Summary
Vi har utvecklat en effektiv metodik för provtagning och analys av luktsignaler för att förstå hur de kan användas i djurkommunikation. Särskilt använder vi headspace solid-phase microextraction i kombination med gaskromatografi-masspektrometri för att analysera flyktiga komponenter i djurlukt och doftmarkeringar.
Abstract
Vi har utvecklat en effektiv metodik för provtagning och analys av luktsignaler, genom att använda huvudutrymmet fastfasmikrotraktion i kombination med gaskromatografi-masspektrometri, för att förstå hur de kan användas i djurkommunikation. Denna teknik gör det möjligt att semikvantitativ analys av flyktiga komponenter i luktsekret genom att möjliggöra separation och preliminär identifiering av komponenterna i provet, följt av analys av topparealförhållanden för att leta efter trender som kan beteckna föreningar som kan vara involverade i signalering. De viktigaste styrkorna för den här aktuella metoden är intervallet för exempel typer som kan analyseras; Bristen på behov av komplexa provberedningar eller extraktioner. Förmågan att separera och analysera komponenterna i en blandning; Identifiering av de identifierade komponenterna. och förmågan att tillhandahålla semikvantitativ och potentiellt kvantitativ information om de upptäckta komponenterna. Den huvudsakliga begränsningen av metoden gäller själva proverna. Eftersom komponenterna av särskilt intresse är flyktiga, och dessa lätt kan gå förlorade eller deras koncentrationer ändras, är det viktigt att proverna lagras och transporteras på lämpligt sätt efter insamlingen. Detta innebär också att provlagrings- och transportförhållandena är relativt kostsamma. Denna metod kan tillämpas på en mängd olika prover (inklusive urin, avföring, hår och doftkörtelluktsekret). Dessa lukter består av komplexa blandningar, som förekommer i en rad matriser, och kräver därför användning av tekniker för att separera de enskilda komponenterna och extrahera föreningar av biologiskt intresse.
Introduction
Mycket lite är känt om de kemiska förändringar som ligger till grund för luktsignalerna hos djur1, också på grund av metodologiska utmaningar vid registrering och kvantifiering av flyktiga kemiska profiler av lukt2. Det finns flera potentiella fallgropar när man arbetar med mycket komplexa, kemiska matriser; Dessa inkluderar vid provtagning och analys av luktproverna3.
Vid Rosalind Franklin Science Center, University of Wolverhampton, genomför vi analysen av lukt och doftmärken för att förstå hur de kan användas av djur. Vi kombinerar semiochemistry med beteendeekologi, endokrinologi och cytologi för att förbättra vår förståelse av den roll som luktsignaler spelar i djurkommunikation.
Vi har utvecklat en metodik och sedan analyserat lukt och markeringar från en mängd olika arter, inklusive flera icke-mänskliga primater (dvs. krönta lemurer, rödruffade lemurer, japanska makaker, oliv babianer, schimpanser) och andra däggdjur (dvs. katter, kor). Vi har samlat in och analyserat en mängd olika prover, inklusive urin, avföring, hår och doftkörtelluktsekret. Dessa lukter och doftmärken består av komplexa blandningar av föreningar och därför måste alla metoder som används för deras analys innehålla någon form av separatory teknik. Som illustreras förekommer de också i en rad matriser som kräver användning av tekniker för att extrahera komponenter av intresse.
Tidigare studier av Vaglio et al.4 och andraförfattare 5 använde dynamiska headspace extraktion (DHS) med gaskromatografi-masspektrometri (GC-MS) medan direkt lösningsmedelextraktion 6 och komplexa lösningsmedelextraktioner 7 har också använts. Särskilt dynamisk huvudutrymmesprovtagning innebär att huvudutrymmet rensas med en känd volym inert gas som i slutändan avlägsnar alla flyktiga föreningar, med undantag för de som visar en stark affinitet för provmatrisen (till exempel polära föreningar i vattenhaltiga prover).
För den nuvarande metoden har vi antagit tekniken för headspace solid-phase microextraction (HS-SPME) i kombination med GC-MS. I synnerhet har vi utvecklat och förbättrat den metod som redan används av Vaglio et al. i dess tidigare GC-MS-laboratorium8,9,10.
Lösningsmedelslösa extraktionstekniker är mycket effektiva för att analysera små, mycket flyktiga föreningar (som annars lätt kan gå förlorade från ett prov) eftersom dessa metoder immobiliserar föreningar på ett stabilt, fast fasstöd. HS-SPME använder en fiber belagd med en adsorbentpolymer för att fånga flyktiga föreningar i provhuvudutrymmet eller för att extrahera upplösta föreningar genom nedsänkning i en vattenhaltig biologiskvätska 11. Polymerbeläggningen binder inte föreningarna starkt, därför genom uppvärmning i injektionsporten på GC kan de avlägsnas. Denna metod är kraftfullare än lösningsmedelsextraktionstekniker och också effektivare än DHS.
I den nuvarande metoden finns prover i glasflaskor. Dessa injektionsflaskar värms upp till en temperatur av 40 °C för att simulera djurkroppstemperaturen för att främja de flyktiga komponenterna i doftmärket för att uppta injektionsflaskans huvudutrymme. En SPME-fiber, belagd med 65 μm polydietylsiloxan/divinylbensen (PDMS/DVB) sorbentmaterial, utsätts för huvudutrymmets miljö och flyktiga komponenter från provet adsorberas på fibern. Vid uppvärmning av fibern i inloppsporten på en GC-MS desorberas de flyktiga komponenterna från fibern och separeras sedan av GC. Masspektrala fragmenteringsmönster erhålls för varje komponent som använder MS. Som jämförelse av dessa masspektra mot masspektratdatabaser kan det vara möjligt att preliminärt identifiera komponenterna i doftmärket. Genom att använda en autoprovtagare kan vi analysera flera prover i omgångar på ett konsekvent sätt.
Med tanke på att varje typ av SPME-fiber har en annan affinitet med polära kemikalier väljs fibern vanligtvis beroende på polariteten och/eller molekylvikten hos målkemikaliens föreningar. Dessutom ändras GC-förhållandena beroende på typen av GC-kolumn och egenskaperna hos målkemikaliens föreningar.
Denna teknik gör det möjligt att halvkvantitativ analys av de flyktiga komponenterna i doftmarkeringar genom att möjliggöra separation och preliminär identifiering av komponenterna i provet, följt av analys av topparealförhållanden för att leta efter trender som kan beteckna komponenter i doftmärkningen som kan vara involverade i signalering.
De viktigaste styrkorna i detta nuvarande tillvägagångssätt är:
- Det intervall av exempeltyper som kan analyseras.
- Inga komplexa provberedningar eller extraktioner krävs.
- Förmågan att analysera flyktiga komponenter.
- Förmågan att separera komponenterna i en blandning.
- För att kunna identifiera de identifierade komponenterna.
- Förmågan att tillhandahålla semikvantitativ och potentiellt kvantitativ information om de identifierade komponenterna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Provtagning
- Provlukt som är något av följande:
- Samla spontant fri från vana försökspersoner (t.ex. zoo primater) via doftmärkning på sterilt filterpapper (t.ex. doftkörtelluktsekret) eller direkt i injektionsflaska (t.ex. urin).
- Samla genom att gnugga sterila bomullspinne efter träning av försökspersoner med hjälp av positiv förstärkningsträning.
- Samla genom att gnugga sterila bomullspinne efter sedering av försökspersoner.
- Placera proverna i sterila 10 ml skruvbeklädda klara glasflaskor och täta med skruvtoppade lock som innehåller FTFE/silikonsepa. Förvara dem omedelbart vid -20 °C.
OBS: Det är viktigt att använda ren personlig skyddsutrustning, såsom nitrilhandskar; ändra dem ofta; undvika direkt hudkontakt med prover och injektionsflaska. Det föredras att använda helt nya injektionsflaskar; Vid använda injektionsflaska är det dock viktigt att förrengöra injektionsflaskan och sedan använda samma protokoll. - Ta miljöämnen varje gång doftmärken samlas in. Samla till exempel in provtagningsmedierna (t.ex. filterpapper eller bomullspinne) och en huvudutrymmesflaska som exponeras för miljön medan provtagningen utförs.
2. Provberedning
- Förbered proverna på fältet genom att skära med ett blad en ungefärlig kvadrat på 10 mm från ett doftmärkt filterpapper, eller bomullspinnens huvud, och placera det i en 10 ml skruvtoppad huvudutrymmesflaska.
- Efter att varje prov har förberetts, kassera eller rengöra bladet som används för att skära provtagningsmedierna med en lämplig antibakteriell våtservett och/eller alkohol och torka noggrant.
- Förvara alla prover vid -20 °C.
OBS: Föredras vid -20 °C eller på annat sätt så lågt som praktiskt möjligt i fältet.
3. Förberedelse för analys
- Ta bort prover från frysen och låt värma naturligt till rumstemperatur i minst 1 timme.
- Ställ in analysmetoden på GC-MS enligt följande:
- För SPME-analysförhållanden, följ tillverkarens anvisningar för att konditionera SPME-fibrer före första användningen: fiberför kondition (260 °C i 5 min), provinkubation (40 °C i 2 min), extraktionstid (15 min), desorptionstid (2 min) och fiber efter kondition (260 °C i 20 min).
- Använd följande GC-förhållanden: kolumn (HP5-MS 30 m x 0,25 mm; 0,25 μm), injektortemperatur (270 °C), flödeshastighet (1 ml/min), insprutningsläge (splitless), GC-ugnsprofil (45 °C i 2 min; 4 °C/min till 170 °C, 20 °C/min till 300 °C), MSD-överföringsledning (280 °C).
OBS: För att förbättra mellan provretentionstidens konsistens är analysmetoden retentionstid låst). - Använd följande MSD-förhållanden: lösningsmedelsfördröjning (2,5 min) och skanningsområde (29 till 400 amu).
OBS: Ett intervall på 10 till 400 användes i tidigare protokoll4.
- Se till att utrensningsgastillförseln till fiberkonditioneringsenheten är på.
OBS: Det är viktigt att SPME-enheten är korrekt installerad i autoprovtagaren och att den är i linje med autoproverbrickorna, fiberkonditioneringsenheten och GC-inloppsporten. Felaktig inriktning kan leda till skador eller förstörelse av SPME-fibern.
4. Analys
- Placera en tom huvudutrymmesflaska (för att fungera som ett system tomt) i den första positionen i GC-MS autoprovproverfältet. Placera miljölösen i autoprovtagarens andra läge. Placera proverna för analys i de efterföljande positionerna på autoprovfältet.
- Skapa en analyssekvens för att analysera varje prov i provfältet.
- Välj Sequence | på startskärmen för MassHunter | Läs in sekvens.
- Fyll i sekvenstabellen för alla ämnen och prover genom att infoga lämplig information. Spara den färdiga sekvenstabellen.
Obs: Den exakta informationen för sekvenstabellen kommer att vara beroende av laboratoriernas formatering för tabellen. Minimiinformationen skulle normalt omfatta exempeltyp, provnamn, injektionsflaskasplats och -nummer, analysmetod och datafilplats och namn (allokering av ett datafilnamn som matchar exempelnamnet underlättar framtida databehandling). Ytterligare prover kan läggas till i sekvensen under analysen.
- Kör sekvensen genom att välja sekvens | Kör sekvens.
- Efter analys returnera prover till frysen så snart som möjligt.
OBS: Det kan vara möjligt att återanföra prover, men det bör noteras att vissa flyktiga komponenter kan ha extraherats helt under den första analysen och vissa föreningar kan ha genomgått termisk och bakteriell nedbrytning vid 40 °C, vilket innebär att det resulterande kromatogrammet kanske inte är helt representativt för den ursprungliga doftmärkningen.
5. Dataanalys
OBS: Inledande dataanalys inkluderar integrering av kromatogram för att erhålla retentionstid och toppområdesdata tillsammans med preliminär identifiering av toppar med hjälp av ChemStation-programvara och NIST (National Institute of Standards and Technology) masspektrala databaser, version MSD F.01.01.2317. Dataanalys kan utföras antingen manuellt eller genom en halvautomatisk metod. Om den halvautomatiska metoden används är det ibland fördelaktigt att genomföra en viss grad av manuell dataanalys för att verifiera preliminära identifieringar.
- Öppna datafilen genom att klicka på lämplig fil i det vänstra navigeringsfältet. Det totala jonkromatogrammet (TIC) visas i det övre fönstret på dataanalysskärmen.
- Om du vill integrera TIC med RTE-integratorn väljer du Kromatogram | Integrera.
- Justera integrationsparametrarna så att toppar som är större än 3 x baslinjebruset integreras. Välj Kromatogram | MS-signalintegreringsparametrar. I utmatningsrutan justerar du det minsta toppområdet efter behov (1.0 ger acceptabla resultat i våra exempel).
- Om du vill identifiera toppar och generera en sammanfattningsrapport väljer du Exportera rapporter | Rapport över sökresultat för bibliotek till XLS.
Obs: De spektralbibliotek som ska genomsökas tillsammans med antalet biblioteksmatchningar som ska visas måste förinställda i programvaran innan en bibliotekssökning kan genomföras. - Den resulterande kalkylbladsrapporten innehåller integrationsdata för varje topp och en preliminär spektralbiblioteksmatchning för att tilldela identitet. Vanligtvis bör bibliotekets kvalitet/biblioteksmatchning vara >80 för att acceptera den preliminära identifieringen. Spara kalkylbladet.
- Identifiera en topp direkt från TIC.
- Välj toppen av intresset.
- Om toppen är liten zoomar du in genom att rita en ruta runt toppen genom att hålla ned den vänstra musknappen, sträcka rutan över toppen och släpp.
- Placera markörlinjen så att den är på toppens högsta punkt (eller strax efter).
- Dubbelklicka på höger musknapp så visas masspektrumet för toppen i det nedre fönstret på dataanalysskärmen.
- Om du vill söka i spektralbiblioteket flyttar du markören var som helst i spektralfönstret och dubbelklickar på höger musknapp. Bibliotekets sökresultat visas i ett nytt fönster.
- Om du vill ta bort bakgrundsljudet från ett spektrum av intresse dubbelklickar du först på höger musknapp på toppen i fråga. Dubbelklicka sedan på höger musknapp i ett område utan toppar omedelbart framför toppen av intresset. Välj Kromatogram | Subtrat spektra. Det subtraherade spektrumet visas i det nedre fönstret på dataanalysskärmen och visas (-)" bredvid SCAN-data i fönsterhuvudet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter detta protokoll identifierade vi preliminärt totalt 32 flyktiga kemiska föreningar från analysen av 14 ano-genitala doftmärken spontant släppt på filterpapper av röd-ruffed lemurer (Varecia variegata rubra) och jämförde luktprofiler med funktioner i signaler12. Naturligt förekommande flyktiga föreningar, såsom kolväten, terpener, terpenalkoholer och ketoner, fanns inom dessa profiler och inkluderade föreningar som tidigare hade visat sig fungera som könsferomoner och signaler till kondition hos andra djurarter. De föreningar som preliminärt har identifierats anges i tabell 1. Representativa kromatogram (1 från en kontroll och 1 från ett lemurdoftmärke) visas i figur 1. Antalet och det relativa förekomst av komponenterna varierade från prov till prov för olika försökspersoner. Sex föreningar (bensaldehyd, 2-etyl-1-hexanol, p-cresol, cis-p-mentha-2,8-dien-1-ol, 2-pinen-4-one, pentadecane) var dock närvarande i alla prover.
Resultaten av denna studie föreslog att röd-ruffed lemurer använder doftmärkning för att förmedla information om kön och kvinnlig ålder, med ano-genital märkning spelar en roll i socio-sexuell kommunikation.
Ett annat representativt resultat efter användningen av detta protokoll var vår studie av fertilitetsreklam av kvinnliga oliv babianer(Papio anubis) (Vaglio et al. opublicerade data). Vi identifierade totalt 74 flyktiga föreningar från analysen av 385 kvinnliga babian vaginal lukt prover. Dessa föreningar inkluderade en rad naturligt förekommande luktfria flyktiga föreningar som ketoner, alkoholer, aldehyder, terpener, flyktiga fettsyror och kolväten. Typiska kromatogram som används för att jämföra blankkontroll och kvinnliga babian vaginala luktprover från bördiga och icke-bördiga perioder visas i figur 2. Vi undersökte sambanden mellan vaginal lukt profiler och sexuell mottaglighet kvinnliga babianer. Våra resultat visade att den totala mängden vaginal lukt skiljer sig från fertiliteten tyder på att lukt kan spela en roll i att signalera kvinnlig babian fertilitet. Vi fann också skillnader i vaginal lukt mellan grupptyper men vi kunde inte skilja effekterna av gruppsammansättning, kvinnlig ålder och paritet.
Figur 1. Exempel på kromatogram. Kontrollprovet , som visar främmande ämnen( det översta kromatogrammet -kontroll). (bottenkromatogram -'lemur doftmärke') en vuxen kvinnlig röd-ruffed lemur ano-genital lukt sekret, som visar föroreningar och meningsfulla biologiska föreningar. Röda pilar anger de sex meningsfulla biologiska föreningar som hittades i alla prover: a) bensaldehyd; b) 2-etyl-1hexanol, c) p-cresol, d) Cis-p-Mentha-2,8-dien-1-ol. e) 2-pinen-4-one, f) Pentadecane. Denna siffra har ändrats från Janda et al.12. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2. Exempel på kromatogram från kontrollprovet (övre kromatogrammet -"kontroll" som visar föroreningar. (mellersta kromatogram -"babian icke-bördig lukt") kvinnlig oliv babian, vaginal luktprov från icke-bördig period; och (bottenkromatogram -"babian bördig lukt") kvinnlig oliv babian, vaginal luktprov från bördig period. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| Retentionstid (minuter) | Preliminärt sammansatt ID | Molekylvikt |
| 3.906 | Sexvärt | 100 |
| 6.057 | 5-metyl-3-hexanon | 114 |
| 7.413 | Alfa-tall | 136 |
| 8.077 | 1-isopropyl-4-metyllenebicyclo[3.1.0]hex-2-one | 134 |
| 8.268 | Bensaldehyd | 106 |
| 8.623 | 3,7,7-trimetyl-1,3,5-cykloheptatrien | 134 |
| 9.096 | fenol | 94 |
| 9.269 | 6-methoxy-5-hepten-2-one | 126 |
| 10.72 | 2-etyl-1-hexanol | 130 |
| 12.362 | p-Cresol (på 1999) | 108 |
| 12.553 | cis-Verbenol (olika) | 152 |
| 13.385 | cis-p-Mentha-2,8-dien-1-ol | 152 |
| 14.104 | 1,7,7-Trimetylbicyclo[2.2.1]hepta-2-one | 152 |
| 14.536 | L-pinokarveol | 152 |
| 14.791 | trans-Verbenol | 152 |
| 15.605 | p-Etylfenol | 122 |
| 15.928 | Terpinen-4-ol | 154 |
| 16.415 | Alpha-Terpineol (olika) | 154 |
| 16.615 | Myrtenol (myrtenol) | 152 |
| 17.047 | 2-Pinen-4-1 | 150 |
| 18.252 | Karvon | 150 |
| 19.217 | p-Mentha-1,8-dien-3-one | 150 |
| 23.283 | 4,7,7-Trimetylbicyclo[4.1.0]hept-3-ene-2-one | 150 |
| 23.443 | Tetradekaner | 198 |
| 25.094 | Geranylacetone (geranylaceton) | 194 |
| 25.899 | Isomethylionone | 206 |
| 26.513 | Pentadecane (pentadecane) | 212 |
| 30.871 | 2,6,10-Trimetylpentadecane | 254 |
| 32.208 | Heptadecane (heptadekan) | 240 |
| 32.372 | 2,6,10-Trimetylhexadecane | 268 |
| 34.446 | n-Tetrakosan | 338 |
| 34.591 | 2,6,10,14-Tetramethylhexadecane | 282 |
Tabell 1. Flyktiga föreningar som finns i filterpappersprover från kvinnliga röd-ruffed lemur ano-genital lukt sekret identifieras preliminärt med hjälp av ChemStation programvara och NIST massa spektral databaser, version MSD F.01.01.2317. Denna tabell har ändrats från Janda et al.12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Användningen av kontrollprover, både miljökontroller som skapades vid tidpunkten för provtagningen och systemämnen, är avgörande för tolkningen av doftmärkesproverna. Alla toppar som tillskrivs provtagningsmiljön eller det instrumentella systemet måste undantas från doftmärkesprover så att endast de toppar som är av intresse inkluderas i någon tolkning. Dessa kontroller kan också spela en roll när det gäller att bedöma och övervaka instrumenteringens "hälsa".
Protokollet innehåller steg för att konditionering fiber före och efter varje extraktion. Detta underlättas genom användning av en autoprovtagare och säkerställer att det inte finns någon korskontaminering från prov till prov.
Den huvudsakliga begränsningen av metoden gäller själva proverna. Efter insamling är det viktigt att de lagras och transporteras på lämpligt sätt. Komponenterna av särskilt intresse är flyktiga, och dessa kan lätt gå förlorade eller deras koncentrationer ändras. För närvarande lagras och transporteras prover frysta, vanligtvis vid -20°C. Till följd av detta finns det en betydande kostnad för lagring och transport av dessa prover. Förseningar i transporten av prover till laboratoriet för analys kommer att öka dessa kostnader ytterligare och potentiellt påverka de resultat som erhålls från doftmärkena. Ytterligare forskning behövs för att förstå effekten av tid och lagring på de analysresultat som erhålls från prover. Eftersom de komponenter som är av särskild betydelse är de mer flyktiga komponenterna i doftmärkena är det möjligt att nivåerna på dessa komponenter kan ändra insamlingen efter provet. Hänsyn kan också behöva tas till potentiella bakterieeffekter inom vissa provtyper. Till exempel, vid alkoholtestning av urinprover, bakterier som finns i urinen kan producera alkohol och därför öka nivåerna av alkohol upptäckt.
Den nuvarande metoden uppfyller alla de krav som tidigare beskrivits. Det ger resultat av god kvalitet från vilka ytterligare information om sammansättningen av doftmärken erhålls. Analysen är dock en laboratoriebaserad teknik som är beroende av att proverna lämnas in till laboratoriet. En möjlig lösning på denna begränsning skulle vara användningen av portabel GC-MS-instrumentering, instrument som skulle kunna tas ut på det område där proverna tas. Detta tillvägagångssätt skulle minska behovet av att lagra och transportera prover och göra det möjligt att analysera doftmärken i realtid och potentiellt ge mer information om de mest flyktiga komponenterna i märkena. Flera bärbara GC-MS-instrument finns tillgängliga. De använder annan teknik än den som finns i den laboratoriebaserade instrumenteringen, men bör ge jämförbara resultat. Användningen av HS-SPME-extraktionstekniken är fortfarande tillämplig. Som ett resultat av att instrumenten är bärbara erbjuder de dock inte möjlighet till automatiserad provtagning. Om prover analyseras så snart de samlas in är det dock troligt att antalet dagliga prov är hanterbart för manuell injektion. Vid fältutvinning bör man också se till att SPME-fibern inte fångar miljökemikalier före användning. För närvarande tillgängliga instrument är batteridrivna vilket möjliggör total bärbarhet, men med hjälp av någon form av strömförsörjning (även en liten generator) kan dessa instrument användas under längre tidsperioder. Dessa instrument är till sin natur ofta utformade för att vara enkla att använda, med minimal utbildning och kunskap som krävs. Detta innebär att det kanske inte är nödvändigt att högutbildade aktörer sätts in med instrumentet och att de kan användas av dem som samlar in proverna. Detaljerad tolkning av analysresultat kan uppnås på distans eller när instrumentet återgår till basen.
En annan stor begränsning med metoder som använder SPME-fibrer är att det är möjligt att analysera endast kemiska föreningar som finns i överflöd i proverna. I synnerhet finns det mycket större mängder av kemikalien i proverna även när mängden molekyler är subthreshold för analysen med SPME-fibrer. Inom ramen för luktsekret som frigörs av djurdoftmärken och andra kemiska signaler från djur tenderar enskilda djur dessutom att använda kemiska föreningar i små mängder för att kommunicera med andra djur och/eller upptäcka luktsignaler från material. Med andra ord kan de olika prestandana hos djurnäsor och SPME-extraktion utgöra en stor utmaning för att denna provtagningsteknik ska bli framgångsrik.
Den framtida utvecklingen av den nuvarande metoden skulle kunna baseras på provtagning i och med undersökningen av användningen av alternativa sorbenta material eller sorbenta rör för användning med termiska desorpteringssystem. En sådan utveckling kan bidra till att ta prov på lagrings- och transportförhållanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Keith Holding för hans hjälp med kemiska analyser på Rosalind Franklin Science Center, Wolverhampton och Ben Mantle för produktionen av videon. Vi är också tacksamma mot prof. Gloriano Moneti, Dr. Giuseppe Pieraccini och medlemmarna i University of Florence's Mass Spectrometry Center, Florens, och till prof. Luca Calamai och Dr. Marco Michelozzi vid CNR: s ARCA Lab, Florens, för deras hjälp med att sätta upp denna metodik. De forskningsprojekt som omfattade de provtagnings- och analysmetoder som beskrivs i manuskriptet stöddes av två Marie Skłodowska-Curie Intra European Fellowships (Grant Agreement ID: 327083, 703611), ett litet anslag ("The sensory berikade primater') från Primate Society of Great Britain, och ett litet forskningsanslag ('Har jägar-samlare en speciell luktsinne?') från British Academy/The Leverhulme Trust till S.V. Det labbarbete som behövdes för att inrätta denna metod fick också finansiering från Fakulteten för vetenskap och tekniks årliga finansieringstävling (Wolverhampton) till S.V.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL autosampler vials | Agilent | 5188-5392 | 10 ml screwtop vials with |
| 18 mm vial caps | Agilent | 8010-0139 | Magnetic with PTFE/silicone septa |
| Autosampler | Agilent | GC120 PAL autosampler | |
| Capillary column | Agilent | HP5-MS | 30 m x 0.25 mm; 0.25 µm |
| Data analysis software | Agilent | - | ChemStation |
| Gas Chromatograph | Agilent | 7890B | |
| Inlet septa | Agilent | 5182-3442 | Merlin microseal |
| Mass Selective Detector | Agilent | 5977A | |
| Reporting software | Microsoft | - | Excel |
| Spectral library | NIST | - | NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library |
| Spectral library search program | NIST | - | MS Search v.2.2 |
| Splitless Inlet liner | Agilent | 5190-4048 | |
| SPME fibres | Agilent | SU57345U | 65 µm PDMS/DVB fibre |
References
- Wyatt, T. D. Pheromones and Animal Behavior: Chemical Signals and Signatures. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2014).
- Heymann, E. W. The neglected sense-olfaction in primate behavior, ecology, and evolution. American Journal of Primatology. 68 (6), 519-524 (2006).
- Drea, C. M., Boulet, M., DelBarco-Trillo, J. The "secret" in secretions: Methodological considerations in deciphering primate olfactory communication. American Journal of Primatology. 75 (7), 621-642 (2013).
- Vaglio, S., et al. Sternal gland scent-marking signals sex, age, rank and group identity in captive mandrills. Chemical Senses. 41 (2), 177-186 (2016).
- Marneweck, C., Jürgens, A., Shrader, A. M. Dung odours signal sex, age, territorial and oestrous state in white rhinos. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 284 (1846), (2016).
- Shear, W. A., Jones, T. H., Miras, H. M. A possible phylogenetic signal in milliped chemical defenses. Biochemical Systematics and Ecology. 35, 838-842 (2007).
- Kimura, R. Volatile substances in feces, urine and urine-marked feces of feral horses. Canadian Journal of Animal Science. 81 (3), 411-420 (2001).
- Vaglio, S., Minicozzi, P., Bonometti, E., Mello, G., Chiarelli, B. Volatile signals during pregnancy: a possible chemical basis for mother-infant recognition. Journal of Chemical Ecology. 35 (1), 131-139 (2009).
- Setchell, J. M., et al. Chemical composition of scent-gland secretions in an Old World monkey (Mandrillus sphinx): influence of sex, male status, and individual identity. Chemical Senses. 35 (3), 205-220 (2010).
- Setchell, J. M., et al. Odour signals MHC genotype in an Old World monkey. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 278 (1703), 274-280 (2011).
- Pawliszyn, J. Solid phase microextraction: theory and practice. , Wiley-VCH. New York, US. (1997).
- Janda, E. D., Perry, K., Hankinson, E., Walker, D., Vaglio, S. Sex differences in scent-marking in captive red-ruffed lemurs. American Journal of Primatology. 81 (1), 22951 (2019).
