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JoVE Journal Neuroscience
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Neuroscience

シナプス可塑性を用いた樹状脊椎の3Dモデリング

Published: May 18, 2020 doi: 10.3791/60896
Automatic Translation
*1, *1
1Center for Mathematics, Computation and Cognition, Federal University of ABC
* These authors contributed equally

Summary

このプロトコルは、シナプス可塑性をモデリングするための樹状脊椎を持つ樹状セグメントの3次元(3D)モデルを開発します。構築されたメッシュは、CellBlender および MCell を使用するソフトウェア プログラム Blender を使用して、長期的なシナプス可塑性における AMPA 受容体の密売の計算モデリングに使用できます。

Abstract

三次元(3D)幾何学における化学種の拡散と反応の計算モデリングは、樹状棘におけるシナプス可塑性のメカニズムを理解するための基本的な方法である。このプロトコルでは、樹状突起および樹状棘の詳細な3D構造は、CellBlenderを使用したソフトウェアBlender上のメッシュでモデル化されています。シナプス領域とシナプス外領域はメッシュ上で定義されます。次に、シナプス受容体およびシナプスアンカー分子は、その拡散定数で定義される。最後に、シナプス受容体とシナプスアンカー間の化学反応が含まれ、計算モデルは、ソフトウェアMCellで数値的に解決されます。この方法は、3D幾何学的構造における単一分子の空間的経路を記述する。したがって、シナプス可塑性の発生時に樹状脊椎の出入りするシナプス受容体の密売を研究することは非常に有用である。この方法の制限は、分子の数が多いとシミュレーションの速度が遅くなることです。この方法を用いた樹状脊椎のモデリングにより、単一脊椎内のホモシナプス増強とうつ病の研究と、隣接樹状脊椎間の不均一な可塑性の研究が可能となる。

Introduction

シナプス可塑性は、学習と記憶に関連付けられている1.シナプス可塑性は、長期増強(LTP)および長期うつ病(LTD)などの、SYNaptic膜2の中および外にAMPA受容体(AMPA)の挿入および除去にそれぞれ関連している。AMPARシナプスは樹状脊椎3と呼ばれる小さな容積構造の上に配置されています。各脊椎は、ポストナプティクス密度(PSD)と呼ばれるポストナプティクス膜にタンパク質密度の高い領域を含んでいます。PSDトラップのアンカータンパク質はシナプス領域のAMPAをトラップします。単一のシナプス内のAMPARsのコピーはほとんどなく、樹状棘の他の種とのAMPARsの人身売買と反応は確率的プロセス22、44である。樹状,棘,55、6、7、86におけるシナプス受容体の入稿のいくつかのコンパートメントモデルがあります。78しかし、樹状突起とその樹状棘の3D構造におけるシナプス可塑性に関連するAMPALの人身売買の確率計算モデルが不足している。

計算モデリングは、シナ,プス可塑性99、10、11、12の発生時に樹状脊椎におけるアンパールの反応拡散のような複雑な系のダイナミクスの基礎となるメカニズム11を調べる12有用なツールである。,10このモデルは、複雑なシナリオを視覚化し、感度パラメータを変化させ、実験12,13,13を制御することが困難または不可能な多くの変数を含む科学的条件で重要な予測を行うために使用できます。計算モデルの詳細レベルを定義することは、モデル化された現象に関する正確な情報を得る上での基本的なステップです。理想的な計算モデルは、複雑さと単純さの微妙なバランスで、計算上の負荷をかけずに自然現象の本質的な特性を捉えることです。詳細すぎる計算モデルは、計算にコストがかかる可能性があります。一方、詳細性の低いシステムでは、現象のダイナミクスを捉えるために不可欠な基本的な要素が欠けている可能性があります。樹状脊椎の3Dモデリングは2Dや1Dよりも計算上高価ですが、時間や3D空間で反応して拡散する非線形変数が多い複雑なシステムなど、3Dレベルでのモデリングはシステムの機能に関する洞察を得るために不可欠な条件があります。さらに、より低次元モデルの本質的な特性を維持するために、複雑さを慎重に軽減することができます。

少量の中で与えられた種のコピーが少ない確率的システムでは、システムの平均ダイナミクスは、大規模な集団の平均ダイナミクスから逸脱する。この場合、反応拡散粒子の確率計算モデリングが必要となる。この研究では、3D樹状脊椎におけるAMPARsの数コピーの確率モデリング反応拡散の方法を紹介する。この方法の目的は、シナプス可塑性をモデル化するための樹状棘及びシナプスを有する樹状線セグメントの3D計算モデルを開発することである。

この方法では、MCellを使用してモデルを数値的に解き、3Dメッシュを構築するためのブレンダー、およびCellBlenderを使用して、3Dメッシュ14、15、16,15,の分子の時空間反応拡散を含むMCellシミュレーションを作成および視覚化します。ブレンダーはメッシュの作成のためのスイートであり、CellBlenderは、基本ソフトウェアブレンダーのためのアドオンです。MCellは、単一分子17の反応拡散のためのモンテカルロシミュレータです。

この方法の使用の背後にある根拠は、樹状棘14の微小生理学的環境におけるこの現象のより良い理解を達成するためにシナプス可塑性をモデル化することから成る。特に、この方法は、樹状脊椎14間のホモシナプス増強、ホモシナプスうつ病、および不均一なナプティック可塑性のシミュレーションを可能にする。

この方法の特徴としては、樹状突起とそのシナプスの3D幾何学的構造のモデル化、ランダムウォークによる拡散、シナプス可塑性に関与する分子の化学反応が挙げられる。この方法は、仮説をテストし、多数の変数を持つ複雑な非線形系の機能を予測するために、豊富な環境を作成する利点を提供します。また、シナプス可塑性の研究だけでなく、一般的に3Dメッシュ構造における分子の確率的反応拡散を研究するためにも適用できます。

あるいは、樹状構造の3Dメッシュは、電子顕微鏡の逐次再構成18からブレンダーに直接構築することができる。連続再構築に基づくメッシュは 3D 構造を提供しますが、実験データへのアクセスは必ずしも利用できるとは限りません。したがって、本プロトコルに記載されているように、基本的な幾何学的構造から適応されたメッシュの構築は、樹状棘を持つカスタマイズされた樹状セグメントを開発する柔軟性を提供する。

別の代替計算方法は、通常の容積,,99、10、11、19、20、21、2210,11のよく混合反応20,21の22バルクシミュレーションである。19バルクシミュレーションは、単一の十分に混合された容積23内の多くの種の反応を解決するのに非常に効率的であるが、バルクアプローチは、高解像度の3Dメッシュで多くのよく混合されたボクセル内の分子の反応拡散を解決するために非常に遅いです。一方、個々の粒子の反応拡散のMCellシミュレーションを用いた本法は、高解像度3Dメッシュ15において効率的に動作する。

この方法を使用する前に、研究した現象が3Dメッシュで確率的反応拡散アプローチを必要とするかどうかを尋ねるべきです。この現象が樹状棘のような小さな容積コンパートメントを持つ複雑な幾何学的構造で拡散する反応種の少なくとも1つのコピー(1,000未満)を持つ場合、3Dメッシュにおける反応拡散の確率的モデリングが適用に適している。

シナプス可塑性を持つ樹状脊椎を含む樹状セグメントの3D計算モデルを構築するために必要ないくつかのステップがあります。主な手順は、モデルの構築のための適切なソフトウェアのインストール、複数の脊椎を作成するためのテンプレートとして使用される単一樹状脊椎の構築、および複数の樹状脊椎で接続された樹状セグメントの作成です。シナプス可塑性をモデリングするステップは、PSD領域にアンカーを挿入し、樹状セグメントと樹状棘にAMPAを挿入することです。次に、PSDとAMPPARに位置するアンカー間の運動反応は、シナプス領域でAMPPARをトラップする複雑なアンカーAMPAR種を生成するように定義される。それぞれ、アンカーとシナプスAMPARs間の親和性の増加と減少は、LTPとLTDのプロセスを作成します。

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Protocol

注: このプロトコルで使用される用語の用語集については 、補足ファイル 1 を参照してください。

1. ブレンダー、セルブレンダー、および M セルをインストールする

注: このプロトコルは、MCell、ブレンダー、およびセルブレンダーのインストールが必要です。

  1. MCell ホームページ (https://mcell.org/tutorials_iframe.html) でソフトウェアをダウンロードしてインストールします。ページの上部にあるダウンロードに進み、手順に従って、選択した環境(Linux、Mac OSX、Windowsなど)でソフトウェアをダウンロードしてインストールします。
    注: このプロトコルで説明されているすべての計算モデルとシミュレーションは、MCell 3.4 と CellBlender 1.1 を備えた Blender 2.78 を含む CellBlender 1.1 バンドルでテストされました。ブレンダー2.79bでも活躍。これらのソフトウェア プログラムはすべてオープン アクセスで、使用する再印刷のアクセス許可は必要ありません。モデルの構築とシミュレーションの手順は、バージョンごとに若干変更できます。このプロトコルの一部はチェコら16.

2. 単一の樹状脊椎を作成する

注: この手順では、変更された球を使用して、脊椎ヘッドと脊椎の首を持つ単一の樹状脊椎のメッシュを作成します。

  1. メインパネルでブレンダー3Dビューを設定します。
    1. 既にインストールされているセルブレンダーでブレンダーを開きます。キーパッドの5を押して[パースペクティブ]から[直交]ビューに変更し、1を押して正面図に変更します。パース ビューには深さがありますが、これは今は必要ありません。パースペクティブビューから直交ビューに変更すると、メッシュをより見やすく表示できます。Shift+ Cキーを押してカーソルを中央に配置します (図 1A)。
  2. 脊椎ヘッドを作成します。
    1. Shift+ Aキーを押してメッシュ パレットを開きます。メッシュを選択し、UV 球を選択します。UV 球は、球の 3D サーフェスにマッピングされたメッシュです。UV球はキノコ樹状脊柱の球状の頭部を表す。ソフトウェアは、UV球の単位がマイクロメートルであると仮定します。
    2. UV 球を追加パネルでパラメータを変更します。サイズを0.25に変更し、リングを32に変更します (図 1B)。キーパッドの+または–を押して、メッシュのビジュアライゼーションをそれぞれ拡大および縮小します。または、マウスのスクロールボタンを使用してズームイン/ズームアウトを行います(図1C)。
      注: パラメータ サイズ は元の球のサイズをスケーリングし、 パラメータ リング はメッシュの解像度を定義します。
  3. 頭のてっぺんを平らにします。
    1. Tab キーを押して、Blenderをオブジェクトモード(標準オブジェクトインタラクションモード) から編集モードに切り替えます。編集モードで、既存のメッシュのコンポーネントを修正します。
    2. 作成したメッシュが自動的に選択されたら、を押して作成したメッシュの選択を解除します。Zキーを押してメッシュを透明にし、編集するパーツを視覚化するのに役立ちます。メッシュを拡大表示します。マウスで球の上3/4を選択するには、bを押します(図2A)。deleteを押して頂点を選択し、頂点を削除するために入力します (図 2B)。
    3. bを押して、上を選択します。e 、s、0を押して、頂点が選択されたままの上部をシールします。 0青い矢印を下に移動して、脊椎の頭の上端に揃えます (図 2C)。zキーを押して、ソリッドビューに変更します(図3A)。7を押して、トップ ビューに変更します。
      注: 球の上部は、スパインヘッドの PSD 領域をモデル化するために平らにします。
  4. 脊椎の上部のメッシュ解像度を上げるには、まず[ツールとナイフ]を選択します。上の中央にナイフで丸を切ります(図3B)。[ツールとループカットとスライド]を選択します。この手順を 4 回繰り返して、上の中心の周りに 4 つの同心円を作成します (図 3C)。
    注: 同心円は、PSD の解像度を上げる新しいボクセルを追加するために使用されます。
  5. 脊椎首を作成します。
    1. を押してメッシュの選択を解除します。1を押して、正面図に変更します。メッシュを透明にするには、zキーを押します。b を押してから、メッシュの底面を選択します(図4A)。Deleteキーと頂点を押します (図 4B)。b を押して、メッシュの底面を選択します(図4C)。押し出しを作成するには、eとz、 -0.45を押します (図 4D)。
      注: z 軸の位置に -0.45 μm の押し出しが作成されます。 a を 押して、メッシュ全体の選択を解除します。
    2. bを押して首の底を選択します。e 、s、および 0を押して、下端を密封します (図4E)。を押してメッシュ全体を選択します。
  6. MCell とメッシュの互換性を確認します。
    1. Crtl+Tを押してメッシュを三角測量します。メッシュは、相互接続された三角形のセットに変換されます。これは、メッシュを MCell と互換性を持たせるために必要な手順です。[ツール] および [ダブルを削除]を選択します。同じ座標を持つ頂点や、相互に非常に近い頂点がある場合は、Doubles 除去ツールを使用して、メッシュと MCell との互換性を持たせる。
      注: メッシュの作成および編集の処理中に、二重重重ね付けされた頂点が誤って作成された可能性があります。
    2. セルブレンダーパネルでモデルオブジェクトを選択します。アクティブ オブジェクトの名前をスパインに変更し、+を押してオブジェクトのスパインを作成します。[CellBlender] パネルで、[メッシュ解析] を選択し、[メッシュ解析] (図 4F)をクリックします。この手順では、頂点、エッジ、面、表面積、体積、メッシュ トポロジの数など、作成されたメッシュのプロパティを解析します。
      注: 解析は メッシュ解析パネル に情報を出力し、 水密、 マニホールド、 外向きの法線になります。この手順は、メッシュが MCell で動作することを確認するために必要です。それ以外の場合、おそらくステップは見逃されていました。この場合、メッシュを 削除 し、ステップ 2.1 からもう一度開始します。
    3. zキーを押して、脊椎のソリッド ビューを視覚化します。[ファイル]および[保存]を押して、ディスク上にスパインを持つブレンダーファイルのコピーを作成します。
      メモ: メッシュの寸法(長さ、直径、サイズ)はマイクロメートルです。各キーボード ショートカットの意味については、用語集を参照してください。

3. 複数の脊椎を持つ樹状突起の作成

  1. セクション 2.1 ~ 2.6 で説明したように、脊椎を生成します。 a を 押して、脊椎の選択を解除します。 Shift+C キー を押してカーソルを中央に配置します。
  2. 樹状突起を作成します。Shift+ Aキーを押してメッシュ パレットを開きます。[メッシュ]を選択し、[円柱]を選択します。[円柱の追加]メニューのパラメータを変更します:半径= 0.3 μm、深さ= 2 μm。 Enterキーを押します。
    注: パラメータの半径と深さは、樹状突起の幾何学的特性に従って定義されます。
  3. 樹状突起に背骨を挿入します。
    1. rを押して90と入力して、円柱を 90° 回転させます (図 5A)。青い矢印を使用して、円柱をスパインの底までドラッグします。キーパッドの3を押して、シリンダの正面図を表示します。
    2. メッシュを透明にするには、zキーを押します。マウスを使用して、シリンダの青い垂直矢印を下に移動し、脊柱の基部をシリンダの内部に移動します(図5B)。a を押してすべてのオブジェクトの選択を解除します。
    3. マウスの右ボタンを使用して樹状突起を選択します(図5C)。[ブレンダー]パネルの [モディファイヤ ](図5D)を選択し、[ モディファイヤを追加]を選択します。次に、[ ブール] を選択し、[ 操作ユニオン] を選択して、[ オブジェクト スパイン] を選択します。 [適用] を押して、樹状突起と脊椎のジョイント メッシュを作成します(図 5E)。この操作により、2 つのメッシュを 1 つのメッシュにマージする新しいメッシュが作成されます。
      注: 新しいメッシュは、デンドライトとスパインを組み合わせたメッシュになります。分離された樹状突起は、異なるメッシュが結合されると消えますが、分離された脊椎メッシュは新しいメッシュと重なったままで、同じスパインの複数のコピーを生成するために使用されます。メッシュを終了した後、孤立した脊椎をすべて削除します。脊椎首と樹状突起の間に完全な重なりが存在することが重要であり、そうでなければ、メッシュは水密ではありません。
  4. セルブレンダー環境にデンドライト オブジェクトを設定します。
    1. を押してメッシュの選択を解除します。デンドライトをマウスで右クリックし、樹状突起のみを選択します。[CellBlender] を選択し、オブジェクトを選択し、[アクティブ オブジェクト]を[樹型オブジェクト] に変更し、+を押して Dendrite オブジェクトを作成します。
  5. デンドライトに新しい脊椎を挿入します。
    1. 1を押して、円柱の側面に変更します。マウスを使用して、孤立した脊椎のメッシュを選択します。より多くの棘を挿入するには、ステップ3.3に従い、それぞれを挿入する位置と角度を変更して生理学的分布を得る。
  6. MCell とメッシュの互換性を確認します。これを行うには、Tabキーを押して編集モードにします。を押してメッシュ全体を選択します。Crtl+Tを押してメッシュを三角測量します。ブレンダーパネルでツールを選択し、ダブルを削除を選択します。
  7. メッシュをスタイル化します。
    1. メッシュをスムーズにします。Tabキーを押してオブジェクト モードに変更します。ブレンダーパネルでツールを選択し、スムーズを選択します。[セルブレンダー]、[モデル オブジェクト] の順に選択し、[マテリアルの追加]を選択します。
    2. [ オブジェクトの透明] および[マテリアルを透明]を選択して、メッシュ を透明にします。 アルファ を 0.5 に変更し、 入力 してメッシュを部分的に透明にします。 z キーを押して、ソリッドビューに変更します。
  8. メッシュが MCell と互換性があるかどうかを確認します。そのためには、CellBlender パネルのメッシュ解析を選択して、メッシュが水密、マニホールド メッシュ、および外側向きの標準であることを確認します。
  9. ブレンダー ファイルをdendrite_with_spines.blendとして保存します。

4. サーフェス領域の定義

注: この手順では、メッシュのサーフェス領域を作成し、後で使用して領域と分子の相互作用を設定します。

  1. Blender 環境でファイルdendrite_with_spinesを開きます。これを行うには、[ファイル]、[開く]、[dendrite_with_spinesブレンド]、および[ブレンダー ファイルを開く] を選択します。
  2. サーフェス領域を定義するためのメッシュを準備します。これを行うには 、Tab キーを押して 編集モードに変更します。 [Z] を押して透明表示に変更します(ビューポート シェーディング、ワイヤフレーム)。 a を 押して、脊椎のある樹状突起のメッシュ全体を選択します。[ モデル オブジェクト] を選択します。[ デンドライト] を選択します。 T キーを押すと CellBlender パネル が非表示になり、メイン パネルのメッシュ全体が表示されます。
    1. キーパッドで + と – を使用して、マウスをズームインおよびズームアウトしたり、スクロールします。これは、サーフェス領域を選択して定義するために、脊椎の上部をより適切に視覚化するために必要です。 a を 押してオブジェクトの選択を解除します。 Tab キーを押して 編集モードに変更します。 T キーを押して、 セルブレンダー パネル を再び表示します。
  3. PSD サーフェス領域を定義します。これを行うには、bを押して、マウスで樹状脊椎の上部を選択します (図 6A,6B)。[定義されたサーフェス領域]で+を押します。[リージョン名]を[PSD1]に変更し、[割り当て] (図 6C)をクリックします。a を押してオブジェクトの選択を解除します。
  4. シナプス外サーフェス領域を定義します。これを行うには、bを押して、マウスで樹状脊椎の上部の領域を選択します (図 6D)。[領域名]で手順 4.3 を繰り返してExtra_syn1します。他の脊椎に対してステップ 4.3 を繰り返して、メッシュの他の領域(PSD2 、PSD3、PSD4、Extra_syn2 、Extra_syn3、およびPSD4 Extra_syn4)を定義します(図 6F)。 Extra_syn2a を押してオブジェクトの選択を解除します。
  5. 樹状突起の端部のサーフェス領域を定義します。これを行うには、bを押して、樹状突起の左端を選択します。[領域名]をLeft_endに変更し、[割り当て] をクリックします。a を押してオブジェクトの選択を解除します。bを押して、樹状突起の右端を選択します (図 6E)。[領域名]を[Right_endに変更し、[割り当て] をクリックします。
    注: メッシュを移動して、各 定義済み領域を選択する最適な位置を見つけます。

5. 分子を作る

  1. アンペアを作成します。そのためには、セルブレンダーパネルで[分子]を選択します。新しい分子を挿入し、名前をAMPARに変更するには、[定義された分子] を選択します。分子タイプを表面分子に変更し、拡散定数を0.05e-8 cm2/s14に変更して、膜内のAMPAの拡散定数を定義します(図7A)。
  2. アンカーを作成します。そのためには、セルブレンダーパネルで[分子]を選択します。[+定義された分子] を選択して新しい分子を挿入し、[名前]を[アンカー ] に変更します。分子タイプを表面分子に変更し、拡散定数を0.001e-8 cm2/s14に変更して、膜内のアンカーの拡散定数を定義します(図7A)。
  3. アンパーにバインドされたアンカーを作成するには、セルブレンダーパネルで[分子]を選択します。新しい分子を挿入するには、[定義された分子]で[+]を選択します。[名前] を [anchor_AMPAR]に変更します。分子タイプを表面分子に変更する 。拡散定数を0.001e-8 cm2/s14に変更します。
  4. anchor_LTPとanchor_AMPAR_LTPを作成します。これを行うには、手順 5.2 を繰り返します。分子に名前を付けるanchor_LTP。ステップ 5.3 を繰り返します。分子に名前を付anchor_AMPAR_LTP。
    注: anchor_LTP は AMPARに対して高い親和性を持っています。したがって、SYNARsはシナプス領域で増加します。
  5. anchor_LTDを作成し、anchor_AMPAR_LTDします。アンカー_LTDを作成するには、手順 5.2 を繰り返します。分子に名前を付anchor_LTD。ステップ 5.3 を繰り返します。分子に名前を付anchor_AMPAR_LTD。
    注: anchor_LTD は AMPARに対して低い親和性を持っています。したがって、AMPAはシナプス領域において減少する。

6. サーフェスクラスの定義

注: この手順では、サーフェス領域に関連付けられているプロパティを持つクラスを定義します。シナプス外領域は、AMPAR にバインドされたフリーアンカーとアンカーを反映します。デンドライトの横端部は全ての分子を反映する。

  1. シナプス外領域のプロパティを定義します。
    1. Tabキーを押してオブジェクト モードに変更します。セルブレンダー パネルで [サーフェス クラス] を選択します。[サーフェス クラス]で[+]を押して、新しいサーフェス クラスを定義します。
    2. シナプス外領域にアンカー分子に結合したAMPARを反映させます。
      注: この手順では、 アンカー とシナプス領域内でそれらにバインドされているすべてのものをトラップします。
      1. [サーフェス クラス名]を[reflective_extra_synに変更します。reflective_extra_syn+プロパティを押して、分子と関連付けます。分子を選択する|単一分子. [anchor_AMPAR]を選択します。[方向 ] = [無視]を選択します。タイプ=反射を選択して、領域にanchor_AMPAR分子を表示します。
      2. anchor_AMPAR_LTPとanchor_AMPAR_LTDに対して手順 6.1.2.1 を繰り返anchor_AMPAR_LTDします。
    3. シナプス外領域にアンカーを反映 させます。
      1. reflective_extra_syn+プロパティを押して、分子と関連付けます。分子を選択する|単一分子.アンカーを選択します。[方向 ] = [無視]を選択します。タイプ=反射を選択して、アンカー分子を領域に反映させます。
      2. anchor_LTPおよびanchor_LTDに対して、ステップ 6.1.3.1 を繰り返anchor_LTDします。
  2. 樹状突起端のプロパティを定義します。これを行うには、サーフェスクラスで+を押して新しいサーフェスクラスを定義します。[サーフェス クラス名]を[reflective_endsに変更します。プロパティの+を押して、分子に関連付けます。分子を選択する|すべての表面分子.方向を選択する|無視します。タイプを選択する|反射してすべての表面分子を反射させる。

7. 作成したクラスを各サーフェス領域に割り当てる

注: この手順では、サーフェス クラスをサーフェス領域に割り当てます。

  1. 樹状突起の端のプロパティを割り当てます。
    1. [+]を押して、領域を持つサーフェス クラスを割り当てます。[サーフェス クラス名] のreflective_endsを選択します (図 7C)。[オブジェクト名] で [デンドライト] を選択します。[ 領域の選択 ] で[ 指定した領域 ] を選択します。[地域名 ] Left_end を選択します。
    2. Right_endに対してステップ 7.1.1 を繰り返します (図 7D)。
  2. シナプス外領域のプロパティを割り当てます。
    1. [+]を押して、領域を持つサーフェス クラスを割り当てます。[reflective_extra_syn]を選択します。 reflective_extra_syn[オブジェクト名] で [デンドライト] を選択します。[ 領域の選択 ] で[ 指定した領域 ] を選択します。[地域名] Extra_syn1を選択します。
    2. Extra_syn2 、Extra_syn3、およびExtra_syn4に対して、手順 7.2.1 を繰り返します。

8. メッシュ上に分子を配置する

注: この手順では、 アンパル、 アンカー 、AMPAR をメッシュ上のアンカーにバインドします。

  1. AMPAR分子をメッシュ上に配置するには、セルブレンダーパネルで[分子配置]を選択します。リリース/配置サイトで+を押して、新しいリリースサイトを作成します。サイト名をrelAMPARに変更します (図 7B)。分子= AMPAR. オブジェクト/領域=デンドライト[ALL]-(デンドライト[Left_end]+デンドライト[Right_end]) を選択します1,000。
  2. メッシュ上に アンカー 分子を配置します。
    1. セルブレンダーパネルで[分子の配置]を選択します。リリース/配置サイトで+を押して、新しいリリースサイトを作成します。[サイト名]を[rel_anchor_PSD1に変更します。分子アンカーを選択します . オブジェクト/領域=デンドライト[PSD1]. リリースする数量= 200.
    2. PSD2、PSD3、およびPSD4について、ステップ 8.2.1 を繰り返します。
  3. メッシュ上anchor_LTP分子を配置します。そのためには、セルブレンダーパネルで[分子の配置]を選択します。リリース/配置サイトで+を押して、新しいリリースサイトを作成します。[サイト名]を[rel_anchor_LTP_PSD1に変更します。分子= anchor_LTP .オブジェクト/領域=デンドライト[PSD1]. リリースする数量 = 0.
    注: anchor_LTPは、AMPA に対するバインディングアフィニティが高いアンカーです。
  4. anchor_LTDanchor_LTD手順 8.3 を繰り返して、メッシュ上にanchor_LTD分子を配置します。
    注: anchor_LTDは、アンプラーに対する結合アフィニティが低いアンカーです。

9. 化学反応を作る

  1. アンカーとAMPAの間の反応を作成します。 reaction
    1. 反応を作成するには、リアクション(図7D)を選択します。+ を押して新しい反応を含めます。反応物 = アンカー' + AMPAR'. 反応タイプ= <->.これは双方向反応を定義します。製品= anchor_AMPAR'. フォワードレート= 0.03. 後方レート= 0.05.
  2. ANCHOR_LTPとreactionamparsの間の反応を作成します。これを行うには、ステップ 9.1 を繰り返しますが、アンカーをanchor_LTPに置き換え、逆方向レート= 0.005を使用してリアクタント間の親和性を高める。
  3. anchor_LTDとAMPAの間の反応を作成し、ファイルを保存します。これを行うには、ステップ 9.2 を繰り返しますが、アンカーをanchor_LTDに置き換え、逆方向レート= 0.5を使用してリアクタント間の親和性を減らします。次に、ファイルを保存します。

10. モデルの出力をプロットする

  1. 基底条件の間にPSD1でAMPALにバインドされたアンカーをプロットします。これを行うには、[印刷出力設定]を選択します。+を押して分子を定義します。[分子anchor_AMPAR]を選択します。[オブジェクト] で [デンドライト] を選択します。[リージョン] で[PSD1]を選択します。すべての PSD リージョンに対してステップ 10.1 を繰り返します。
    注: 各樹状脊椎の PSD に閉じ込められた AMPAL の基底数を観察すると便利です。 AMPAL にバインドされたアンカーの数は、LTP および LTD の間の基礎条件と比較して増減することができます。
  2. LTP 中にPSD1でAMPA にバインドされたアンカーをプロットします。手順 10.1 を繰り返してこれを行います。anchor_AMPARをanchor_AMPAR_LTPに置き換え、LTD の間にPSD1でAMPA にバインドされたアンカーをプロットし、最後にステップ 10.1 を繰り返しますが、anchor_AMPAR_LTPを anchor_AMPAR_LTDに置き換えます。

11. シミュレーションを実行する

  1. 基底条件を実行するには、[シミュレーションを実行]を選択します。イテレーション= 30,000を選択します。時間ステップ= 1e-3 s を設定します。[エクスポートと実行] を押します。シミュレーションが終了するまで待ちます。数分から数時間かかる場合があります。
    注:基底状態では、anchor_LTPおよびrel_anchor_LTD分子の放出はありません。シミュレーションのパラメータに関しては、反復回数は、樹状突起からのAMPAの拡散とPSDでのアンカーを観察するのに十分な長さである必要があります。時間ステップが小さいほど正確ですが、シミュレーションを完了するには時間がかかります。
  2. [ 視覚化データの再読み込み] を選択します。再生アニメーションを選択して、時間的な結果を視覚化します (図 8)。[印刷出力設定]を選択します。プロットを押す。
    注: CellBlender によって生成されたグラフは、選択した化学種の分離時系列です。サードパーティのプログラムを使用して、複数のシミュレーションから保存されたデータをインポートして、複数の条件の重ね合ったプロットを作成することができます(例えば、基礎、LTP、LTD、 図8を参照)。
  3. ホモシナプス増強条件を実行します (つまり、LTP;図 8を参照)。そのためには、セルブレンダーパネルで[分子の配置]を選択します。[リリース/配置サイト] で [rel_anchor_LTP_PSD1]を選択します。
  4. リリース = 200 に数量を変更します。[リリース/配置サイト] で[rel_anchor_LTD_PSD1]を選択します。リリース = 0に数量を変更0します。[リリース/配置サイト] で[rel_anchor _PSD1]を選択します。リリース = 0に数量を変更0します。ステップ 11.1 ~ 11.2 を繰り返します。
  5. ホモシナプス抑制状態を実行します (つまり、LTD;図 8を参照してください)。これを行うには、rel_ANCHOR_LTP_PSD1ではなくReleaseリリース 200 rel_anchor_LTD_PSD1。rel_anchorとrel_anchor_LTP_PSD1を0に設定します。ステップ 11.1 ~ 11.2 を繰り返します。

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Representative Results

これらの結果は、脊椎の頭部と脊椎の首を持つ樹状脊椎をシミュレートする 3D メッシュの構築手順を提供します (図 1 ~図 4)。また、複数樹状脊椎を単一樹状セグメント(図5)に挿入して、AMPARs14の不均一な可塑性を研究することができる。14脊椎ヘッドの上部にあるPSD(図6)は、シナプスアンカーがAMPARsに結合し、シナプスで一時的にトラップする場所です(図7、図8)。

シナプス可塑性は、各脊椎のanchor_AMPAR、anchor_AMPAR_LTP、anchor_AMPAR_LTDの種anchor_AMPAR数の変化を通anchor_AMPAR_LTDじて、ほぼ検証することができた。シナプス可塑性の発生の正確な計算のために、シナプスでアンカーとフリーのAMPARsの合計数の変動を計算することをお勧めします。これは、サードパーティ製のプログラムを使用して、シミュレーションの保存データを開き、各PSDでフリーのAMPARsとアンカーされたAMPARsの時系列を合計することができます(図8)。

メッシュ上のAMPARsの放出は、樹状突起および樹状棘に沿った確率的ランダムな歩行によって拡散を観察することを可能にした。トランスレーション後の変更やエンドサイトーシスやエキソサイトーシスの速度の変更など、アンカーに対するAMPALの親和性を変更する要因は、PSD24、25、2625,でAMPAL24をトラップすることができます。26PSDに位置するアンカーとのAMPARの結合は、シナプスでAMPAの高密度を閉じ込めました。ホモシナプス増強(図9)およびうつ病(図10)は、基底状態と比較してアンカーによるAMPALの親和性の変化によって引き起こされるアンカーアンパールの数の増加と減少を通じてそれぞれ検証することができる(図11)。アンカーとのAMPARsの親和性を低下させる要因は、1つの樹状脊柱(すなわち、ホモシナプスうつ病)から複数のAMPARsを放出し、隣接する脊椎で異重napitic増強を誘発した。また、1つの脊椎におけるアンカーに対するAMPARsの親和性を増加させる要因は、隣接する脊椎14におけるその脊椎および異感覚吸うつにおけるホモシナプス増強を誘導した。このようにして、異種の可塑性は、所定の脊椎で誘発されるホモシナプス可塑性の隣接する脊椎において反対の効果として観察された。例えば、単一の脊椎でのホモシナプスLTP誘導は、隣接する脊椎に異種鼻電化LTD効果を生み出した(図8E、F、G)。FG

Figure 1
図1:球状メッシュを使用した樹状脊椎頭部の作成(A) UV球を追加する。(B) 球の寸法を設定する。(C) 作成した球を観察する。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:トップ領域の構築(A) 球の上部領域を選択します。(B) 選択した領域を削除してフラットにする。(C)平らなトップを密封する。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図 3: 脊椎の上部に同心円領域を作成する。(A) トップを視覚化する。(B) ナイフを使って同心円状の領域を定義する。(C) 複数の同心領域を作成する。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:樹状脊椎首の作成(A) 変更した球の底面を選択します。(B) 選択した頂点を削除します。(C) 下端を選択します。(D) 底部を押し出して、脊椎首を作成する。(E)脊椎首の底部を密封する。(F) 作成した脊椎の分析。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:複数の脊椎を持つ樹状突起の作成(A) 円筒メッシュを使用して樹状突起を作成する。(B)樹状脊椎を円柱に合わせる。(C) 脊柱と円柱を結合する。(D) メッシュを結合するためのブール演算。(E) 新しい結合メッシュ。(F) 2 つ目の脊椎を追加する。(G) 3つ目の脊椎を追加する。(H) 4つ目の脊椎を追加する。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 6
図6:PSD領域とペリシナプティックゾーンの定義(A) PSD 領域の選択(B) 作成された PSD の詳細ビュー。(C) PSD サーフェス領域を定義する。(D) PSD周辺のペリシナプティックゾーンを選択して定義する。(E) 樹状突起の側面を選択して定義する。(F) 定義されたサーフェス領域。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 7
図7:表面分子の定義(A) アンカーにバインドされた AMPAR、アンカー、および AMPAR を定義します。(B) AMPAR コピーの場所と数量を定義する。(C) サーフェスクラスの定義(D) サーフェスクラスの割り当て。(E) 分子間の化学反応を作り出す。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 8
図8:シナプス可塑性の代表結果。(A) 2、4、または8つの脊椎を持つ樹状セグメントの異なるメッシュ。(B) 8つの脊椎を有する樹状セグメントの異なるビュー。(C) PSDでのアンドルとアンカーを持つ樹状脊椎の詳細図。(D) アンカーとの相互作用による PSD の出入りによる AMPARs の入稿の図。(E-G)カーブは、基礎条件および LTP および LTD の間の各 PSD におけるシナプス AMPA の数を示しています。単一の脊椎でのホモシナプスLTPまたはLTDの誘導は、2つの脊椎(E)、4つの脊椎(F)、および8つの脊椎(G)を有するメッシュの近くの脊椎に異種吸刺激効果を生み出した。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 9
図9:LTP状態の代表的な結果。(A) X 軸は時間、y 軸は PSD1 の複合anchor_LTP_AMPARの数です。シミュレーションの開始時に200の無料anchor_LTPのリリースがありました。基礎条件と比較してアンカーを持つ結合の数が多い (図 11)この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 10
図10:LTD条件の代表結果。(A) X 軸は時間、y 軸は PSD1 の複素anchor_LTD_AMPARの数です。シミュレーションの開始時に200の無料anchor_LTDのリリースがありました。アンカーを持つ結合の数が少ない場合、基底条件と比較して形成された (図 11)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 11
図11:基底状態時の代表的な結果。(A) X 軸は時間、y 軸は PSD1 の複素数anchor_AMPAR数です。シミュレーションの開始時に200のフリーアンカーのリリースがありました。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

この記事では、樹状棘を持つ樹状セグメントにおける反応拡散シナプス可塑性プロセスをモデリングするための3Dメッシュの構築方法を紹介します。開発されたモデルには樹状棘の少ない樹状線が含まれています。シナプスアンカーを用いたAMPALの横拡散と反応により、基底ダイナミクスのシミュレーションが可能です。プロトコルの重要なステップは、脊椎頭部の上部(図1、図2、図3)、脊椎首を作成するための押し出し(図4)、および樹状突起と脊椎の結合を単一のメッシュに結合するための球を切断することです(図5)。脊椎の首と樹状突起の間に完全な重なりがあってはなかなか重要です。そうしないと、メッシュは水密ではありません。その他の重要なステップは、膜領域の選択と表面クラスの定義である(図6、図7)。重要なステップごとにファイルを別の名前で保存します。

メッシュ解析ツールを使用して、単一の脊椎を作成した後、およびスパインとの結合樹状突起を作成した後に、メッシュが水密、マニホールド、および外側向きの法線であることを確認します。メッシュがこの解析に失敗した場合は、最後に保存した正しいバージョンに戻ります。インストールされているソフトウェアのバージョン、オペレーティング システム、およびキーボードの種類によって、手順が若干異なる場合があります。

このプロトコルは、3Dメッシュ(図8、図9、図10、図11)におけるAMPAR分子の入稿をシミュレートし、神経興奮伝達およびシナプス可塑性の鍵となる。3Dメッシュにおける単一分子の密売は、分子21,22の均質な分布を有する十分に混合された体積に基づく既存の方法に関するこのモデルの貴重な特徴であり、22これはシナプス27における生理学的状態ではない。この手法の限界は、高い計算コストと、各分子のコピーの数が多く、それらの間の化学反応の数が多いシミュレーションの速度が遅いということです。この制約は、各種のコピー数を減らすことによって克服することができます。

現実的な3Dメッシュと分子の時空間的な追跡を持つシステムの構築は、多数の非線形変数を持つシステムの機能に関する大きな洞察を与えることができる機械的シナリオをテストするための強力なツールです。

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Disclosures

著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。

Acknowledgments

この研究の一部は、サンパウロ州科学財団(FAPESP)助成金#2015/50122-0およびIRTG-GRTK 1740/2、IBM/FAPESP助成金#2016/18825-4、およびFAPESP助成金#2018/06504-4によって支えられました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blender Blender Foundation https://www.blender.org/
CellBlender University of Pittsburgh https://mcell.org/
Mcell University of Pittsburgh https://mcell.org/

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References

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神経科学、問題159、AMPA受容体の密売、反応拡散、シナプス可塑性、樹状棘、計算モデリング、長期増強、長期うつ病、不均一可塑性
シナプス可塑性を用いた樹状脊椎の3Dモデリング
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Antunes, G., Simoes de Souza, F. M. 3D Modeling of Dendritic Spines with Synaptic Plasticity. J. Vis. Exp. (159), e60896, doi:10.3791/60896 (2020).

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