Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

3D-modellering af dendritiske pigge med synaptisk plasticitet

Published: May 18, 2020 doi: 10.3791/60896
Automatic Translation
*1, *1
1Center for Mathematics, Computation and Cognition, Federal University of ABC
* These authors contributed equally

Summary

Protokollen udvikler en tre-dimensionel (3D) model af en dendritisk segment med dendritiske pigge til modellering synaptisk plasticitet. Den konstruerede mesh kan bruges til beregningsmæssige modellering af AMPA receptor handel i den langsigtede synaptiske plasticitet ved hjælp af softwareprogrammet Blender med CellBlender og MCell.

Abstract

Beregningsmodellering af diffusion og reaktion af kemiske arter i en tredimensionel (3D) geometri er en grundlæggende metode til at forstå mekanismerne i synaptisk plasticitet i dendritiske pigge. I denne protokol er den detaljerede 3D-struktur af dendritter og dendritiske pigge modelleret med masker på softwaren Blender med CellBlender. De synaptiske og ekstrasynaptiske områder er defineret på masken. Dernæst er synaptaceptoren og synaptiske ankermolekyler defineret med deres diffusionskonstanter. Endelig er de kemiske reaktioner mellem synaptiske receptorer og synaptiske ankre inkluderet, og beregningsmodellen løses numerisk med softwaren MCell. Denne metode beskriver den spatiotemporale sti for hvert enkelt molekyle i en 3D geometrisk struktur. Det er derfor meget nyttigt at studere handel med synaptiske receptorer ind og ud af de dendritiske pigge under forekomsten af synaptisk plasticitet. En begrænsning af denne metode er, at det høje antal molekyler bremser simuleringshastigheden. Modellering af dendritiske pigge med denne metode giver mulighed for undersøgelse af homosynaptisk potensering og depression inden for enkelt pigge og heterosynaptisk plasticitet mellem nabo dendritiske pigge.

Introduction

Synaptisk plasticitet har været forbundet med læring og hukommelse1. Synaptisk plasticitet, såsom langvarig potensering (LTP) og langvarig depression (LTD), er forbundet med henholdsvis indsættelse og fjernelse af AMPA-receptorer (AMPAR' er) ind og ud af den synaptiskemembran 2. AMPAR synapserne er placeret oven på de små volumenstrukturer kaldet dendritiske pigge3. Hver rygsøjle indeholder et protein tæt område i den postsynaptiske membran kaldet postsynaptiske tæthed (PSD). Forankr proteiner ved PSD fælde AMPAR'er i den synaptiske region. Der er få kopier af AMPAR'er inden for en enkelt synapse, og amparernes handel og reaktion med andre arter i dendritiske pigge er en stokastiskproces 2,4. Der er flere opdelte modeller af synapta receptor handel på dendritiske pigge5,,6,,7,,8. Der er imidlertid mangel på stokastiske beregningsmodeller for handel med AMPAR'er forbundet med synaptisk plasticitet ved 3D-strukturerne i dendritterne og deres dendritiske pigge.

Beregningsmodellering er et nyttigt redskab til at undersøge de mekanismer , der ligger til grund for dynamikken i komplekse systemer såsom reaktionsspiffusion af AMPAR'er i dendritiske pigge under forekomsten af synaptisk plasticitet9,10,11,12. Modellen kan bruges til at visualisere komplekse scenarier, varierende følsomme parametre og gøre vigtige forudsigelser i videnskabelige forhold, der involverer mange variabler, der er vanskelige eller umulige at kontrollereeksperimentelle 12,13. Definition af detaljeringsgraden af en beregningsmodel er et grundlæggende skridt i at opnå nøjagtige oplysninger om det modellerede fænomen. En ideel beregningsmodel er en hårfin balance mellem kompleksitet og enkelhed for at indfange de væsentlige egenskaber ved naturfænomenerne uden at være beregningsmæssigt uoverkommelige. Beregningsmodeller, der er for detaljerede, kan være dyre at beregne. På den anden side kan systemer, der er dårligt detaljerede, mangle de grundlæggende komponenter, der er afgørende for at fange fænomenets dynamik. Selv om 3D-modellering af dendritiske pigge er beregningsmæssigt dyrere end 2D og 1D, der er betingelser, såsom i komplekse systemer med mange ikke-lineære variabler reagerer og spreder i tid og 3D-rum, for hvilke modellering på et 3D-niveau er afgørende for at få indsigt i funktionen af systemet. Desuden kan kompleksiteten reduceres omhyggeligt for at bevare de væsentlige egenskaber ved en lavere dimensionel model.

I et stokastisk system med få kopier af en given art inden for et lille volumen afviger systemets gennemsnitlige dynamik fra den gennemsnitlige dynamik i en stor population. I dette tilfælde er den stokastiske beregningsmæssige modellering af reaktionssp spredende partikler påkrævet. Dette arbejde introducerer en metode til stokastisk modellering reaktion-diffusion af et par kopier af AMPAR'er i 3D dendritiske pigge. Formålet med denne metode er at udvikle en 3D-beregningsmodel af et dendritisk segment med dendritiske pigge og deres synapser til modellering af synaptisk plasticitet.

Metoden bruger softwaren MCell til at løse modellen numerisk, Blender til konstruere 3D-masker, og CellBlender at skabe og visualisere MCell simuleringer, herunder spatiotemporal reaktion-diffusion af molekyler i 3D-masker14,15,16. Blender er en suite til oprettelse af masker og CellBlender er en add-on til basen software Blender. MCell er en Monte Carlo simulator til reaktionsspiffusion af enkelte molekyler17.

Begrundelsen for brugen af denne metode består i at modellere synaptisk plasticitet for at opnå en bedre forståelse af dette fænomen i det mikrofysiologiske miljø af dendritiske pigge14. Især denne metode giver mulighed for simulering af homosynaptic potensering, homosynaptic depression, og heterosynaptic plasticitet mellem dendritiske pigge14.

Funktionerne i denne metode omfatter modellering af 3D geometriske struktur af dendrite og dens synapser, diffusion ved tilfældig gang, og de kemiske reaktioner af molekyler involveret med synaptisk plasticitet. Denne metode giver den fordel, at skabe rige miljøer til at teste hypoteser og gøre forudsigelser om driften af et komplekst ikke-lineært system med et stort antal variabler. Desuden kan denne metode anvendes ikke kun til at studere synaptisk plasticitet, men også til at studere stokastisk reaktionsspiffusion af molekyler i 3D-meshstrukturer generelt.

Alternativt kan 3D-masker af dendritiske strukturer konstrueres direkte i Blender fra elektronmikroskop serielle rekonstruktioner18. Selv om masker baseret på serielle rekonstruktioner giver 3D-strukturer, er der ikke altid adgang til forsøgsdata. Således giver konstruktionen af masker tilpasset fra grundlæggende geometriske strukturer, som beskrevet i denne protokol, fleksibilitet til at udvikle tilpassede dendritiske segmenter med dendritiske pigge.

En anden alternativ beregningsmetode er massesimulering af velblandet reaktioner i et regelmæssigt bind9,10,11,19,20,21,22. Bulksimuleringerne er meget effektive til at løse reaktionerne fra mange arter inden for et enkelt velblandet volumen23,men bulktilgangen er ekstremt langsom til at løse reaktionsspiffusionen af molekyler i mange velblandet voxels i et 3D-net med høj opløsning. På den anden side fungerer den nuværende metode med MCell-simuleringer af reaktionssp diffusion af individuelle partikler effektivt i 3D-masker med høj opløsning15.

Før du bruger denne metode, bør man spørge, om det undersøgte fænomen kræver en stokastisk reaktion-diffusion tilgang i en 3D-mesh. Hvis fænomenet har få kopier (mindre end 1.000) af mindst én af de reagerende arter, der spreder sig i en kompleks geometrisk struktur med små rum, såsom dendritiske pigge, er det hensigtsmæssigt at foretage stokastisk modellering af reaktionsdiffusion i 3D-masker.

Der er flere trin, der kræves for at konstruere en 3D-beregningsmodel af et dendritisk segment, der indeholder dendritiske pigge med synaptisk plasticitet. De vigtigste trin er installationen af den rette software til opførelse af modellen, opførelsen af en enkelt dendritisk rygsøjlen, der skal bruges som en skabelon til at skabe flere pigge, og oprettelsen af en dendritisk segment, der er forbundet med flere dendritiske pigge. Trinnet til modellering af synaptisk plasticitet består i at indsætte ankre i PSD-regionen og AMPAR'erne i det dendritiske segment og dendritiske pigge. Derefter defineres kinetiske reaktioner mellem ankre placeret ved PSD og AMPAR'erne for at producere komplekse anker-AMPAR-arter, der fanger AMPAR'erne i den synaptiske region. Henholdsvis stigningen og faldet i affiniteten mellem ankre og synaptiske AMPAR'er skaber processen med LTP og LTD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: Se den supplerende fil 1 for ordlisten, der anvendes i denne protokol.

1. Installer Blender, CellBlender og MCell

BEMÆRK: Denne protokol kræver installation af MCell, Blender og Cell Blender.

  1. Download og installer softwaren på MCells hjemmeside (https://mcell.org/tutorials_iframe.html). Gå til overførsler øverst på siden, og følg derefter de trinvise instruktioner for at hente og installere softwaren i det valgmiljø (f.eks.
    BEMÆRK: Alle beregningsmodeller og simuleringer, der er beskrevet i denne protokol, blev testet på en CellBlender 1.1-pakke, der indeholder Blender 2.78 med MCell 3.4 og CellBlender 1.1. Sig arbejdede lige på Blender 2.79b. Alle disse softwareprogrammer er åbne og kræver ikke tilladelse til genoptrykning, der skal bruges. Instruktionerne for konstruktion og simulering af modellen kan ændre sig lidt fra en version til en anden. Dele af denne protokol er blevet tilpasset fra tjekkisk et al.16.

2. Opret en enkelt dendritisk rygsøjle

BEMÆRK: Denne procedure skaber en maske af en enkelt dendritisk ryg med en rygsøjle hoved og en rygsøjle hals ved hjælp af en modificeret kugle.

  1. Konfigurer Blender 3D-visning i hovedpanelet.
    1. Åbn Blender med CellBlender er allerede installeret. Tryk på 5 på tastaturet for at skifte fra perspektiv til ortogonal visning, og tryk på 1 for at skifte til frontvisning. Perspektivvisningen har dybde, men det er ikke nødvendigt nu. Hvis du skifter fra perspektiv til ortogontvisning, kan du visualisere masken bedre. Tryk på Skift+C for at centrere markøren( Figur 1A).
  2. Opret rygsøjlen hovedet.
    1. Tryk på Skift+A for at åbne maskepaletten. Vælg Masken, og vælg derefter UV-kugle. En UV-kugle er en maske, der er knyttet til en kugles 3D-overflade. UV-kuglen repræsenterer det sfæriske hoved af en svampedritisk rygsøjle. Softwaren antager enhederne af UV-kuglen er mikrometer.
    2. Rediger parametrene i panelet Tilføj UV Sphere. Skift størrelse til 0,25 og Ringe til 32 (Figur 1B). Tryk på + eller – på tastaturet for henholdsvis at zoome ind og zoome ud af visualiseringen af masken. Du kan også bruge rulleknappen i musen til at zoome ind og ud(Figur 1C).
      BEMÆRK: Parameterstørrelsen skalerer størrelsen på den oprindelige kugle, og parameterringene definerer maskens opløsning.
  3. Gør toppen af hovedet fladt.
    1. Tryk på Tab for at skifte blender fra objekttilstand, standardobjektinteraktionstilstanden, til Rediger tilstand. Arbejd i redigeringstilstand til redigering af komponenterne i en eksisterende maske.
    2. Når den oprettede maske er valgt automatisk, skal du trykke på en for at fravælge den oprettede maske. Tryk på z for at gøre masken gennemsigtig, hvilket hjælper med at visualisere de dele, der skal redigeres. Zoom ind på masken. Tryk på b for at markere kuglens top 3/4 med musen ( Figur2A). Tryk påDelete , vælg knudepunkter, og angiv for at fjerne knudepunkterne (Figur 2B).
    3. Tryk på b, og vælg toppen. Tryk på e, s, 0, og indtast for at forsegle toppen med knudepunkterne stadig markeret. Flyt den blå pil ned for at justere til toppen af rygsøjlens hoved (Figur 2C). Tryk på z for at skifte til fast visning ( Figur3A). Tryk på 7 for at skifte til topvisning.
      BEMÆRK: Toppen af kuglen er lavet fladt til at modellere PSD-området af rygsøjlen hovedet.
  4. For at øge maskeopløsningen øverst på rygsøjlen skal du først vælge Værktøj og kniv. Skær en cirkel med kniven omkring midten af toppen (Figur 3B). Vælg Værktøj og Sløjfe klip og slide. Gentag dette trin fire gange for at oprette fire koncentriske cirkler omkring midten af toppen (Figur 3C).
    BEMÆRK: De koncentriske cirkler bruges til at tilføje nye voxels, der vil øge opløsningen af PSD.
  5. Opret rygsøjlen hals.
    1. Tryk på a for at fravælge masken. Tryk på 1 for at skifte til forvisningen. Tryk på z for at gøre masken gennemsigtig. Tryk på b, og vælg derefter bunden af masken (Figur 4A). Tryk på slet og knudepunkter (Figur 4B). Tryk på b, og vælg bunden af masken (Figur 4C). Tryk på e og z , -0,45 for at oprette en ekstrudering (Figur 4D).
      BEMÆRK: Dette skaber en ekstrudering til z-aksepositionen ved -0,45 μm. Tryk på a for at fravælge hele masken.
    2. Tryk på b, og vælg bunden af halsen. Tryk på e, sog 0 for at forsegle bunden ( Figur4E). Tryk på a for at markere hele masken.
  6. Gør masken kompatibel med MCell.
    1. Tryk på Crtl+T for at triangulere masken. Masken omdannes til et sæt indbyrdes forbundne trekanter. Dette er en nødvendig procedure for at gøre masken kompatibel med MCell. Vælg Værktøj og Fjern doubler. Brug værktøjerne Fjern doubler til at fjerne eventuelle dublerede knudepunkter, der har de samme koordinater eller er meget tæt på hinanden, for at gøre masken kompatibel med MCell.
      BEMÆRK: Dobbelt overlejrede knudepunkter kan være blevet oprettet ved et uheld under processen med mesh skabelse og redigering.
    2. Vælg Modelobjekter i panelet CellBlender. Rediger navnet på det aktive objekt til rygsøjlen, og tryk på + for at oprette objektets rygsøjle. Vælg Maskeanalyse i panelet CellBlender, og klik derefter på Analysér maske (Figur 4F). Denne procedure analyserer egenskaberne for den oprettede maske, herunder antallet af knudepunkter, kanter, flader, overfladeareal, volumen og meshtopologi.
      BEMÆRK: Analysen udskriver oplysningerne i panelet Maskeanalyse , og de skalvære vandtætte , mangfoldigeog udadvendte normaler. Dette trin er nødvendigt for at sikre, at masken vil arbejde på MCell. Ellers blev et skridt sandsynligvis savnet. I dette tilfælde skal du slette masken og starte fra trin 2.1 igen.
    3. Tryk på z for at visualisere den solide visning af rygsøjlen. Tryk på Filer og Gem for at få en kopi af blenderfilen med rygsøjlen på disken.
      BEMÆRK: Maskernes dimensioner (dvs. længde, diameter, størrelse) er i mikrometer. Se ordlisten for at få betydningen af hver tastaturgenvej.

3. Oprettelse af en dendrite med flere pigge

  1. Generer en rygsøjle som beskrevet tidligere i afsnit 2.1-2.6. Tryk på a for at fravælge rygsøjlen. Skriv Skift+C for at centrere markøren.
  2. Opret en dendrite. Tryk på Skift+A for at åbne maskepaletten. Vælg Maske og derefter Cylinder. Ændre parametrene i menuen Tilføj cylinder: Radius = 0,3 μm, Dybde = 2 μm. Tryk på Enter.
    BEMÆRK: Parametrene radius og dybde er defineret i henhold til de geometriske egenskaber af dendrite.
  3. Indsæt en rygsøjle i dendrite.
    1. Tryk på r og skriv 90 for at rotere cylinderen 90°(Figur 5A). Brug den blå pil til at trække cylinderen ned til bunden af rygsøjlen. Tryk på 3 på tastaturet for at få et forbillede af cylinderen.
    2. Tryk på z for at gøre masken gennemsigtig. Brug musen til at flytte cylinderens blå normale pil nedad for at flytte bunden af rygsøjlen til cylinderens indre (Figur 5B). Tryk på a for at fravælge alle objekter.
    3. Brug den højre knap på musen til at vælge dendrite (Figur 5C). Vælg Modifikator i panelet Blender (Figur 5D), vælg Tilføj modifikator. Vælg derefter Boolesk, vælg Operation Union, og vælg Objekthvirvelsøjlen. Tryk på Anvend for at skabe en fælles maske af dendrite og rygsøjlen (Figur 5E). Denne handling opretter en ny maske, der fletter to masker i en enkelt.
      BEMÆRK: Den nye maske vil være den kombinerede dendrite og rygsøjlen. Den isolerede dendrite forsvinder, når de forskellige masker kombineres, men den isolerede rygsøjlemaske forbliver overlappet med den nye maske og bruges til at generere flere kopier af den samme rygsøjle. Slet alle de isolerede pigge efter endt masken. Det er afgørende at have en fuldstændig overlapning mellem rygsøjlen hals og dendrite, ellers vil masken ikke være vandtæt.
  4. Indstil dendrite-objektet til CellBlender-miljøet.
    1. Tryk på a for at fravælge maskerne. Højreklik i dendrite med musen for at vælge dendrite alene. Markér CellBlender, Modelobjekter, og skift aktivt objekt til Dendrite, og tryk på + for at oprette objektet Dendrite.
  5. Indsæt nye pigge i dendrite.
    1. Tryk på 1 for at skifte til sidevisningen af cylinderen. Brug musen til at vælge masken af den isolerede rygsøjlen. For at indsætte flere pigge, følg trin 3.3, ændre position og vinkel for at indsætte hver enkelt for at opnå en fysiologisk fordeling.
  6. Gør masken kompatibel med MCell. Det gør du ved at trykke på Tab for at gå til redigeringstilstand. Tryk på a for at markere hele masken. Tryk på Crtl+T for at triangulere masken. Vælg Værktøj i panelet Blender, og vælg Fjern doubler.
  7. Stiliser maskerne.
    1. Glat masken. Tryk på Tab for at skifte til objekttilstand. Vælg Værktøj i panelet Blender, og vælg Udjævn. Vælg CellBlender, Modelobjekter, og vælg Tilføj et materiale.
    2. Gør masken gennemsigtig ved at markere Objekt gennemsigtigt og materiale gennemsigtigt. Skift alfa til 0,5, og indtast den for at gøre masken delvist gennemsigtig. Tryk på z for at skifte til fast visning.
  8. Bekræft, om masken stadig er kompatibel med MCell. Det kan du gøre ved at vælge Maskeanalyse i panelet CellBlender for at sikre, at masken stadig er vandtæt , manifoldmaskeog udadvendt normal. watertight
  9. Gem blenderfilen som dendrite_with_spines.blend.

4. Definer overfladeområder

BEMÆRK: Denne procedure opretter overfladen områder af masken, der senere vil blive brugt til at oprette, hvordan regionerne interagerer med molekylerne.

  1. Åbn filfilen dendrite_with_spines i blendermiljøet. Det kan du gøre ved at vælge Filer, Åbn dendrite_with_spines.blendog Åbn blenderfil.
  2. Forbered masken til at definere overfladeområderne. Det gør du ved at trykke på Tab for at skifte til redigeringstilstand. Tryk på z for at skifte til gennemsigtig visning(Viewport shading, wireframe). Tryk på en for at markere hele masken af dendrite med pigge. Vælg Modelobjekter. Vælg Dendrite. Tryk på t for at skjule CellBlender-panelet, og visualiser hele masken bedre i hovedpanelet.
    1. Brug + og – på tastaturet for at zoome ind og ud eller rulle med musen. Dette er nødvendigt for bedre visualisering af toppen af pigge til at vælge og definere overfladen regioner. Tryk på a for at fjerne markeringen af objektet. Tryk på Tab for at skifte til Redigeringstilstand. Tryk på t for at få vist panelet CellBlender igen.
  3. Definer PSD-overfladeområdet. Det gør du ved at trykke på b og vælge toppen af en dendritisk ryg med musen ( Figur6A,6B). Tryk på + på Definerede overfladeområder. Skift områdenavnet til PSD1, og klik på Tildel (Figur 6C). Tryk på a for at fjerne markeringen af objektet.
  4. Definer det ekstrasynaptiske overfladeområde. For at gøre dette skal du trykke på b og vælge området rundt om toppen af dendritiske ryg med musen ( Figur6D). Gentag trin 4.3 for at ændre Extra_syn1. Gentag trin 4.3 for de øvrige pigge for at definere de øvrige områder af masken (PSD2, PSD3, PSD4, Extra_syn2, Extra_syn3og Extra_syn4) (Figur 6F). Tryk på a for at fjerne markeringen af objektet.
  5. Definer overfladeområderne i enderne af dendrite. Det gør du ved at trykke på b og vælge den venstre ende af dendrite. Rediger områdenavnet for at Left_end , og klik på Tildel. Tryk på a for at fjerne markeringen af objektet. Tryk på b, og vælg den højre ende af dendrite (Figur 6E). Rediger områdenavnet for at Right_end og klik på Tildel.
    BEMÆRK: Flyt masken for at finde den bedste placering til at vælge hvert defineret område.

5. Opret molekyler

  1. Opret AMPAR'er. Det kan du gøre ved at vælge Molekyler i CellBlender-panelet. Vælg + på Definerede molekyler for at indsætte et nyt molekyle og ændre navn til AMPAR. Skift molekyletype til overflademolekyle og diffusionskonstant til 0,05e-8 cm 22/s14 for at definere diffusionskonstanten for AMPAR'er i membranen ( Figur7A).
  2. Opret ankre. Det kan du gøre ved at vælge Molekyler i CellBlender-panelet. Vælg + på Definerede molekyler for at indsætte et nyt molekyle og ændre navn for at forankre. Skift molekyletype til overflademolekyle og skift diffusionskonstant til 0,001e-8 cm 22/s14 for at definere diffusionskonstanten for ankre i membranen ( Figur7A).
  3. Hvis du vil oprette ankre bundet til AMPAR'er, skal du vælge Molekyler i CellBlender-panelet. Vælg + på definerede molekyler for at indsætte et nyt molekyle. Skift navn til anchor_AMPAR. Skift molekyletype til overflademolekyle. Skift diffusionskonstant til 0,001e-8 cm2/s14.
  4. Opret anchor_LTP og anchor_AMPAR_LTP. Det gør du ved at gentage trin 5.2. Navngr. molekylet anchor_LTP. Gentag trin 5.3. Navngr. molekylet anchor_AMPAR_LTP.
    BEMÆRK: Anchor_LTP har en høj affinitet for AMPAR; AMPAR'er stiger således i synaptiske regioner.
  5. Opret anchor_LTD og anchor_AMPAR_LTD. Hvis du vil oprette et _LTD,skal du gentage trin 5.2. Navngr. molekylet anchor_LTD. Gentag trin 5.3. Navngr. molekylet anchor_AMPAR_LTD.
    BEMÆRK: Anchor_LTD har en lav affinitet for AMPAR; AMPAR'er falder således i synaptisk region.

6. Definer overfladeklasser

BEMÆRK: Denne procedure definerer klasserne med de egenskaber, der er knyttet til overfladeområderne. De ekstrasynaptiske områder afspejler de frie ankre og ankre, der er bundet til AMPAR. Dendrites laterale ender afspejler alle molekylerne.

  1. Definer egenskaberne for de ekstrasynaptiske områder.
    1. Tryk på Tab for at skifte til objekttilstand. Vælg Overfladeklasser i CellBlender-panelet. Tryk på + på Surface Class for at definere en ny overfladeklasse.
    2. Få det ekstrasynaptiske område til at afspejle AMPAR, der er bundet til ankermolekylerne.
      BEMÆRK: Denne procedure vil fange ankre og alt bundet til dem inden for synaptiske region.
      1. Skift navnet på Surface-klasse for at reflective_extra_syn. Tryk på + på reflective_extra_syn egenskaber for at knytte det til et molekyle. Vælg molekyler | Enkelt molekyle. Vælg anchor_AMPAR. Vælg Retning = Ignorer. Vælg Type = Reflekterende for at få regionen til at vise anchor_AMPAR molekyler.
      2. Trin 6.1.2.1 gentages for anchor_AMPAR_LTP og anchor_AMPAR_LTD.
    3. Få det ekstrasynaptiske område til at afspejle ankre.
      1. Tryk på + på reflective_extra_syn egenskaber for at knytte det til et molekyle. Vælg molekyler | Enkelt molekyle. Vælg anker. Vælg Retning = Ignorer. Vælg Type = Reflekterende for at få regionen til at afspejle ankermolekylerne.
      2. Trin 6.1.3.1 gentages for anchor_LTP og anchor_LTD.
  2. Definer egenskaberne for dendrite-enderne. Det gør du ved at trykke på + på Surface Class for at definere en ny overfladeklasse. Skift navnet på Surface-klasse til reflective_ends. Tryk på Egenskaber for egenskaber for at knytte det til et molekyle. Vælg molekyler | Alle overflademolekyler. Vælg retning | Ignorer. Vælg type | Reflekterende for at få det til at afspejle alle overflademolekyler.

7. Tildel de oprettede klasser til hvert overfladeområde

BEMÆRK: Dette trin tildeler overfladeklasserne til overfladeområderne.

  1. Tildel egenskaberne for enderne af dendrite.
    1. Tryk på + for at tildele en overfladeklasse med et område. Vælg reflective_ends for Navnet på Surface-klassen (Figur 7C). Vælg Dendrite for Objektnavn. Vælg Angivet område for Områdemarkering. Vælg Left_end for Områdenavn.
    2. Trin 7.1.1 gentages for Right_end (Figur 7D).
  2. Tildel egenskaberne for de ekstrasynaptiske områder.
    1. Tryk på + for at tildele en overfladeklasse med et område. Vælg reflective_extra_syn til Surface Class Name. Vælg Dendrite for Objektnavn. Vælg Angivet område for Områdemarkering. Vælg Extra_syn1 for Områdenavn.
    2. Gentag trin 7.2.1 for Extra_syn2, Extra_syn3og Extra_syn4.

8. Placer molekyler på masken

BEMÆRK: Dette trin placerer AMPAR'erne, ankre og AMPAR bundet til ankre på masken.

  1. Hvis du vil placere AMPAR-molekyler på masken, skal du vælge Molekyleplacering på CellBlender-panelet. AMPAR Tryk på + på udgivelses-/placeringswebstederne for at oprette et nyt udgivelseswebsted. Skift webstedsnavn til relAMPAR (Figur 7B). Vælg Molekyle = AMPAR. Objekt/Område = Dendrite[ALL]-(Dendrite[Left_end]+Dendrite[Right_end]). Antal, der skal frigives = 1.000.
  2. Placer ankermolekyler på masken.
    1. Vælg molekyleplacering i CellBlender-panelet. Tryk på + på udgivelses-/placeringswebstederne for at oprette et nyt udgivelseswebsted. Skift webstedsnavn til rel_anchor_PSD1. Vælg Molekyleanker. . Objekt/område = Dendrite[PSD1]. Antal, der skal frigives = 200.
    2. Gentag trin 8.2.1 til PSD2, PSD3og PSD4.
  3. Placer anchor_LTP molekyler på masken. Det kan du gøre ved at vælge Molekyleplacering i CellBlender-panelet. Tryk på + på udgivelses-/placeringswebstederne for at oprette et nyt udgivelseswebsted. Skift webstedsnavn til rel_anchor_LTP_PSD1. Vælg Molekyle = anchor_LTP. Objekt/område = Dendrite[PSD1]. Antal, der skal frigives = 0.
    BEMÆRK: anchor_LTP er et anker med høj bindingsaffinitet for AMPAR'er.
  4. Placer anchor_LTD molekyler på masken ved at gentage trin 8.3 for anchor_LTD.
    BEMÆRK: anchor_LTD er et anker med lav binding affinitet for AMPAR'er.

9. Skabe de kemiske reaktioner

  1. Oprettelse af reaktionen mellem anker og AMPAR'er.
    1. Vælg Reaktioner (Figur 7D) for at oprette reaktionerne. Tryk på + for at inkludere en ny reaktion. Reaktanter = anker' + AMPAR'. Reaktionstype = <->. Dette definerer en tovejsreaktion. Produkter = anchor_AMPAR«. Forward Rate = 0,03. Tilbageskridt = 0,05.
  2. Skab reaktionen mellem ANCHOR_LTP AMPAR'er. Det kan du gøre ved at gentage trin 9.1, men erstatte anker med anchor_LTPog bruge en tilbageskridt = 0,005 for at øge affiniteten mellem reaktanterne.
  3. Opret reaktionen mellem anchor_LTD ampar'er, og gem filen. Det kan du gøre ved at gentage trin 9.2, men erstatte anker med anchor_LTDog bruge en bagudrettet hastighed = 0,5 for at mindske affiniteten mellem reaktanterne. Gem derefter filen.

10. Plot af modellens output

  1. Plot ankre bundet til AMPAR'er på PSD1 under basal tilstand. Det kan du gøre ved at vælge Afbild outputindstillinger. Tryk på + for at definere molekylerne. Vælg anchor_AMPAR på Molekyle. Vælg dendrite på Objekt. Vælg PSD1 på Region. Gentag trin 10.1 for alle PSD-områder.
    BEMÆRK: Det er nyttigt at observere det basale antal fangne AMPAR'er til PSD'en for hver dendritisk rygsøjle. Antallet af ankre, der er bundet til AMPAR'er, kan stige eller falde i forhold til de basale forhold under LTP og LTD.
  2. Plot ankre bundet til AMPAR'er på PSD1 under LTP. Gør dette ved at gentage trin 10.1. Erstat anchor_AMPAR med anchor_AMPAR_LTP, derefter plotte ankre bundet til AMPAR'er på PSD1 under LTD og endelig gentage trin 10,1, men erstatte anchor_AMPAR_LTP med anchor_AMPAR_LTD.

11. Kør simuleringerne

  1. Hvis du vil køre basalbetingelsen, skal du vælge Kør simulering. Vælg Gentagelser = 30.000. Angiv tidstrin = 1e-3 s. Tryk på Eksportér og kør. Vent, indtil simuleringen slutter. Det kan tage fra minutter til timer.
    BEMÆRK: I basaltilstand er der ingen frigivelse af anchor_LTP og rel_anchor_LTD molekyler. Med hensyn til parametrene for simuleringen skal antallet af gentagelser være langt nok til at kunne observere udbredelsen af AMPAR'er fra dendritterne og deres forankring ved PSD. Små tidstrin er mere præcise, men langsommere til at fuldføre simuleringen.
  2. Vælg Genindlæs visualiseringsdata. Vælg afspilningsanimation for at visualisere de spatiotemporale resultater (Figur 8). Vælg Afbild outputindstillinger. Tryk plot.
    BEMÆRK: Graferne genereret af CellBlender er isolerede tidsserier af de valgte kemiske arter. Tredjepartsprogrammer kan bruges til at importere de data, der er gemt fra flere simuleringer, for at oprette overlejrede plots af flere betingelser (f.eks. basal, LTP, LTD; se figur 8).
  3. Kør den homosynaptiske potenseringstilstand (dvs. Figure 8 Det kan du gøre ved at vælge Molekyleplacering i CellBlender-panelet. Vælg rel_anchor_LTP_PSD1 på udgivelses-/placeringswebstederne.
  4. Skift antal til frigivelse = 200. Vælg rel_anchor_LTD_PSD1 på udgivelses-/placeringswebstederne. Skift antal til frigivelse = 0. Vælg rel_anchor _PSD1 på udgivelses-/placeringswebstederne. Skift antal til frigivelse = 0. Gentag trin 11.1-11.2.
  5. Kør den homosynaptiske depression tilstand (dvs. LTD; se figur 8). Det kan du gøre ved at udgive 200 rel_anchor_LTD_PSD1 i stedet for rel_ANCHOR_LTP_PSD1. Angiv rel_anchor og rel_anchor_LTP_PSD1 til nul. Gentag trin 11.1-11.2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Disse resultater giver de skridt til opførelse af en 3D-mesh, der simulerer en dendritisk rygsøjlen med en rygsøjle hoved og rygsøjle hals (Figur 1 til Figur 4). Desuden kan flere dendritiske pigge indsættes i et enkelt dendritisk segment (Figur 5) for at studere heterosynaptisk plasticitet af AMPAR'er14. PSD på toppen af rygsøjlen hovedet (Figur 6) er det sted, hvor synaptiske ankre binder sig til AMPAR'er og fælde dem midlertidigt ved synapsen (Figur 7, Figur 8).

Synaptisk plasticitet kunne verificeres groft gennem ændringer i antallet af arter af anchor_AMPAR, anchor_AMPAR_LTP, og anchor_AMPAR_LTD på hver rygsøjle. Til nøjagtig beregning af forekomsten af synaptisk plasticitet anbefales det at beregne variationen i det samlede antal forankrede og frie AMPAR'er ved synapsen. Dette kan udføres ved hjælp af tredjepartsprogrammer til at åbne de gemte data i simuleringen for at opsummere tidsserierne for de frie AMPAR'er og de forankrede AMPAR'er ved hver PSD (Figur 8).

Frigivelsen af AMPAR'er på masken gjorde det muligt at observation af deres diffusion ved en stokastisk tilfældig gåtur langs dendrite og dendritiske pigge. Faktorer, der ændrer affiniteten af AMPAR'er for ankre, såsom posttranslationale ændringer og ændringer af satserne for endocytose og exocytose, kan fælde AMPAR'erne på PSD24,25,26. Bindingen af AMPAR'er med ankre placeret ved PSD fanget en høj tæthed af AMPAR'er på synapsen. Homosynaptisk potensering (figur 9) og depression (figur 10) kan verificeres henholdsvis gennem stigninger og fald i antallet af forankrede AMPAR'er forårsaget af ændringer i AMPAR'ernes affinitet med ankre i forhold til de basale tilstand ( figur11). Faktorer, der reducerede affiniteten af AMPAR'er med ankre frigivet flere AMPAR'er fra en dendritisk rygsøjlen (dvs. homosynaptic depression) og induceret heterosynaptic potensering på de omkringliggende pigge. Også faktorer, der øgede affiniteten af AMPAR'er for ankre på en rygsøjle induceret homosynaptic potensering på, at rygsøjlen og heterosynaptic depression på de omkringliggende pigge14. På denne måde blev heterosynaptic plasticitet observeret som den modsatte effekt på de omkringliggende pigge af den homosynaptiske plasticitet induceret på en given rygsøjle. For eksempel, homosynaptic LTP induktion på en enkelt rygsøjle skabt en heterosynaptic LTD effekt på de omkringliggende pigge (Figur 8E,F,G).

Figure 1
Figur 1: Oprettelse af det dendritiske rygsøjlehoved ved hjælp af en sfærisk maske. (A) Tilføjelse af UV-kuglen. BB) Opsætning af kugledimensionerne. (C) Observation af den skabte sfære. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Opførelse af den øverste region. (A) Valg af kuglens øverste område. (B) Fjernelse af det valgte område for at gøre det fladt. (C) Forsegling af den flade top. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Oprettelse af koncentriske områder på toppen af rygsøjlen. (A) Visualisering af toppen. (B) Brug af en kniv til at definere en koncentrisk region. (C) Oprettelse af flere koncentriske regioner. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Oprettelse af dendritiske rygsøjle hals. (A) Valg af bunden af den ændrede kugle. (B) Sletning af de valgte knudepunkter. (C) Valg af bunden. (D) Ekstrudering af bunden for at skabe rygsøjlen hals. (E) Forsegling bunden af rygsøjlen hals. (F) Analyse af den oprettede rygsøjle. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Oprettelse af dendrite med flere pigge. (A) Brug af den cylindriske maske til at skabe en dendrite. (B) Tilpasning af dendritiske rygsøjlen med cylinderen. (C) Sammenføjning af cylinderen med rygsøjlen. DD) Den booleske operation for at slutte sig til maskerne. (E) Den nye kombinerede maske. (F) Tilføjelse af den anden rygsøjle. (G) Tilføjelse af den tredje rygsøjle. (H) Tilføjelse af den fjerde rygsøjle. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Definition af PSD-regionen og den perisynaptiske zone. (A) Valg af PSD-området. (B) Detaljeret visning af den oprettede PSD. c )Definitionaf PSD-overfladeregionen. (D) Valg og definition af den perisynaptiske zone omkring PSD. (E) Valg og definition af dendrites laterale overflade. (F) Definerede overfladeområder. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Definition af overflademolekylerne. (A) Definition ampar, anker, og AMPAR bundet til anker. bB) Definition af placeringen og mængden af AMPAR-kopier. CC) Definition af overfladeklasserne. DD) Tildeling af overfladeklasser. (E) Oprettelse af kemiske reaktioner mellem molekylerne. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: Repræsentative resultater af synaptisk plasticitet. a) Forskellige masker i et dendritisk segment med to, fire eller otte pigge. bB) En anden opfattelse af det dendritiske segment med otte pigge. cC) Detaljeret visning af en dendritisk rygsøjle med AMPAR'er og ankre ved PSD. D) Diagram over handel med AMPAR'er ind og ud af PSD gennem deres interaktioner med ankre. (E-G) Kurverne viser antallet af synaptiske AMPAR'er ved hver PSD for basaltilstanden og under LTP og LTD. Induktionen af homosynaptiske LTP eller LTD på en enkelt rygsøjle skabte en heterosynaptisk effekt i de nærliggende pigge for masken med to pigge (E), fire pigge (F) og otte pigge (G). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 9
Figur 9: Repræsentativt resultat af LTP-betingelsen. (A) X-aksen er tiden, og y-aksen er antallet af de anchor_LTP_AMPAR ved PSD1. Der var en udgivelse på 200 anchor_LTP i begyndelsen af simuleringen. Et højere antal obligationer med ankre blev dannet i forhold til den basale tilstand (Figur 11) Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 10
Figur 10: Repræsentativt resultat af LTD-betingelsen. (A) X-aksen er tiden, og y-aksen er antallet af de komplekse anchor_LTD_AMPAR ved PSD1. Der var en udgivelse på 200 gratis anchor_LTD i begyndelsen af simuleringen. Et lavere antal bindinger med ankre blev dannet i forhold til basaltilstanden (figur 11). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 11
Figur 11: Repræsentativt resultat under basaltilstand. (A) X-aksen er tiden, og y-aksen er antallet af de komplekse anchor_AMPAR ved PSD1. Der var en frigivelse af 200 gratis ankre i begyndelsen af simuleringen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende sag 1. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne artikel præsenterer en metode til konstruktion af 3D-masker til modellering reaktion-diffusion synaptisk plasticitet processer i en dendritisk segment med dendritiske pigge. Den udviklede model indeholder et dendritisk segment med få dendritiske pigge. Den laterale diffusion og reaktion af AMPAR'er med synaptiske ankre tillader simulering af basaldynamikken. De kritiske trin i protokollen er at skære kuglen for oprettelsen af toppen af rygsøjlen hovedet (Figur 1, Figur 2, Figur 3), ekstrudering til at skabe rygsøjlen hals (Figur 4), og sammenføjning af dendrite og pigge i en enkelt maske (Figur 5). Det er afgørende at have en fuldstændig overlapning mellem rygsøjlen hals og dendrite; Ellers vil masken ikke være vandtæt. Andre kritiske trin er valget af membranregioner og definitionen af overfladeklasserne (Figur 6, Figur 7). Gem filerne for hvert kritisk trin med et andet navn.

Brug mesh analyse værktøj til at sikre, at masken er vandtæt, manifold, og udadvendt normal efter oprettelse af enkelt rygsøjlen og efter oprettelse af den kombinerede dendrite med rygsøjlen. Hvis masken ikke udfører denne analyse, skal du vende tilbage til den sidste korrekte version, der er gemt. Nogle trin kan være lidt forskellige, afhængigt af den installerede version af softwaren, operativsystemet og tastaturtypen.

Denne protokol simulerer handel med AMPAR-molekyler i 3D-masken (Figur 8, Figur 9, Figur 10, Figur 11), som er nøglen til neuronal excitatorisk transmission og synaptisk plasticitet. Handel med enkelte molekyler i et 3D-net er et værdifuldt træk ved denne model med hensyn til eksisterende metoder baseret på velblandet volumener med homogene fordelinger afmolekyler 21,22, som ikke er den fysiologiske tilstand ved synapserne27. En begrænsning af denne teknik er de høje beregningsomkostninger og den langsomme hastighed af simuleringer, der bruger et stort antal kopier af hvert molekyle og et stort antal kemiske reaktioner mellem dem. Denne begrænsning kan overvindes ved at reducere antallet af kopier af hver art.

Opførelsen af et system med en realistisk 3D-mesh og spatiotemporal sporing af molekyler er et kraftfuldt værktøj til at teste mekaniske scenarier, der kan give stor indsigt i driften af systemer med et stort antal ikke-lineære variabler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev delvist støttet af Sao Paulo State Science Foundation (FAPESP) tilskud #2015/50122-0 og IRTG-GRTK 1740/2, af IBM/FAPESP-tilskuddet #2016/18825-4 og af FAPESP-tilskuddet #2018/06504-4.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blender Blender Foundation https://www.blender.org/
CellBlender University of Pittsburgh https://mcell.org/
Mcell University of Pittsburgh https://mcell.org/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sweatt, J. D. Neural plasticity and behavior - sixty years of conceptual advances. Journal of Neurochemistry. 139, 179-199 (2016).
  2. Heine, M., et al. Surface mobility of postsynaptic AMPARs tunes synaptic transmission. Science. 320 (5873), 201-205 (2008).
  3. Buonarati, O. R., Hammes, E. A., Watson, J. F., Greger, I. H., Hell, J. W. Mechanisms of postsynaptic localization of AMPA-type glutamate receptors and their regulation during long-term potentiation. Science Signaling. 12 (562), 6889 (2019).
  4. Nair, D., et al. Super-Resolution Imaging Reveals That AMPA Receptors Inside Synapses Are Dynamically Organized in Nanodomains Regulated by PSD95. Journal of Neuroscience. 33 (32), 13204-13224 (2013).
  5. Czöndör, K., et al. Unified quantitative model of AMPA receptor trafficking at synapses. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (9), 3522-3527 (2012).
  6. Triesch, J., Vo, A. D., Hafner, A. S. Competition for synaptic building blocks shapes synaptic plasticity. eLife. 7, 37836 (2018).
  7. Earnshaw, B. A., Bressloff, P. C. Biophysical model of AMPA receptor trafficking and its regulation during long-term potentiation/long-term depression. Journal of Neuroscience. 26 (47), 12362-12373 (2006).
  8. Earnshaw, B. A., Bressloff, P. C. Modeling the role of lateral membrane diffusion in AMPA receptor trafficking along a spiny dendrite. Journal of Computational Neuroscience. 25 (2), 366-389 (2008).
  9. Antunes, G., Roque, A. C., Simoes-de-Souza, F. M. Stochastic Induction of Long-Term Potentiation and Long-Term Depression. Scientific Reports. 6, 30899 (2016).
  10. Kotaleski, J. H., Blackwell, K. T. Modelling the molecular mechanisms of synaptic plasticity using systems biology approaches. Nature Reviews Neuroscience. 11 (4), 239-251 (2010).
  11. Bhalla, U. S. Molecular computation in neurons: a modeling perspective. Current Opinion in Neurobiology. 25, 31-37 (2014).
  12. Czöndör, K., Thoumine, O. Biophysical mechanisms regulating AMPA receptor accumulation at synapses. Brain Research Bulletin. 93, 57-68 (2013).
  13. Bromer, C., et al. Long-term potentiation expands information content of hippocampal dentate gyrus synapses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2410-2418 (2018).
  14. Antunes, G., Simoes-de-Souza, F. M. AMPA receptor trafficking and its role in heterosynaptic plasticity. Scientific Reports. 8 (1), 10349 (2018).
  15. Kerr, R. A., et al. Fast monte carlo simulation methods for biological reaction-diffusion systems in solution and on surfaces. SIAM Journal on Scientific Computing. 30 (6), 3126 (2008).
  16. Czech, J., Dittrich, M., Stiles, J. R. Rapid Creation, Monte Carlo Simulation, and Visualization of Realistic 3D Cell Models. Systems Biology. 500, 237-287 (2009).
  17. Stiles, J., Bartol, T., et al. Monte Carlo Methods for Simulating Realistic Synaptic Microphysiology Using MCell. Computational Neuroscience. De Schutter,, et al. , CRC Press. (2000).
  18. Jorstad, A., et al. NeuroMorph: A Toolset for the Morphometric Analysis and Visualization of 3D Models Derived from Electron Microscopy Image Stacks. Neuroinformatics. 13 (1), 83-92 (2015).
  19. Antunes, G., Roque, A. C., Simoes de Souza, F. M. Modelling intracellular competition for calcium: kinetic and thermodynamic control of different molecular modes of signal decoding. Scientific Reports. 6, 23730 (2016).
  20. Antunes, G., Roque, A. C., Simoes-de-Souza, F. M. Molecular mechanisms of detection and discrimination of dynamic signals. Scientific Reports. 8 (1), 2480 (2018).
  21. Hoops, S., et al. COPASI--a COmplex PAthway SImulator. Bioinformatics. 22 (24), 3067-3074 (2006).
  22. Faeder, J. R., Blinov, M. L., Hlavacek, W. S. Rule-based modeling of biochemical systems with BioNetGen. Methods in Molecular Biology. 500, 113-167 (2009).
  23. Gillespie, D. T. Exact stochastic simulation of coupled chemical reactions. Journal of Physical Chemistry. 81 (25), 21 (1977).
  24. Anggono, V., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 461-469 (2012).
  25. Matsuda, S., Launey, T., Mikawa, S., Hirai, H. Disruption of AMPA receptor GluR2 clusters following long-term depression induction in cerebellar Purkinje neurons. EMBO Journal. 19 (12), 2765-2774 (2000).
  26. Ahmad, M., et al. Postsynaptic Complexin Controls AMPA Receptor Exocytosis during LTP. Neuron. 73 (2), 260-267 (2012).
  27. Sheng, M., Hoogenraad, C. C. The postsynaptic architecture of excitatory synapses: a more quantitative view. Annual Review of Biochemistry. 76, 823-847 (2007).

Tags

Neurovidenskab AMPA receptor handel reaktion-diffusion synaptisk plasticitet dendritiske pigge beregningsmæssige modellering langsigtet potensering langvarig depression heterosynaptic plasticitet
3D-modellering af dendritiske pigge med synaptisk plasticitet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Antunes, G., Simoes de Souza, F. M.… More

Antunes, G., Simoes de Souza, F. M. 3D Modeling of Dendritic Spines with Synaptic Plasticity. J. Vis. Exp. (159), e60896, doi:10.3791/60896 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter