Summary
이 프로토콜은 시냅스 가소성을 모델링하기 위한 수지상 척추가 있는 수지상 세그먼트의 3차원(3D) 모델을 개발합니다. 생성 된 메쉬는 CellBlender 및 MCell을 사용하는 소프트웨어 프로그램 블렌더를 사용하여 장기 시냅스 가소성에서 AMPA 수용체 인신 매매의 전산 모델링에 사용할 수 있습니다.
Abstract
3차원(3D) 기하학에서 화학종의 확산 및 반응의 전산 모델링은 수지상 척추에서 시냅스 가소성의 메커니즘을 이해하는 근본적인 방법입니다. 이 프로토콜에서, 원더라이트와 수지상 척추의 상세한 3D 구조는 CellBlender와 소프트웨어 블렌더에 메싱으로 모델링된다. 시냅스 및 외향적 영역은 메시에 정의됩니다. 다음으로, 시냅스 수용체와 시냅스 앵커 분자는 확산 상수로 정의됩니다. 마지막으로 시냅스 수용체와 시냅스 앵커 간의 화학 반응이 포함되고 계산 모델은 소프트웨어 MCell을 통해 수치적으로 해결된다. 이 방법은 3D 기하학적 구조의 모든 단일 분자의 현면 경로를 설명합니다. 따라서 시냅스 가소성이 발생되는 동안 수지상 척추 안팎의 시냅스 수용체의 인신 매매를 연구하는 것이 매우 유용하다. 이 방법의 한계는 분자의 높은 수가 시뮬레이션의 속도를 느리게한다는 것입니다. 이 방법으로 수지상 척추를 모델링하면 이웃 수지상 척추 사이의 단일 척추 및 이종 내수 가소성 내에서 균질성 전능성 및 우울증을 연구할 수 있습니다.
Introduction
시냅스 가소성은 학습 및 메모리1과관련이 있습니다. 시냅스 가소성, 장기 전성(LTP) 및 장기 우울증(LTD)과 같은 시냅스 가소성은 시냅스 멤브레인2안팎에서 AMPA 수용체(AMPARs)의 삽입 및 제거와 각각 연관된다. AMPAR 시냅스는 수지상 척추3이라는작은 볼륨 구조 위에 있습니다. 각 척추는 포스트 냅 스 밀도라는 포스트 냅 스 막에 단백질 조밀 한 영역을 포함 (PSD). 시냅스 부위의 PSD 트랩 AMPAR에서 단백질을 고정합니다. 단일 시냅스 내에 AMPARs의 몇 사본이 있으며 수지상 척추에서 다른 종과의 AmpARs의 인신 매매 및 반응은 금세 과정2,,4입니다. 수지상 척추,5,6,,7,8에서시냅스 수용체 인신 매매의 여러 구획 모델이 있다.7 그러나, 수상달레의 3D 구조와 수지상 척추의 시냅스 가소성과 관련된 AMPARs의 인신 매매의 스토세스 전산 모델의 부족이 있다.
전산 모델링은 시냅스 가소성9,10,11,12의발생 시 수지상 척추에서 AMPARs의 반응 확산과 같은 복잡한 시스템의 역학의 근본적인,메커니즘을조사하는 유용한 도구이다., 이 모델은 복잡한 시나리오를 시각화하고 민감한 매개 변수를 다양하게 시각화하고 실험12,,13을제어하기 어렵거나 불가능한 많은 변수를 포함하는 과학적 조건에서 중요한 예측을 하는 데 사용할 수 있습니다. 계산 모델의 세부 수준을 정의하는 것은 모델링된 현상에 대한 정확한 정보를 얻는 근본적인 단계입니다. 이상적인 계산 모델은 복잡성과 단순성 사이의 섬세한 균형으로 계산금지 없이 자연 현상의 본질적인 특성을 포착합니다. 너무 상세한 계산 모델은 계산비용이 많이 들 수 있습니다. 반면에, 제대로 상세하지 않은 시스템은 현상의 역학을 포착하는 데 필수적인 기본 구성 요소가 부족할 수 있습니다. 수지상 척추의 3D 모델링은 2D 및 1D보다 계산적으로 비용이 많이 들지만, 많은 비선형 변수가 시간과 3D 공간에서 반응하고 확산되는 복잡한 시스템에서와 같은 조건이 있으며, 3D 수준에서 모델링하는 것은 시스템의 기능에 대한 통찰력을 얻는 데 필수적입니다. 또한, 저차원 모델의 본질적인 특성을 보존하기 위해 복잡성을 신중하게 줄일 수 있다.
소량 내에서 주어진 종의 복사본이 거의 없는 관면 시스템에서 시스템의 평균 역학은 큰 인구의 평균 역학에서 벗어난다. 이 경우 반응 확산 입자의 스토세스 전산 모델링이 필요합니다. 이 작품은 3D 수지상 척추에 AMPAR의 몇 복사본의 stochastic 모델링 반응 확산을위한 방법을 소개합니다. 이 방법의 목적은 수지상 척추와 시냅스 가소성을 모델링하기 위한 시냅스를 가진 수지상 세그먼트의 3D 전산 모델을 개발하는 것입니다.
이 방법은 3D 메쉬를 생성하기 위한 모델, 3D 메쉬를 구성하는 블렌더 및 CellBlender를 사용하여 3D meshes14,,15,,16에서분자의 현면 반응 확산을 포함하여 MCell 시뮬레이션을 생성하고 시각화한다. 블렌더는 메쉬를 만들기 위한 제품군이며 셀블렌더는 기본 소프트웨어 블렌더의 추가 기능입니다. MCell은 단일분자(17)의반응 확산을 위한 몬테 카를로 시뮬레이터이다.
이 방법의 사용 뒤에 근거는 수지상 척추의 미세 생리 환경에서이 현상의 더 나은 이해를 달성하기 위해 시냅스 가소성을 모델링으로구성된다(14). 특히, 이 방법은 수지상척추(14)사이의 동종성 전성, 균질성 우울증 및 이질성 가소성의 시뮬레이션을 허용한다.
이 방법의 특징은 원점과 시냅스의 3D 기하학적 구조를 모델링, 무작위 보행에 의한 확산, 시냅스 가소성과 관련된 분자의 화학 반응을 포함한다. 이 방법은 가설을 테스트하고 많은 수의 변수를 가진 복잡한 비선형 시스템의 기능에 대해 예측하기 위해 풍부한 환경을 만드는 이점을 제공합니다. 또한, 이 방법은 시냅스 가소성을 연구할 뿐만 아니라 일반적으로 3D 메쉬 구조에서 분자의 조직반응 확산을 연구하기 위해서도 적용될 수 있다.
대안적으로, 수지상 구조물의 3D 근접체는 전자 현미경 직렬재구성(18)으로부터블렌더에서 직접 구성될 수 있다. 직렬 재구성을 기반으로 하는 meshe가 3D 구조를 제공하지만 실험 데이터에 대한 액세스를 항상 사용할 수 있는 것은 아닙니다. 따라서, 본 프로토콜에 설명된 바와 같이 기본 기하학적 구조로부터 조정된 메싱의 시공은 수지상 척추를 가진 맞춤형 수지상 세그먼트를 개발할 수 있는 유연성을 제공한다.
또 다른 대체 계산 방법은 정규 부피9,,,,10,11,19,20,,,21, 21,,22에서잘 혼합된 반응의 벌크 시뮬레이션이다.20 벌크 시뮬레이션은 단일 잘 혼합 된부피(23)내에서 많은 종의 반응을 해결하는 데 매우 효율적이지만, 대량 접근법은 고해상도 3D 메쉬에서 많은 잘 혼합 된 복셀 내에서 분자의 반응 확산을 해결하는 데 매우 느립니다. 한편, 개별 입자의 반응 확산의 MCell 시뮬레이션을 이용한 본 방법은 고해상도 3D메시(15)에서효율적으로 작동한다.
이 방법을 사용하기 전에 연구된 현상이 3D 메시에서 관면 반응 확산 접근법이 필요한지 물어봐야 합니다. 이 현상이 수지상 척추와 같은 작은 부피 구획을 가진 복잡한 기하학적 구조에서 확산되는 반응종 중 적어도 하나의 사본(1,000 미만)이 있는 경우, 3D 메시에서 반응 확산의 재차 적 모델링이 적용에 적합하다.
시냅스 가소성을 가진 수지상 척추를 포함하는 수지상 세그먼트의 3D 계산 모델을 구성하는 데 필요한 몇 가지 단계가 있습니다. 주요 단계는 모델의 건설을위한 적절한 소프트웨어의 설치, 여러 개의 척추를 만들기 위해 템플릿으로 사용되는 단일 수지상 척추의 건설, 여러 수지상 척추와 연결된 수지상 세그먼트의 생성입니다. 시냅스 가소성을 모델링하는 단계는 수지상 세그먼트 및 수지상 척추에 PSD 영역 및 AMPAR에 앵커를 삽입하는 것으로 구성됩니다. 이어서, PSD와 AMPAR에 위치한 앵커 들 간의 운동 반응은 시냅스 영역에서 AMPARs를 트랩하는 복잡한 앵커-AMPAR 종을 생성하도록 정의된다. 각각, 앵커와 시냅스 AMPARs 간의 선호도의 증가 및 감소는 LTP 및 LTD의 프로세스를 생성한다.
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Protocol
참고: 이 프로토콜에 사용된 용어체에 대한 보충 파일 1을 참조하십시오.
1. 블렌더, 셀블렌더 및 MCell 설치
참고: 이 프로토콜에는 MCell, 블렌더 및 셀 블렌더를 설치해야 합니다.
- MCell 홈페이지(https://mcell.org/tutorials_iframe.html)에 소프트웨어를 다운로드하고 설치합니다. 페이지 상단에 있는 다운로드로 이동한 다음 단계별 지침을 따라 선택한 환경(예: Linux, Mac OSX 또는 Windows)에서 소프트웨어를 다운로드하고 설치합니다.
참고: 이 프로토콜에 설명된 모든 계산 모델 및 시뮬레이션은 MCell 3.4 및 CellBlender 1.1이 있는 블렌더 2.78을 포함하는 CellBlender 1.1 번들에서 테스트되었습니다. 그것은 또한 블렌더 2.79b에 일했다. 이러한 모든 소프트웨어 프로그램은 열려 있는 액세스이며 재인쇄 권한이 필요하지 않습니다. 모델의 구성 및 시뮬레이션에 대한 지침은 한 버전에서 다른 버전으로 약간 변경될 수 있습니다. 이 프로토콜의 일부는 체코 등에서 적응되었습니다.16.
2. 수지상 척추 를 하나 만드세요
참고: 이 절차는 변형된 구를 사용하여 척추 머리와 척추 목이 있는 단일 수지상 척추의 메쉬를 만듭니다.
- 메인 패널에서 블렌더 3D 뷰를 설정합니다.
- 셀 블렌더가 이미 설치된 오픈 블렌더. 키패드에서 5를 눌러 관점에서 직교보기로 변경하고 1을 눌러 앞보기로 변경합니다. 관점보기에는 깊이가 있지만 지금은 필요하지 않습니다. 원근에서 직교 보기로 변경하면 메시를 더 잘 시각화할 수 있습니다. 커서(그림1A)를중심으로 시프트+C를 누릅니다.
- 척추 머리를 만듭니다.
- 시프트+A를 눌러 메시 팔레트를 엽니다. 메시를 선택한 다음 UV 구를 선택합니다. UV 구는 구의 3D 표면에 매핑된 메시입니다. UV 구는 버섯 수지상 척추의 구형 머리를 나타냅니다. 소프트웨어는 UV 구체의 단위가 마이크로미터라고 가정합니다.
- UV 구 추가 패널의 매개 변수를 변경합니다. 크기를 0.25로 변경하고 링은 32로 변경합니다(그림1B). + 또는 – 키패드에서 각각 메시의 시각화를 확대/축소합니다. 또는 마우스의 스크롤 버튼을 사용하여 확대/축소(그림1C)를사용합니다.
참고: 매개 변수 크기는 원래 구의 크기를 조정하고 매개 변수 링은 메시의 해상도를 정의합니다.
- 머리의 상단을 평평하게 만드십시오.
- 탭을 눌러 표준 개체 상호 작용 모드인 오브젝트 모드에서 블렌더를 편집 모드로 전환합니다. 기존 메시의 구성 요소를 수정하기 위한 편집 모드에서 작업합니다.
- 생성된 메시가 자동으로 선택되면 a를 눌러 생성된 메시의 선택을 취소합니다. z를 눌러 메시를 투명하게 만들면 편집할 부품을 시각화하는 데 도움이 됩니다. 메시를 확대합니다. b를 눌러 마우스로 구의 상위 3/4를 선택합니다(그림2A). 삭제를누르고 정점을선택하고 정점을 제거하기 위해 입력합니다(그림2B).
- b를 누르고 상단을 선택합니다. e, s, 0을 누르고 정점이 여전히 선택된 채 상단을 밀봉합니다. 파란색 화살표를 아래로 이동하여 척추 머리 의 상단에 정렬합니다(그림2C). Z를 눌러 솔리드 뷰로 변경합니다(그림3A). 7을 눌러 상단 보기로 변경합니다.
참고: 구의 상단은 척추 헤드의 PSD 영역을 모델링하기 위해 평평하게 만들어집니다.
- 척추 의 상단에 있는 메쉬 해상도를 높이기 위해 먼저 도구및 나이프를선택한다. 상단의 중앙 에 칼로 원을 잘라(그림 3B). 도구 및 루프 절단 및 슬라이드를 선택합니다. 이 단계를 네 번 반복하여 상단의 중심 주위에 4개의 동심 원을만듭니다(그림 3C).
참고: 동심 원은 PSD의 해상도를 높이는 새 복셀을 추가하는 데 사용됩니다. - 척추 목을 만듭니다.
- 메시를 선택 해제하려면 누릅니다. 1을 눌러 전면 뷰로 변경합니다. z를 눌러 메시를 투명하게 만듭니다. b를 누간 다음 메시의 바닥을 선택합니다(그림4A). 삭제 및 정점을 누릅니다(그림4B). b를 누르고 메시의 바닥을 선택합니다(도4C). e 및 z, -0.45를 눌러 압출(도4D)을만듭니다.
참고: 이것은 -0.45 μm에서 z 축 위치에 압출을 만듭니다. 전체 메시의 선택을 취소하려면 a를 누릅니다. - b를 누르고 목 의 바닥을 선택합니다. e, s, 0을 눌러 바닥을 밀봉합니다(그림4E). 전체 메시를 선택하려면 a를 누릅니다.
- 메시를 선택 해제하려면 누릅니다. 1을 눌러 전면 뷰로 변경합니다. z를 눌러 메시를 투명하게 만듭니다. b를 누간 다음 메시의 바닥을 선택합니다(그림4A). 삭제 및 정점을 누릅니다(그림4B). b를 누르고 메시의 바닥을 선택합니다(도4C). e 및 z, -0.45를 눌러 압출(도4D)을만듭니다.
- 메시를 MCell과 호환합니다.
- Crtl+T를 눌러 메시를 삼각형으로 삼각조합니다. 메시는 상호 연결된 삼각형 집합으로 변환됩니다. 메시를 MCell과 호환하도록 하는 데 필요한 절차입니다. 도구를 선택하고 두 배 제거합니다. 두 배로 제거 도구를 사용하여 동일한 좌표가 있거나 서로 매우 가까운 중복 된 정점을 제거하여 메시를 MCell과 호환되도록 합니다.
참고: 메시 생성 및 편집 과정에서 이중 중첩 된 정점이 실수로 생성되었을 수 있습니다. - 셀블렌더 패널에서 모델 개체를 선택합니다. 활성 개체의 이름을 척추로 변경하고 +를 눌러 오브젝트 척추를 만듭니다. CellBlender 패널에서 메시 분석을 선택한 다음 메시 분석(그림 4F)을클릭합니다. 이 프로시저는 정점, 모서리, 면, 표면적, 볼륨 및 메시 토폴로지 수를 포함하여 생성된 메시의 속성을 분석합니다.
참고: 분석은 메시 분석 패널에 정보를 인쇄하고 방수, 매니폴드및 바깥쪽을 향한 노멀이어야 합니다. 이 단계는 메시가 MCell에서 작동하는지 확인하는 데 필요합니다. 그렇지 않으면 한 단계가 누락되었을 수 있습니다. 이 경우 메시를 삭제하고 2.1 단계에서 다시 시작합니다. - z를 눌러 척추의 견고한 뷰를 시각화합니다. 파일을 누르고 저장하여 디스크에 척추가 있는 블렌더 파일의 복사본을 저장합니다.
참고: 메쉬의 치수(예: 길이, 직경, 크기)는 마이크로미터에 있습니다. 각 키보드 단축컷의 의미에 대한 용어집을 참조하십시오.
- Crtl+T를 눌러 메시를 삼각형으로 삼각조합니다. 메시는 상호 연결된 삼각형 집합으로 변환됩니다. 메시를 MCell과 호환하도록 하는 데 필요한 절차입니다. 도구를 선택하고 두 배 제거합니다. 두 배로 제거 도구를 사용하여 동일한 좌표가 있거나 서로 매우 가까운 중복 된 정점을 제거하여 메시를 MCell과 호환되도록 합니다.
3. 여러 개의 척추가 있는 수상자 만들기
- 섹션 2.1-2.6에 앞에서 설명한 대로 척추를 생성합니다. 척추를 선택 해제하려면 누릅니다. 커서를 중심으로 시프트+C를 입력합니다.
- 수상월을 만듭니다. 시프트+A를 눌러 메시 팔레트를 엽니다. 메시를 선택한 다음 실린더를 선택합니다. 실린더 추가 메뉴의 매개 변수 변경: 반지름 = 0.3 μm, 깊이 = 2 μm. Enter를 누릅니다.
참고: 매개변수 반지름과 깊이는 수상자의 기하학적 특성에 따라 정의됩니다. - 선인단에 척추를 삽입합니다.
- r 및 타입 90을 눌러 실린더 90°(그림 5A)를회전시합니다. 파란색 화살표를 사용하여 원통을 척추 바닥으로 드래그합니다. 키패드에서 3을 눌러 실린더의 전면 보기를 갖습니다.
- z를 눌러 메시를 투명하게 만듭니다. 마우스를 사용하여 원통의 파란색 정상 화살표를 아래쪽으로 이동하여 척추의 기저선을 실린더의 내부로 이동시(도5B). 모든 개체의 선택을 취소하려면 a를 누릅니다.
- 원더라이트(그림5C)를선택하려면 마우스의 오른쪽 버튼을 사용합니다. 블렌더패널(그림 5D)에서 수정자를 선택하여 수정자 추가를 선택합니다. 그런 다음 부울을선택하고 작업 조합을선택하고 오브젝트 척추를 선택합니다. 눌러 서 원원과 척추의 조인트 메쉬를 작성합니다(도5E). 이 작업은 두 개의 메시를 하나의 메시로 병합하는 새 메시를 만듭니다.
참고: 새 메쉬는 결합된 점선과 척추가 됩니다. 서로 다른 메시가 결합되면 격리된 원더라이트가 사라지지만 격리된 척추 메시가 새 메시와 겹쳐져 동일한 척추의 여러 복사본을 생성하는 데 사용됩니다. 메시를 완료한 후 격리된 모든 가시를 삭제합니다. 척추 목과 원더라이트 사이에 완전한 겹침이 있는 것이 중요하며, 그렇지 않으면 메쉬가 방수되지 않습니다.
- Dendrite 오브젝트를 셀블렌더 환경으로 설정합니다.
- 메쉬의 선택을 취소하려면 누릅니다. 마우스로 수상월리에서 마우스를 마우스로 마우스로 마우스로 마우스로 마우스로 마우스를 마우스로 마우스오른쪽 단추로 클릭하여 선자일만 선택합니다. 셀블렌더, 모델 오브젝트를선택하고 활성 오브젝트를 원더라이트로 변경하고 +를 눌러 Dendrite 개체를 만듭니다.
- 수상월에 새 가시를 삽입합니다.
- 1을 눌러 실린더의 측면 뷰로 변경합니다. 마우스를 사용하여 격리된 척추의 메시를 선택합니다. 더 많은 척추를 삽입하려면, 단계 3.3을 따르며, 생리적 분포를 얻기 위해 각각의 위치를 삽입하는 위치와 각도를 변경한다.
- 메시를 MCell과 호환합니다. 이렇게 하려면 탭을 눌러 편집 모드로 이동합니다. 전체 메시를 선택하려면 a를 누릅니다. Crtl+T를 눌러 메시를 삼각형으로 삼각조합니다. 블렌더 패널에서 도구를 선택하고 더블 제거를 선택합니다.
- 메쉬를 양식에 지정합니다.
- 메시를 부드럽게 합니다. 탭을 눌러 개체 모드로 변경합니다. 블렌더 패널에서 도구를 선택하고 부드러운 을 선택합니다. 셀블렌더, 모델 오브젝트를선택하고 재질 추가를 선택합니다.
- 오브젝트투명 및 재질 투명을선택하여 메시를 투명하게 만듭니다. 알파를 0.5로 변경하고 메시를 부분적으로 투명하게 만들기 위해 입력합니다. Z를 눌러 솔리드 뷰로 변경합니다.
- 메시가 MCell과 여전히 호환되는지 확인합니다. 이렇게 하려면 CellBlender 패널에서 메시 분석을 선택하여 메시가 여전히 방수, 매니폴드 메시및 바깥쪽을 향하지않는 정상인지 확인합니다.
- 블렌더 파일을 dendrite_with_spines.blend로 저장합니다.
4. 표면 영역 정의
참고: 이 절차는 나중에 영역이 분자와 상호 작용하는 방식을 설정하는 데 사용되는 메시의 표면 영역을 만듭니다.
- 블렌더 환경에서 파일 dendrite_with_spines 엽니다. 이렇게 하려면 파일, 열기, dendrite_with_spines.blend및 블렌더 파일을 엽니다.
- 서피스 영역을 정의하기 위해 메시를 준비합니다. 이렇게 하려면 탭을 눌러 편집 모드로 변경합니다. 투명보기(뷰포트 샤딩, 와이어프레임)로변경하려면 z를 누릅니다. 가스와 함께 수상자의 전체 메시를 선택하려면 a를 누릅니다. 모델 객체를 선택합니다. 덴드라이트를 선택합니다. T를 눌러 CellBlender 패널을 숨기고 메인 패널의 전체 메시를 더 잘 시각화합니다.
- + 및 – 키패드에서 마우스로 확대 및 축소하거나 스크롤합니다. 이는 표면 영역을 선택하고 정의하기 위해 척추 상단을 더 잘 시각화하는 데 필요합니다. 개체의 선택을 취소하려면 a를 누릅니다. 탭을 눌러 편집 모드로 변경합니다. T를 눌러 셀 블렌더 패널을 다시 표시합니다.
- PSD 표면 영역을 정의합니다. 이렇게 하려면 b를 누르고 마우스로 수지상 척추의 상단을선택합니다(그림 6A,6B). 정의된 표면 영역에 + 누릅니다. 지역 이름을 PSD1로 변경하고 할당(그림 6C)을클릭합니다. 개체의 선택을 취소하려면 a를 누릅니다.
- 외향적 표면 영역을 정의합니다. 이렇게 하려면 b를 누르고마우스(도 6D)로수지상 척추 의 상단 주위 영역을 선택합니다. 지역 이름에 대해 4.3단계를 반복하여 Extra_syn1.. 다른 척추에 대해 4.3단계를 반복하여 메시의 다른영역(PSD2, PSD3, PSD4, Extra_syn2, Extra_syn3및Extra_syn4)(그림 Extra_syn46F)을정의한다. 개체의 선택을 취소하려면 a를 누릅니다.
- 끝의 표면 영역을 정의합니다. 이렇게 하려면 b를 누르고 원더라이트의 왼쪽 끝을 선택합니다. 지역 이름을 Left_end 변경하고 할당을 클릭합니다. 개체의 선택을 취소하려면 a를 누릅니다. b를 누르고 원더라이트의 오른쪽 끝을 선택합니다(그림6E). 지역 이름을 Right_end 변경하고 할당을 클릭합니다.
참고: 메시를 이동하여 정의된 각 리전을선택하는 최적의 위치를 찾습니다.
5. 분자 만들기
- AMPA를 만듭니다. 이렇게 하려면 셀블렌더 패널에서 분자를 선택합니다. 정의된 분자에서 + 를 선택하여 새로운 분자를 삽입하고 이름을 AMPAR로변경합니다. 분자 유형을 표면 분자 및 확산 상수0.05e-8 cm Diffusion Constant 22/s14로 변경하여 멤브레인내 AMPARs의 확산 상수를 정의한다(도7A).
- 앵커를 만듭니다. 이렇게 하려면 셀블렌더 패널에서 분자를 선택합니다. 정의된 분자에서 +를 선택하여 새 분자를 삽입하고 이름을 앵커로변경합니다. 분자 유형을 표면 분자로 변경하고 확산 상수를 0.001e-8cm2/s14로 변경하여 멤브레인내 앵커의 확산 상수를 정의한다(도7A).2
- AMPARs에 바인딩된 앵커를 만들려면 셀블렌더 패널에서 분자를 선택합니다. 정의된 분자에서 + 새로운 분자를 삽입합니다. 이름을 anchor_AMPAR. 분자 유형을 표면 분자로변경합니다. 확산 상수를 0.001e-8cm2/s14로변경합니다./s
- anchor_LTP 만들고 anchor_AMPAR_LTP.. 이렇게 하려면 5.2 단계를 반복하십시오. 분자의 이름을 anchor_LTP. 5.3 단계를 반복합니다. 분자의 이름을 anchor_AMPAR_LTP.
참고: anchor_LTP AMPAR에대한 높은 선호도를 가지고 있습니다. 따라서, AMPARs는 시냅스 영역에서 증가한다. - anchor_LTD 만들고 anchor_AMPAR_LTD. 앵커 _LTD만들려면 5.2단계를 반복합니다., 분자의 이름을 anchor_LTD. 5.3 단계를 반복합니다. 분자의 이름을 anchor_AMPAR_LTD.
참고: anchor_LTD AMPAR에 대한 선호도가 낮습니다. 따라서, AMPARs는 시냅스 영역에서 감소한다.
6. 서피스 클래스 정의
참고: 이 절차는 서피스 영역과 연결된 속성으로 클래스를 정의합니다. 외향적 영역은 AMPAR에 바인딩된 무료 앵커와 앵커를 반영합니다. 수상장의 측면 끝은 모든 분자를 반영합니다.
- 외향적 영역의 속성을 정의합니다.
- 탭을 눌러 개체 모드로 변경합니다. 셀블렌더 패널에서 표면 클래스를 선택합니다. Surface 클래스에서 +를 눌러 새 표면 클래스를 정의합니다.
- 외계 영역이 앵커 분자에 바인딩된 AMPAR를 반영하도록 합니다.
참고: 이 절차는 앵커와 시냅스 영역 내에서 바인딩된 모든 것을 트래핑합니다.- reflective_extra_syn 표면 클래스 이름을 변경합니다. reflective_extra_syn reflective_extra_syn 특성에 + 눌러 분자와 연결합니다. 분자 선택 | 단일 분자. anchor_AMPAR 선택합니다. 방향 선택 = 무시합니다. 유형 = 반사를 선택하여 영역이 anchor_AMPAR 분자를 표시하도록 합니다.
- anchor_AMPAR_LTP 및 anchor_AMPAR_LTD 경우 6.1.2.1 단계를 반복하십시오.
- 초대형 영역이 앵커를 반영합니다.
- reflective_extra_syn 특성에 + 눌러 분자와 연결합니다. 분자 선택 | 단일 분자. 앵커를선택합니다. 방향 선택 = 무시합니다. 유형 = 반사를 선택하여 영역이 앵커 분자를 반영하도록 합니다.
- anchor_LTP 및 anchor_LTD 위해 6.1.3.1 단계를 반복하십시오.
- 끝끝의 속성을 정의합니다. 이렇게 하려면 Surface 클래스에서 +를 눌러 새 표면 클래스를 정의합니다. reflective_ends 표면 클래스 이름을 변경합니다. reflective_ends 속성에 + 눌러 분자와 연결합니다. 분자 선택 | 모든 표면 분자. 방향 선택 | 무시합니다. 유형 선택 | 반사하여 모든 표면 분자를 반영합니다.
7. 생성된 클래스를 각 표면 영역에 할당합니다.
참고: 이 단계는 표면 클래스를 표면 영역에 할당합니다.
- 수상월리 끝의 속성을 할당합니다.
- +를 눌러 영역을 사용하여 표면 클래스를 할당합니다. Surface 클래스 이름(그림 7C)에대한 reflective_ends 선택합니다. 개체 이름에 대한 Dendrite를 선택합니다. 지역 선택을 위해 지정된 지역을 선택합니다. 지역 이름에 대한 Left_end 선택합니다.
- Right_end 7.1.1을 반복합니다(그림7D).
- 외향적 영역의 속성을 할당합니다.
- +를 눌러 영역을 사용하여 표면 클래스를 할당합니다. Surface 클래스 이름에 대한 reflective_extra_syn 선택합니다. 개체 이름에 대한 Dendrite를 선택합니다. 지역 선택을 위해 지정된 지역을 선택합니다. 지역 이름에 대한 Extra_syn1 선택합니다.
- Extra_syn2, Extra_syn3및 Extra_syn4 위해 7.2.1 단계를 반복하십시오.
8. 메쉬에 분자를 놓습니다.
참고: 이 단계에서는 AMPAR,앵커 및 AMPAR가 메시의 앵커에 바인딩되어 있습니다. anchors
- AMPAR 분자를 메시에 배치하려면 셀블렌더 패널에서 분자 배치를 선택합니다. 릴리스/게재 위치 사이트에서 + 누를 수 있으며 새 릴리스 사이트를만듭니다. 사이트 이름을 relAMPAR로 변경합니다(그림7B). 분자 = AMPAR. 개체 / 영역 = Quantity to Release Dendrite [all]-(dendrite[Left_end]+dendrite[Right_end])를( 1,000선택합니다. ).
- 앵커 분자를 메시에 놓습니다.
- 셀블렌더 패널에서 분자 배치를 선택합니다. 릴리스/게재 위치 사이트에서 + 누를 수 있으며 새 릴리스 사이트를만듭니다. 사이트 이름을 rel_anchor_PSD1 로 변경합니다. 분자 앵커선택 . 개체 200 / 영역 = Dendrite [PSD1]. Quantity to Release
- PSD2, PSD3및 PSD4에 대한 반복 단계 8.2.1 .
- 메시에 anchor_LTP 분자를 배치합니다. 이렇게 하려면 셀블렌더 패널에서 분자 배치를 선택합니다. 릴리스/게재 위치 사이트에서 + 누를 수 있으며 새 릴리스 사이트를만듭니다. 사이트 이름을 rel_anchor_LTP_PSD1. 분자 = 0 anchor_LTP. 개체 / 영역 = Dendrite [PSD1]. Quantity to Release
참고: anchor_LTP AMPAR에 대한 구속력이 높은 선호도를 가진 앵커입니다. - anchor_LTD 위해 8.3 단계를 반복하여 메시에 anchor_LTD 분자를 배치합니다..
참고: anchor_LTD AMPAR에 대한 결합 선호도가 낮은 앵커입니다.
9. 화학 반응 만들기
- 앵커와 AMPARs 간의 반응을 생성합니다.
- 반응을 만들도록 반응(그림 7D)을선택합니다. 누르면 + 새로운 반응을포함합니다. 리액션인 = 앵커 + AMPAR'. 반응 유형 = & >. 이것은 양방향 반응을 정의합니다. 제품 = anchor_AMPAR. 내이속도 = 0.03. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.05.
- ANCHOR_LTP AmpA사이의 반응을 만듭니다. 이렇게 하려면 9.1 단계를 반복하지만 앵커를 anchor_LTP교체하고 뒤로 속도 = 0.005를 사용하여 반응자간의 선호도를 높입니다.
- anchor_LTD AmpAR 간의 반응을 만들고 파일을 저장합니다. 이렇게 하려면 9.2 단계를 반복하지만 앵커를 anchor_LTD교체하고 뒤로 속도 = 0.5를 사용하여 반응자 간의 선호도를 감소시면 됩니다. reactants 그런 다음 파일을 저장합니다.
10. 모델의 출력을 플롯
- 기초 상태 동안 PSD1에서 AMPA에 바인딩된 앵커를 플롯합니다. 이렇게 하려면 플롯 출력 설정을선택합니다. +를 눌러 분자를 정의합니다. 분자에서 anchor_AMPAR 선택합니다. 오브젝트에서 드엔드라이트를 선택합니다. 지역에서 PSD1을 선택합니다. 모든 PSD 영역에 대해 10.1단계를 반복합니다.
참고: 각 수지상 척추의 PSD에 갇힌 AMPAR의 기저 수를 관찰하는 것이 유용합니다. AMPAR에 바인딩된 앵커의 수는 LTP 및 LTD 의 기초 조건에 비해 증가하거나 감소할 수 있습니다. - LTP 동안 PSD1에서 AMPA에 바인딩된 앵커를 플롯합니다. 10.1 단계를 반복하여 이 작업을 수행합니다. anchor_AMPAR anchor_AMPAR_LTP교체한 다음 LTD 동안 PSD1에서 AMPAR에 바인딩된 앵커를 플롯하고 마지막으로 10.1단계를 반복하지만 anchor_AMPAR_LTP anchor_AMPAR_LTD대체합니다.
11. 시뮬레이션 실행
- 기초 조건을 실행하려면 시뮬레이션 실행을 선택합니다. 반복 선택 = 30,000. 설정 시간 단계 = 1e-3 s. 내보내기 및 실행을 누릅니다. 시뮬레이션이 끝날 때까지 기다립니다. 몇 분에서 몇 시간까지 걸릴 수 있습니다.
참고 : 기저 조건에서, anchor_LTP 및 rel_anchor_LTD 분자의 방출이없습니다. 시뮬레이션의 매개 변수와 관련하여, 회선에서 AMPAR의 확산과 PSD에서의 앵커링을 관찰할 수 있을 만큼 반복 횟수가 길어야 합니다. 작은 시간 단계는 시뮬레이션을 완료하는 데 더 정확하지만 느립니다. - 시각화 데이터 재로드를 선택합니다. 현면 결과를 시각화하려면 재생 애니메이션을 선택합니다(그림8). 플롯 출력 설정을 선택합니다. 플롯을누릅니다.
참고: CellBlender에서 생성한 그래프는 선택한 화학 종의 격리 된 타임 시리즈입니다. 타사 프로그램을 사용하여 여러 시뮬레이션에서 저장된 데이터를 가져와 여러 조건(예: 기초, LTP, LTD; 그림 8참조)의 오버레이 플롯을 만들 수 있습니다. - 동종 성 전위 조건(즉, LTP; 그림 8참조)을 실행합니다. 이렇게 하려면 셀블렌더 패널에서 분자 배치를 선택합니다. 릴리스/게재 위치 사이트에서 rel_anchor_LTP_PSD1 선택합니다.
- 릴리스할 수 있는 수량을 변경 = 200. 릴리스/게재 위치 사이트에서 rel_anchor_LTD_PSD1 선택합니다. 릴리스 수량 변경 = 0. 릴리스/게재 위치 사이트에서 rel_anchor _PSD1 선택합니다. 릴리스 수량 변경 = 0. 11.1-11.2 단계를 반복합니다.
- 동종 우울증 상태를 실행 (즉, LTD; 그림 8참조). 이렇게 하려면 rel_ANCHOR_LTP_PSD1 대신 200 rel_anchor_LTD_PSD1 해제합니다. Release rel_anchor 설정하고 rel_anchor_LTP_PSD1 0으로설정합니다. 11.1-11.2 단계를 반복합니다.
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Representative Results
이러한 결과는 척추 머리와 척추목으로 수지상 척추를 시뮬레이션하는 3D 메쉬의 시공을 위한 단계를제공한다(도 1 ~ 도 4). 또한, 다중 수지상 척추는 AMPARs14의이종내피 가소성을 연구하기 위해 단일 수지상세그먼트(도 5)에삽입될 수 있다. 척추 머리 의 상단에 PSD(그림 6)시냅스 앵커가 AMPAR에 결합하고 시냅스에서 일시적으로 트랩 하는 장소입니다(그림 7, 그림 8).
시냅스 가소성은 각 척추에서 anchor_AMPAR, anchor_AMPAR_LTP및 anchor_AMPAR_LTD 종의 수의 변화를 통해 대략 확인할 수 있었습니다. 시냅스 가소성의 발생의 정확한 계산을 위해 시냅스에서 고정 및 무료 AMPAR의 총 수의 변동을 계산하는 것이 좋습니다. 이는 타사 프로그램을 사용하여 시뮬레이션의 저장된 데이터를 열어 각 PSD(그림8)에서자유 AMPAR 및 고정된 AMPAR의 시계열을 합산할 수 있다.
메쉬에 AMPARs의 방출은 원원지와 수지상 척추를 따라 금욕적인 무작위 산책에 의해 확산의 관찰을 허용했다. 앵커에 대한 AMPARs의 선호도를 수정하는 요인(예: 내세포 및 외세포증의 속도의 변형) 및 PSD24,,25,,26에서AMPARs를 트랩할 수 있다. PSD에 있는 앵커와 AMPARs의 바인딩은 시냅스에서 AmpAR의 고밀도를 갇혔다. 호모시냅스 전능(도9)및우울증(도 10)은기초 상태(도 11)에 비해 앵커에 의한 AMPARs의 선호도 변화에 의한 고정 된 AMPARs의 수의 증가 및 감소를 통해 각각 검증될 수 있었다(도 11). 앵커와의 AMPARs의 선호도를 감소시키는 요인은 1개의 수지상 척추에서 다중 AMPAR을 풀어내고 (즉, 동질성 우울증) 및 인접한 척추에서 이종성 전능성을 유도하였다. 또한, 한 척추에서 앵커에 대한 AMPARs의 선호도를 증가시킨 요인은 인접한 척추에서 척추와 이종냅성 우울증을 유발하여 동종성 전성을유도한다(14). 이러한 방식으로, 이종성 내포가소성은 주어진 척추에서 유도된 동종가성의 인접한 척추에서 반대의 효과로 관찰되었다. 예를 들어, 단일 척추에서 균질성 LTP 유도는 인접한 척추에서 이종수 내혈 LTD 효과를 생성하였다(도8E,F,G).
그림 1: 구형 메쉬를 사용하여 수지상 척추 헤드를 생성합니다. (A)UV 구를 추가합니다. (B)구 치수를 설정합니다. (C)생성된 구를 관찰한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 상위 지역의 건설. (A)구의 최상위 영역을 선택합니다. (B)선택한 영역을 제거하여 평평하게 만듭니다. (C)플랫 탑 밀봉. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 척추 상단에 동심 영역 만들기. (A)상단을 시각화합니다. (B)칼을 사용하여 동심 영역을 정의한다. (C)여러 동심 영역 만들기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 수지상 척추 목 만들기. (A)수정된 구의 아래쪽을 선택한다. (B)선택한 정점을 삭제합니다. (C)하단을 선택합니다. (D)척추 목을 만들기 위해 바닥의 압출. (E)척추 목의 바닥을 밀봉. (F)생성된 척추 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 여러 개의 척추가 있는 수상월리 생성. (A)원통형 메쉬를 사용하여 원원기를 만듭니다. (B)수지상 척추를 실린더와 정렬합니다. (C)척추와 실린더에 합류. (D)부스엘 작업으로 메쉬에 합류합니다. (E)새로운 결합 된 메쉬. (F)두 번째 척추를 추가합니다. (G)세 번째 척추를 추가합니다. (H)네 번째 척추를 추가합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: PSD 영역 및 perisynaptic 영역 정의. (A)PSD 영역을 선택합니다. (B)생성된 PSD의 상세보기. (C)PSD 표면 영역을 정의합니다. (D)PSD 주위의 회고 영역을 선택하고 정의합니다. (E)원더라이트의 측면 표면을 선택하고 정의한다. (F)정의된 표면 영역. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 표면 분자 정의. (A)AMPAR, 앵커 및 AMPAR를 정의합니다. (B)AMPAR 사본의 위치 및 수량을 정의합니다. (C)표면 클래스 정의. (D)서피스 클래스 할당. (E)분자 간의 화학 반응을 생성한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 시냅스 가소성의 대표적인 결과. (A)2개, 4개 또는 8개의 척추가 있는 수지상 세그먼트의 다른 메스. (B)8개의 척추를 가진 수지상 세그먼트의 다른 보기. (C)PSD에서 AMPA및 앵커가 있는 수지상 척추의 상세한 보기. (D)앵커와의 상호 작용을 통해 PSD 안팎의 AMPAR 인신 매매다이어그램. (E-G) 곡선은 기초 상태와 LTP 및 LTD 동안 각 PSD에서 시냅스 AMPAR의 수를 보여줍니다. 단일 척추에서 균등성 LTP 또는 LTD의 유도는 두 개의 척추(E),4 척추(F)및 8 척추(G)와메쉬에 대한 근처의 척추에서 이종 내막 효과를 생성했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9: LTP 조건의 대표적인 결과. (A)x축은 PSD1에서 복잡한 anchor_LTP_AMPAR 수와 y축의 시간입니다. 시뮬레이션 의 시작 부분에 200 무료 anchor_LTP 릴리스가 있었다. 기준조건(도11)에비해 앵커와의 채권수가 더 많았으며, 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 10: LTD 조건의 대표적인 결과. (A)x축은 시간및 y축이 PSD1에서 복잡한 anchor_LTD_AMPAR 수이다. 시뮬레이션 의 시작 부분에 200 무료 anchor_LTD 릴리스가 있었다. 앵커와의 채권수가 낮고 기저상태(도11)에비해 형성되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 11: 기저 조건 중 대표적인 결과. (A)x축은 시간및 y축이 PSD1에서 복잡한 anchor_AMPAR 수이다. 시뮬레이션 의 시작 부분에 200 무료 앵커의 릴리스가 있었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 문서에서는 수지상 척추가 있는 수지상 세그먼트에서 반응 확산 시냅스 가소성 공정을 모델링하기 위한 3D 메쉬를 시공하는 방법을 제시합니다. 개발된 모델에는 수지상 척추가 거의 없는 수지상 세그먼트가 포함되어 있습니다. 시냅스 앵커를 가진 AMPAR의 측면 확산 및 반응은 기초 역학의 시뮬레이션을 허용합니다. 프로토콜의 중요한 단계는 척추 헤드의상단(도 1, 도 2, 도 3)의생성을 위한 구를 절단하고, 척추목을 만드는 압출(도4),그리고 원원과 척추를 단일 메쉬로 결합한다(도5). 척추 목과 선장 사이에 완전한 오버랩을 갖는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면 메시가 방수되지 않습니다. 다른 중요한 단계는 멤브레인 영역의 선택과 표면 클래스의 정의입니다(그림 6, 도 7). 각 중요 단계에 대해 다른 이름으로 파일을 저장합니다.
메쉬 분석 도구를 사용하여 단일 척추를 만든 후 결합된 원더라이트를 생성한 후 메시가 방수, 매니폴드 및 바깥쪽을 향하게 하는 정상인지 확인합니다. 메시가 이 분석에 실패하면 저장된 마지막 올바른 버전으로 돌아갑니다. 설치된 소프트웨어 버전, 운영 체제 및 키보드 유형에 따라 일부 단계가 약간 다를 수 있습니다.
이 프로토콜은 3D 메쉬에서 AMPAR 분자의 인신 매매를 시뮬레이션(도 8, 도 9, 도 10, 도 11),이는 신경 흥분 전달 및 시냅스 가소성에 대한 핵심이다. 3D 메쉬에서 단일 분자의 인신 매매는시냅스(27)에서생리학적 상태가 아닌분자(21,,22)의균일한 분포를 가진 잘 혼합된 부피를 기반으로 하는 기존 방법에 대하여 본 모델의 귀중한 특징이다. 이 기술의 한계는 높은 계산 비용과 각 분자의 높은 수의 사본과 그들 사이의 많은 수의 화학 반응을 사용하는 시뮬레이션의 느린 속도입니다. 이 제약 조건은 각 종의 복사본 수를 줄임으로써 극복할 수 있습니다.
분자의 사실적인 3D 메쉬와 지각적 추적시스템을 구축한 것은 많은 수의 비선형 변수를 가진 시스템의 기능에 대한 훌륭한 통찰력을 제공할 수 있는 기계적 시나리오를 테스트하는 강력한 도구입니다.
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Disclosures
저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 상파울루 주 과학 재단 (FAPESP) 보조금 #2015/50122-0 및 IRTG-GRTK 1740/2, IBM/ FAPESP 보조금 #2016/18825-4, 그리고 FAPESP 보조금 #2018/06504-4에 의해 부분적으로 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blender | Blender Foundation | https://www.blender.org/ | |
| CellBlender | University of Pittsburgh | https://mcell.org/ | |
| Mcell | University of Pittsburgh | https://mcell.org/ |
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