Summary
Vi beskriver protokoller for å vurdere graden av transduksjon ved cellepenetrerende peptider ved hjelp av ex vivo-bildesystemer etterfulgt av parafininnebygging, snitting og konfidenscerende mikroskopi ved hjelp av hjertemålretting peptid som et eksempel. I vår protokoll kan et enkelt dyr brukes til å skaffe seg begge typer bildevurdering av de samme organene, og dermed kutte antall dyr som trengs for studier til det halve.
Abstract
Siden den første beskrivelsen av proteintransduksjonsdomener, også kjent som cellegjennomtrengende peptider, for over 25 år siden, har det vært intens interesse for å utvikle disse peptidene, spesielt cellespesifikke, som nye vektorer for å levere diagnostiske og terapeutiske materialer. Vårt tidligere arbeid som involverer phage display identifisert en roman, nonnaturally forekommende, 12 aminosyre-lang peptid som vi kalte hjerte målretting peptid (CTP) på grunn av sin evne til å transduce normal hjertevev in vivo med topp opptak sett i så lite som 15 min etter en intravenøs injeksjon. Vi har gjennomført detaljerte biodistribusjonsstudier ved å injisere CTP merket med fluoroforecyanine5.5, slik at den kan sirkulere i ulike perioder, og euthanizing, fikse og snitting flere organer etterfulgt av fluorescerende mikroskopi avbildning. I denne publikasjonen beskriver vi disse prosessene samt ex vivo-avbildning av høstede organer ved hjelp av et in vivo-bildesystem i detalj. Vi tilbyr detaljerte metoder og praksiser for å gjennomføre transduction samt biodistribusjonsstudier ved hjelp av CTP som et eksempel.
Introduction
Celleplasmamembranen er en halvgjennomtrengelig barriere som er avgjørende for celleintegritet og overlevelse og tjener til å regulere det indre av cellen ved å kontrollere bevegelse av stoffer inn i cellen. Selv om det er viktig for overlevelse, presenterer det også en barriere for levering av last til cellen. I 1988 ble transaktivatoren av transkripsjon (Tat) protein av humant immunsviktvirus vist å gå inn i kultiverte celler og fremme viral genuttrykk1,2, med domenene som er ansvarlige for denne transduction begrenset til en arginin og lysinrik 13-aminosyreregion av den tredje helixlix 3 Disse ble dermed kalt cellepenerasjons peptider (CPPs). Dette ble etterfulgt av forskning som viser evnen til Tat peptid å bære funksjonell β-galaktosidase i flere celletyper4. Siden den første beskrivelsen har antall cellepenetrerende peptider økt dramatisk. Disse transduksjondomenene er naturlig forekommende eller syntetiske korte peptider, vanligvis 6-20 aminosyrer lange, som er i stand til å bære funksjonelle laster på tvers av cellemembraner. Disse lastene kan variere fra andre små peptider, full-lengde proteiner, nukleinsyrer, nanopartikler, virale partikler, fluorescerende molekyler, og radioisotoper5. De første CPPs beskrevet var ikke cellespesifikke, med Tat blir tatt opp av flere celletyper og selv krysset blod-hjernebarrieren4, og dermed begrense det terapeutiske potensialet. For å identifisere cellespesifikke CPPer, har etterforskerne gjennomført phage-skjerm ved hjelp av store, kommersielt tilgjengelige phage biblioteker6. Vårt eget arbeid ved hjelp av en kombinatorial in vitro og in vivo phage display metodikk førte til identifisering av en CPP navngitt hjertemåling peptid (CTP)7, en 12-aminosyre, nonnaturally forekommende peptid (NH2-APWHLSSQYSRT-COOH) som retter seg mot hjertet med toppopptak på 15 min etter en perifer intravenøs injeksjon8. Ved hjelp av immunfluorescerende kolokalsisering med actin, en intracellulær markør, og utelukkelse av laminin, en cellemembran markør, viste vi at CTP er internalisert i mus kardiomyocytter etter en intravenøs injeksjon7. I tillegg inkuberte vi humaninduserte pluripotente stamcelleavledede bankdiomyocytter med dual-labeled CTP, merket med 6-karboksyfluorescein ved c-terminus og rhodamin ved sin N-terminus gjennom en ester kobling som bare kunne kleses av intracellulære esterases. Rask akkumulering av rhodamin til å slå kardiomyocytter ble observert innen 15 min på konfisk mikroskopi8.
I denne artikkelen presenterer vi to gratis metoder som kan brukes til å spore biodistribusjon og bekrefte vevsspesifikk internalisering av CPPer ved hjelp av CTP som et eksempel. For disse metodene ble CTP syntetisert, fluorescerende merket ved N-terminus med cyanine5,5 (CY5,5), og amide-caped på C-terminus for større peptid stabilitet. De to metodene som brukes er in vivo fluorescerende optiske bildesystemer og fluorescerende mikroskopi av vevsseksjoner. Begge metodene er svært nyttige for å studere biodistribusjon, opptak og eliminering av fluorescerende merkede CPPer. Fordelen med å vurdere biodistribusjon ved hjelp av disse metodene over andre, for eksempel enkeltfotoutslippstomografi (SPECT) eller positronutslippstomografi (PET), er at det ikke er behov for tidkrevende radiomerking av CPPs sammenlignet med fluorescerende merking, som er relativt enkelt og i rutinemessig bruk på alle peptidsynteseanlegg. Bruken av in vivo-avbildning produserer raskt biodistribusjonsdata i forbindelse med et levende system, mens snitting gir større inngående informasjon om peptidopptak og lokalisering i celler via bevaring av morfologiske detaljer. Denne protokollen kan brukes på et bredt spekter av organer og vev som hjerte, lunge, lever, nyre, hjerne, milt, mage, tykktarm, tynntarm, skjelettmuskulatur, bein, testiklene / eggstokkene, og øyne.
Protocol
University of Pittsburgh's Institutional Animal Care and Use Committee godkjente alle dyreprotokoller som er spesifisert i denne publikasjonen før de gjennomførte noen av disse dyreforsøkene.
MERK: Denne protokollen beskriver hvordan du utfører ex vivo biodistribusjonsstudier ved hjelp av ex vivo optisk fluorescerende avbildning etterfulgt av in vivo biodistribusjonsstudier ved å bygge inn organene i parafin, snitting og utføre fluorescerende mikroskopi. Selv om CTP brukes som et eksempel, kan denne metoden brukes på alle fluorescerende merkede CPP.
1. In vivo-bildebehandling
- Syntese CTP ved bruk av synteseteknikker for fast fase9,10 fra et peptidsynteseanlegg ved hjelp av L-aminosyrer med n-terminus merket med Cy5.5 og C-terminus amide-capped for økt stabilitet.
MERK: Alle syntetiserte CPPer bør karakteriseres ved hjelp av høyytelses flytende kromatografi (HPLC) og/eller matrixassistert laserdesorpsjon/ionisering (MALDI) før bruk11. - Lag en 1 mM eller 10 mM lagerløsning av CTP i dimetylsulfoksid (DMSO), aliquot og oppbevares ved -80 °C, lysbeskyttet.
MERK: Peptider leveres som lyofilisert pulver. Lyofilisert pulver kan lagres langsiktig (6 måneder-2 år) i -20 °C, lysbeskyttet og under hygroskopiske forhold. Når aliquoted i DMSO og lagret, fryse-tine sykluser bør unngås. - Veie og bedøve 6 uker gamle CD1 hunnmus ved hjelp av 2 μL/g vevsvekt av en ketamin/xylazineoppløsning (100 mg/kg ketamin og 20 mg/kg xylazin) administrert intramuskulært (bakben) eller intraperitonealt (nedre venstre kvadrant).
MERK: Ketamin/xylazineløsninger skal gjøres friske på bruksdagen. Ubrukt ketamin/xylazin skal kastes riktig og volumer som brukes kontra kassert volum som kastes i en logg, da ketamin er et kontrollert stoff. Tilstrekkelig nivå av anestesi vil bli oppnådd i 5-7 min, som vurdert av mangel på respons på en tå klype. - Beregn en dose på 10 mg/kg cy5,5-CTP, fortynn med fosfatbufret saltvann (PBS) til ikke mer enn 200 μL, og injiser enten retro-orbitalt eller gjennom haleveneinjeksjon ved hjelp av en insulinsprøyte (figur 1A).
- La peptid sirkulere for prespecified tid, alt fra 15 min-6 h.
- Euthanize musen ved hjelp av høy CO2 inhalasjonsmetode som spesifisert av Institutional Animal Care and Use Committee og åpne brysthulen ved hjelp av saks (Figur 1B).
- Bruk saks til å plassere et lite nick i sideveis, fri vegg av høyre atrium og injisere 3 ml av 10% bufret formalin fosfat ved hjelp av en 26 G nål for det doble formålet med perfusjon fikse organene i musen og skylle ut røde blodlegemer (Figur 1C).
- Dissekere ut hjerte, lunge, lever, nyrer, milt, tykktarm, tynntarm, blære, eggstokkene / testiklene, og hjernen og plassere i individuelle brønner av en 12 brønnplate for ex vivo optisk avbildning (Figur 1D).
- Start programvaren for bildeinnhenting, og klikk på Initialiser-knappen for å klargjøre systemet for bildeprøver. Åpne bildebehandlingsveiviseren, velg fluorescens, filtrer deretter paret, og velg deretter Cy5.5-fargestoffet fra listen over fargestoffer for å bruke 580 nm eksitasjon og 620 nm-utslippsfiltre. Velg manuelle innstillinger for eksponeringsparametere, sett deretter faseposisjonen til B, angi eksponeringstid til 1 sekund, sett F/stop til 8, og sett hyllen til liten.
MERK: Eksitasjonsutslippsfiltrene varierer avhengig av etiketten som brukes. Eksitasjon og utslipp av etiketten som brukes kan angis manuelt for programvaren for å tildele eksitasjon og utslippsfiltre. Sørg for at tellingene er mellom 600-60 000 for å unngå metning. Avhengig av systemet som brukes, kan automatisk anskaffelsesoptimalisering være tilgjengelig. Hvis systemet har kompensasjon for å sammenligne bilder som er anskaffet med forskjellige innstillinger, kan de automatiske innstillingene brukes. Hvis ingen kompensasjon er tilgjengelig, må innstillingene bestemmes, lagres og brukes konsekvent på tvers av prøver. - Når systemet er helt initialisert, ordne organene av interesse i en 12 brønnplate og plasser den inne i det optiske bildekammeret, slik at prøvene er ordnet som ønsket for bildene. Velg anskaffe, og velg deretter en lagringssted for bildene. Informasjon om musen kan skrives inn i popup-vinduet for redigeringsbildeetiketter.
- Etter avbildning, fjern prøvene fra kammeret og lagre i 10% bufret formalinfosfat i et volum som er minst 20 ganger volumet av vevet i scintillation hetteglass med lysbeskyttelse ved romtemperatur (RT).
- Kvantifiser bildene ved å sette enheter til Radiant Effektivitet og deretter velge 4x3 ROI og justere for å passe hver brønn inn i en firkant av avkastningen jevnt, etterfulgt av å klikke mål. Åpne kategorien rutenettavkastningsmålinger, velg eksport, og lagre målingene som en CVS-fil.
2. Histologi
MERK: Følg trinn 1.1−1.8 for å få ulike organer. Alternativt kan de samme organene som ble avbildet plasseres i formalin umiddelbart og brukes til snitting som beskrevet nedenfor.
- Oppbevar hvert organ individuelt i 10 % bufret formalifosfat i minst 48 timer før behandling for histologi.
- Når organene er tilstrekkelig festet etter 48 timer, overfør organene til vevsbehandling og innebygging av kassetter og plasser inn i en vevsbehandlingsmaskin (figur 1E).
- Sett behandlingsmaskinen til å dehydrere vevet i 70% etanol i 30 min, etterfulgt av 80% etanol i 30 min, 95% etanol i 30 min, 95% etanol i 30 min, 100% etanol i 15 min, 100% etanol i 20 min, og til slutt 100% etanol i 20 min.
- Fjern vevet i xylen 2x, med 30 min for hver xylen behandling.
- Infiltrer det ryddet vevet med parafinvoks 4x ved 60 °C i 30 min ved hver behandling.
- Bygg inn i parafin ved hjelp av metallformer. Fyll formen med smeltet parafin (oppbevart ved 65 °C), og overfør til en kald plate. Når parafinen nederst i formen begynner å stivne, plasserer du orgelet i parafinen (figur 1F).
- Plasser en merket kassett på toppen av formen som en backing og overfyll med smeltet parafin. La det avkjøles til det er fast. Lagre deretter blokken i en -20 °C fryser over natten, slik at voksen kan krympe ytterligere for enkel fjerning fra formene.
MERK: Blokkene kan nå lagres ved RT med lysbeskyttelse. - Forbered et vannbad på 38 °C med destillert vann. Sett opp mikrotomen med en bladvinkel på 6° og en seksjonstykkelse på 10 μm.
- Monter vevsblokkene i mikrotomen og begynn å kutte til seksjoner som inneholder vev oppnås. Plasser deretter blokkene med forsiden ned i vannet i 5 min eller til vevet har absorbert litt fuktighet (f.eks. når en tynn hvit omriss av vevet vises i blokken [Figur 1G]).
MERK: Bladet må skiftes ut ofte for å sikre kvaliteten på seksjonene. - Plasser vevet på en flat isblokk i 10 min, og returner det deretter til mikrotomen i samme retning som i trinn 2.9. Begynn å ta inndelinger og la avkortede inndelinger danne lange bånd med 6−10-seksjoner hver. Kast suboptimale parafinbånd til et bånd av høy kvalitet av tilstrekkelig lengde til å dekke et lysbilde produseres. Optimaliser snitting ved å justere skjærehastigheter, vevsfuktighet og vannbadtemperatur for å unngå klipping eller rynker av vevsseksjonene.
MERK: Seksjoner som har hull der vev falt ut, rips i vevet, eller stramme rynker og folder i vevet bør kastes. - Velg forsiktig kvalitetsbåndet av valget med stumpe kant tang og flyte på overflaten av 38 ° C vannbad. La seksjonene sitte på overflaten til de glatter ut, og pass på å ikke la dem være for lange for å hindre at parafinen går i oppløsning og seksjonen fra hverandre.
- Flyte de flate delene på overflaten av rene glasslysbilder. Plasser lysbildene i en 65 °C ovn i 30 min for å smelte voksen.
MERK: Disse lysbildene kan lagres ved RT med lysbeskyttelse. - Deparaffinis lysbildene i xylen 3x, 10 min for hver behandling.
- Rehydrere vevet i 100% etanol i 5 min, etterfulgt av 95% etanol i 5 min, 70% etanol i 5 min, 50% etanol i 5 min, og til slutt 1x tris-bufret saltvann (TBS) i 5 min (Figur 1H). La lysbildene tørke over natten.
MERK: Disse lysbildene kan lagres på lang sikt ved RT så lenge de er lysbeskyttet. - Monter lysbildene med dekkslips ved hjelp av 125 μL monteringsmedier som inneholder 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI), en kjernefysisk fluorescerende sonde (figur 1I). Tørre lysbilder over natten ved RT, lysbeskyttet.
MERK: Tørkede lysbilder kan lagres på lang sikt ved 4 °C, lysbeskyttet. - Bildelysbilder ved hjelp av fluorescerende mikroskopi.
MERK: Mettede bilder bør unngås, da de ikke er kvantitativt nyttige. Justering av eksponerings- og forsterkningsinnstillingene kan senkes for å unngå metning. Pass på at du bruker de samme innstillingene på tvers av prøvene som sammenlignes. Unngå bleking av vevet ved å begrense eksponeringstidene.
Representative Results
Ved hjelp av denne protokollen behandlet vi tre mus med en dose på 10 mg/kg Cy5,5-CTP gjennom en retro-orbital injeksjon (figur 1A). Etter at peptidet kunne sirkulere i 15 min, ble musene eutanisert ved hjelp av et CO2-kammer, brystet åpnet gjennom et median sternotomy snitt, høyre atrium ble hakket, og musene perfusjon fast ved hjelp av 3 ml 10% fosfatbufret formalin (figur 1B,C). Etter fiksering ble hjertet, lungene, leveren, nyrene, milten og hjernen dissekert ut og arrangert i en 12 brønnplate for ex vivo optisk fluorescerende avbildning (figur 1D og figur 2A). Tre kontrollmus uten injeksjoner ble også perfundert, dissekert og avbildet (Figur 1B−D og figur 2B). Fluorescensdataene som er innhentet for hvert sett med organer, kan sammenlignes på grunn av at antallet konverteres til strålende effektivitet, den relative fluorescensenheten til bildeprogramvaren. Disse dataene kan kvantifiseres for å gi både kvalitative bilder og kvantitative data for hvert organ i spørsmålet (figur 2C) på tvers av ulike tidspunkter for biodistribusjonsstudier. Autofluorescensen til forskjellige organer som svar på ulike eksitasjonsbølgelengder er vist i figur 3A−E. Kortere eksitasjonsbølgelengder, som forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP), er forbundet med høyere autofluorescens, spesielt i lever og hjerne, enn langt rødt (Cy5.5) eller nær infrarød (Cy7) eksitasjon bølgelengder (Figur 3). De avbildede organene ble festet i 10% fosfat bufret formalin ved RT i minst 48 timer, etterfulgt av en overføring til vevsbehandling og innebygging av kassetter (figur 1E). Organene ble behandlet og paraffinisert i en vevsbehandlingsmaskin, plassert i former fylt med parafin, frosset på et -20 °C stadium og lagret over natten ved -20 °C (figur 1F). Prøvene ble delt inn (figur 1G) og behandlet med løsningsutveksling for å rehydrere vevet (figur 1H). De forberedte lysbildene ble deretter montert med DAPI fluorescerende monteringsmedium (figur 1I). Når de var tørre, vanligvis over natten, ble lysbildene avbildet ved hjelp av fluorescerende mikroskopi. Representative bilder av hvert organ fra en mus vises i figur 4A. Bildene fra forskjellige organer ble anskaffet ved hjelp av identiske innstillinger for å tillate sammenligning på tvers av mus, og for å tillate kvantifisering (figur 4B).
Figur 1: Høsting av museorganer for ex vivo optisk fluorescerende avbildning og snitting. (A)Wild type mus injisert retro-orbitally med CTP-Cy5.5. (B)Mus dissekert med brystet åpnet, høyre atrium snipped, for perfusjon fiksering. (C) Hjerteinjisert med 3 ml 10 % bufret formalofosfat for perfusjonsfiksering av dyret. (D) Organer av interesse høstet og arrangert i en 12 brønnplate for fluorescerende optisk bildebehandling. (E)Hjerte lastet inn i en kassett og behandlet ved hjelp av en vevsprosessor. (F)Hjerte innebygd i parafin. (G)Hjerte seksjonert på en mikrotom. (H) Lysbilder avparaffinert gjennom en rekke løsningsutvekslinger. (I)Seksjoner montert med dekkslips ved hjelp av DAPI. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Representative bilder fra behandlede og kontrollere organer. (A) Organer fra en mus behandlet med 10 mg / kg CTP-Cy5,5. (B)Organer fra en ubehandlet kontrollmus. (C) Kvantifisering av fluorescens for hvert sett med organer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Ubehandlede museorganer avbildet ved forskjellige eksitasjonsutslippsbølgelengder for å demonstrere hvordan lengre bølgelengder gir mindre autofluorescens. (A) Cy7: 740−790. (B) Cy5.5: 660−710. (C) Cy5: 620-670. (D) Cy3: 520−570. (E) EGFP: 480-520. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Transduksjon av hjerte, lunge, lever og nyre etter intravenøs injeksjon hos mus. Wild type mus ble injisert med 10 mg/kg Cy5,5-CTP, eller et tilfeldig peptid (RAN-Cy5.5), og eutanisert på de angitte tidspunktene. (A)Peak transduction av hjertevev ble sett ved 15 min med jevn reduksjon i fluorescens over tid. Noen kapillæropptak ble notert i lungene med robust transduction i leveren samt ved nyreglomerulære kapillærer, sistnevnte antyder en nyremekanisme for utskillelse. (B) Kvantifisering av fluorescerende intensitet viser signifikant økt hjerteopptak av CTP-Cy5.5 over RAN-Cy5.5. Skala bar = 500 μm. Dette tallet er endret fra Zahid et al.8. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Dyremodeller er avgjørende for preklinisk legemiddelutvikling i alle faser av prosessen fra identifisering av nye CPPs, biodistribusjonsstudier, mekanisme for transduksjon, til slutt testing for effekt av den leverte lasten ved hjelp av disse nye CPPs som vektorer. Det er mange vanlige metoder tilgjengelig for å vurdere biodistribusjon som histologi, nukleærmedisin imaging (SPECT og PET), og in vivo optisk bildebehandling12. Kjernefysiske bildemetoder kan være tungvint på grunn av begrenset tilgjengelighet av små dyr SPECT og PET-systemer, samt evnen til å produsere radiolabel-narkotika konjugater, som krever ekspertisen til en radiokjemiker. I motsetning er fluorescerende etiketter mye enklere og kan være kostnadseffektive å jobbe med. Protokollen som er beskrevet i dette papiret gir rask analyse av biodistribusjon ved hjelp av flere metoder. Ex vivo hele organ fluorescerende optisk avbildning gjør det mulig for umiddelbar sammenligning av fluorescens på tvers av ulike vev og behandlingsgrupper og kan identifisere organopptak og tid til toppopptak i organ av interesse på en semikantitativ måte. Kvantitativ vevs histologi krever mer omfattende behandling for å behandle, seksjon, bilde og analysere vev, men det gir mer data på mikroskopisk nivå og er en gjeldende standardteknikk. Det er verdt å merke seg at direkte, kvantitativ sammenligning på tvers av de to teknikkene ikke er mulig, fordi autofluorescens sett med hver teknikk for forskjellige organer og eksitasjonsbølgelengder varierer betydelig.
En viktig del av denne protokollen er å velge riktig fluorophore å merke kandidat CPPs for eksperimenter. Et potensielt problem er spektra overlapping, noe som kan være problematisk når flere fluorofoer er nødvendig. DAPI fluorescerende monteringsmedier og Cy5.5 har ikke overlappende spektra. Men for visse applikasjoner der det er behov for flere fluorofoer, må risikoen for spektral overlapping vurderes nøye. Avhengig av systemet som brukes, kan fluorophore-valget være begrenset. Derfor er kunnskap om systemets evner nøkkelen. Fluorescerende optiske systemer utnyttes best med langt rødt eller nær-infrarødfluorofore på grunn av høy vevsabsorpsjon av kortere bølgelengder13. Fluorophores i området av forbedret grønn fluorescerende protein har en stor begrensning, fordi det er betydelig organ autofluorescens sett på eksitasjon bølgelengde, spesielt i hjernen og levervev. Avhengig av forholdene i et eksperiment, unngås noen fluoroforeer best. Noen vannløselige organiske fluorofofag har en sterk interaksjon med lipid bilayers, noe som kan forårsake falske positive. Derfor, tar skritt for å avgjøre om en fluorophore har sterk affinitet til vev av interesse er tilrådelig14. En annen faktor å vurdere er å velge riktig metode for fluorophore konjugering, som kan være en viktig parameter som påvirker resultatene. CpPs kan merkes fluorescerende ved N- eller C-terminus gjennom et kovalent bånd mellom N-terminus av peptid og carboxyl gruppen av fargestoff som Cy5.5-NHS. Forsiktighet bør utvises, fordi mekanismen for transduksjon av de fleste CPPs ikke forstås i detalj og bøyning i den ene enden kan påvirke opptaksmekanismen mer enn i den andre enden. En annen mulighet for merking av CPPs er gjennom biotinylating N-terminus for konjugering til fluorescerende merket streptavidin. Ved hjelp av denne strategien har bekvemmeligheten av å tillate ulike fluorescerende streptavidin konjugater som skal utnyttes. En mulig begrensning av denne strategien er imidlertid at et biotin-streptavidin kompleks er en stor konstruksjon, som potensielt kan forstyrre transduging.
Fluorescerende optiske bildesystemer er en effektiv strategi for å generere sammenligning av fluorescens på tvers av ulike organer og behandlinger effektivt, men er ute av stand til å produsere et kvantitativt mål på absolutte konsentrasjoner i vev. Dette skyldes lette spredningseffekter i vevet, som videre forverres av den naturlig forekommende variasjonen i vevsstørrelser og tettheter, og forskjeller i vascularity, med variabel fluorescensspredning. Vev autofluorescens kan være en faktor også, på grunn av naturlig forekommende biokjemiske kilder som kollagen, eller kosttilskudd kilder som klorofyll i mat13.
Histologi er den mest brukte metoden for å måle biodistribusjon og kan potensielt brukes til å måle og sammenligne opptak på tvers av forskjellige vev over tid. Lysspredningsproblemer unngås ved hjelp av denne metoden fordi alle vev er delt til sammetykkelse 15. En stor fordel med denne metoden er evnen til å inkludere flere fluorescerende etiketter postsectioning for immunohistochemistry. Selv om tillegg av en annen fluorophore kan gjøre avbildning mer utfordrende, kan bruk av fluorescerende etiketter være nyttig for lokalisering av en CPP til bestemte intracellulære rom, som lysosomer eller mitokondrier. Et antistoff kan brukes i et konfikalt mikroskopieksperiment for å avgjøre om en transdusert kandidat CPP colocalizes med en struktur av interesse, som kan vise potensialet til en CPP som en leveringsagent. En begrensning av denne metoden er at fremstilling av lysbilder fra organprøver kan være tidkrevende, arbeidsintensiv og utsatt for menneskelig feil12,15. Når bildelysbilder, bør det tas hensyn til å ikke bildee det samme stedet for lenge for å unngå fotobleking. Noen fotobleking vil være uunngåelig, avhengig av fluorophores følsomhet. Forsiktighet bør tas på hvert trinn i denne protokollen for å beskytte prøvene mot omgivelseslys og lagre dem riktig16. Vi anbefaler at lysbilder lagres ved 4 °C, lysbeskyttet, for fremtidig bildebehandling.
Det finnes en rekke metoder tilgjengelig for måling av biodistribusjon av en kandidat CPP som krever spesialisert utstyr og kan gi sammenlignbare resultater, selv om de kan kreve mer kompleks CPP merking. Protokollen som er beskrevet i dette papiret bruker to kompatible metoder for effektivt å produsere biodistribusjonsdata i sammenheng med et levende system, samtidig som det muliggjør oppkjøp av større inngående informasjon om peptid internalisering i celler fra samme prøve, og dermed kutte antall dyr som trengs for en studie med halvparten. Disse metodene ble brukt til å generere de ovennevnte dataene, som viser at begge metodene kan brukes sekvensielt i samme dyr, og kvaliteten på dataene som genereres av hver. Våre resultater fremhever også manglende evne til å direkte korrelere resultatene mellom de to teknikkene på en kvantitativ måte.
Disclosures
M.Z. og Paul D. Robbins (University of Minnesota, Minnesota, MN, USA) holder et patent på bruk av hjertemålretting peptid som en hjertevektor (Cardiac-spesifikk protein målretting domene, US Patent Serial No. 9,249,184). M.Z. fungerer også som chief scientific officer og sitter i styret i oppstarten Vivasc Therapeutics Inc. og har betydelig fremtidig egenkapital i den.
Acknowledgments
M.Z. og K.S.F. støttes av American Heart Association Scientist Development Award 17SDG33411180, og av et stipend tildelt under Pitt Innovation Challenge (PInCh®), gjennom Clinical and Translational Science Institute ved University of Pittsburgh.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Buffered Formalin Phosphate | ThermoFisher | SF100-4 | |
| 10x Tris Buffered Saline (TBS) | ThermoFisher | BP2471-1 | |
| 12-well Cell Culture Plate | ThermoFisher | 353043 | |
| 1x TBS Solution | 10x TBS is diluted 1:10 with deionized water. This solution can be stored at room temperature. | ||
| 20 mL Scintillation Vials | Wheaton | 334173 | |
| 26G Needles | Becton Dickinson | 305110 | |
| 28G 0.5ml Insulin syringes | Becton Dickinson | 329461 | |
| 3mL Syringe | Becton Dickinson | 309657 | |
| CD1 Mice | Charles River | 022 | 6 to 12 week old albino, female mice |
| Cover Glass | ThermoFisher | 12-544-14 | |
| Cy5.5-CTP-amide | Prepared by peptide synthesis, conjugated with Cy5.5 fluorophore, and purified using HPLC. Lyophilized powder is reconstituted in DMSO at 10mM concentration. After reconstituting, store at -80 °C. | ||
| Dapi Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 99150-20 | |
| Ethanol | |||
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Ketamine HCl 100mg/mL | KetaVed | NDC 50989-161-06 | |
| Ketamine/Xylazine Solution | Ketamine HCl is mixed with Xylazine 1:1 to produce a stock solution containing 50mg/mL ketamine and 10mg/mL Xylazine. This solution is made fresh before each use. | ||
| Leica RM2235 Rotary Microtome | Leica | RM2235 | |
| Microscope Slides | ThermoFisher | B9992000TN | |
| Paraplast X-TRA | Sigma | P3808-1KG | |
| Perkin Elmer Lumina S5 IVIS | Perkin Elmer | CLS148588 | |
| Sparkle Optical Lens Cleaner | ThermoFisher | NC0090079 | |
| Tissue-Tek Processing/Embedding Cassettes | ThermoFisher | NC9499605 | |
| Tissue-Tek VIP Processing machine | Tissue-Tek | VIP 5A-F1 | |
| Xylazine 20 mg/mL | AnaSed | NDC 59399-110-20 | |
| Xylenes | ThermoFisher | X5-4 |
References
- Green, M., Loewenstein, P. M. Autonomous functional domains of chemically synthesized human immunodeficiency virus tat trans-activator protein. Cell. 55 (6), 1179-1188 (1988).
- Frankel, A. D., Pabo, C. O. Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus. Cell. 55 (6), 1189-1193 (1988).
- Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G., Prochiantz, A. The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. Journal of Biological Chemistry. 269 (14), 10444-10450 (1994).
- Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).
- Zahid, M., Robbins, P. D. Cell-type specific penetrating peptides: therapeutic promises and challenges. Molecules. 20 (7), 13055-13070 (2015).
- Zahid, M., Robbins, P. D. Identification and characterization of tissue-specific protein transduction domains using peptide phage display. Methods in Molecular Biology. 683, 277-289 (2011).
- Zahid, M., et al. Identification of a cardiac specific protein transduction domain by in vivo biopanning using a M13 phage peptide display library in mice. PLoS One. 5 (8), e12252 (2010).
- Zahid, M., et al. Cardiac Targeting Peptide, a Novel Cardiac Vector: Studies in Bio-Distribution, Imaging Application, and Mechanism of Transduction. Biomolecules. 8 (4), E147 (2018).
- Amblard, M., Fehrentz, J. A., Martinez, J., Subra, G. Methods and protocols of modern solid phase Peptide synthesis. Molecular Biotechnology. 33 (3), 239-254 (2006).
- Katritzky, A. R., Yoshioka, M., Narindoshvili, T., Chung, A., Johnson, J. V. Fluorescent labeling of peptides on solid phase. Organic and Biomolecular Chemistry. 6 (24), 4582-4586 (2008).
- Prabhala, B. K., Mirza, O., Hojrup, P., Hansen, P. R. Characterization of Synthetic Peptides by Mass Spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1348, 77-82 (2015).
- Arms, L., et al. Advantages and Limitations of Current Techniques for Analyzing the Biodistribution of Nanoparticles. Frontiers in Pharmacology. 9, 802 (2018).
- Leblond, F., Davis, S. C., Valdes, P. A., Pogue, B. W. Pre-clinical whole-body fluorescence imaging: Review of instruments, methods and applications. Journal of Photochemistry and Photobiology. 98 (1), 77-94 (2010).
- Hughes, L. D., Rawle, R. J., Boxer, S. G. Choose your label wisely: water-soluble fluorophores often interact with lipid bilayers. PLoS One. 9 (2), e87649 (2014).
- McGowan, J. W., Bidwell, G. L. 3rd The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules. Journal of Visualized Experiments. (118), e54987 (2016).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 185 (7), 1135-1148 (2009).
