Vi beskriver protokoller for å vurdere graden av transduksjon ved cellepenetrerende peptider ved hjelp av ex vivo-bildesystemer etterfulgt av parafininnebygging, snitting og konfidenscerende mikroskopi ved hjelp av hjertemålretting peptid som et eksempel. I vår protokoll kan et enkelt dyr brukes til å skaffe seg begge typer bildevurdering av de samme organene, og dermed kutte antall dyr som trengs for studier til det halve.
Siden den første beskrivelsen av proteintransduksjonsdomener, også kjent som cellegjennomtrengende peptider, for over 25 år siden, har det vært intens interesse for å utvikle disse peptidene, spesielt cellespesifikke, som nye vektorer for å levere diagnostiske og terapeutiske materialer. Vårt tidligere arbeid som involverer phage display identifisert en roman, nonnaturally forekommende, 12 aminosyre-lang peptid som vi kalte hjerte målretting peptid (CTP) på grunn av sin evne til å transduce normal hjertevev in vivo med topp opptak sett i så lite som 15 min etter en intravenøs injeksjon. Vi har gjennomført detaljerte biodistribusjonsstudier ved å injisere CTP merket med fluoroforecyanine5.5, slik at den kan sirkulere i ulike perioder, og euthanizing, fikse og snitting flere organer etterfulgt av fluorescerende mikroskopi avbildning. I denne publikasjonen beskriver vi disse prosessene samt ex vivo-avbildning av høstede organer ved hjelp av et in vivo-bildesystem i detalj. Vi tilbyr detaljerte metoder og praksiser for å gjennomføre transduction samt biodistribusjonsstudier ved hjelp av CTP som et eksempel.
Celleplasmamembranen er en halvgjennomtrengelig barriere som er avgjørende for celleintegritet og overlevelse og tjener til å regulere det indre av cellen ved å kontrollere bevegelse av stoffer inn i cellen. Selv om det er viktig for overlevelse, presenterer det også en barriere for levering av last til cellen. I 1988 ble transaktivatoren av transkripsjon (Tat) protein av humant immunsviktvirus vist å gå inn i kultiverte celler og fremme viral genuttrykk1,2, med domenene som er ansvarlige for denne transduction begrenset til en arginin og lysinrik 13-aminosyreregion av den tredje helixlix 3 Disse ble dermed kalt cellepenerasjons peptider (CPPs). Dette ble etterfulgt av forskning som viser evnen til Tat peptid å bære funksjonell β-galaktosidase i flere celletyper4. Siden den første beskrivelsen har antall cellepenetrerende peptider økt dramatisk. Disse transduksjondomenene er naturlig forekommende eller syntetiske korte peptider, vanligvis 6-20 aminosyrer lange, som er i stand til å bære funksjonelle laster på tvers av cellemembraner. Disse lastene kan variere fra andre små peptider, full-lengde proteiner, nukleinsyrer, nanopartikler, virale partikler, fluorescerende molekyler, og radioisotoper5. De første CPPs beskrevet var ikke cellespesifikke, med Tat blir tatt opp av flere celletyper og selv krysset blod-hjernebarrieren4, og dermed begrense det terapeutiske potensialet. For å identifisere cellespesifikke CPPer, har etterforskerne gjennomført phage-skjerm ved hjelp av store, kommersielt tilgjengelige phage biblioteker6. Vårt eget arbeid ved hjelp av en kombinatorial in vitro og in vivo phage display metodikk førte til identifisering av en CPP navngitt hjertemåling peptid (CTP)7, en 12-aminosyre, nonnaturally forekommende peptid (NH2-APWHLSSQYSRT-COOH) som retter seg mot hjertet med toppopptak på 15 min etter en perifer intravenøs injeksjon8. Ved hjelp av immunfluorescerende kolokalsisering med actin, en intracellulær markør, og utelukkelse av laminin, en cellemembran markør, viste vi at CTP er internalisert i mus kardiomyocytter etter en intravenøs injeksjon7. I tillegg inkuberte vi humaninduserte pluripotente stamcelleavledede bankdiomyocytter med dual-labeled CTP, merket med 6-karboksyfluorescein ved c-terminus og rhodamin ved sin N-terminus gjennom en ester kobling som bare kunne kleses av intracellulære esterases. Rask akkumulering av rhodamin til å slå kardiomyocytter ble observert innen 15 min på konfisk mikroskopi8.
I denne artikkelen presenterer vi to gratis metoder som kan brukes til å spore biodistribusjon og bekrefte vevsspesifikk internalisering av CPPer ved hjelp av CTP som et eksempel. For disse metodene ble CTP syntetisert, fluorescerende merket ved N-terminus med cyanine5,5 (CY5,5), og amide-caped på C-terminus for større peptid stabilitet. De to metodene som brukes er in vivo fluorescerende optiske bildesystemer og fluorescerende mikroskopi av vevsseksjoner. Begge metodene er svært nyttige for å studere biodistribusjon, opptak og eliminering av fluorescerende merkede CPPer. Fordelen med å vurdere biodistribusjon ved hjelp av disse metodene over andre, for eksempel enkeltfotoutslippstomografi (SPECT) eller positronutslippstomografi (PET), er at det ikke er behov for tidkrevende radiomerking av CPPs sammenlignet med fluorescerende merking, som er relativt enkelt og i rutinemessig bruk på alle peptidsynteseanlegg. Bruken av in vivo-avbildning produserer raskt biodistribusjonsdata i forbindelse med et levende system, mens snitting gir større inngående informasjon om peptidopptak og lokalisering i celler via bevaring av morfologiske detaljer. Denne protokollen kan brukes på et bredt spekter av organer og vev som hjerte, lunge, lever, nyre, hjerne, milt, mage, tykktarm, tynntarm, skjelettmuskulatur, bein, testiklene / eggstokkene, og øyne.
Dyremodeller er avgjørende for preklinisk legemiddelutvikling i alle faser av prosessen fra identifisering av nye CPPs, biodistribusjonsstudier, mekanisme for transduksjon, til slutt testing for effekt av den leverte lasten ved hjelp av disse nye CPPs som vektorer. Det er mange vanlige metoder tilgjengelig for å vurdere biodistribusjon som histologi, nukleærmedisin imaging (SPECT og PET), og in vivo optisk bildebehandling12. Kjernefysiske bildemetoder kan være tungvint på grunn av begrenset tilgjengelighet av små dyr SPECT og PET-systemer, samt evnen til å produsere radiolabel-narkotika konjugater, som krever ekspertisen til en radiokjemiker. I motsetning er fluorescerende etiketter mye enklere og kan være kostnadseffektive å jobbe med. Protokollen som er beskrevet i dette papiret gir rask analyse av biodistribusjon ved hjelp av flere metoder. Ex vivo hele organ fluorescerende optisk avbildning gjør det mulig for umiddelbar sammenligning av fluorescens på tvers av ulike vev og behandlingsgrupper og kan identifisere organopptak og tid til toppopptak i organ av interesse på en semikantitativ måte. Kvantitativ vevs histologi krever mer omfattende behandling for å behandle, seksjon, bilde og analysere vev, men det gir mer data på mikroskopisk nivå og er en gjeldende standardteknikk. Det er verdt å merke seg at direkte, kvantitativ sammenligning på tvers av de to teknikkene ikke er mulig, fordi autofluorescens sett med hver teknikk for forskjellige organer og eksitasjonsbølgelengder varierer betydelig.
En viktig del av denne protokollen er å velge riktig fluorophore å merke kandidat CPPs for eksperimenter. Et potensielt problem er spektra overlapping, noe som kan være problematisk når flere fluorofoer er nødvendig. DAPI fluorescerende monteringsmedier og Cy5.5 har ikke overlappende spektra. Men for visse applikasjoner der det er behov for flere fluorofoer, må risikoen for spektral overlapping vurderes nøye. Avhengig av systemet som brukes, kan fluorophore-valget være begrenset. Derfor er kunnskap om systemets evner nøkkelen. Fluorescerende optiske systemer utnyttes best med langt rødt eller nær-infrarødfluorofore på grunn av høy vevsabsorpsjon av kortere bølgelengder13. Fluorophores i området av forbedret grønn fluorescerende protein har en stor begrensning, fordi det er betydelig organ autofluorescens sett på eksitasjon bølgelengde, spesielt i hjernen og levervev. Avhengig av forholdene i et eksperiment, unngås noen fluoroforeer best. Noen vannløselige organiske fluorofofag har en sterk interaksjon med lipid bilayers, noe som kan forårsake falske positive. Derfor, tar skritt for å avgjøre om en fluorophore har sterk affinitet til vev av interesse er tilrådelig14. En annen faktor å vurdere er å velge riktig metode for fluorophore konjugering, som kan være en viktig parameter som påvirker resultatene. CpPs kan merkes fluorescerende ved N- eller C-terminus gjennom et kovalent bånd mellom N-terminus av peptid og carboxyl gruppen av fargestoff som Cy5.5-NHS. Forsiktighet bør utvises, fordi mekanismen for transduksjon av de fleste CPPs ikke forstås i detalj og bøyning i den ene enden kan påvirke opptaksmekanismen mer enn i den andre enden. En annen mulighet for merking av CPPs er gjennom biotinylating N-terminus for konjugering til fluorescerende merket streptavidin. Ved hjelp av denne strategien har bekvemmeligheten av å tillate ulike fluorescerende streptavidin konjugater som skal utnyttes. En mulig begrensning av denne strategien er imidlertid at et biotin-streptavidin kompleks er en stor konstruksjon, som potensielt kan forstyrre transduging.
Fluorescerende optiske bildesystemer er en effektiv strategi for å generere sammenligning av fluorescens på tvers av ulike organer og behandlinger effektivt, men er ute av stand til å produsere et kvantitativt mål på absolutte konsentrasjoner i vev. Dette skyldes lette spredningseffekter i vevet, som videre forverres av den naturlig forekommende variasjonen i vevsstørrelser og tettheter, og forskjeller i vascularity, med variabel fluorescensspredning. Vev autofluorescens kan være en faktor også, på grunn av naturlig forekommende biokjemiske kilder som kollagen, eller kosttilskudd kilder som klorofyll i mat13.
Histologi er den mest brukte metoden for å måle biodistribusjon og kan potensielt brukes til å måle og sammenligne opptak på tvers av forskjellige vev over tid. Lysspredningsproblemer unngås ved hjelp av denne metoden fordi alle vev er delt til sammetykkelse 15. En stor fordel med denne metoden er evnen til å inkludere flere fluorescerende etiketter postsectioning for immunohistochemistry. Selv om tillegg av en annen fluorophore kan gjøre avbildning mer utfordrende, kan bruk av fluorescerende etiketter være nyttig for lokalisering av en CPP til bestemte intracellulære rom, som lysosomer eller mitokondrier. Et antistoff kan brukes i et konfikalt mikroskopieksperiment for å avgjøre om en transdusert kandidat CPP colocalizes med en struktur av interesse, som kan vise potensialet til en CPP som en leveringsagent. En begrensning av denne metoden er at fremstilling av lysbilder fra organprøver kan være tidkrevende, arbeidsintensiv og utsatt for menneskelig feil12,15. Når bildelysbilder, bør det tas hensyn til å ikke bildee det samme stedet for lenge for å unngå fotobleking. Noen fotobleking vil være uunngåelig, avhengig av fluorophores følsomhet. Forsiktighet bør tas på hvert trinn i denne protokollen for å beskytte prøvene mot omgivelseslys og lagre dem riktig16. Vi anbefaler at lysbilder lagres ved 4 °C, lysbeskyttet, for fremtidig bildebehandling.
Det finnes en rekke metoder tilgjengelig for måling av biodistribusjon av en kandidat CPP som krever spesialisert utstyr og kan gi sammenlignbare resultater, selv om de kan kreve mer kompleks CPP merking. Protokollen som er beskrevet i dette papiret bruker to kompatible metoder for effektivt å produsere biodistribusjonsdata i sammenheng med et levende system, samtidig som det muliggjør oppkjøp av større inngående informasjon om peptid internalisering i celler fra samme prøve, og dermed kutte antall dyr som trengs for en studie med halvparten. Disse metodene ble brukt til å generere de ovennevnte dataene, som viser at begge metodene kan brukes sekvensielt i samme dyr, og kvaliteten på dataene som genereres av hver. Våre resultater fremhever også manglende evne til å direkte korrelere resultatene mellom de to teknikkene på en kvantitativ måte.
The authors have nothing to disclose.
M.Z. og K.S.F. støttes av American Heart Association Scientist Development Award 17SDG33411180, og av et stipend tildelt under Pitt Innovation Challenge (PInCh®), gjennom Clinical and Translational Science Institute ved University of Pittsburgh.
10% Buffered Formalin Phosphate | ThermoFisher | SF100-4 | |
10x Tris Buffered Saline (TBS) | ThermoFisher | BP2471-1 | |
12-well Cell Culture Plate | ThermoFisher | 353043 | |
1x TBS Solution | 10x TBS is diluted 1:10 with deionized water. This solution can be stored at room temperature. | ||
20 mL Scintillation Vials | Wheaton | 334173 | |
26G Needles | Becton Dickinson | 305110 | |
28G 0.5ml Insulin syringes | Becton Dickinson | 329461 | |
3mL Syringe | Becton Dickinson | 309657 | |
CD1 Mice | Charles River | 022 | 6 to 12 week old albino, female mice |
Cover Glass | ThermoFisher | 12-544-14 | |
Cy5.5-CTP-amide | Prepared by peptide synthesis, conjugated with Cy5.5 fluorophore, and purified using HPLC. Lyophilized powder is reconstituted in DMSO at 10mM concentration. After reconstituting, store at -80 °C. | ||
Dapi Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 99150-20 | |
Ethanol | |||
Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
Ketamine HCl 100mg/mL | KetaVed | NDC 50989-161-06 | |
Ketamine/Xylazine Solution | Ketamine HCl is mixed with Xylazine 1:1 to produce a stock solution containing 50mg/mL ketamine and 10mg/mL Xylazine. This solution is made fresh before each use. | ||
Leica RM2235 Rotary Microtome | Leica | RM2235 | |
Microscope Slides | ThermoFisher | B9992000TN | |
Paraplast X-TRA | Sigma | P3808-1KG | |
Perkin Elmer Lumina S5 IVIS | Perkin Elmer | CLS148588 | |
Sparkle Optical Lens Cleaner | ThermoFisher | NC0090079 | |
Tissue-Tek Processing/Embedding Cassettes | ThermoFisher | NC9499605 | |
Tissue-Tek VIP Processing machine | Tissue-Tek | VIP 5A-F1 | |
Xylazine 20 mg/mL | AnaSed | NDC 59399-110-20 | |
Xylenes | ThermoFisher | X5-4 |