Protokollen udvikler en tre-dimensionel (3D) model af en dendritisk segment med dendritiske pigge til modellering synaptisk plasticitet. Den konstruerede mesh kan bruges til beregningsmæssige modellering af AMPA receptor handel i den langsigtede synaptiske plasticitet ved hjælp af softwareprogrammet Blender med CellBlender og MCell.
Beregningsmodellering af diffusion og reaktion af kemiske arter i en tredimensionel (3D) geometri er en grundlæggende metode til at forstå mekanismerne i synaptisk plasticitet i dendritiske pigge. I denne protokol er den detaljerede 3D-struktur af dendritter og dendritiske pigge modelleret med masker på softwaren Blender med CellBlender. De synaptiske og ekstrasynaptiske områder er defineret på masken. Dernæst er synaptaceptoren og synaptiske ankermolekyler defineret med deres diffusionskonstanter. Endelig er de kemiske reaktioner mellem synaptiske receptorer og synaptiske ankre inkluderet, og beregningsmodellen løses numerisk med softwaren MCell. Denne metode beskriver den spatiotemporale sti for hvert enkelt molekyle i en 3D geometrisk struktur. Det er derfor meget nyttigt at studere handel med synaptiske receptorer ind og ud af de dendritiske pigge under forekomsten af synaptisk plasticitet. En begrænsning af denne metode er, at det høje antal molekyler bremser simuleringshastigheden. Modellering af dendritiske pigge med denne metode giver mulighed for undersøgelse af homosynaptisk potensering og depression inden for enkelt pigge og heterosynaptisk plasticitet mellem nabo dendritiske pigge.
Synaptisk plasticitet har været forbundet med læring og hukommelse1. Synaptisk plasticitet, såsom langvarig potensering (LTP) og langvarig depression (LTD), er forbundet med henholdsvis indsættelse og fjernelse af AMPA-receptorer (AMPAR’ er) ind og ud af den synaptiskemembran 2. AMPAR synapserne er placeret oven på de små volumenstrukturer kaldet dendritiske pigge3. Hver rygsøjle indeholder et protein tæt område i den postsynaptiske membran kaldet postsynaptiske tæthed (PSD). Forankr proteiner ved PSD fælde AMPAR’er i den synaptiske region. Der er få kopier af AMPAR’er inden for en enkelt synapse, og amparernes handel og reaktion med andre arter i dendritiske pigge er en stokastiskproces 2,4. Der er flere opdelte modeller af synapta receptor handel på dendritiske pigge5,,6,,7,,8. Der er imidlertid mangel på stokastiske beregningsmodeller for handel med AMPAR’er forbundet med synaptisk plasticitet ved 3D-strukturerne i dendritterne og deres dendritiske pigge.
Beregningsmodellering er et nyttigt redskab til at undersøge de mekanismer , der ligger til grund for dynamikken i komplekse systemer såsom reaktionsspiffusion af AMPAR’er i dendritiske pigge under forekomsten af synaptisk plasticitet9,10,11,12. Modellen kan bruges til at visualisere komplekse scenarier, varierende følsomme parametre og gøre vigtige forudsigelser i videnskabelige forhold, der involverer mange variabler, der er vanskelige eller umulige at kontrollereeksperimentelle 12,13. Definition af detaljeringsgraden af en beregningsmodel er et grundlæggende skridt i at opnå nøjagtige oplysninger om det modellerede fænomen. En ideel beregningsmodel er en hårfin balance mellem kompleksitet og enkelhed for at indfange de væsentlige egenskaber ved naturfænomenerne uden at være beregningsmæssigt uoverkommelige. Beregningsmodeller, der er for detaljerede, kan være dyre at beregne. På den anden side kan systemer, der er dårligt detaljerede, mangle de grundlæggende komponenter, der er afgørende for at fange fænomenets dynamik. Selv om 3D-modellering af dendritiske pigge er beregningsmæssigt dyrere end 2D og 1D, der er betingelser, såsom i komplekse systemer med mange ikke-lineære variabler reagerer og spreder i tid og 3D-rum, for hvilke modellering på et 3D-niveau er afgørende for at få indsigt i funktionen af systemet. Desuden kan kompleksiteten reduceres omhyggeligt for at bevare de væsentlige egenskaber ved en lavere dimensionel model.
I et stokastisk system med få kopier af en given art inden for et lille volumen afviger systemets gennemsnitlige dynamik fra den gennemsnitlige dynamik i en stor population. I dette tilfælde er den stokastiske beregningsmæssige modellering af reaktionssp spredende partikler påkrævet. Dette arbejde introducerer en metode til stokastisk modellering reaktion-diffusion af et par kopier af AMPAR’er i 3D dendritiske pigge. Formålet med denne metode er at udvikle en 3D-beregningsmodel af et dendritisk segment med dendritiske pigge og deres synapser til modellering af synaptisk plasticitet.
Metoden bruger softwaren MCell til at løse modellen numerisk, Blender til konstruere 3D-masker, og CellBlender at skabe og visualisere MCell simuleringer, herunder spatiotemporal reaktion-diffusion af molekyler i 3D-masker14,15,16. Blender er en suite til oprettelse af masker og CellBlender er en add-on til basen software Blender. MCell er en Monte Carlo simulator til reaktionsspiffusion af enkelte molekyler17.
Begrundelsen for brugen af denne metode består i at modellere synaptisk plasticitet for at opnå en bedre forståelse af dette fænomen i det mikrofysiologiske miljø af dendritiske pigge14. Især denne metode giver mulighed for simulering af homosynaptic potensering, homosynaptic depression, og heterosynaptic plasticitet mellem dendritiske pigge14.
Funktionerne i denne metode omfatter modellering af 3D geometriske struktur af dendrite og dens synapser, diffusion ved tilfældig gang, og de kemiske reaktioner af molekyler involveret med synaptisk plasticitet. Denne metode giver den fordel, at skabe rige miljøer til at teste hypoteser og gøre forudsigelser om driften af et komplekst ikke-lineært system med et stort antal variabler. Desuden kan denne metode anvendes ikke kun til at studere synaptisk plasticitet, men også til at studere stokastisk reaktionsspiffusion af molekyler i 3D-meshstrukturer generelt.
Alternativt kan 3D-masker af dendritiske strukturer konstrueres direkte i Blender fra elektronmikroskop serielle rekonstruktioner18. Selv om masker baseret på serielle rekonstruktioner giver 3D-strukturer, er der ikke altid adgang til forsøgsdata. Således giver konstruktionen af masker tilpasset fra grundlæggende geometriske strukturer, som beskrevet i denne protokol, fleksibilitet til at udvikle tilpassede dendritiske segmenter med dendritiske pigge.
En anden alternativ beregningsmetode er massesimulering af velblandet reaktioner i et regelmæssigt bind9,10,11,19,20,21,22. Bulksimuleringerne er meget effektive til at løse reaktionerne fra mange arter inden for et enkelt velblandet volumen23,men bulktilgangen er ekstremt langsom til at løse reaktionsspiffusionen af molekyler i mange velblandet voxels i et 3D-net med høj opløsning. På den anden side fungerer den nuværende metode med MCell-simuleringer af reaktionssp diffusion af individuelle partikler effektivt i 3D-masker med høj opløsning15.
Før du bruger denne metode, bør man spørge, om det undersøgte fænomen kræver en stokastisk reaktion-diffusion tilgang i en 3D-mesh. Hvis fænomenet har få kopier (mindre end 1.000) af mindst én af de reagerende arter, der spreder sig i en kompleks geometrisk struktur med små rum, såsom dendritiske pigge, er det hensigtsmæssigt at foretage stokastisk modellering af reaktionsdiffusion i 3D-masker.
Der er flere trin, der kræves for at konstruere en 3D-beregningsmodel af et dendritisk segment, der indeholder dendritiske pigge med synaptisk plasticitet. De vigtigste trin er installationen af den rette software til opførelse af modellen, opførelsen af en enkelt dendritisk rygsøjlen, der skal bruges som en skabelon til at skabe flere pigge, og oprettelsen af en dendritisk segment, der er forbundet med flere dendritiske pigge. Trinnet til modellering af synaptisk plasticitet består i at indsætte ankre i PSD-regionen og AMPAR’erne i det dendritiske segment og dendritiske pigge. Derefter defineres kinetiske reaktioner mellem ankre placeret ved PSD og AMPAR’erne for at producere komplekse anker-AMPAR-arter, der fanger AMPAR’erne i den synaptiske region. Henholdsvis stigningen og faldet i affiniteten mellem ankre og synaptiske AMPAR’er skaber processen med LTP og LTD.
Denne artikel præsenterer en metode til konstruktion af 3D-masker til modellering reaktion-diffusion synaptisk plasticitet processer i en dendritisk segment med dendritiske pigge. Den udviklede model indeholder et dendritisk segment med få dendritiske pigge. Den laterale diffusion og reaktion af AMPAR’er med synaptiske ankre tillader simulering af basaldynamikken. De kritiske trin i protokollen er at skære kuglen for oprettelsen af toppen af rygsøjlen hovedet (Figur 1, <strong class="xfi…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev delvist støttet af Sao Paulo State Science Foundation (FAPESP) tilskud #2015/50122-0 og IRTG-GRTK 1740/2, af IBM/FAPESP-tilskuddet #2016/18825-4 og af FAPESP-tilskuddet #2018/06504-4.
Blender | Blender Foundation | https://www.blender.org/ | |
CellBlender | University of Pittsburgh | https://mcell.org/ | |
Mcell | University of Pittsburgh | https://mcell.org/ |