Summary
Vi har udviklet en effektiv metode til prøveudtagning og analyse af lugtsignaler for at forstå, hvordan de kan bruges i dyrekommunikation. Især bruger vi headspace solid-fase mikroextraction kombineret med gaskromatografi-masse spektrometri til at analysere de flygtige komponenter af dyrelugt og duft-markeringer.
Abstract
Vi har udviklet en effektiv metode til prøveudtagning og analyse af lugtsignaler ved hjælp af headspace solid-phase microextraction kombineret med gaskromatografi-massespektrometri for at forstå, hvordan de kan anvendes i dyrekommunikation. Denne teknik gør det muligt at foretage en halvkantitativ analyse af de flygtige komponenter i lugtsekretioner ved at gøre det muligt at udskille og foreløbig identifikation af komponenterne i prøven efterfulgt af analysen af forholdet mellem spidsbelastningsområde og at lede efter tendenser, der kan betyde forbindelser, der kan være involveret i signalering. De vigtigste styrker ved denne aktuelle tilgang er det udvalg af stikprøvetyper, der kan analyseres. manglende behov for et komplekst prøvepræparat eller -ekstraktion evnen til at adskille og analysere komponenterne i en blanding; identifikation af de konstaterede komponenter og evnen til at levere semi-kvantitative og potentielt kvantitative oplysninger om de fundne komponenter. Den væsentligste begrænsning af metoden vedrører selve stikprøverne. Da komponenter af særlig interesse er flygtige, og disse let kan gå tabt, eller deres koncentrationer ændres, er det vigtigt, at prøverne opbevares og transporteres korrekt efter indsamlingen. Det betyder også, at opbevarings- og transportforholdene for stikprøver er relativt dyre. Denne metode kan anvendes på en række prøver (herunder urin, afføring, hår og duft-kirtel lugt sekreter). Disse lugte består af komplekse blandinger, der forekommer i en række matricer, og kræver derfor brug af teknikker til at adskille de enkelte komponenter og udtrække forbindelser af biologisk interesse.
Introduction
Der vides meget lidt om de kemiske ændringer , der understøtter de olfaktoriske signaler hos dyr1, også på grund af metodologiske udfordringer med at registrere og kvantificere flygtige kemiske profiler af lugt2. Der er flere potentielle faldgruber, når man arbejder med meget komplekse, kemiske matricer; disse omfatter ved prøveudtagning og analyse aflugtprøverne 3.
På Rosalind Franklin Science Center, University of Wolverhampton, er vi i gang med en analyse af lugt og duft-mærker til at forstå, hvordan de kan bruges af dyr. Vi kombinerer semiokemisteri med adfærdsmæssig økologi, endokrinologi og cytologi for at forbedre vores forståelse af den rolle, som olfaktoriske signaler spiller i dyrekommunikation.
Vi har udviklet en metode og derefter analyseret lugte og markeringer fra en række arter, herunder flere ikke-menneskelige primater (dvs. kronede lemurer, rød-ruffed lemurer, japanske makakaber, oliven bavianer, chimpanser) og andre pattedyr (dvs. katte, køer). Vi har indsamlet og analyseret en række prøver, herunder urin, afføring, hår og duft-kirtel lugt sekreter. Disse lugte og duftmærker består af komplekse blandinger af forbindelser, og derfor skal enhver metode, der anvendes til deres analyse, omfatte en form for separateringsteknik. Som illustreret forekommer de også i en række matricer, som kræver brug af teknikker til at udtrække de komponenter af interesse.
Tidligere undersøgelser foretaget af Vaglio et al.4 og andre forfattere5 anvendte dynamisk headspaceekstraktion (DHS) med gaskromatografi-massespektrometri (GC-MS), mens der også er anvendt direkte solventekstraktion6 og komplekse solventekstraktioner7. Især indebærer dynamisk headspace-prøvetagning, at hovedrummet renses med en kendt mængde inert gas, som i sidste ende fjerner alle flygtige forbindelser med undtagelse af dem, der viser en stærk affinitet for prøvematrixen (f.eks. polære forbindelser i vandige prøver).
For den nuværende metode har vi vedtaget teknikken med headspace solid-phase microextraction (HS-SPME) kombineret med GC-MS. Vi har især udviklet og forbedret den metode, der allerede blev anvendt af Vaglio et al. i det tidligere GC-MS-laboratorium8,9,10.
Solventless ekstraktion teknikker er meget effektive til at analysere små, meget flygtige forbindelser (som ellers kan gå tabt let fra en prøve), fordi disse metoder immobilisere forbindelser på en stabil, solid fase støtte. HS-SPME bruger en fiber belagt med en adsorbent polymer til at fange flygtige forbindelser i prøvens headspace eller til at udtrække opløste forbindelser ved nedsænkning i en vandig biologisk væske11. Polymerbelægningen binder ikke forbindelserne kraftigt, derfor kan de fjernes ved opvarmning i GC'ens injektionsport. Denne metode er mere kraftfuld end solventekstraktionsteknikker og også mere effektiv end DHS.
I den nuværende metode er prøverne indeholdt i glasflasker. Disse hætteglas opvarmes til en temperatur på 40 °C for at simulere dyrets kropstemperatur for at fremme de flygtige komponenter i duftmærket for at besætte hætteglassets hovedrum. En SPME-fiber, belagt med 65 μm polydimethylsiloxan/divinylbenzen (PDMS/DVB) sorbentmateriale, udsættes for headspacemiljøet, og flygtige komponenter fra prøven adsorberes på fiberen. Ved opvarmning af fiberen i indløbsporten på en GC-MS desorberes de flygtige komponenter fra fiberen og adskilles derefter af GC. Der opnås massespektralfragmenteringsmønstre for hver komponent, der anvender MS. Ved sammenligning af disse massespektre mod massespektrale databaser kan det være muligt forsøgsvis at identificere komponenterne i duftmærket. Gennem brug af en auto-sampler, er vi i stand til at analysere flere prøver i partier på en ensartet måde.
I betragtning af at hver type SPME fiber har en anden affinitet med polære kemikalier, er fiberen normalt vælges afhængigt af polaritet og / eller molekylvægt af målet kemiske forbindelser. Derudover ændres GC-betingelserne afhængigt af typen af GC-kolonne og egenskaberne ved de målkemiske forbindelser.
Denne teknik gør det muligt at foretage en halvkantitativ analyse af de flygtige komponenter i duftmarkeringer ved at muliggøre adskillelse og foreløbig identifikation af komponenterne i prøven efterfulgt af en analyse af forholdet mellem spidsbelastningsområde for at se efter tendenser, der kan betyde komponenter i duftmærkningen, der kan være involveret i signalering.
De vigtigste styrker ved denne nuværende tilgang er:
- Det interval af eksempeltyper, der kan analyseres.
- Der kræves ingen kompleks prøveforberedelse eller -ekstraktion.
- Evnen til at analysere flygtige komponenter.
- Evnen til at adskille komponenterne i en blanding.
- At være i stand til at identificere de fundne komponenter.
- Evnen til at give semi-kvantitative og potentielt kvantitative oplysninger om de fundne komponenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Prøveindsamling
- Prøvelugt, der er en af følgende:
- Indsamle spontant frigivet af beboede forsøgspersoner (f.eks zoo primater) via duft-mærkning på sterilt filterpapir (f.eks duft-kirtel lugt sekreter) eller direkte i hætteglas (f.eks urin).
- Indsamle ved at gnide sterile vatpinde efter træning forsøgspersoner ved hjælp af positiv forstærkning uddannelse.
- Indsamle ved at gnide sterile vatpinde efter sedation af forsøgspersoner.
- Prøverne anbringes i sterile 10 mL skruehættede klare glasglas, og der forsegles med skruetoppede hætter med FTFE/silikone-septa. Opbevar dem straks ved -20 °C.
BEMÆRK: Det er vigtigt at bruge rene personlige værnemidler, såsom nitrilhandsker; ændre dem ofte; undgå direkte hudkontakt med prøver og hætteglas. Det foretrækkes at bruge helt nye hætteglas; I tilfælde af brugte hætteglas er det imidlertid afgørende at forrense hætteglassene og derefter bruge den samme protokol. - Tag miljømæssige emner, hver gang duft-mærker er indsamlet. F.eks. indsamles prøvetagningsmedierne (f.eks. filtrerpapir eller vatpind) og et headspace-hætteglas, der udsættes for miljøet, mens der udtages prøver.
2. Prøveforberedelse
- Forbered prøver i marken ved at skære med en kniv en omtrentlig 10 mm kvadrat fra en duft-mærket filterpapir, eller lederen af vatpinden, og placere den i en 10 mL skrue-toppet hoved-rum hætteglas.
- Når hver prøve er blevet forberedt, skal klingen, der anvendes til at skære prøvemediet, bortskaffes eller rengøres ved hjælp af en passende antibakteriel tør og/eller alkohol, og den tørres grundigt.
- Alle prøver opbevares ved -20 °C.
BEMÆRK: Foretrækkes ved -20 °C eller på anden måde så lavt som praktisk muligt i marken.
3. Forberedelse til analyse
- Prøverne fjernes fra fryseren, og der opvarmes naturligt til stuetemperatur i mindst 1 time.
- Konfigurer analysemetoden på GC-MS på følgende måde:
- For SPME-analysebetingelser skal du følge producentens anvisninger for at konditionere SPME-fibre før første brug: fiberforbehandler (260 °C i 5 min), prøveinkubation (40 °C i 2 minutter), ekstraktionstid (15 min), desorptionstid (2 min) og fiber efter tilstand (260 °C i 20 min).
- Brug følgende GC-betingelser: kolonne (HP5-MS 30 m x 0,25 mm; 0,25 μm), injektortemperatur (270 °C), strømningshastighed (1 mL/min), injektionstilstand (splitless), GC-ovnprofil (45 °C i 2 minutter; 4 °C/min. til 170 °C; 20 °C/min. til 300 °C), overførselslinje for muskel- og pengeoverførsel (280 °C).
BEMÆRK: For at forbedre opbevaringstiden mellem prøvefastholdelsestiden er analysemetoden opbevaringstid låst). - Brug følgende MSD-betingelser: forsinkelse af opløsningsmidler (2,5 min. ) og scanningsområde (29 til 400 amu).
BEMÆRK: Der blev anvendt et interval på 10 til 400 i tidligere protokol4.
- Sørg for, at rensegasforsyningen til fiberkonditioneringsenheden er tændt.
BEMÆRK: Det er vigtigt, at SPME-samlingen er korrekt installeret i autoprøvetageren, og at den er justeret efter de automatiske prøvebakker, fiberkonditioneringsenheden og GC-indløbsporten. Forkert justering kan resultere i skade eller ødelæggelse af SPME-fiberen.
4. Analyse
- Placer et tomt headspace-hætteglas (for at fungere som et system tomt) i første position af GC-MS autoprøvebakken. Placer den miljømæssige blindprøve i den anden position af autoprøvebakken. Prøverne anbringes til analyse i de efterfølgende positioner på bakken med automatisk prøve.
- Opret en analysesekvens for at analysere hver prøve i prøvebakken.
- Vælg Sequence | Indlæs sekvens.
- Udfyld sekvenstabellen for alle tomme felter og eksempler ved at indsætte de relevante oplysninger. Gem den færdige sekvenstabel.
BEMÆRK: De nøjagtige oplysninger for sekvenstabellen afhænger af laboratoriernes formatering af tabellen. Minimumoplysningerne omfatter normalt eksempeltype, eksempelnavn, hætteglasplacering og -nummer, analysemetode og placering og navn af datafil (tildeling af et datafilnavn, der svarer til eksempelnavnet, hjælper fremtidig databehandling). Yderligere prøver kan føjes til sekvensen under analysen.
- Kør sekvensen ved at vælge | Kør sekvens.
- Efter analyse returneres prøverne til fryseren så hurtigt som muligt.
BEMÆRK: Det kan være muligt at reanalysere prøver, men det skal bemærkes, at nogle flygtige komponenter kan være blevet fuldstændig ekstraheret under den indledende analyse, og at nogle forbindelser kan have undergået termisk og bakteriel nedbrydning ved 40 °C, hvorfor det resulterende kromatogram muligvis ikke er grundigt repræsentativt for den oprindelige duftmærkning.
5. Dataanalyse
BEMÆRK: Indledende dataanalyse omfatter integration af kromatogrammer for at opnå opbevaringstid og data om spidsbelastningsområde sammen med foreløbig identifikation af toppe ved hjælp af ChemStation-software og NIST (National Institute of Standards and Technology) massespektraldatabaser, version MSD F.01.01.2317. Dataanalyse kan udføres enten manuelt eller ved hjælp af en halvautomatisk metode. Hvis den halvautomatiske metode anvendes, er det undertiden gavnligt at foretage en vis manuel dataanalyse for at verificere foreløbige identifikationer.
- Åbn datafilen ved at klikke på den relevante fil på navigationslinjen til venstre. Det samlede ION-kromatogram (TIC) vises i det øverste vindue på dataanalyseskærmen.
- Hvis du vil integrere TIC ved hjælp af RTE-integratoren, skal du vælge Chromatogram | Integrer.
- Juster integrationsparametre, så toppe, der er større end 3 x grundlinjestøj, integreres. Vælg | Parametre for MS Signal Integration. I outputboksen justeres minimumstoparealet efter behov (1,0 giver acceptable resultater i vores eksempler).
- Hvis du vil identificere spidsbelastninger og generere en oversigtsrapport, skal du vælge Eksporter rapporter | Rapporten med søgeresultater for biblioteker til XLS.
BEMÆRK: De spektralbiblioteker, der skal søges sammen med antallet af biblioteksmatch, der skal vises, skal forudindstilles i softwaren, før der kan foretages en bibliotekssøgning. - Den resulterende regnearksrapport indeholder integrationsdata for hvert højdepunkt og et foreløbigt spektralbibliotek, der svarer til tildelingen af identitet. Bibliotekskvaliteten/biblioteksmatchet skal typisk være >80 for at acceptere den foreløbige identifikation. Gem regnearket.
- Identificer et højdepunkt direkte fra TIC.
- Vælg toppen af interesse.
- Hvis toppen er lille, skal du zoome ind ved at tegne en boks rundt om toppen ved at holde venstre museknap nede, strække boksen over toppen og slippe.
- Placer markørlinjen, så den er på det højeste punkt i toppen (eller lige efter).
- Dobbeltklik på højre museknap, og massespektret for toppen vises i det nederste vindue på dataanalyseskærmen.
- Hvis du vil søge i spektralbiblioteket, skal du flytte markøren et vilkårligt sted i spektralvinduet og dobbeltklikke på højre museknap. Bibliotekets søgeresultater vises i et nyt vindue.
- Hvis du vil fjerne baggrundsstøjen fra et interessespektrum, skal du først dobbeltklikke på højre museknap på det pågældende højdepunkt. Dobbeltklik derefter på højre museknap i et område uden toppe umiddelbart foran toppen af interessen. Vælg | Træk spektre fra. Det subtraktive spektrum vises i det nederste vindue på dataanalyseskærmen og viser '(-)' ud for SCAN-dataene i vinduesoverskriften.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter denne protokol identificerede vi foreløbigt i alt 32 flygtige kemiske forbindelser fra analysen af 14 ano-genitale duftmærker, der spontant blev frigivet på filterpapir af rød-ruffede lemurer (Varecia variegata rubra) og sammenlignede lugtprofiler med funktionerne i signaler12. Naturligt forekommende flygtige forbindelser, såsom kulbrinter, terpener, terpenalkoholer og ketoner, var til stede inden for disse profiler og omfattede forbindelser, der tidligere havde vist sig at fungere som sex feromoner og signaler til fitness i andre dyrearter. De forbindelser , der foreløbigt er identificeret , er anført i tabel 1. Repræsentative kromatogrammer (1 fra en kontrol og 1 fra et lemurduftemærke) er vist i figur 1. Antallet og den relative overflod af komponenterne varierede fra prøve til prøve på tværs af forskellige forsøgspersoner. Der var imidlertid seks forbindelser (benzaldehyd, 2-ethyl-1-hexanol, p-cresol, cis-p-mentha-2,8-dien-1-ol, 2-pinen-4-one, pentadecane) til stede i alle prøver.
Resultaterne af denne undersøgelse antydede, at rød-ruffed lemurer bruger duft-mærkning til at formidle oplysninger om køn og kvindelige alder, med ano-genital mærkning spiller en rolle i socio-seksuel kommunikation.
Et andet repræsentativt resultat efter brugen af denne protokol var vores undersøgelse af fertilitetsannonce af kvindelige olivenbavianer (Papio anubis) (Vaglio et al. ikke-offentliggjorte data). Vi identificerede i alt 74 flygtige forbindelser fra analysen af 385 kvindelige bavian vaginal lugt prøver. Disse forbindelser omfattede en række naturligt forekommende lugtholdige flygtige forbindelser såsom ketoner, alkoholer, aldehyder, terpener, flygtige fedtsyrer og kulbrinter. Typiske kromatogrammer, der anvendes til at sammenligne blank kontrol og kvindelige bavian vaginal lugtprøver fra frugtbare og ikke-frugtbare perioder, er vist i figur 2. Vi undersøgte forholdet mellem vaginal lugt profiler og seksuel modtagelighed af kvindelige bavianer. Vores resultater viste, at den samlede mængde vaginal lugt adskiller sig med fertilitet tyder på, at lugt kan spille en rolle i signalering kvindelige bavian frugtbarhed. Vi fandt også forskelle i vaginal lugt mellem gruppetyper, men vi kunne ikke skelne virkningerne af gruppesammensætning, kvindelig alder og paritet.
Figur 1. Eksempel på kromatogrammer; (topkromatogram -'kontrol') kontrolprøven, der viser forurenende stoffer (bundkromatogram -'lemur duft-mærke') en voksen kvinde rød-ruffed lemur ano-genital lugt sekreter, der viser forurenende stoffer og meningsfulde biologiske forbindelser. Røde pile angiver de seks meningsfulde biologiske forbindelser, der blev fundet i alle prøver: a) benzaldehyd; b) 2-ethyl-1hexanol c) p-cresol d) cis-p-mentha-2,8-dien-1-ol e) 2-pinen-4-1 f) pentadecane. Dette tal er blevet ændret fra Janda et al.12. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Eksempel på kromatogram fra (øverste kromatogram -'kontrol') kontrolprøve, der viser forurenende stoffer; (mellemkromatogram -'bavian ikke-frugtbar lugt') kvindelig olivenbavian, vaginal lugtprøve fra ikke-frugtbar periode; og (bundkromatogram -'bavian frugtbar lugt') kvindelig olivenbavian, vaginal lugtprøve fra frugtbar periode. Klik her for at se en større version af dette tal.
| RetentionStid (min.) | Foreløbigt sammensat id | Molekylvægt |
| 3.906 | Hexanal | 100 |
| 6.057 | 5-methyl-3-hexanone | 114 |
| 7.413 | Alfa-pinene | 136 |
| 8.077 | 1-isopropyl-4-methylenbicyclo[3.1.0]hex-2-1 | 134 |
| 8.268 | Benzaldehyd | 106 |
| 8.623 | 3,7,7-trimethyl-1,3,5-cycloheptatriene | 134 |
| 9.096 | fenol | 94 |
| 9.269 | 6-methoxy-5-hepten-2-1 | 126 |
| 10.72 | 2-ethyl-1-hexanol | 130 |
| 12.362 | p-Cresol | 108 |
| 12.553 | cis-Verbenol | 152 |
| 13.385 | cis-p-Mentha-2,8-dien-1-ol | 152 |
| 14.104 | 1,7,7-Trimethylbicyclo[2.2.1]hepta-2-1 | 152 |
| 14.536 | L-Pinocarveol | 152 |
| 14.791 | trans-Verbenol | 152 |
| 15.605 | p-Ethyl-phenol | 122 |
| 15.928 | Terpinen-4-ol | 154 |
| 16.415 | Alpha-Terpineol | 154 |
| 16.615 | Myrtenol | 152 |
| 17.047 | 2-Pinen-4-1 | 150 |
| 18.252 | Carvon | 150 |
| 19.217 | p-Mentha-1,8-dien-3-one | 150 |
| 23.283 | 4,7,7-Trimethylbicyclo[4.1.0]hept-3-ene-2-one | 150 |
| 23.443 | Tetradecane | 198 |
| 25.094 | Geranylacetone | 194 |
| 25.899 | Isomethylionone | 206 |
| 26.513 | Pentadecane | 212 |
| 30.871 | 2,6,10-Trimethylpentadecane | 254 |
| 32.208 | Heptadecane | 240 |
| 32.372 | 2,6,10-Trimethylhexadecane | 268 |
| 34.446 | n-Tetracosane | 338 |
| 34.591 | 2,6,10,14-Tetramethylhexadecane | 282 |
Tabel 1. Flygtige forbindelser til stede i filterpapir prøver fra kvindelige rød-ruffed lemur ano-genital lugt sekreter identificeret forsøgsvis ved hjælp af ChemStation software og NIST massespektral databaser, version MSD F.01.01.2317. Tabellen er ændret fra Janda et al.12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Brugen af kontrolprøver, både miljøkontroller, der blev oprettet på tidspunktet for prøveindsamlingen, og systemdiske emner er afgørende for fortolkningen af duftmærkeprøverne. Eventuelle toppe, der tilskrives prøvetagningsmiljøet eller instrumentsystemet, skal udelukkes fra duftmærkeprøver, således at kun de højeste af interesse indgår i enhver fortolkning. Disse kontroller kan også spille en rolle i vurderingen og overvågningen af instrumenteringens "sundhed".
Protokollen indeholder trin til at konditionere fiberen før og efter hver ekstraktion. Dette gøres lettere ved brug af en automatisk prøvetager og sikrer, at der ikke er krydskontaminering fra prøve til prøve.
Den væsentligste begrænsning af metoden vedrører selve stikprøverne. Efter indsamling er det vigtigt, at de opbevares og transporteres korrekt. Komponenterne af særlig interesse er flygtige, og disse kan let gå tabt, eller deres koncentrationer ændres. I øjeblikket opbevares og transporteres prøver frosset, typisk ved -20 °C. Som følge heraf er der betydelige omkostninger forbundet med opbevaring og transport af disse prøver. Forsinkelser i transporten af prøver til laboratoriet til analyse vil øge disse omkostninger yderligere og potentielt påvirke resultaterne af duftmærkerne. Yderligere forskning er nødvendig for at forstå effekten af tid og opbevaring på de analytiske resultater fra prøver. Da komponenter af særlig betydning er de mere flygtige komponenter i duftmærkerne, er det muligt, at niveauerne af disse komponenter kan ændre indsamlingen efter prøven. Det kan også være nødvendigt at overveje potentielle bakterielle virkninger inden for visse stikprøvetyper. For eksempel, i alkohol test af urinprøver, bakterier til stede i urinen kan producere alkohol og derfor øge niveauet af alkohol opdaget.
Den nuværende metode opfylder alle de krav, der tidligere er skitseret. Det giver resultater af god kvalitet, hvorfra der indhentes yderligere oplysninger om sammensætningen af duftmærker. Analysen er imidlertid en laboratoriebaseret teknik, der er afhængig af, at prøverne indsendes til laboratoriet. En mulig løsning på denne begrænsning ville være ved hjælp af bærbare GC-MS instrumentering, instrumenter, der kunne tages i det område, hvor prøverne er ved at blive taget. Denne fremgangsmåde vil mindske behovet for at opbevare og transportere prøver og vil gøre det muligt at foretage realtidsanalyser af duftmærker, der potentielt giver større information om de mest flygtige komponenter i varemærkerne. Der findes flere bærbare GC-MS-instrumenter. De bruger anden teknologi end den, der findes i den laboratoriebaserede instrumentering, men bør give sammenlignelige resultater. Anvendelsen af HS-SPME-ekstraktionsteknikken er stadig gældende. Som følge af transportabel giver instrumenterne imidlertid ikke mulighed for automatisk indførelse af stikprøver. Hvis prøverne analyseres, så snart de er indsamlet, vil de daglige prøvetal sandsynligvis kunne håndteres med henblik på manuel injektion. I tilfælde af markudvinding skal det også sørges for, at SPME-fiberen ikke fanger miljøkemikalier før brug. De instrumenter, der er til rådighed i øjeblikket, er batteridrevne, hvilket muliggør total bærbarhed, men med en eller anden form for strømforsyning (selv en lille generator) kan disse instrumenter betjenes i længere tid. Disse instrumenter er i sagens natur ofte designet til at være enkle at betjene, med minimal uddannelse og viden påkrævet. Det betyder, at det måske ikke er nødvendigt, at højtuddannede operatører indsættes sammen med instrumentet, og at de kan betjenes af dem, der indsamler prøverne. Detaljeret fortolkning af analyseresultater kan opnås eksternt, eller når instrumentet vender tilbage til basen.
En anden væsentlig begrænsning med metoder, der bruger SPME-fibre, er, at det kun er muligt at analysere kemiske forbindelser, der findes i overflod i prøverne. Især findes der langt større mængder af kemikaliet i prøverne, selv når mængden af molekyler er subthreshold til analysen ved hjælp af SPME-fibre. I forbindelse med lugtsekretioner, der frigives af dyreduftemærker og andre kemiske signaler fra dyr, har de enkelte dyr desuden en tendens til at bruge kemiske forbindelser i små mængder til at kommunikere med andre dyr og/eller detektere olfaktoriske signaler fra materialer. Med andre ord kan de forskellige præstationer af dyrenæser og SPME-ekstraktion udgøre en stor udfordring for denne prøvetagningstekniks succes.
Den fremtidige udvikling af den nuværende metode kunne baseres på stikprøveindsamling med undersøgelsen af brugen af alternative sorbentmaterialer eller sorbentrør til brug med termiske desorptionssystemer. En sådan udvikling kan bidrage til at prøve opbevarings- og transportforholdene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Keith Holding for hans hjælp med kemiske analyser på Rosalind Franklin Science Center, Wolverhampton, og Ben Mantle for produktionen af videoen. Vi er også taknemmelige for professor Gloriano Moneti, Dr. Giuseppe Pieraccini og medlemmerne af Universitetet i Firenzes Mass Spectrometry Center, Firenze, og for prof. Luca Calamai og Dr. Marco Michelozzi fra CNR's ARCA Lab, Firenze, for deres hjælp til at oprette denne metode. De forskningsprojekter, der omfattede de prøveudtagnings- og analysemetoder, der er beskrevet i manuskriptet, blev støttet af to Marie Skłodowska-Curie Intra European Fellowships (Grant Agreement IDs: 327083, 703611), et lille tilskud ('Den sensoriske berigede primat') fra Primate Society of Britain og et lille forskningstilskud ('Har jæger-samlere en særlig lugtesans?') fra British Academy / The Leverhulme Trust til S.V. Laboratoriearbejdet, der var nødvendigt for at oprette denne metode, modtog også finansiering fra Det Naturvidenskabelige Fakultets årlige finansieringskonkurrence (Wolverhampton) til S.V.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL autosampler vials | Agilent | 5188-5392 | 10 ml screwtop vials with |
| 18 mm vial caps | Agilent | 8010-0139 | Magnetic with PTFE/silicone septa |
| Autosampler | Agilent | GC120 PAL autosampler | |
| Capillary column | Agilent | HP5-MS | 30 m x 0.25 mm; 0.25 µm |
| Data analysis software | Agilent | - | ChemStation |
| Gas Chromatograph | Agilent | 7890B | |
| Inlet septa | Agilent | 5182-3442 | Merlin microseal |
| Mass Selective Detector | Agilent | 5977A | |
| Reporting software | Microsoft | - | Excel |
| Spectral library | NIST | - | NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library |
| Spectral library search program | NIST | - | MS Search v.2.2 |
| Splitless Inlet liner | Agilent | 5190-4048 | |
| SPME fibres | Agilent | SU57345U | 65 µm PDMS/DVB fibre |
References
- Wyatt, T. D. Pheromones and Animal Behavior: Chemical Signals and Signatures. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2014).
- Heymann, E. W. The neglected sense-olfaction in primate behavior, ecology, and evolution. American Journal of Primatology. 68 (6), 519-524 (2006).
- Drea, C. M., Boulet, M., DelBarco-Trillo, J. The "secret" in secretions: Methodological considerations in deciphering primate olfactory communication. American Journal of Primatology. 75 (7), 621-642 (2013).
- Vaglio, S., et al. Sternal gland scent-marking signals sex, age, rank and group identity in captive mandrills. Chemical Senses. 41 (2), 177-186 (2016).
- Marneweck, C., Jürgens, A., Shrader, A. M. Dung odours signal sex, age, territorial and oestrous state in white rhinos. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 284 (1846), (2016).
- Shear, W. A., Jones, T. H., Miras, H. M. A possible phylogenetic signal in milliped chemical defenses. Biochemical Systematics and Ecology. 35, 838-842 (2007).
- Kimura, R. Volatile substances in feces, urine and urine-marked feces of feral horses. Canadian Journal of Animal Science. 81 (3), 411-420 (2001).
- Vaglio, S., Minicozzi, P., Bonometti, E., Mello, G., Chiarelli, B. Volatile signals during pregnancy: a possible chemical basis for mother-infant recognition. Journal of Chemical Ecology. 35 (1), 131-139 (2009).
- Setchell, J. M., et al. Chemical composition of scent-gland secretions in an Old World monkey (Mandrillus sphinx): influence of sex, male status, and individual identity. Chemical Senses. 35 (3), 205-220 (2010).
- Setchell, J. M., et al. Odour signals MHC genotype in an Old World monkey. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 278 (1703), 274-280 (2011).
- Pawliszyn, J. Solid phase microextraction: theory and practice. , Wiley-VCH. New York, US. (1997).
- Janda, E. D., Perry, K., Hankinson, E., Walker, D., Vaglio, S. Sex differences in scent-marking in captive red-ruffed lemurs. American Journal of Primatology. 81 (1), 22951 (2019).
