Summary
אנו מתארים פרוטוקולים עבור הערכת מידת התמרה על ידי תאי-חודר פפטידים ניצול מערכות הדמיה vivo ex ולאחר מכן הטבעה פרפין, ומיקרוסקופית פלורסנט קונפוקלית וקד באמצעות מיקוד הלב פפטיד כדוגמה. בפרוטוקול שלנו, בעל חיים יחיד יכול לשמש לרכישת שני סוגים של הערכת הדמיה של אותם איברים, ובכך לחתוך את מספר בעלי החיים הדרושים ללימודים על ידי חצי.
Abstract
מאז התיאור הראשוני של תחומים התמרה חלבונים, הידוע גם בשם פפטידים חודר תאים, לפני 25 שנים, יש כבר עניין אינטנסיבי בפיתוח אלה פפטידים, במיוחד תאים ספציפיים, כמו וקטורים הרומן עבור אספקת חומרים האבחון והטיפולי. עבודת העבר שלנו מעורבים תצוגת phage זיהה רומן, לא טבעי המתרחשים, 12 חומצות אמינו-פפטיד ארוך שאנו בעלי שם מיקוד הלב פפטיד (CTP) בשל יכולתה לשנות את רקמת הלב נורמלי בvivo עם ספיגת שיא לראות מעט כמו 15 דקות לאחר הזרקה ורידית. עשינו מחקרים ביולוגיים מפורטים על ידי הזרקת CTP עם שכותרתו fluorophore 5.5, המאפשר לו להסתובב לפרקי זמן שונים, המתת חסד, תיקון, והפצת איברים מרובים ואחריו הדמיה מיקרוסקופית פלורסנט. בפרסום זה, אנו מתארים תהליכים אלה, כמו גם הדמיה vivo ex של איברים שנקטפו באמצעות מערכת הדמיה vivo בפרוטרוט. אנו מספקים מתודולוגיות ושיטות מפורטות לצורך התמרה ומחקרים ביולוגיים באמצעות CTP כדוגמה.
Introduction
קרום פלזמה התא הוא מכשול חדיר למחצה, כי הוא חיוני עבור שלמות התא והישרדות ומשמש כדי לווסת את הפנים של התא על ידי שליטה תנועה של חומרים לתוך התא. למרות שהוא חיוני להישרדות, הוא מציג גם מכשול להעברת מטענים לתא. ב 1988, טרנס activator של תמלול (תאת) חלבון של וירוס הכשל החיסוני האנושי הוכח להיכנס לתאים מתורבתים ולקדם ביטוי גנים נגיפי1,2, עם תחומים האחראים התמרה זה מוגבל ארגינין ו ליזין עשיר 13-אמינו באזור של הסליל השלישי3 אלה היו ובכך נקרא פפטידים חדירה לתא (cpps). זה היה לאחר מכן מחקרים המראים את היכולת של פפטיד תאת לשאת β-גלטוסידאז פונקציונלי לתוך סוגי תאים מרובים4. מאז התיאור הראשוני, מספר הפפטידים חודר התא גדל באופן דרמטי. תחומים אלה התמרה מתרחשות באופן טבעי או פפטידים קצרים, בדרך כלל 6-20 חומצות אמינו ארוכות, כי הם מסוגלים לשאת מטענים פונקציונליים על פני קרום התא. מטענים אלה יכולים לנוע בין פפטידים קטנים אחרים, חלבונים באורך מלא, חומצות גרעין, חלקיקים, חלקיקים נגיפי, מולקולות פלורסנט, רדיואיזוטופים5. CPPs הראשונית תיאר לא היו ספציפיים לתא, עם תאת להיות נלקח על ידי סוגי תאים מרובים ואף לחצות את מכשול המוח בדם4, ומכאן הגבלת הפוטנציאל התרפויטי שלה. על מנת לזהות CPPs ספציפי לתא, החוקרים הננקטות להציג phage ניצול גדול, מסחרית זמין בספריות phage6. העבודה שלנו באמצעות קומבינטורית ב מבחנה vivo phage להציג מתודולוגיה הובילה לזיהוי של CPP בשם מיקוד הלב פפטיד (CTP)7, חומצה 12-אמינו, פפטיד בלתי טבעי (NH2-APולג-cooh) כי מטרות הלב עם ספיגת שיא ב 15 דקות לאחר הזרקה היקפית ורידית8. באמצעות מערכת immunofluorescent לוקליזציה עם actin, סמן תאיים, והדרה של למינציה, סמן ממברנה התא, הראנו כי CTP הוא הפניציטים העכבר לאחר הזרקה ורידית7. בנוסף, אנו מודקות גזע האדם המושרה pluriפוטנטי תאים-הכאתו קרדיוגנול עם CTP בעל תווית כפולה, מתויג עם 6-carboxyfluorבתוך C-טרמינוס ו rhodamine ב שלה N-הטרמינוס דרך הצמדה אסתר זה יכול להיות רק ביקע על ידי מוחק תאיים. הצטברות מהירה של הרודטין למכות קרדיוציטים נצפתה בתוך 15 דקות במיקרוסקופיה מיקרוקלית8.
במאמר זה, אנו מציגים שתי מתודולוגיות בחינם שניתן להשתמש בהן כדי לעקוב אחר התפלגות ביולוגית ולאשר הפנמה ספציפית לרקמות של CPPs באמצעות CPPS כדוגמה. עבור מתודולוגיות אלה, CTP היה מסונתז, מתויג בקביעות ב-N-טרמינוס עם cyanine 5.5 (CY 5.5), ו אמיד-הכתיר ב C-טרמינוס ליציבות פפטיד יותר. שתי המתודולוגיות המשמשות הן במערכות דימות אופטיות vivo ומיקרוסקופית פלורסנט של מקטעי רקמות. שתי השיטות הן מאוד שימושיות בלמידה biodistribution פצה, ספיגה, וחיסול של CPPs בתווית מתויג. היתרון של הערכת biodistribution פצה באמצעות שיטות אלה על אחרים, כגון טומוגרפיה בודדת פוטון (הפסיכומטרית) או פליטת פוזיטרונים טומוגרפיה (PET), הוא שאין צורך בזמן רדיויניום אינטנסיבית של CPPs לעומת תיוג פלורסנט, אשר קל יחסית ובשימוש שגרתי בכל מתקני סינתזה פפטיד. השימוש ב vivo הדמיה מייצרת במהירות נתונים biodistribution בהקשר של מערכת החיים, תוך הימנעות מספק מידע מעמיק יותר על ספיגת פפטיד ולוקליזציה בתוך תאים באמצעות שימור של פירוט מורפולוגית. פרוטוקול זה ניתן להחיל על מגוון רחב של איברים ורקמות כגון הלב, ריאות, כבד, כליות, מוח, טחול, קיבה, המעי הגס, המעי הדק, שריר השלד, עצם, האשכים/שחלות, ועיניים.
Protocol
הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים של אוניברסיטת פיטסבורג אישרה את כל פרוטוקולי החיות שצוינו בפרסום זה לפני התחייבות לניסויים אלה בבעלי חיים.
הערה: פרוטוקול זה מפרט כיצד לבצע מחקרים vivo biodistribution תפלגות לשעבר ניצול הדמיה אופטית לשעבר vivo אופטי ואחריו במחקרים ביולוגיים vivo על ידי הטבעת האיברים בפרפין, הפצת, וביצוע מיקרוסקופ פלורסנט. למרות ש-CTP משמש לדוגמה, ניתן להחיל שיטה זו על כל מזהה התווית של CPP.
1. בהדמיה vivo
- לסנתז ctp באמצעות שיטות סינתזה של שלב מוצק9,10 ממתקן סינתזה פפטיד באמצעות חומצות אמינו L-באמצעות שכותרתו N-טרמינוס עם cy 5.5 ו-C-טרמינוס amide-הכתיר עבור יציבות מוגברת.
הערה: כל CPPs מסונתז צריך להיות מאופיין באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים ו/או מטריצה בסיוע לייזר/אינון (MALDI) לפני השימוש11. - הפוך פתרון מניות של 1 מ"מ או 10 מ"מ של CTP ב-diמתיל סולפוקסיד (DMSO), aliquot, ואחסן ב-80 ° c, מוגן באור.
הערה: פפטידים מועברים כאבקה ליאופ,. ניתן לאחסן את האבקה לטווח ארוך (6 חודשים-2 שנים) ב-20 ° c, מוגן באור ובתנאים היאלוסקופיים. כאשר מצוטטים ב DMSO ו מאוחסן, מחזורי הקפאת ההפשרה יש להימנע. - שוקלים ומורדם 6-שבוע בן CD1 עכברים נקבה באמצעות 2 μL/g של משקל רקמות של פתרון קטמין/xylazine (100 mg/ק"ג ו 20 מ"ג/ק"ג xylazine) מנוהל בתוך הפנים (האחוריות) או intraperitoneally (רביע השמאלי התחתון).
הערה: יש לרענן את הפתרונות קטמין/xylazine ביום השימוש. אין להשתמש בקטמין/xylazine כראוי ואמצעי אחסון המשמשים לעומת אמצעי אחסון שהושלכו ביומן, כאשר קטמין הוא חומר מבוקר. רמה נאותה של הרדמה תושג 5-7 דקות, כפי שמוערך על ידי חוסר תגובה צביטה בבוהן. - לחשב 10 מ"ג/ק"ג מינון של Cy 5.5-CTP, לדלל עם מלוחים באגירה פוספט (PBS) לא יותר מ 200 μL, ולהזריק או באמצעות הזרקת וריד הזנב באמצעות מזרק אינסולין (איור 1א).
- אפשר פפטיד לזרום עבור הזמן שצוין מראש, החל 15 דקות-6 h.
- המתת החסד העכבר באמצעות שיטה גבוהה שיתוף2 שאיפה החברה כפי שצוין על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים והשתמש הוועדה ולפתוח את חלל החזה באמצעות מספריים (איור 1B).
- מספריים להשתמש כדי למקם ניק קטן לרוחב, קיר חינם של האטריום הימני ולהזריק 3 מ ל של 10% באגירה מואגור ב-26 המחט G עבור המטרה הכפולה של זלוף תיקון האיברים של העכבר לרוקן את כדוריות הדם האדומות (איור 1ג).
- לנתח את הלב, הריאות, הכבד, הכליות, הטחול, המעי הגדול, המעי הקטן, שלפוחית השתן, השחלות/האשכים, ואת המוח ואת המקום לתוך בארות בודדות של 12 צלחת לvivo הדמיה אופטית לשעבר (איור 1ד).
- הפעל את תוכנת רכישת התמונות ולחץ על לחצן אתחול כדי להכין את המערכת לדגימות דימות. פתח את אשף ההדמיה, בחר את הקרינה הפלואורסצנטית, לאחר מכן לסנן זוג, ולאחר מכן בחר את Cy 5.5 לצבוע מתוך רשימת הצבעים כדי להחיל 580 ננומטר הריגוש ו 620 מסנני פליטה ננומטר. בחר הגדרות ידניות לפרמטרי חשיפה לאחר מכן הגדר את מיקום השלב ל-B, קבע זמן חשיפה לשניה אחת, הגדר את ה-F/stop ל-8, והגדר את האפשרות הקטנה ביותר.
הערה: מסנני הפליטה של עירור ישתנו בהתאם לתווית שבשימוש. עירור ופליטה של התווית בשימוש ניתן להזין באופן ידני עבור התוכנה כדי להקצות עירור ומסנני פליטה. ודא שספירות הן בין 600-60000 כדי למנוע רוויה. בהתאם למערכת שבה נעשה שימוש, מיטוב הרכישה האוטומטי עשוי להיות זמין. אם למערכת יש פיצוי כדי להשוות תמונות שנרכשו עם הגדרות שונות, ניתן להשתמש בהגדרות האוטומטיות. אם אין פיצוי זמין, הגדרות יצטרכו להיקבע, לשמור ולהשתמש בעקביות בדגימות. - כאשר המערכת מאותחלת לחלוטין, מסדרים את אברי העניין בצלחת של 12 ומניחים אותו בתוך חדר ההדמיה האופטי, ומבטיחים שהדגימות מסודרות לפי הצורך בתמונות. בחר רכישה ולאחר מכן בחר מיקום שמירה עבור התמונות. ניתן לכתוב מידע על העכבר לתוך החלון המוקפץ של תוויות תמונה.
- לאחר הדמיה, להסיר את הדגימות מן החדר ולאחסן 10% פורמלין באגירה בתוך אמצעי אחסון לפחות 20 פעמים את נפח הרקמה בבקבוקונים מבחנות עם הגנה קלה בטמפרטורת החדר (RT).
- לכמת את התמונות על ידי הגדרת יחידות כדי קורן יעילות מכן בחירת ההחזר 4x3 והתאמה כדי להתאים כל טוב לתוך ריבוע אחד של ROI באופן שווה, ואחריו לחיצה על מדידה. פתח את הכרטיסיה מדידות של הרשת ROI, בחר ייצוא ושמור את המידות כקובץ. קורות חיים.
2. היסטולוגיה
הערה: בצע את שלבים 1.1-1.8 כדי להשיג איברים שונים. לחילופין, ניתן להציב את אותם איברים שנוצרו באמצעות התמונה באופן מיידי ולהשתמש בו להצבת המידע המפורט להלן.
- אחסן כל איבר בנפרד 10% פורמאלין פוספט באגירה למינימום של 48 h לפני עיבוד עבור היסטולוגיה.
- כאשר האיברים הם קבועים מספיק אחרי 48 h, להעביר את האיברים לעיבוד רקמות והטבעה של קלטות ומקום לתוך מכונת עיבוד רקמות (איור 1E).
- הגדר את מכונת העיבוד כדי ליטול את הרקמה ב 70% אתנול עבור 30 דקות, ואחריו 80% אתנול עבור 30 דקות, 95% אתנול עבור 30 דקות, 95% אתנול עבור 30 דקות, 100% אתנול עבור 15 דקות, 100% אתנול עבור 20 דקות, ולבסוף 100% אתנול עבור 20 דקות.
- נקה את הרקמה ב קסילן 2x, עם 30 דקות עבור כל טיפול קסילן.
- לחדור את הרקמה הנקיה עם פרפין 4x ב 60 ° c עבור 30 דקות עם כל טיפול.
- הטמע פרפין בעזרת תבניות מתכת. ממלאים את העובש בפרפין מותך (שנשמר ב65 ° c), ומעבירים לצלחת קרה. כמו פרפין בתחתית העובש מתחיל לגבש, מניחים את האיבר לתוך פרפין (איור 1F).
- מניחים מחסנית על תווית על גבי העובש כגיבוי ומילוי יתר עם פרפין מותכת. אפשר להתקרר עד שיהיה מוצק. ואז לאחסן את הבלוק ב-20 ° c מקפיא לילה, המאפשר שעווה להתכווץ עוד להסרה קלה של התבניות.
הערה: בלוקים יכול כעת להיות מאוחסן ב-RT עם הגנה קלה. - הכינו אמבטיית מים ב38 ° c עם מים מזוקקים. הגדר את המיקרוטומה עם זווית להב של 6 ° ועובי מקטע של 10 μm.
- הר גושי רקמות ב מיקרוטום ולהתחיל חיתוך עד סעיפים המכילים רקמות מתקבלים. ואז למקם את הפנים בלוקים למטה במים עבור 5 דקות או עד הרקמה ספג כמה לחות (למשל, כאשר קו מתאר לבן דק של הרקמה מופיע בלוק [איור 1g]).
הערה: יש להחליף את הלהב בתדירות גבוהה כדי להבטיח את איכות המקטעים. - מניחים את הרקמה על בלוק קרח שטוח במשך 10 דקות, ואז להחזיר אותו המיקרוטומה בכיוון זהה כמו בשלב 2.9. התחל לקחת סעיפים ואפשר מקטעים חתוכים ליצירת רצועות ארוכות של 6-10 סעיפים כל אחד. התעלם מרצועות פרפין מיטביות עד שרצועת הכלים באיכות גבוהה של אורך מספיק כדי לכסות שקופית מופקת. מיטוב הסדר על ידי התאמת מהירויות חיתוך, לחות רקמות, וטמפרטורת אמבט מים כדי למנוע הטיית או קמטים של מקטעי הרקמה.
הערה: סעיפים שיש להם חורים שבהם הרקמה נפלה, קורע את הרקמה, או קמטים וקפלי הדוק ברקמה צריך להיות מושלך. - בחר בקפידה את רצועת הכלים של איכות הבחירה עם מלקחיים בצד קהה ולצוף על פני השטח של האמבטיה 38 ° c. תנו לסעיפים לשבת על פני השטח עד שהם מסתדרים, ודואגים לא להשאיר אותם יותר מדי זמן כדי למנוע מהפרפין להתפרק ולקרוע את הקטע.
- הצפת המקטעים המשוטחים על פני שקופיות זכוכית נקיות. מניחים את השקופיות בתנור של 65 ° c במשך 30 דקות כדי להמיס את השעווה.
הערה: ניתן לאחסן שקופיות אלה ב-RT עם הגנה קלה. - השאר את השקופיות בתוך קסילן 3x, 10 דקות עבור כל טיפול.
- מימה את הרקמה ב 100% אתנול עבור 5 דקות, ואחריו 95% אתנול עבור 5 דקות, 70% אתנול עבור 5 דקות, 50% אתנול עבור 5 דקות, ולבסוף 1x טריס באגירה מלוחים (TBS) עבור 5 דקות (איור 1H). אפשר לשקופיות להתייבש במשך הלילה.
הערה: ניתן לאחסן שקופיות אלה לטווח ארוך ב-RT, כל עוד הן מוגנות באור. - הר את השקופיות עם coverslips באמצעות 125 μL של התקנת מדיה המכילה 4 ′, 6-diamidino-2-פנילילינדול (DAPI), החללית פלורסנט גרעינית (איור 1I). שקופיות יבשות ללילה בשעה RT, מוגן באור.
הערה: ניתן לאחסן שקופיות מיובשות בטווח הארוך ב -4 ° c, מוגן באור. - שקופיות תמונה באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט.
הערה: יש להימנע מתמונות רוויות, מאחר שהן אינן שימושיות כמותית. התאמת החשיפה והגדרות הרווח ניתנת להורדת כדי להימנע מרוויה. לטפל להשתמש באותן הגדרות על פני הדגימות להיות לעומת. הימנע הלבנת הרקמה על ידי הגבלת זמני חשיפה.
Representative Results
באמצעות פרוטוקול זה, התייחסו שלושה עכברים עם מינון 10 מ"ג/ק"ג של Cy 5.5-CTP דרך הזרקה רטרו מסלולית (איור 1א). לאחר שהוא מאפשר פפטיד להסתובב 15 דקות, העכברים הורדמים באמצעות חדר CO2 , החזה נפתח דרך חתך האונה החציוני, האטריום הימני היה עצור, ואת העכברים זלוף קבוע באמצעות 3 מ ל 10% פוספט באגירה (איור 1B, ג). לאחר קיבעון, הלב, הריאות, כבד, כליות, טחול, ואת המוח היו גזור וסידר בצלחת 12 הבאר עבור הדמיה פלורסנט vivo אופטי ex (איור 1D ואיור 2א). שלושה עכברים שליטה עם זריקות לא היו גם מוכן, גזור, בתמונה (איור 1b-D ואיור 2ב). הנתונים הפלואורסצנטית שנרכשו עבור כל קבוצה של איברים ניתן להשוות בשל ספירות להיות המרה ליעילות קורן, יחידת הזריחה היחסית של תוכנת ההדמיה. ניתן לכמת נתונים אלה כדי להניב הן תמונות איכותיות והן נתונים כמותיים עבור כל איבר הנדון (איור 2ג) על פני נקודות זמן שונות עבור לימודי הפצה ביולוגית. הקרינה האוטומטית של איברים שונים בתגובה אורכי גל עירור שונים מוצג באיור 3A-E. אורכי גל עירור קצר יותר, כגון חלבון פלורסנט ירוק משופר (EGFP), משויכים לניאון גבוהה יותר, במיוחד בכבד ובמוח, מאשר באדום הרחוק (Cy 5.5) או בסמוך אינפרא אדום (Cy7) עירור אורכי גל (איור 3). איברי הדימות תוקנו ב-10% פוספט באגירה מפוספאט בשעה RT למינימום של 48 h, ואחריו העברה לעיבוד רקמות והטמעה של קלטות (איור 1E). האברים עובדו והוקמו במכונת עיבוד רקמות, הממוקמות בתבניות מלאות בפרפין, קפואות בשלב של 20 ° c ואוחסנו במשך הלילה ב-20 ° צ' (איור 1F). הדגימות היו מנות (איור 1G) וטיפל בחילופי פתרונות כדי לחדש את הרקמה (איור 1H). השקופיות המוכנות נטענו לאחר מכן עם מדיום הרכבה DAPI (איור 1I). לאחר ייבוש, בדרך כלל בן לילה, השקופיות היו תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט. תמונות מייצגות של כל איבר מעכבר מוצגים באיור 4א. התמונות מאיברים שונים נרכשו באמצעות הגדרות זהות כדי לאפשר השוואה בין עכברים, כדי לאפשר כימות (איור 4ב).
איור 1: קצירת איברים של העכבר עבור הדמיה פלורסנט vivo אופטי לשעבר והשחרים. (א) סוג העכבר הפראי הזריקרטרו-אורקובאלי עם ctp-cy 5.5. (ב) העכבר לגזור עם החזה נפתח, הימני פרוזדור שנכרת, עבור קיבוע זלוף. (ג) לב שהוזרק עם 3 מ ל של 10% של פוראלין פוספט באגירה עבור קיבעון הפרזיה של החיה. (ד) איברי הריבית שנקטפו ומסודרים בצלחת 12 היטב עבור דימות אופטי פלורסנט. (E) הלב נטען לתוך קלטת ומעובד באמצעות מעבד רקמות. (ו) לב המוטבע בפרפין. (ז) שמתי לב במיקרוטומה. (ח) שקופיות מסוימות בסדרה של חילופי פתרונות. (I) סעיפים הנטענים עם שמיכות באמצעות dapi. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תמונות מייצגות מאיברים שטופלו ושליטה. (א) איברים של עכבר שטופלו עם 10 מ"ג/ק"ג Ctp-cy 5.5. (ב) איברים מעכבר שליטה ללא מטופל. (ג) קוונפיקציה של קרינה פלואורסצנטית עבור כל קבוצה של איברים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: איברי העכבר מטופל התמונה על הפליטה עירור שונים גל כדי להדגים כיצד אורכי גל ארוכים יותר לייצר פלואורסצנטית אוטומטי פחות. (א) Cy7 -740-790. (ב) cy 5.5: 660-710. (ג) Cy5: 620-670. (ד) Cy3: 520-570. (E) egfp: 480-520. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: התמרה של הלב, הריאות, הכבד והכליה לאחר הזרקה בתוך ורידי עכברים. עכברים סוג פראי הוזרק עם 10 מ"ג/ק"ג של Cy 5.5-CTP, או פפטיד אקראית (RAN-Cy 5.5), ו מורדמים בנקודות הזמן המצוין. (א) שיא של רקמת הלב נראה ב 15 דקות עם ירידה יציבה בזריחה לאורך זמן. ספיגת נימים כמה היה ציין בריאות עם התמרה חזקה בכבד, כמו גם על נימי הכליה בכליות, האחרון רומז מנגנון כליות של הפרשה. (ב) כימות של עוצמת פלורסנט מראה באופן משמעותי ספיגת לב מוגברת של ctp-cy 5.5 מעל רן-cy 5.5. סרגל קנה מידה = 500 μm. דמות זו שונתה מ-Zahid ואח '8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
מודלים בעלי חיים חיוניים לפיתוח תרופות טרום-קלינית בכל שלב של התהליך מזיהוי של CPPs הרומן, לימודי biodistribution פצה, מנגנון התמרה, בסופו של דבר בדיקה ליעילות של המטען המועבר באמצעות הרומן הזה CPPs כמו וקטורים. ישנן שיטות רבות המשמשות בשימוש נפוץ כדי להעריך biodistribution פצה כגון היסטולוגיה, הדמיה גרעינית התרופה (הזהיר ו PET), ו vivo אופטי הדמיה12. שיטות הדמיה גרעינית יכול להיות מסורבל בשל הזמינות מוגבלת של בעלי חיים קטנים ומערכות לחיות מחמד, כמו גם את היכולת לייצר radiolabel-מחוות הסמים, אשר דורשים את המומחיות של רדיוכימאי. לעומת זאת, תוויות פלורסנט הם הרבה יותר פשוט והוא יכול להיות חסכוני לעבוד עם. הפרוטוקול המתואר במאמר זה מאפשר ניתוח מהיר של ביוהפצה באמצעות שיטות מרובות. Vivo Ex הדמיה האיבר האופטי האיברים מאפשר השוואה מיידית של זריחה על פני רקמות שונות וקבוצות טיפול והוא יכול לזהות ספיגת איברים וזמן כדי ספיגת שיא באיבר העניין באופן כמותי למחצה. היסטולוגיה רקמות כמותי דורש עיבוד נרחב יותר לטיפול, סעיף, תמונה, ולנתח רקמות, אבל זה מספק יותר נתונים על רמת מיקרוסקופיים והוא טכניקה סטנדרטית הנוכחי. כדאי לציין כי השוואה ישירה, כמותית על פני שתי טכניקות אינו אפשרי, משום שניתן לראות את האוטופלואורסצנטית עם כל טכניקה עבור איברים שונים ואורכי גל עירור משתנה באופן משמעותי.
חלק חשוב בפרוטוקול זה הוא בחירת fluorophore ימינה כדי תווית מועמד CPPs עבור ניסויים. בעיה פוטנציאלית אחת היא החפיפה של ספקטרום, אשר יכול להיות בעייתי כאשר fluorophores מרובים נחוצים. המדיה הפלואורסצנטית DAPI הרכבה ו-Cy 5.5 אין ספקטרום חופפים. עם זאת, עבור יישומים מסוימים שבו fluorophores מרובים נחוצים, הסיכון של חפיפה ספקטרלי צריך להיחשב בזהירות. בהתאם למערכת הנמצאת בשימוש, בחירת fluorophore עשויה להיות מוגבלת. לכן, הידע על יכולות המערכת הוא המפתח. פלורסנט מערכות אופטיות מנוצל הטוב ביותר עם fluorophores הרבה אדום או קרוב אינפרא אדום בשל ספיגת רקמות גבוהות של אורכי גל קצרים13. Fluorophores בטווח של חלבון פלורסנט ירוק משופר יש מגבלה גדולה, כי יש האיבר משמעותי מאוד autoפלואורסצנטי לראות את הגל שלה עירור, במיוחד במוח רקמת הכבד. בהתאם לתנאים של ניסוי, fluorophores כמה הם הטובים ביותר להימנע. כמה מסיסים במים fluorophores אורגני יש אינטראקציה חזקה עם bilayers השומנים, אשר יכול לגרום תוצאות חיוביות שווא. מכאן, נקיטת צעדים כדי לקבוע אם fluorophore יש זיקה חזקה לרקמת העניין הוא רצוי14. גורם נוסף לשקול הוא בחירת השיטה המתאימה של הקונפפור, אשר יכול להיות פרמטר חשוב המשפיע על התוצאות. ניתן לתייג את cpps באמצעות קשר כלשהו בין n-הטרמינוס של הפפטיד לבין קבוצת קרבוקסילי של הצבע כגון cy 5.5-בי. הטיפול צריך להילקח, כי מנגנון התמרה של רוב CPPs אינו מובן בפרוטרוט והקוניוגציה בקצה אחד עשויים להשפיע על מנגנון ספיגת יותר כך מאשר בקצה השני. אפשרות נוספת עבור תיוג CPPs היא דרך biotinylating N-טרמינוס עבור בניינים כדי fluorescently בתווית. באמצעות אסטרטגיה זו יש את הנוחות של מתן אפשרות שונים פלורסנט streptavidin השערים להיות מנוצל. עם זאת, מגבלה אפשרית של אסטרטגיה זו היא שקומפלקס ביוטין-streptavidin הוא מבנה גדול, שעלול להפריע להתמרה.
פלורסנט מערכות דימות אופטי הם אסטרטגיה יעילה ליצירת השוואה של זריחה על פני איברים שונים וטיפולים ביעילות אך אינם מסוגלים לייצר מידה כמותית של ריכוזים מוחלטים ברקמה. זאת בשל השפעות פיזור אור בתוך הרקמה, אשר מורכב עוד יותר על ידי מגוון טבעי בגדלים וצפיפויות רקמות, והבדלים ב vascularity עם פיזור משתנה של זריחה. הרקמה האוטומטית של רקמות יכול להיות גורם גם, בשל התרחשות טבעית מקורות ביוכימיים כגון קולגן, או מקורות תזונתיים כמו כלורופיל במזון13.
היסטולוגיה היא השיטה הנפוצה ביותר למדידת biodistribution והוא עלול לשמש כדי למדוד במדויק ולהשוות ספיגה בין רקמות שונות לאורך זמן. בעיות פיזור אור נמנעים באמצעות שיטה זו מכיוון שכל הרקמות מנות לעובי זהה15. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא היכולת לכלול מדבקות פלורסנט נוספות החותמות עבור אימונוהיסטוכימיה. למרות התוספת של fluorophore אחר יכול להפוך הדמיה מאתגרת יותר, השימוש בתוויות פלורסנט יכול להיות שימושי עבור לוקליזציה של CPP לתאי תאיים מסוימים, כמו lysosomes או המיטו,. ניתן להשתמש בנוגדן לניסוי מיקרוסקופ ממוקד כדי לקבוע אם המועמד העומד בפני מבנה CPP משתמש במבנה של עניין, שיכול להראות את הפוטנציאל של CPP כסוכן משלוחים. מגבלה אחת של שיטה זו היא כי הכנת שקופיות מדגימות איברים יכול לגזול זמן רב, עבודה אינטנסיבית, ונטייה לטעות אנוש12,15. כאשר שקופיות הדמיה, הטיפול צריך להילקח לא תמונה באותו מיקום יותר מדי זמן כדי למנוע הלבנת. Photobleaching לבנת חלק יהיה בלתי נמנע, בהתאם לרגישות של fluorophore. הטיפול צריך להילקח בכל שלב של פרוטוקול זה כדי להגן על דגימות מאור הסביבה ולאחסן אותם כראוי16. מומלץ לאחסן את השקופיות ב -4 ° c, מוגנות באור, להדמיה עתידית.
קיימות מגוון שיטות זמינות למדידת ההתפלגות הביומלית של מועמד CPP המחייב ציוד מיוחד והוא יכול להפיק תוצאות דומות, למרות שהם עשויים לדרוש תיוג מורכב יותר של CPP. הפרוטוקול המתואר במאמר זה משתמש בשתי שיטות תואמות כדי לייצר ביעילות נתוני הפצה ביולוגיים בהקשר של מערכת חיים, תוך מתן אפשרות לרכישת מידע מעמיק יותר אודות פפטיד הפנמה בתוך תאים מאותה דוגמית, ובכך לחתוך את מספר בעלי החיים הדרושים למחקר על ידי חצי. שיטות אלה שימשו להפקת הנתונים הנ ל, אשר מדגימים כי שתי השיטות יכולות להיות מנוצל באופן רציף באותה חיה, ואת איכות הנתונים שנוצרו על ידי כל אחד. התוצאות שלנו מדגישות גם את חוסר היכולת לתאם ישירות את התוצאות בין שתי הטכניקות באופן כמותי.
Disclosures
M.Z. ופול ד. רובינס (אוניברסיטת מינסוטה, מינסוטה, MN, ארה ב) להחזיק פטנט על השימוש של פפטיד מיקוד הלב כמו וקטור לב (לבלב ספציפי חלבון מיקוד התחום, U.S. פטנטים סדרתי No. 9,249,184). M.Z. משמש גם כקצין מדעי ראשי, והוא במועצת המנהלים של האתחול Vivasc Therapeutics Inc. והוא מחזיק הון עתידי משמעותי בו.
Acknowledgments
M.Z. ו K.S.F. נתמכים על ידי האמריקני האיגוד לפיתוח מדען הפרס 17SDG33411180, ועל ידי מענק הוענק תחת האתגר החדשנות פיט (קמצוץ®), באמצעות מכון המדע הקליני ו טרנסלtional באוניברסיטת פיטסבורג.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Buffered Formalin Phosphate | ThermoFisher | SF100-4 | |
| 10x Tris Buffered Saline (TBS) | ThermoFisher | BP2471-1 | |
| 12-well Cell Culture Plate | ThermoFisher | 353043 | |
| 1x TBS Solution | 10x TBS is diluted 1:10 with deionized water. This solution can be stored at room temperature. | ||
| 20 mL Scintillation Vials | Wheaton | 334173 | |
| 26G Needles | Becton Dickinson | 305110 | |
| 28G 0.5ml Insulin syringes | Becton Dickinson | 329461 | |
| 3mL Syringe | Becton Dickinson | 309657 | |
| CD1 Mice | Charles River | 022 | 6 to 12 week old albino, female mice |
| Cover Glass | ThermoFisher | 12-544-14 | |
| Cy5.5-CTP-amide | Prepared by peptide synthesis, conjugated with Cy5.5 fluorophore, and purified using HPLC. Lyophilized powder is reconstituted in DMSO at 10mM concentration. After reconstituting, store at -80 °C. | ||
| Dapi Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 99150-20 | |
| Ethanol | |||
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Ketamine HCl 100mg/mL | KetaVed | NDC 50989-161-06 | |
| Ketamine/Xylazine Solution | Ketamine HCl is mixed with Xylazine 1:1 to produce a stock solution containing 50mg/mL ketamine and 10mg/mL Xylazine. This solution is made fresh before each use. | ||
| Leica RM2235 Rotary Microtome | Leica | RM2235 | |
| Microscope Slides | ThermoFisher | B9992000TN | |
| Paraplast X-TRA | Sigma | P3808-1KG | |
| Perkin Elmer Lumina S5 IVIS | Perkin Elmer | CLS148588 | |
| Sparkle Optical Lens Cleaner | ThermoFisher | NC0090079 | |
| Tissue-Tek Processing/Embedding Cassettes | ThermoFisher | NC9499605 | |
| Tissue-Tek VIP Processing machine | Tissue-Tek | VIP 5A-F1 | |
| Xylazine 20 mg/mL | AnaSed | NDC 59399-110-20 | |
| Xylenes | ThermoFisher | X5-4 |
References
- Green, M., Loewenstein, P. M. Autonomous functional domains of chemically synthesized human immunodeficiency virus tat trans-activator protein. Cell. 55 (6), 1179-1188 (1988).
- Frankel, A. D., Pabo, C. O. Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus. Cell. 55 (6), 1189-1193 (1988).
- Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G., Prochiantz, A. The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. Journal of Biological Chemistry. 269 (14), 10444-10450 (1994).
- Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).
- Zahid, M., Robbins, P. D. Cell-type specific penetrating peptides: therapeutic promises and challenges. Molecules. 20 (7), 13055-13070 (2015).
- Zahid, M., Robbins, P. D. Identification and characterization of tissue-specific protein transduction domains using peptide phage display. Methods in Molecular Biology. 683, 277-289 (2011).
- Zahid, M., et al. Identification of a cardiac specific protein transduction domain by in vivo biopanning using a M13 phage peptide display library in mice. PLoS One. 5 (8), e12252 (2010).
- Zahid, M., et al. Cardiac Targeting Peptide, a Novel Cardiac Vector: Studies in Bio-Distribution, Imaging Application, and Mechanism of Transduction. Biomolecules. 8 (4), E147 (2018).
- Amblard, M., Fehrentz, J. A., Martinez, J., Subra, G. Methods and protocols of modern solid phase Peptide synthesis. Molecular Biotechnology. 33 (3), 239-254 (2006).
- Katritzky, A. R., Yoshioka, M., Narindoshvili, T., Chung, A., Johnson, J. V. Fluorescent labeling of peptides on solid phase. Organic and Biomolecular Chemistry. 6 (24), 4582-4586 (2008).
- Prabhala, B. K., Mirza, O., Hojrup, P., Hansen, P. R. Characterization of Synthetic Peptides by Mass Spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1348, 77-82 (2015).
- Arms, L., et al. Advantages and Limitations of Current Techniques for Analyzing the Biodistribution of Nanoparticles. Frontiers in Pharmacology. 9, 802 (2018).
- Leblond, F., Davis, S. C., Valdes, P. A., Pogue, B. W. Pre-clinical whole-body fluorescence imaging: Review of instruments, methods and applications. Journal of Photochemistry and Photobiology. 98 (1), 77-94 (2010).
- Hughes, L. D., Rawle, R. J., Boxer, S. G. Choose your label wisely: water-soluble fluorophores often interact with lipid bilayers. PLoS One. 9 (2), e87649 (2014).
- McGowan, J. W., Bidwell, G. L. 3rd The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules. Journal of Visualized Experiments. (118), e54987 (2016).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 185 (7), 1135-1148 (2009).
