Summary
Desenvolvemos uma metodologia eficaz para amostragem e análise de sinais de odor, a fim de entender como eles podem ser usados na comunicação animal. Particularmente, usamos microextração de fase sólida do headspace, juntamente com espectrometria de massa cromatografia gasosa para analisar os componentes voláteis de odores animais e marcas de odor.
Abstract
Desenvolvemos uma metodologia eficaz para amostragem e análise de sinais de odor, utilizando microextração em fase sólida do headspace, juntamente com espectrometria de massa cromatografia gasosa, para entender como eles podem ser usados na comunicação animal. Esta técnica permite a análise semi-quantitativa dos componentes voláteis das secreções do odor, permitindo a separação e a identificação provisória dos componentes na amostra, seguida pela análise das razões de pico de área para procurar tendências que possam significar compostos que possam estar envolvidos na sinalização. Os principais pontos fortes dessa abordagem atual são a gama de tipos de amostra que podem ser analisados; a falta de necessidade de qualquer preparação ou extração de amostras complexas; a capacidade de separar e analisar os componentes de uma mistura; a identificação dos componentes detectados; e a capacidade de fornecer informações semi-quantitativas e potencialmente quantitativas sobre os componentes detectados. A principal limitação à metodologia diz respeito às próprias amostras. Uma vez que os componentes de interesse específico são voláteis, e estes poderiam facilmente ser perdidos, ou suas concentrações alteradas, é importante que as amostras sejam armazenadas e transportadas adequadamente após sua coleta. Isso também significa que as condições de armazenamento e transporte de amostras são relativamente caras. Este método pode ser aplicado a uma variedade de amostras (incluindo urina, fezes, secreções de odor de cabelo e odor de glândulas odor). Esses odores consistem em misturas complexas, ocorrendo em uma variedade de matrizes, e, portanto, necessitam do uso de técnicas para separar os componentes individuais e extrair os compostos de interesse biológico.
Introduction
Muito pouco se sabe sobre as mudanças químicas que sustentam os sinais olfativos nos animais1, também por causa dos desafios metodológicos no registro e quantificação de perfis químicos voláteis de odores2. Existem várias armadilhas potenciais quando se trabalha com matrizes químicas altamente complexas; estes incluem na amostragem e análise das amostras de odor3.
No Centro de Ciências Rosalind Franklin, Universidade de Wolverhampton, estamos realizando a análise de odores e marcas de cheiro para entender como eles podem ser usados por animais. Combinamos semioquímica com ecologia comportamental, endocrinologia e citologia para melhorar nossa compreensão do papel desempenhado pelos sinais olfativos na comunicação animal.
Desenvolvemos uma metodologia e, em seguida, analisamos odores e marcas de uma variedade de espécies, incluindo vários primatas não humanos (ou seja, lêmures coroados, lêmures-vermelhos, macaques japoneses, babuínos de oliva, chimpanzés) e outros mamíferos (ou seja, gatos, vacas). Coletamos e analisamos uma variedade de amostras, incluindo urina, fezes, secreções de odor de cabelo e odor de glândulas odor. Estes odores e marcas de odor consistem em misturas complexas de compostos e, portanto, qualquer metodologia utilizada para sua análise precisa incluir alguma forma de técnica separada. Como ilustrado, também ocorrem em uma gama de matrizes que necessitam do uso de técnicas para extrair os componentes de interesse.
Estudos anteriores de Vaglio et al.4 e outros autores5 utilizaram extração dinâmica do headspace (DHS) com espectrometria de massa cromatografia gasosa (GC-MS), enquanto a extração direta de solventes6 e extrações complexas de solventes7 também foram utilizadas. Particularmente, a amostragem dinâmica do headspace envolve a eliminação do espaço para a cabeça com um volume conhecido de gás inerte que, em última análise, remove todos os compostos voláteis, com exceção daqueles que mostram uma forte afinidade com a matriz amostral (por exemplo, compostos polares em amostras aquosas).
Para a metodologia atual, adotamos a técnica de microextração em fase sólida do headspace (HS-SPME) aliada ao GC-MS. Em particular, desenvolvemos e aprimoraram a metodologia já utilizada por Vaglio et al. em seu laboratório anterior GC-MS8,9,10.
As técnicas de extração sem solvente são muito eficazes para analisar compostos pequenos e altamente voláteis (que de outra forma podem ser perdidos facilmente de uma amostra) porque esses métodos imobilizam compostos em um suporte de fase estável e sólido. O HS-SPME usa uma fibra revestida com um polímero adsorbente para capturar compostos voláteis no headspace da amostra ou para extrair compostos dissolvidos por imersão em um fluido biológico aquoso11. O revestimento de polímero não liga fortemente os compostos, portanto, pelo aquecimento na porta de injeção do GC eles podem ser removidos. Este método é mais poderoso do que as técnicas de extração de solventes e também mais eficaz que o DHS.
Na abordagem atual, as amostras estão contidas dentro de frascos de vidro. Estes frascos são aquecidos a uma temperatura de 40 °C para simular a temperatura do corpo animal, a fim de promover os componentes voláteis da marca do perfume para ocupar o espaço da cabeça do frasco. Uma fibra SPME, revestida com 65 μm de material sorbente de polidimtilsiloxano/divinylbenzene (PDMS/DVB), é exposta ao ambiente do headspace e componentes voláteis da amostra são adsorvidos na fibra. Ao aquecer a fibra na porta de entrada de um GC-MS, os componentes voláteis são desordenados da fibra e, em seguida, separados pelo GC. Padrões de fragmentação espectral em massa são obtidos para cada componente usando o MS. Comparando esses espectros de massa com bancos de dados espectrais em massa, pode ser possível identificar provisoriamente os componentes da marca do perfume. Através do uso de um amostrador automático, podemos analisar várias amostras em lotes de forma consistente.
Dado que cada tipo de fibra SPME tem uma afinidade diferente com produtos químicos polares, a fibra geralmente é escolhida dependendo da polaridade e/ou peso molecular dos compostos químicos alvo. Além disso, as condições de GC são alteradas dependendo do tipo de coluna GC e das características dos compostos químicos alvo.
Esta técnica permite a análise semi-quantitativa dos componentes voláteis das marcas de odor, permitindo a separação e a identificação provisória dos componentes da amostra, seguida pela análise das razões de pico de área para procurar tendências que possam significar componentes da marcação do odor que possam estar envolvidos na sinalização.
Os principais pontos fortes desta abordagem atual são:
- A gama de tipos de amostra que podem ser analisados.
- Não são necessárias preparações ou extrações complexas da amostra.
- A capacidade de analisar componentes voláteis.
- A capacidade de separar os componentes de uma mistura.
- Para ser capaz de identificar os componentes detectados.
- A capacidade de fornecer informações semi-quantitativas e potencialmente quantitativas sobre os componentes detectados.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Coleta de amostras
- Odores amostrais que são um dos seguintes:
- Coletar espontaneamente liberado por sujeitos de estudo habituados (por exemplo, primatas do zoológico) através da marcação do perfume em papel filtro estéril (por exemplo, secreções de odor de glândulas odor) ou diretamente em frascos (por exemplo, urina).
- Coletar esfregando cotonetes de algodão estéreis após o treinamento dos sujeitos do estudo usando treinamento de reforço positivo.
- Coletar esfregando cotonetes estéreis de algodão após sedação de sujeitos de estudo.
- Coloque amostras em frascos de vidro transparente estéreis com tampa de parafuso de 10 mL e vedação com tampas de rosca que incorporam FTFE/septa de silicone. Guarde-os imediatamente a -20 °C.
NOTA: É vital o uso de equipamentos de proteção individual limpos, como luvas de nitrito; alterá-los com frequência; evite contato direto da pele com amostras e frascos. É preferível usar frascos novinhos; no entanto, no caso de frascos usados, é vital pré-limpar os frascos e, em seguida, usar o mesmo protocolo. - Leve espaços em branco ambientais toda vez que marcas de perfume forem coletadas. Por exemplo, colete os meios de amostragem (por exemplo, papel filtro ou cotonete) e um frasco de headspace que são expostos ao ambiente durante a realização da amostragem.
2. Preparação da amostra
- Prepare as amostras no campo cortando com uma lâmina um quadrado aproximado de 10 mm de um papel filtro marcado pelo cheiro, ou na cabeça do cotonete, e colocando-a em um frasco de 10 mL com tampa de cabeça.
- Depois de preparado, descarte ou limpe a lâmina usada para cortar a mídia de amostragem usando um lenço antibacteriano apropriado e/ou álcool e seque completamente.
- Armazene todas as amostras a -20 °C.
NOTA: Preferencial a -20 °C ou de outra forma o mais baixo possível no campo.
3. Preparação para análise
- Retire amostras do congelador e deixe aquecer naturalmente à temperatura ambiente por pelo menos 1 h.
- Configure o método analítico no GC-MS da seguinte forma:
- Para condições de análise spme, siga as instruções do fabricante para condicionar as fibras SPME antes do primeiro uso: pré-condição de fibra (260 °C por 5 min), incubação de amostras (40 °C por 2 min), tempo de extração (15 min), tempo de dessorção (2 min) e pós-condição de fibra (260 °C para 20 min).
- Use as seguintes condições gc: coluna (HP5-MS 30 m x 0,25 mm; 0,25 μm), temperatura do injetor (270 °C), taxa de fluxo (1 mL/min), modo de injeção (splitless), perfil do forno GC (45 °C por 2 min; 4 °C/min a 170 °C; 20 °C/min a 300 °C), linha de transferência MSD (280 °C).
NOTA: Para melhorar entre a consistência do tempo de retenção da amostra, o método analítico é o tempo de retenção bloqueado). - Use as seguintes condições de MSD: atraso de solvente (2,5 min) e faixa de varredura (29 a 400 amu).
NOTA: Um intervalo de 10 a 400 foi usado nos protocolos anteriores4.
- Certifique-se de que o fornecimento de gás de purga para a unidade de condicionamento de fibras esteja ligado.
NOTA: É vital que o conjunto SPME esteja corretamente instalado no amostrador automático e esteja alinhado às bandejas do amostrador automático, à unidade de condicionamento de fibras e à porta de entrada GC. O alinhamento incorreto pode resultar em danos ou destruição da fibra SPME.
4. Análise
- Coloque um frasco de espaço para cabeça vazio (para agir como um sistema em branco) na primeira posição da bandeja de amostrador automático GC-MS. Coloque o vazio ambiental na segunda posição da bandeja do amostrador automático. Coloque as amostras para análise nas posições subsequentes da bandeja de amostra automática.
- Crie uma sequência analítica para analisar cada amostra dentro da bandeja de amostras.
- Na tela inicial do MassHunter, selecione Sequência | Sequência de carga.
- Complete a tabela de sequência para todos os espaços em branco e amostras inserindo as informações apropriadas. Salve a tabela de sequência completa.
NOTA: As informações exatas para a tabela de sequência dependerão da formatação dos laboratórios para a tabela. As informações mínimas normalmente incluem tipo de amostra, nome da amostra, localização e número de frascos, método analítico e localização e nome do arquivo de dados (a alocação de um nome de arquivo de dados que corresponde ao nome da amostra auxilia o processamento futuro de dados). Amostras adicionais podem ser adicionadas à sequência durante a análise.
- Execute a sequência selecionando sequência | Sequência de execução.
- Após análise, devolva amostras ao congelador o mais rápido possível.
NOTA: pode ser possível reanalisar amostras, mas deve-se notar que alguns componentes voláteis podem ter sido totalmente extraídos durante a análise inicial e alguns compostos podem ter sofrido decomposição térmica e bacteriana a 40 °C, portanto, o cromatograma resultante pode não ser completamente representativo da marcação original do perfume.
5. Análise de dados
NOTA: A análise inicial de dados inclui a integração de cromatógrafos para obter dados de tempo de retenção e área de pico, juntamente com a identificação provisória de picos usando o software ChemStation e bancos de dados espectrais de massa do NIST (National Institute of Standards and Technology), versão MSD F.01.01.2317. A análise dos dados pode ser realizada manualmente ou através de um método semi-automatizado. Se o método semi-automatizado for usado, às vezes é benéfico realizar um grau de análise manual de dados para verificar identificações provisórias.
- Abra o arquivo de dados clicando no arquivo apropriado na barra de navegação à esquerda. O cromatógrafo de íon total (TIC) será exibido na janela superior da tela de análise de dados.
- Para integrar o TIC usando o integrador RTE, selecione o Croromatograma | Integrar.
- Ajuste os parâmetros de integração para que os picos superiores a 3 x ruídos da linha de base sejam integrados. Selecione | de cromatograma Parâmetros de integração de sinal MS. Na caixa de saída ajuste a área mínima de pico conforme apropriado (1.0 produz resultados aceitáveis em nossos exemplos).
- Para identificar picos e gerar um relatório de resumo, selecione Relatórios de exportação | Os resultados da pesquisa da biblioteca reportam-se ao XLS.
NOTA: As bibliotecas espectrais a serem pesquisadas juntamente com o número de correspondências de biblioteca a serem exibidas precisam ser predefinidas dentro do software antes que uma pesquisa na biblioteca possa ser realizada. - O relatório de planilha resultante contém dados de integração para cada pico e uma tentativa de correspondência de biblioteca espectral para atribuir identidade. Normalmente, a correspondência de qualidade/biblioteca da biblioteca deve ser >80 para aceitar a identificação provisória. Salve a planilha.
- Identifique um pico diretamente do TIC.
- Escolha o pico de interesse.
- Se o pico for pequeno, amplie desenhando uma caixa ao redor do pico segurando o botão do mouse da mão esquerda para baixo, estique a caixa sobre o pico e solte.
- Coloque a linha do cursor para que ela esteja no ponto mais alto do pico (ou logo depois).
- Clique duas vezes no botão do mouse da mão direita e o espectro de massa para o pico aparecerá na janela inferior da tela de análise de dados.
- Para pesquisar na biblioteca espectral, mova o cursor em qualquer lugar da janela espectral e clique duas vezes no botão do mouse da mão direita. Os resultados da pesquisa da biblioteca aparecerão em uma nova janela.
- Para remover o ruído de fundo de um espectro de interesse, clique primeiro em dobro no botão do mouse da mão direita no pico em questão. Em seguida, clique duas vezes no botão do mouse da mão direita em uma área sem picos imediatamente em frente ao pico de interesse. Selecione | de cromatograma Espectros subtraídos. O espectro subtraído será exibido na janela inferior da tela de análise de dados e exibirá '(-)' ao lado dos dados SCAN no cabeçalho da janela.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Seguindo este protocolo, identificamos provisoriamente um total de 32 compostos químicos voláteis a partir da análise de 14 marcas de odor ano-genital liberadas espontaneamente em papel filtro por lêmures de babados vermelhos(Varecia variegata rubra) e comparamos perfis de odor com características do sinalizador12. Compostos voláteis de ocorrência natural, como hidrocarbonetos, terpenos, álcoois terpenos e cetonas, estavam presentes dentro desses perfis e incluíam compostos que haviam sido encontrados anteriormente para atuar como feromônios sexuais e pistas para a aptidão em outras espécies animais. Os compostos que foram identificados provisoriamente estão listados na Tabela 1. Cromatógrafos representativos (1 de um controle e 1 de uma marca de perfume de lêmure) são mostrados na Figura 1. O número e a abundância relativa dos componentes variaram de amostra para amostra em diferentes sujeitos do estudo. No entanto, seis compostos (benzaldeído, 2-ethyl-1-hexanol, p-cresol, cis-p-mentha-2,8-dien-1-ol, 2-pinen-4-one, pentadecano) estavam presentes em todas as amostras.
Os resultados deste estudo sugeriram que os lêmures-vermelhos usam a marcação do perfume para transmitir informações sobre sexo e idade feminina, com marcação ano-genital desempenhando um papel na comunicação sociosexual.
Outro resultado representativo após o uso deste protocolo foi o nosso estudo da propaganda de fertilidade por babuínos de oliva femininos(Papio anubis) (Vaglio et al. dados inéditos). Identificamos um total de 74 compostos voláteis a partir da análise de 385 amostras de odor vaginal babuíno feminino. Esses compostos incluíam uma série de compostos voláteis odorosos de ocorrência natural, como cetonas, álcoois, aldeídos, terpenos, ácidos graxos voláteis e hidrocarbonetos. Cromatógramas típicos usados para comparar o controle em branco e amostras de odor vaginal babuíno fêmea de períodos férteis e não férteis são mostrados na Figura 2. Examinamos as relações entre perfis de odor vaginal e receptividade sexual de babuínos fêmeas. Nossos resultados mostraram que a quantidade total de odor vaginal difere da fertilidade sugerindo que o odor pode desempenhar um papel na sinalização da fertilidade babuína feminina. Também foram encontradas diferenças no odor vaginal entre os tipos de grupo, mas não conseguimos distinguir os efeitos da composição do grupo, idade feminina e paridade.
Figura 1. Exemplo de cromatogramas; (cromatografia superior -'controle') a amostra de controle, mostrando contaminantes; (cromatografia inferior -'marca de perfume de lêmure') uma fêmea adulta de lêmure vermelho-babado secreções de odor, mostrando contaminantes e compostos biológicos significativos. As setas vermelhas indicam os seis compostos biológicos significativos encontrados em todas as amostras: (a) benzaldeído; b 2-ethyl-1hexanol; c P-cresol; d Cis-p-mentha-2,8-dien-1-ol; e 2-pinen-4-one; f Pentadecano. Este valor foi modificado a partir de Janda et al.12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Exemplo de cromatograma da amostra de controle (cromatatograma superior -'controle'), mostrando contaminantes; (cromatografia média -'babuíno não-fértil odor') babuíno de oliva fêmea, amostra de odor vaginal de período não fértil; e (cromatografia inferior -'babuíno fértil odor') babuíno fêmea de oliva, amostra de odor vaginal de período fértil. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Tempo de retenção (minutos) | ID composto provisório | peso molecular |
| 3.906 | Hexanal | 100 |
| 6.057 | 5-metil-3-hexanona | 114 |
| 7.413 | Alfa-pinene | 136 |
| 8.077 | 1-isopropil-4-metilenebicyclo[3.1.0]hex-2-one | 134 |
| 8.268 | Benzaldehyde | 106 |
| 8.623 | 3,7,7-trimetil-1,3,5-cicloheptatrieno | 134 |
| 9.096 | fenol | 94 |
| 9.269 | 6-metoxi-5-hepten-2-one | 126 |
| 10.72 | 2-ettil-1-hexanol | 130 |
| 12.362 | p-Cresol | 108 |
| 12.553 | cis-Verbenol | 152 |
| 13.385 | cis-p-Mentha-2,8-dien-1-ol | 152 |
| 14.104 | 1,7,7-Trimetilbicilo[2.2.1]hepta-2-one | 152 |
| 14.536 | L-Pinocarveol | 152 |
| 14.791 | trans-Verbenol | 152 |
| 15.605 | p-Etil-phenol | 122 |
| 15.928 | Terpinen-4-ol | 154 |
| 16.415 | Alfa-Terpineol | 154 |
| 16.615 | Myrtenol | 152 |
| 17.047 | 2-Pinen-4-one | 150 |
| 18.252 | carvona | 150 |
| 19.217 | p-Mentha-1,8-dien-3-one | 150 |
| 23.283 | 4,7,7-Trimetilbicilo[4.1.0]hept-3-ene-2-one | 150 |
| 23.443 | Tetradecano | 198 |
| 25.094 | Geranylacetone | 194 |
| 25.899 | Isometilionona | 206 |
| 26.513 | Pentadecano | 212 |
| 30.871 | 2,6,10-Trimetilpentadecano | 254 |
| 32.208 | Heptadecane | 240 |
| 32.372 | 2,6,10-Trimetilhexadecano | 268 |
| 34.446 | n-Tetracosano | 338 |
| 34.591 | 2,6,10,14-Tetramethylhexadecane | 282 |
Mesa 1. Compostos voláteis presentes em amostras de papel filtro de secreções de odor ano-genital de lêmure-vermelho-ruivo feminino identificados provisoriamente usando o software ChemStation e bancos de dados espectrais de massa NIST, versão MSD F.01.01.2317. Esta tabela foi modificada a partir de Janda et al.12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O uso de amostras de controle, ambos os controles ambientais criados no momento da coleta de amostras e espaços em branco do sistema, são cruciais para a interpretação das amostras de marca de odor. Quaisquer picos atribuídos ao ambiente amostral ou ao sistema instrumental precisam ser excluídos das amostras de marcas de odor para que apenas os picos de interesse sejam incluídos em qualquer interpretação. Esses controles também podem desempenhar um papel na avaliação e monitoramento da "saúde" da instrumentação.
O protocolo inclui etapas para condicionar a fibra antes e depois de cada extração. Isso é facilitado pelo uso de um amostrador automático e garante que não haja contaminação cruzada da amostra para a amostra.
A principal limitação à metodologia diz respeito às próprias amostras. Após a coleta, é importante que sejam armazenados e transportados adequadamente. Os componentes de interesse específico são voláteis, e estes podem facilmente ser perdidos, ou suas concentrações alteradas. Atualmente, as amostras são armazenadas e transportadas congeladas, tipicamente a -20°C. Como resultado, há um custo significativo envolvido no armazenamento e transporte dessas amostras. Atrasos no transporte de amostras para o laboratório para análise aumentarão ainda mais esses custos e poderão afetar potencialmente os resultados obtidos a partir das marcas de odor. Mais pesquisas são necessárias para entender o efeito do tempo e armazenamento nos resultados analíticos obtidos a partir das amostras. Como os componentes de significado particular são os componentes mais voláteis das marcas de odor, é possível que os níveis desses componentes possam alterar a coleta de amostras pós-amostra. A consideração também pode precisar ser dada a potenciais efeitos bacterianos dentro de alguns tipos de amostra. Por exemplo, no teste de álcool de amostras de urina, as bactérias presentes na urina podem produzir álcool e, portanto, aumentar os níveis de álcool detectados.
A metodologia atual atende a todos os requisitos previamente descritos. Fornece resultados de boa qualidade a partir dos quais mais informações sobre a composição de marcas de odor estão sendo obtidas. No entanto, a análise é uma técnica de laboratório que depende das amostras que estão sendo submetidas ao laboratório. Uma solução potencial para essa limitação seria através do uso de instrumentação GC-MS portátil, instrumentos que poderiam ser levados para o campo onde as amostras estão sendo colhidas. Essa abordagem aliviaria a necessidade de armazenar e transportar amostras e permitiria a análise em tempo real de marcas de odor potencialmente fornecendo maiores informações sobre os componentes mais voláteis das marcas. Vários instrumentos GC-MS portáteis estão disponíveis. Eles utilizam tecnologia diferente da encontrada na instrumentação baseada em laboratório, mas devem fornecer resultados comparáveis. O uso da técnica de extração HS-SPME ainda é aplicável. No entanto, como resultado de ser portátil, os instrumentos não oferecem a opção de introdução automatizada da amostra; no entanto, se as amostras forem analisadas assim que forem coletadas, é provável que os números de amostras diárias sejam gerenciáveis para injeção manual. Além disso, em caso de extração de campo, deve-se tomar cuidado para que a fibra SPME não presentisse produtos químicos ambientais antes do uso. Atualmente, os instrumentos disponíveis são alimentados por baterias que permitem a portabilidade total, mas com o fornecimento de alguma forma de fonte de alimentação (mesmo um pequeno gerador), esses instrumentos poderiam ser operados por períodos mais longos de tempo. Esses instrumentos por sua natureza são muitas vezes projetados para serem simples de operar, com o mínimo de treinamento e conhecimento necessários. Isso significa que pode não ser necessário que operadores altamente treinados sejam implantados com o instrumento e que possam ser operados por aqueles que coletam as amostras. A interpretação detalhada dos resultados analíticos pode ser alcançada remotamente ou quando o instrumento retornar à base.
Outra grande limitação com os métodos que utilizam fibras SPME é que é possível analisar apenas compostos químicos que existem em abundância nas amostras. Em particular, quantidades muito maiores do produto químico existem nas amostras mesmo quando a quantidade de moléculas é sublocada para a análise usando fibras SPME. Além disso, no contexto de secreções de odor liberadas por marcas de odor animal e outros sinais químicos animais, animais individuais tendem a usar compostos químicos em pequenas quantidades para se comunicar com outros animais e/ou detectar sinais olfativos de materiais. Em outras palavras, as diferentes performances de narizes animais e extração de SPME podem representar um grande desafio para o sucesso desta técnica amostral.
O desenvolvimento futuro da metodologia atual poderia baser-se na coleta de amostras com a investigação sobre o uso de materiais alternativos ou tubos sorbent para uso com sistemas de desorção térmica. Tais desenvolvimentos podem ajudar a experimentar as condições de armazenamento e transporte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Keith Holding por sua ajuda com análises químicas no Rosalind Franklin Science Center, Wolverhampton, e Ben Mantle pela produção do vídeo. Também somos gratos ao Prof. Gloriano Moneti, ao Dr. Giuseppe Pieraccini e aos membros do Centro de Espectrometria de Massa da Universidade de Florença, Florença, e ao Prof. Luca Calamai e ao Dr. Marco Michelozzi do Laboratório ARCA da CNR, Florença, por sua ajuda na criação dessa metodologia. Os projetos de pesquisa que incluíram os métodos de amostragem e análise descritos no manuscrito foram apoiados por duas Bolsas Intra Europeias Marie Skłodowska-Curie (IDs do Grant Agreement: 327083, 703611), uma pequena bolsa ('O primata enriquecido sensorial') da Sociedade Primata da Grã-Bretanha, e uma pequena bolsa de pesquisa ('Caçadores-coletores têm um senso especial de olfato?') da Academia Britânica/The Leverhulme Trust para S.V. O trabalho de laboratório necessário para criar essa metodologia também recebeu financiamento da Competição Anual de Financiamento da Faculdade de Ciências e Engenharia (Wolverhampton) para a S.V.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL autosampler vials | Agilent | 5188-5392 | 10 ml screwtop vials with |
| 18 mm vial caps | Agilent | 8010-0139 | Magnetic with PTFE/silicone septa |
| Autosampler | Agilent | GC120 PAL autosampler | |
| Capillary column | Agilent | HP5-MS | 30 m x 0.25 mm; 0.25 µm |
| Data analysis software | Agilent | - | ChemStation |
| Gas Chromatograph | Agilent | 7890B | |
| Inlet septa | Agilent | 5182-3442 | Merlin microseal |
| Mass Selective Detector | Agilent | 5977A | |
| Reporting software | Microsoft | - | Excel |
| Spectral library | NIST | - | NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library |
| Spectral library search program | NIST | - | MS Search v.2.2 |
| Splitless Inlet liner | Agilent | 5190-4048 | |
| SPME fibres | Agilent | SU57345U | 65 µm PDMS/DVB fibre |
References
- Wyatt, T. D. Pheromones and Animal Behavior: Chemical Signals and Signatures. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2014).
- Heymann, E. W. The neglected sense-olfaction in primate behavior, ecology, and evolution. American Journal of Primatology. 68 (6), 519-524 (2006).
- Drea, C. M., Boulet, M., DelBarco-Trillo, J. The "secret" in secretions: Methodological considerations in deciphering primate olfactory communication. American Journal of Primatology. 75 (7), 621-642 (2013).
- Vaglio, S., et al. Sternal gland scent-marking signals sex, age, rank and group identity in captive mandrills. Chemical Senses. 41 (2), 177-186 (2016).
- Marneweck, C., Jürgens, A., Shrader, A. M. Dung odours signal sex, age, territorial and oestrous state in white rhinos. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 284 (1846), (2016).
- Shear, W. A., Jones, T. H., Miras, H. M. A possible phylogenetic signal in milliped chemical defenses. Biochemical Systematics and Ecology. 35, 838-842 (2007).
- Kimura, R. Volatile substances in feces, urine and urine-marked feces of feral horses. Canadian Journal of Animal Science. 81 (3), 411-420 (2001).
- Vaglio, S., Minicozzi, P., Bonometti, E., Mello, G., Chiarelli, B. Volatile signals during pregnancy: a possible chemical basis for mother-infant recognition. Journal of Chemical Ecology. 35 (1), 131-139 (2009).
- Setchell, J. M., et al. Chemical composition of scent-gland secretions in an Old World monkey (Mandrillus sphinx): influence of sex, male status, and individual identity. Chemical Senses. 35 (3), 205-220 (2010).
- Setchell, J. M., et al. Odour signals MHC genotype in an Old World monkey. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 278 (1703), 274-280 (2011).
- Pawliszyn, J. Solid phase microextraction: theory and practice. , Wiley-VCH. New York, US. (1997).
- Janda, E. D., Perry, K., Hankinson, E., Walker, D., Vaglio, S. Sex differences in scent-marking in captive red-ruffed lemurs. American Journal of Primatology. 81 (1), 22951 (2019).
