combinatoire a mené à l’identification d’un peptide de ciblage cardiaque (CTP)7, un peptide de 12 acides aminés, non naturel (NH2-APWHLSSQYSRT-COOH) qui cible le coeur avec l’absorption de pointe à 15 min après une injection intraveineuse périphérique8. En utilisant la colocalisation immunofluorescente avec l’actine, un marqueur intracellulaire, et l’exclusion de la laminine, un marqueur de membrane cellulaire, nous avons montré que CTP est intériorisé en cardiomyocytes de souris après une injection intraveineuse7. En outre, nous avons incubé des cardiomyocytes de battement pluripotents induits par l’homme de cellules souches avec CTP double-étiqueté, étiquetés avec la 6-carboxyfluorescéine à son C-terminus et rhodamine à son N-terminus par un lien d’ester qui ne pouvait être clivé par des esterases intracellulaires. L’accumulation rapide de rhodamine dans les cardiomyocytes de battement a été observée dans les 15 min sur la microscopie confocale8.
Dans cet article, nous présentons deux méthodologies complémentaires qui peuvent être utilisées pour suivre la biodistribution et confirmer l’internalisation spécifique aux tissus des PCP en utilisant CTP comme exemple. Pour ces méthodologies, CTP a été synthétisé, fluorescent étiqueté au N-terminus avec la cyanine5.5 (CY5.5), et amide-plafonné au C-terminus pour une plus grande stabilité de peptide. Les deux méthodes utilisées sont les systèmes d’imagerie optique fluorescente in vivo et la microscopie fluorescente des sections de tissu. Les deux méthodes sont très utiles pour étudier la biodistribution, l’absorption et l’élimination des CPP étiquetés fluorescents. L’avantage d’évaluer la biodistribution à l’aide de ces méthodes par rapport à d’autres, comme la tomographie par émission de photons simples (SPECT) ou la tomographie par émission de positrons (PET), est qu’il n’est pas nécessaire d’étiqueter les CPA à durée de vie par rapport à l’étiquetage fluorescent, qui est relativement facile et utilisé de façon routinière dans toutes les installations de synthèse de peptides. L’utilisation de l’imagerie in vivo produit rapidement des données de biodistribution dans le contexte d’un système vivant, tandis que la section fournit une plus grande information approfondie sur l’absorption et la localisation des peptides dans les cellules par la préservation des détails morphologiques. Ce protocole peut être appliqué à une grande variété d’organes et de tissus tels que le cœur, le poumon, le foie, les reins, le cerveau, la rate, l’estomac, le gros intestin, l’intestin grêle, le muscle squelettique, les os, les testicules/ovaires et les yeux.
Protocol
Le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Pittsburgh a approuvé tous les protocoles animaux spécifiés dans la présente publication avant d’entreprendre l’une ou l’autre de ces expériences sur les animaux.
REMARQUE : Ce protocole détaille comment effectuer des études de biodistribution ex vivo utilisant l’imagerie fluorescente optique ex vivo suivie d’études de biodistribution in vivo en intégrant les organes dans la paraffine, la section et l’exécution de la microscopie fluorescente. Bien que le CTP soit utilisé comme exemple, cette méthode peut être appliquée à n’importe quel RPC étiqueté fluorescent.
1. Imagerie in vivo
- Synthétisez CTP à l’aide de techniques de synthèse de phase solide9,10 à partir d’une installation de synthèse de peptides à l’aide d’acides L-aminés avec un terminus N étiqueté avec Cy5.5 et C-terminus amide-capped pour une stabilité accrue.
REMARQUE : Tous les CPP synthétisés doivent être caractérisés à l’aide d’une chromatographie liquide haute performance (HPLC) et/ou d’une désorption/ionisation au laser assistée par matrice (MALDI) avant l’utilisation11. - Fabriquez une solution de 1 mM ou 10 mM de CTP dans le sulfoxyde de diméthyle (DMSO), liquote et stockez-la à -80 °C, protégées par la lumière.
REMARQUE : Les peptides sont livrés sous forme de poudre lyophilisée. La poudre lyophilisée peut être stockée à long terme (6 mois-2 ans) en -20 °C, protégée par la lumière et dans des conditions hygroscopiques. Lorsqu’il est aliquoté dans DMSO et stocké, les cycles de gel-dégel doivent être évités. - Peser et anesthésier des souris femelles CD1 de 6 semaines à l’aide de 2 μL/g de poids tissulaire d’une solution kétamine/xylazine (100 mg/kg de kétamine et 20 mg/kg de xylazine) administrées intramusculairement (jambe postérieure) ou intrapéritonéalement (quadrant inférieur gauche).
REMARQUE : Les solutions de kétamine/xylazine doivent être rafraîchies le jour de l’utilisation. La kétamine/xylazine non utilisée doit être éliminée de façon appropriée et les volumes utilisés par rapport aux volumes rejetés enregistrés dans un journal, car la kétamine est une substance contrôlée. Un niveau adéquat d’anesthésie sera atteint en 5−7 min, tel qu’évalué par le manque de réponse à une pincée d’orteil. - Calculer une dose de 10 mg/kg de Cy5.5-CTP, diluer avec la solution saline tamponnée de phosphate (PBS) à un montant maximal de 200 μL, et injecter soit rétro-orbitale, soit par injection de veine de queue à l’aide d’une seringue à insuline (Figure 1A).
- Permettre au peptide de circuler pendant le temps prédépécifié, allant de 15 min-6 h.
- Euthanasier la souris à l’aide de la méthode d’inhalation de CO2 élevée telle que spécifiée par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux et ouvrir la cavité thoracique à l’aide de ciseaux (Figure 1B).
- Utilisez des ciseaux pour placer une petite entaille dans la paroi latérale et libre de l’atrium droit et injecter 3 mL de phosphate formaline tamponné de 10 % àl’aide d’uneaiguille de 26 G dans le double but de fixer les organes de la souris et de rincer les globules rouges ( Figure 1C).
- Disséquer le cœur, le poumon, le foie, les reins, la rate, les gros intestins, les intestins grêles, la vessie, les ovaires/testicules et le cerveau et placer dans des puits individuels d’une plaque de puits de 12 pour l’imagerie optique ex vivo (figure 1D).
- Démarrez le logiciel d’acquisition d’images et cliquez sur le bouton Initialiser pour préparer le système pour les échantillons d’imagerie. Ouvrez l’Assistant d’imagerie, sélectionnez fluorescence, puis filtrez la paire, puis sélectionnez le colorant Cy5.5 dans la liste des colorants pour appliquer 580 nm d’excitation et 620 nm filtres d’émission. Sélectionnez les paramètres manuels pour les paramètres d’exposition, puis définissez la position de la scène sur B, définissez le temps d’exposition à 1 seconde, réglez le F/stop à 8 et réglez le binning sur le petit.
REMARQUE : Les filtres d’émission d’excitation varient selon l’étiquette utilisée. L’excitation et l’émission de l’étiquette utilisée peuvent être saisies manuellement pour que le logiciel attribue des filtres d’excitation et d’émission. Assurez-vous que les dénombrements sont compris entre 600 et 60 000 afin d’éviter la saturation. Selon le système utilisé, l’optimisation automatique de l’acquisition peut être disponible. Si le système a une compensation pour comparer les images acquises avec différents paramètres, les paramètres automatiques peuvent être utilisés. Si aucune compensation n’est disponible, les paramètres devront être déterminés, enregistrés et utilisés de façon cohérente dans tous les échantillons. - Lorsque le système est complètement initialisé, organiser les organes d’intérêt dans une plaque de 12 puits et le placer à l’intérieur de la chambre d’imagerie optique, en veillant à ce que les échantillons sont disposés comme souhaité pour les images. Sélectionnez acquérir, puis sélectionnez un emplacement d’enregistrement pour les images. Les informations sur la souris peuvent être écrites dans la fenêtre contextuelle modifier les étiquettes d’image.
- Après l’imagerie, retirer les échantillons de la chambre et stocker dans 10% de phosphate de formaline tamponné dans un volume d’au moins 20 fois le volume du tissu dans les flacons de scintillation avec protection légère à température ambiante (RT).
- Quantifier les images en définissant les unités sur Radiant Efficiency, puis en sélectionnant le roi 4x3 et en ajustant pour s’adapter à chaque puits dans un carré du roi uniformément, suivie d’une mesure en cliquant. Ouvrez l’onglet Mesures du roi de la grille, sélectionnez exporter et enregistrez les mesures en tant que fichier .cvs.
2. Histologie
REMARQUE : Suivez les étapes 1.1−1.8 pour obtenir différents organes. Alternativement, les mêmes organes qui ont été photographiés peuvent être placés dans la formaline immédiatement et utilisés pour la sectionnage comme détaillé ci-dessous.
- Conserver chaque organe individuellement dans 10 % de phosphate de formaline tamponné pendant au moins 48 h avant d’être traité pour l’histologie.
- Lorsque les organes sont suffisamment fixés après 48 h, transférer les organes dans le traitement des tissus et l’intégration des cassettes et les placer dans une machine de traitement des tissus (Figure 1E).
- Réglez la machine de traitement pour déshydrater le tissu dans 70% d’éthanol pendant 30 min, suivi de 80% d’éthanol pour 30 min, 95% d’éthanol pour 30 min, 95% d’éthanol pour 30 min, 100% d’éthanol pour 15 min, 100% d’éthanol pendant 20 min, et enfin 100% d’éthanol pendant 20 min.
- Effacer le tissu en xylène 2x, avec 30 min pour chaque traitement de xylène.
- Infiltrer le tissu dégagé avec de la cire de paraffine 4x à 60 °C pendant 30 min à chaque traitement.
- Incorporer dans la paraffine à l’aide de moules métalliques. Remplir le moule de paraffine fondue (conservée à 65 °C) et transférer dans une plaque froide. Comme la paraffine au fond du moule commence à se solidifier, placez l’organe dans la paraffine (Figure 1F).
- Placez une cassette étiquetée sur le moule comme support et remplissez-le de paraffine fondue. Laisser refroidir jusqu’à consistance solide. Ensuite, rangez le bloc dans un congélateur à -20 °C pendant la nuit, ce qui permet à la cire de rétrécir davantage pour faciliter l’enlèvement des moules.
REMARQUE : Les blocs peuvent maintenant être stockés à RT avec protection lumineuse. - Préparer un bain d’eau à 38 °C avec de l’eau distillée. Mettre en place le microtome avec un angle de lame de 6° et une épaisseur de section de 10 μm.
- Montez les blocs de tissu dans le microtome et commencez à couper jusqu’à ce que des sections contenant du tissu soient obtenues. Placez ensuite les blocs face vers le bas dans l’eau pendant 5 min ou jusqu’à ce que le tissu ait absorbé un peu d’humidité (p. ex., lorsqu’un mince contour blanc du tissu apparaît dans le bloc [Figure 1G]).
REMARQUE : La lame doit être remplacée fréquemment pour assurer la qualité des sections. - Placez le tissu sur un bloc de glace plat pendant 10 min, puis retournez-le au microtome dans la même orientation qu’à l’étape 2.9. Commencez à prendre des sections et laissez les sections tronquées former de longs rubans de 6 à 10 sections chacune. Jetez les rubans de paraffine sous-optimaux jusqu’à ce qu’un ruban de haute qualité d’une longueur suffisante pour couvrir une diapositive soit produit. Optimisez la section en ajustant les vitesses de coupe, l’hydratation des tissus et la température du bain d’eau afin d’éviter le cisaillement ou le froissement des sections de tissu.
REMARQUE : Les sections qui ont des trous où le tissu est tombé, déchire dans le tissu, ou les rides serrées et les plis dans le tissu devraient être jetés. - Choisissez soigneusement le ruban de qualité de choix avec des forceps de bord émoussés et flottez sur la surface du bain d’eau de 38 °C. Laissez les sections reposer sur la surface jusqu’à ce qu’elles lissent, en prenant soin de ne pas les laisser trop longtemps pour empêcher la paraffine de se désintégrer et de déchirer la section.
- Faites flotter les sections aplaties sur la surface des lames de verre propres. Placer les lames dans un four à 65 °C pendant 30 min pour faire fondre la cire.
REMARQUE : Ces diapositives peuvent être stockées à RT avec protection lumineuse. - Déparaffiniser les diapositives en xylène 3x, 10 min pour chaque traitement.
- Réhydrater le tissu en éthanol à 100 % pendant 5 min, suivi de 95 % d’éthanol pendant 5 min, 70 % d’éthanol pendant 5 min, 50 % d’éthanol pendant 5 min, et enfin de 1 x saline tamponnée par tris (SCT) pendant 5 min (figure 1H). Laisser sécher les lames pendant la nuit.
REMARQUE : Ces diapositives peuvent être stockées à long terme à RT tant qu’elles sont protégées par la lumière. - Montez les lames avec des couvercles à l’aide de 125 μL de supports de montage contenant 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI), une sonde fluorescente nucléaire (Figure 1I). Glisse sèche pendant la nuit à RT, protégée par la lumière.
REMARQUE : Les lames séchées peuvent être stockées à long terme à 4 °C, protégées par la lumière. - Diapositives d’image utilisant la microscopie fluorescente.
REMARQUE : Les images saturées doivent être évitées, car elles ne sont pas quantitativement utiles. L’ajustement des paramètres d’exposition et de gain peut être abaissé pour éviter la saturation. Prenez soin d’utiliser les mêmes paramètres à travers les échantillons en cours de comparaison. Évitez le blanchiment du tissu en limitant les temps d’exposition.
Representative Results
En utilisant ce protocole, nous avons traité trois souris avec une dose de 10 mg/kg de Cy5.5-CTP par une injection rétro-orbitale (Figure 1A). Après avoir laissé circuler le peptide pendant 15 min, les souris ont été euthanasiés à l’aide d’une chambre co2, la poitrine s’est ouverte par une incision médiane de sternotomie, l’atrium droit a été entaillé, et la perfusion de souris fixe à l’aide de 3 mL de formaline tamponnée de phosphate de 10 % (figure 1B,C). Après fixation, le cœur, les poumons, le foie, les reins, la rate et le cerveau ont été disséqués et disposés dans une plaque de puits de 12 pour l’imagerie fluorescente optique ex vivo (figure 1D et figure 2A). Trois souris témoins sans injection ont également été perfusées, disséquées et imageuses (figure 1B−D et figure 2B). Les données de fluorescence acquises pour chaque ensemble d’organes peuvent être comparées en raison des dénombrements convertis en efficacité radiante, l’unité de fluorescence relative du logiciel d’imagerie. Ces données peuvent être quantifiées pour produire à la fois des images qualitatives et des données quantitatives pour chaque organe en question (figure 2C) à travers différents points de temps pour les études de biodistribution. L’autofluorescence de différents organes en réponse à différentes longueurs d’onde d’excitation est démontrée à la figure 3A−E. Des longueurs d’onde plus courtes d’excitation, telles que la protéine fluorescente verte améliorée (EGFP), sont associées à une autofluorescence plus élevée, en particulier dans le foie et le cerveau, que les longueurs d’onde d’excitation rouge lointain (Cy5.5) ou proche infrarouge (Cy7) (figure 3). Les organes photographiés ont été fixés en formaline tamponnée de phosphate de 10 % à RT pendant au moins 48 h, suivis d’un transfert aux cassettes de traitement et d’intégration des tissus (figure 1E). Les organes ont été traités et paraffinisés dans une machine de traitement des tissus, placés dans des moules remplis de paraffine, congelés sur une scène de -20 °C et stockés toute la nuit à -20 °C (figure 1F). Les échantillons ont été sectionnés (figure 1G) et traités par des échanges de solutions pour réhydrater le tissu (figure 1H). Les diapositives préparées ont ensuite été montées avec un support de montage fluorescent DAPI (Figure 1I). Une fois sèches, habituellement pendant la nuit, les diapositives ont été images à l’aide de la microscopie fluorescente. Les images représentatives de chaque organe d’une souris sont présentées à la figure 4A. Les images de différents organes ont été acquises à l’aide de paramètres identiques pour permettre la comparaison entre les souris, et pour permettre la quantification (Figure 4B).
Figure 1 : Récolte d’organes de souris pour l’imagerie fluorescente optique ex vivo et la section. (A) Souris de type sauvage injectée rétro-orbitalement avec CTP-Cy5.5. (B) Souris disséquée avec la poitrine ouverte, atrium droit snipped, pour la fixation de perfusion. (C) Coeur injecté avec 3 mL de phosphate de formaline tamponné de 10% pour la fixation de perfusion de l’animal. (D) Organes d’intérêt récoltés et disposés dans une plaque de 12 puits pour l’imagerie optique fluorescente. (E) Coeur chargé dans une cassette et traité à l’aide d’un processeur de tissu. (F) Coeur incorporé dans la paraffine. (G) Coeur sectionné sur un microtome. (H) Diapositives déparaffinisées par une série d’échanges de solutions. (I) Sections montées avec des couvercles à l’aide de DAPI. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Images représentatives d’organes traités et témoins. (A) Organes d’une souris traités avec 10 mg/kg CTP-Cy5.5. (B) Organes d’une souris témoin non traitée. (C) Quantification de la fluorescence pour chaque ensemble d’organes. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Les organes de souris non traités photographiés à différentes longueurs d’onde d’émission d’excitation pour démontrer combien de longueurs d’onde plus longues produisent moins d’autofluorescence. (A) Cy7: 740−790. (B) Cy5.5: 660−710. (C) Cy5: 620−670. (D) Cy3: 520−570. EE) EGFP: 480−520. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Transduction du cœur, du poumon, du foie et des reins après injection intraveineuse chez les souris. Des souris de type sauvage ont été injectées avec 10 mg/kg de Cy5.5-CTP, ou un peptide aléatoire (RAN-Cy5.5), et euthanasiées aux points de temps indiqués. (A)Transduction maximale du tissu cardiaque a été vu à 15 min avec la diminution régulière de la fluorescence au fil du temps. Une certaine absorption capillaire a été notée dans les poumons avec la transduction robuste dans le foie aussi bien aux capillaires glomerular de rein, ce dernier impliquant un mécanisme rénal d’excrétion. (B) La quantification de l’intensité fluorescente montre une augmentation significative de l’absorption cardiaque de CTP-Cy5.5 sur RAN-Cy5.5. Barre d’échelle = 500 μm. Ce chiffre a été modifié à partir de Zahid et al.8. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Discussion
Les modèles animaux sont essentiels pour le développement de médicaments précliniques à chaque étape du processus, de l’identification de nouveaux PCP, des études de biodistribution, du mécanisme de transduction, à l’essai final de l’efficacité de la cargaison livrée en utilisant ces nouveaux CPP comme vecteurs. Il existe de nombreuses méthodes couramment utilisées pour évaluer la biodistribution comme l’histologie, l’imagerie en médecine nucléaire (SPECT et PET) et l’imagerie optique in vivo12. Les méthodes d’imagerie nucléaire peuvent être lourdes en raison de la disponibilité limitée des systèmes SPECT et PET pour petits animaux, ainsi que de la capacité de produire des conjugués radiolabel-médicaments, qui nécessitent l’expertise d’un radiochimiste. En revanche, les étiquettes fluorescentes sont beaucoup plus simples et peuvent être rentables pour travailler avec. Le protocole décrit dans cet article permet une analyse rapide de la biodistribution à l’aide de multiples méthodes. L’imagerie optique fluorescente ex vivo permet la comparaison immédiate de la fluorescence entre différents tissus et groupes de traitement et peut identifier l’absorption d’organes et le temps de pic d’absorption dans l’organe d’intérêt d’une manière semi-quantitative. L’histologie quantitative des tissus nécessite un traitement plus étendu pour traiter, sectionr, imager et analyser les tissus, mais elle fournit plus de données au niveau microscopique et est une technique standard actuelle. Il est utile de noter que la comparaison directe et quantitative entre les deux techniques n’est pas possible, parce que l’autofluorescence observée avec chaque technique pour différents organes et longueurs d’onde d’excitation varie considérablement.
Une partie importante de ce protocole consiste à choisir le fluorophore droit pour étiqueter les CPP candidats pour les expériences. Un problème potentiel est le chevauchement des spectres, qui peut être problématique lorsque plusieurs fluorophores sont nécessaires. Les supports de montage fluorescent DAPI et le Cy5.5 n’ont pas de spectres qui se chevauchent. Toutefois, pour certaines applications où de multiples fluorophores sont nécessaires, le risque de chevauchement spectral doit être soigneusement pris en considération. Selon le système utilisé, la sélection des fluorophores peut être limitée. Par conséquent, la connaissance des capacités du système est essentielle. Les systèmes optiques fluorescents sont mieux utilisés avec des fluorophores infrarouges lointains ou proches en raison de l’absorption élevée des tissus des longueurs d’onde plus courtes13. Les fluorophores de la gamme des protéines fluorescentes vertes améliorées ont une limitation majeure, parce qu’il y a l’autofluorescence significative d’organe vu à sa longueur d’onde d’excitation, spécifiquement dans le cerveau et le tissu de foie. Selon les conditions d’une expérience, il est préférable d’éviter certains fluorophores. Certains fluorophores organiques solubles dans l’eau ont une forte interaction avec les bicouches lipidiques, ce qui peut causer de faux positifs. Par conséquent, il est conseillé de prendre des mesures pour déterminer si un fluorophore a une forte affinité avec le tissu d’intérêt14. Un autre facteur à considérer est la sélection de la méthode appropriée de conjugaison de fluorophore, qui peut être un paramètre important affectant les résultats. Les CPP peuvent être étiquetés fluorescents au terminus N ou C par un lien covalent entre le terminus N du peptide et le groupe carboxyle du colorant tel que Cy5.5-NHS. Il faut faire attention, parce que le mécanisme de transduction de la plupart des CPP n’est pas compris en détail et la conjugaison à une extrémité peut affecter le mécanisme d’absorption plus qu’à l’autre extrémité. Une autre possibilité pour l’étiquetage des CPP est de biotinyler le N-terminus pour la conjugaison à la streptavidine fluorescente étiquetée. L’utilisation de cette stratégie a la commodité de permettre différents conjugués fluorescents streptavidin d’être utilisés. Cependant, une limitation possible de cette stratégie est qu’un complexe de biotine-streptavidine est une grande construction, qui pourrait potentiellement interférer avec la transduction.
Les systèmes d’imagerie optique fluorescente sont une stratégie efficace pour générer une comparaison efficace de la fluorescence entre différents organes et traitements, mais ils sont incapables de produire une mesure quantitative des concentrations absolues dans les tissus. Ceci est dû aux effets de diffusion de la lumière dans le tissu, qui est encore aggravée par la variété naturelle dans les tailles et les densités de tissus, et les différences dans la vascularité, avec la dispersion variable de fluorescence. L’autofluorescence des tissus peut également être un facteur, en raison de sources biochimiques naturelles telles que le collagène, ou des sources alimentaires comme la chlorophylle dans les aliments13.
L’histologie est la méthode la plus couramment utilisée pour mesurer la biodistribution et peut potentiellement être utilisée pour mesurer et comparer avec précision l’absorption entre différents tissus au fil du temps. Les problèmes de diffusion de la lumière sont évités en utilisant cette méthode parce que tous les tissus sont sectionnés à la même épaisseur15. Un avantage majeur de cette méthode est la capacité d’inclure des étiquettes fluorescentes supplémentaires postsection pour l’immunohistorichimie. Bien que l’ajout d’un autre fluorophore puisse rendre l’imagerie plus difficile, l’utilisation d’étiquettes fluorescentes peut être utile pour la localisation d’un RPC dans des compartiments intracellulaires particuliers, comme les lysosomes ou les mitochondries. Un anticorps pourrait être utilisé dans une expérience de microscopie confocale pour déterminer si un candidat transduqué CPP colocalise avec une structure d’intérêt, ce qui peut montrer le potentiel d’un RPC en tant qu’agent de livraison. Une limitation de cette méthode est que la préparation des diapositives à partir d’échantillons d’organes peut prendre beaucoup de temps, la main-d’œuvre, et sujette à l’erreur humaine12,15. Lors de l’imagerie des diapositives, il faut prendre soin de ne pas imager le même endroit trop longtemps pour éviter le photobleaching. Certains photobleaching sera inévitable, en fonction de la sensibilité de la fluorophore. Il faut faire attention à chaque étape de ce protocole pour protéger les échantillons de la lumière ambiante et les stocker correctement16. Nous recommandons que les diapositives soient stockées à 4 °C, protégées par la lumière, pour l’imagerie future.
Il existe une variété de méthodes disponibles pour mesurer la biodistribution d’un RPC candidat qui nécessitent de l’équipement spécialisé et peuvent produire des résultats comparables, bien qu’elles puissent nécessiter une étiquetage plus complexe du RPC. Le protocole décrit dans cet article utilise deux méthodes compatibles pour produire efficacement des données de biodistribution dans le contexte d’un système vivant tout en permettant l’acquisition d’informations plus approfondies sur l’internalisation des peptides dans les cellules à partir du même échantillon, réduisant ainsi de moitié le nombre d’animaux nécessaires à une étude. Ces méthodes ont été utilisées pour générer les données ci-dessus, qui démontrent que les deux méthodes peuvent être utilisées séquentiellement chez le même animal, et la qualité des données générées par chacun. Nos résultats mettent également en évidence l’incapacité de corréler directement les résultats entre les deux techniques d’une manière quantitative.
Disclosures
M.Z. et Paul D. Robbins (University of Minnesota, Minnesota, MN, USA) détiennent un brevet sur l’utilisation du peptide de ciblage cardiaque comme vecteur cardiaque (Domaine de ciblage des protéines cardiaques, U.S. Patent Serial No. 9 249 184). M.Z. est également directeur scientifique et siège au conseil d’administration de la start-up Vivasc Therapeutics Inc. et détient d’importantes capitaux propres à l’avenir.
Acknowledgments
M.Z. et K.S.F. sont soutenus par l’American Heart Association Scientist Development Award 17SDG333411180, et par une subvention accordée dans le cadre du Pitt Innovation Challenge (PInCh®), par l’intermédiaire du Clinical and Translational Science Institute de l’Université de Pittsburgh.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Buffered Formalin Phosphate | ThermoFisher | SF100-4 | |
| 10x Tris Buffered Saline (TBS) | ThermoFisher | BP2471-1 | |
| 12-well Cell Culture Plate | ThermoFisher | 353043 | |
| 1x TBS Solution | 10x TBS is diluted 1:10 with deionized water. This solution can be stored at room temperature. | ||
| 20 mL Scintillation Vials | Wheaton | 334173 | |
| 26G Needles | Becton Dickinson | 305110 | |
| 28G 0.5ml Insulin syringes | Becton Dickinson | 329461 | |
| 3mL Syringe | Becton Dickinson | 309657 | |
| CD1 Mice | Charles River | 022 | 6 to 12 week old albino, female mice |
| Cover Glass | ThermoFisher | 12-544-14 | |
| Cy5.5-CTP-amide | Prepared by peptide synthesis, conjugated with Cy5.5 fluorophore, and purified using HPLC. Lyophilized powder is reconstituted in DMSO at 10mM concentration. After reconstituting, store at -80 °C. | ||
| Dapi Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 99150-20 | |
| Ethanol | |||
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Ketamine HCl 100mg/mL | KetaVed | NDC 50989-161-06 | |
| Ketamine/Xylazine Solution | Ketamine HCl is mixed with Xylazine 1:1 to produce a stock solution containing 50mg/mL ketamine and 10mg/mL Xylazine. This solution is made fresh before each use. | ||
| Leica RM2235 Rotary Microtome | Leica | RM2235 | |
| Microscope Slides | ThermoFisher | B9992000TN | |
| Paraplast X-TRA | Sigma | P3808-1KG | |
| Perkin Elmer Lumina S5 IVIS | Perkin Elmer | CLS148588 | |
| Sparkle Optical Lens Cleaner | ThermoFisher | NC0090079 | |
| Tissue-Tek Processing/Embedding Cassettes | ThermoFisher | NC9499605 | |
| Tissue-Tek VIP Processing machine | Tissue-Tek | VIP 5A-F1 | |
| Xylazine 20 mg/mL | AnaSed | NDC 59399-110-20 | |
| Xylenes | ThermoFisher | X5-4 |
References
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