Summary
Vi har utviklet en effektiv metodikk for prøvetaking og analyse av luktsignaler for å forstå hvordan de kan brukes i dyrekommunikasjon. Spesielt bruker vi headspace solid-phase mikroekstraksjon kombinert med gasskromatografi-massespektrometri for å analysere de flyktige komponentene i dyrelukt og duftmarkeringer.
Abstract
Vi har utviklet en effektiv metodikk for prøvetaking og analyse av luktsignaler, ved å bruke fastfasemikroekstraksjon i hoderommet kombinert med gasskromatografi-massespektrometri, for å forstå hvordan de kan brukes i dyrekommunikasjon. Denne teknikken tillater semi-kvantitativ analyse av de flyktige komponentene av luktsekretjoner ved å muliggjøre separasjon og foreløpig identifisering av komponentene i prøven, etterfulgt av analyse av toppområdeforhold for å se etter trender som kan betegne forbindelser som kan være involvert i signalering. Nøkkelstyrkene ved denne gjeldende tilnærmingen er utvalget av utvalgstyper som kan analyseres. mangelen på behov for komplekse prøvepreparater eller ekstraksjoner; evnen til å skille og analysere komponentene i en blanding; identifikasjonen av komponentene som ble oppdaget; og muligheten til å gi semi-kvantitativ og potensielt kvantitativ informasjon om komponentene som oppdages. Hovedbegrensningen på metodikken gjelder selve prøvene. Siden komponentene av spesifikk interesse er flyktige, og disse lett kan gå tapt, eller konsentrasjonene deres endres, er det viktig at prøvene lagres og transporteres på riktig måte etter innsamlingen. Dette betyr også at prøvelagrings- og transportforholdene er relativt kostbare. Denne metoden kan brukes på en rekke prøver (inkludert urin, avføring, hår og luktsekretjoner i duftkjertelen). Disse luktene består av komplekse blandinger, som forekommer i en rekke matriser, og krever dermed bruk av teknikker for å skille de enkelte komponentene og trekke ut forbindelsene av biologisk interesse.
Introduction
Svært lite er kjent om de kjemiske endringene som ligger til grunn for de olfaktoriske signalene hos dyr1, også på grunn av metodologiske utfordringer ved registrering og kvantifisering av flyktige kjemiske profiler av lukt2. Det er flere potensielle fallgruver når du arbeider med svært komplekse, kjemiske matriser; disse inkluderer ved prøvetaking og analyse av luktprøvene3.
På Rosalind Franklin Science Center, University of Wolverhampton, gjennomfører vi analysen av lukt og duftmerker for å forstå hvordan de kan brukes av dyr. Vi kombinerer semiokjemi med atferdsøkologi, endokrinologi og cytologi for å forbedre vår forståelse av rollen som spilles av olfaktoriske signaler i dyrekommunikasjon.
Vi har utviklet en metodikk og deretter analysert lukt og markeringer fra en rekke arter, inkludert flere ikke-menneskelige primater (dvs. kronede lemurer, rød-ruffed lemurer, japanske macaques, olivenbavianer, sjimpanser) og andre pattedyr (dvs. katter, kyr). Vi har samlet og analysert en rekke prøver, inkludert urin, avføring, hår og luktsekretjoner i duftkjertelen. Disse luktene og duftmerkene består av komplekse blandinger av forbindelser, og derfor må enhver metodikk som brukes til analysen, inkludere en form for separatorteknikk. Som illustrert forekommer de også i en rekke matriser som nødvendiggjør bruk av teknikker for å trekke ut komponentene av interesse.
Tidligere studier av Vaglio et al.4 og andre forfattere5 brukte dynamisk headspace extraction (DHS) med gasskromatografi-massespektrometri (GC-MS) mens direkte løsningsmiddelutvinning6 og komplekse løsningsmiddelutvinninger7 også har blitt brukt. Spesielt innebærer dynamisk hoderomsprøvetaking å rense hoderommet med et kjent volum inertgass som til slutt fjerner alle flyktige forbindelser med unntak av de som viser en sterk affinitet for prøvematrisen (for eksempel polare forbindelser i vandige prøver).
For den nåværende metodikken har vi tatt i bruk teknikken for headspace solid-phase microextraction (HS-SPME) kombinert med GC-MS. Spesielt har vi utviklet og forbedret metodikken som allerede brukes av Vaglio et al. i sitt forrige GC-MS-laboratorium8,9,10.
Løsemiddelløse ekstraksjonsteknikker er svært effektive for å analysere små, svært flyktige forbindelser (som ellers kan gå tapt lett fra en prøve) fordi disse metodene immobiliserer forbindelser på en stabil, solid fasestøtte. HS-SPME bruker en fiberbelagt med en adsorbentpolymer for å fange flyktige forbindelser i prøvehoderommet eller for å trekke ut oppløste forbindelser ved nedsenking i en vandig biologisk væske11. Polymerbelegget binder ikke forbindelsene sterkt, derfor ved oppvarming i injeksjonsporten til GC kan de fjernes. Denne metoden er kraftigere enn løsningsmiddelekstraksjonsteknikker og også mer effektiv enn DHS.
I den nåværende tilnærmingen finnes prøver i glassflasker. Disse hetteglassene varmes opp til en temperatur på 40 °C for å simulere kroppstemperaturen til dyr for å fremme de flyktige komponentene i duftmerket for å okkupere hetteglassets hoderom. En SPME fiber, belagt med 65 μm polydimetylsiloksan /divinylbenzen (PDMS/DVB) sorbent materiale, er utsatt for headspace miljøet og flyktige komponenter fra prøven adsorberes på fiberen. Ved oppvarming av fiberen i innløpsporten til en GC-MS blir de flyktige komponentene desorbert fra fiberen og deretter skilt av GC. Massespektral fragmentering mønstre oppnås for hver komponent ved hjelp av MS. Ved sammenligning av disse massespektra mot massespektraldatabaser, kan det være mulig å foreløpig identifisere komponentene i duftmerket. Gjennom bruk av en auto-sampler, er vi i stand til å analysere flere prøver i partier på en konsekvent måte.
Gitt at hver type SPME fiber har en annen affinitet med polare kjemikalier, er fiberen vanligvis valgt avhengig av polariteten og / eller molekylvekten til målkjemiske forbindelser. I tillegg endres GC-forholdene avhengig av typen GC-kolonne og egenskapene til målkjemiske forbindelser.
Denne teknikken gjør det mulig for den semi-kvantitative analysen av de flyktige komponentene i duftmarkeringer ved å muliggjøre separasjon og foreløpig identifisering av komponentene i prøven, etterfulgt av analyse av toppområdeforhold for å se etter trender som kan betegne komponenter i duftmarkeringen som kan være involvert i signalering.
De viktigste styrkene ved denne nåværende tilnærmingen er:
- Utvalget av utvalgstyper som kan analyseres.
- Ingen komplekse prøvepreparater eller ekstraksjoner er nødvendig.
- Evnen til å analysere flyktige komponenter.
- Evnen til å skille komponentene i en blanding.
- For å kunne identifisere komponentene som ble oppdaget.
- Evnen til å gi semi-kvantitativ og potensielt kvantitativ informasjon om komponentene som oppdages.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Eksempelsamling
- Prøv lukt som er en av følgende:
- Samle spontant utgitt av vanlige forsøkspersoner (f.eks. dyrehage primater) via duftmarkering på sterilt filterpapir (f.eks. luktsekretjoner i duftkjertelen) eller direkte i hetteglass (f.eks. urin).
- Samle ved å gni sterile bomullspinne etter trening studere forsøkspersoner ved hjelp av positiv forsterkningstrening.
- Samle ved å gni sterile bomullspinne etter sedasjon av forsøkspersoner.
- Plasser prøver i sterile 10 ml skruekappede klare hetteglass i glass, og forsegle med skrue toppede hetter som inneholder FTFE/silikon septa. Oppbevar dem umiddelbart ved -20 °C.
MERK: Det er viktig å bruke rent personlig verneutstyr, for eksempel nitrilhansker; endre dem ofte; unngå direkte hudkontakt med prøver og hetteglass. Det er foretrukket å bruke helt nye hetteglass; Ved brukte hetteglass er det imidlertid viktig å forhåndsrense hetteglassene, og deretter bruke samme protokoll. - Ta miljøemner hver gang duftmerker samles inn. Samle for eksempel prøvetakingsmediet (f.eks. filterpapir eller vattpinne) og et hetteglass med hoderom som utsettes for miljøet under prøvetaking.
2. Prøvepreparering
- Forbered prøver i feltet ved å kutte med et blad en omtrentlig 10 mm firkant fra et duftmerket filterpapir eller vattpinnens hode, og plasser det i et 10 ml skrue-toppet hode-rom hetteglass.
- Etter at hver prøve er klargjort, kast eller rengjør bladet som brukes til å kutte prøvetakingsmediet med en passende antibakteriell klut og/eller alkohol og tørk grundig.
- Oppbevar alle prøver ved -20 °C.
MERK: Foretrekkes ved -20 °C eller på annen måte så lavt som praktisk mulig i felten.
3. Forberedelse til analyse
- Fjern prøver fra fryseren og la det varme naturlig til romtemperatur i minst 1 time.
- Definer analysemetoden på GC-MS på følgende måte:
- For SPME-analyseforhold må du følge produsentens anvisninger for å kondisjonere SPME-fibre før første gangs bruk: fiberpre-tilstand (260 °C i 5 minutter), prøveinkubasjon (40 °C i 2 minutter), ekstraksjonstid (15 min), desorpsjonstid (2 min) og fiberposttilstand (260 °C i 20 minutter).
- Bruk følgende GC-betingelser: kolonne (HP5-MS 30 m x 0,25 mm; 0,25 μm), injektortemperatur (270 °C), strømningshastighet (1 ml/min), injeksjonsmodus (uten deling), GC-ovnsprofil (45 °C i 2 min; 4 °C/min til 170 °C; 20 °C/min til 300 °C), MSD-overføringslinje (280 °C).
MERK: For å forbedre den analytiske metoden mellom tidskonsistens for prøveoppbevaring er oppbevaringstiden låst). - Bruk følgende MSD-forhold: løsningsmiddelforsinkelse (2,5 min) og skanneområde (29 til 400 amu).
MERK: Et område på 10 til 400 ble brukt i tidligere protokoller4.
- Kontroller at rensegasstilførselen til fiberkondisjoneringsenheten er slått på.
MERK: Det er viktig at SPME-enheten er riktig installert i auto sampleren og at den er justert etter auto-sampler skuffer, fiber condition enhet og GC innløpsport. Feil justering kan føre til skade eller ødeleggelse av SPME-fiberen.
4. Analyse
- Plasser et tomt hoderomshette hetteglass (for å fungere som et tomt system) i den første posisjonen til GC-MS auto-sampler-skuffen. Plasser miljøemnet i den andre posisjonen til autoprøvebrettet. Plasser prøvene for analyse i de påfølgende posisjonene til den automatiske prøveskuffen.
- Lag en analytisk sekvens for å analysere hver prøve i prøveskuffen.
- Velg Sekvens på startskjermen til MassHunter | Last inn sekvens.
- Fyll ut sekvenstabellen for alle tomme felt og eksempler ved å sette inn riktig informasjon. Lagre den fullførte sekvenstabellen.
MERK: Den nøyaktige informasjonen for sekvenstabellen vil være avhengig av laboratorieformateringen for tabellen. Minimumsinformasjon vil normalt omfatte utvalgstype, eksempelnavn, hetteglassplassering og -nummer, analytisk metode og datafilplassering og -navn (tildeling av et datafilnavn som samsvarer med eksempelnavnet, bidrar til fremtidig databehandling). Flere prøver kan legges til i sekvensen under analysen.
- Kjør sekvensen ved å velge Sekvens | Kjør sekvens.
- Etter analyse returneres prøver til fryseren så snart som mulig.
MERK: Det kan være mulig å analysere prøver på nytt, men det skal bemerkes at noen flyktige komponenter kan ha blitt fullstendig ekstrahert under den første analysen, og noen forbindelser kan ha gjennomgått termisk og bakteriell dekomponering ved 40 °C, og dermed kan det resulterende kromatogrammet ikke være grundig representativt for den opprinnelige duftmarkeringen.
5. Dataanalyse
MERK: Innledende dataanalyse inkluderer integrering av kromatogrammer for å oppnå oppbevaringstid og toppområdedata sammen med foreløpig identifisering av topper ved hjelp av ChemStation-programvare og NIST (National Institute of Standards and Technology) massespektraldatabaser, versjon MSD F.01.01.2317. Dataanalyse kan utføres enten manuelt eller gjennom en halvautomatisk metode. Hvis den halvautomatiske metoden brukes, er det noen ganger gunstig å foreta en grad av manuell dataanalyse for å verifisere foreløpige identifikasjoner.
- Åpne datafilen ved å klikke på den aktuelle filen i navigasjonsfeltet til venstre. Det totale ionkromatogrammet (TIC) vises i det øverste vinduet på dataanalyseskjermen.
- Hvis du vil integrere TIC ved hjelp av RTE-integratoren, velger du Kromatogram | Integrer.
- Juster integrasjonsparametere slik at topper som er større enn 3 x basisstøy, integreres. Velg Kromatogram | Parametere for MS-signalintegrering. I utgangsboksen justeres det minste toppområdet etter behov (1,0 gir akseptable resultater i eksemplene våre).
- Hvis du vil identifisere topper og generere en sammendragsrapport, velger du Eksporter rapporter | Rapport for søkeresultater for bibliotek til XLS.
MERK: Spektralbibliotekene som skal søkes sammen med antall bibliotekkamper som skal vises, må forhåndsinnstilles i programvaren før et biblioteksøk kan gjennomføres. - Den resulterende regnearkrapporten inneholder integreringsdata for hver topp og et foreløpig spektralbibliotek som samsvarer med for å tilordne identitet. Vanligvis bør bibliotekets kvalitet / bibliotekssamsvar være >80 for å godta den foreløpige identifikasjonen. Lagre regnearket.
- Identifiser en topp direkte fra TIC.
- Velg toppen av interesse.
- Hvis toppen er liten, zoomer du inn ved å tegne en boks rundt toppen ved å holde venstre museknapp nede, strekke boksen over toppen og slippe.
- Plasser markørlinjen slik at den er på det høyeste punktet på toppen (eller like etter).
- Dobbeltklikk på høyre museknapp, og massespekteret for toppen vises i det nedre vinduet på dataanalyseskjermen.
- Hvis du vil søke i spektralbiblioteket, flytter du markøren hvor som helst i spektralvinduet og dobbeltklikker museknappen til høyre. Søkeresultatene for biblioteket vises i et nytt vindu.
- Hvis du vil fjerne bakgrunnsstøyen fra et spekter av interesse, dobbeltklikker du først på høyre museknapp på den aktuelle toppen. Deretter dobbeltklikker du høyre museknapp i et område uten topper rett foran toppen av interesse. Velg Kromatogram | Trekk fra spektra. Det trukket spekteret vises i det nedre vinduet på dataanalyseskjermen og vil vise '(-)' ved siden av SCAN-dataene i vindusoverskriften.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter denne protokollen identifiserte vi foreløpig totalt 32 flyktige kjemiske forbindelser fra analysen av 14 ano-genital duftmerker spontant utgitt på filterpapir av rød-ruffed lemurer (Varecia variegata rubra) og sammenlignet luktprofiler med egenskapene til signaler12. Naturlig forekommende flyktige forbindelser, som hydrokarboner, terpener, terpenalkoholer og ketoner, var til stede innenfor disse profilene og inkluderte forbindelser som tidligere hadde blitt funnet å fungere som sexferomoner og signaler til kondisjon i andre dyrearter. Forbindelsene som er foreløpig identifisert, er oppført i tabell 1. Representative kromatogrammer (1 fra en kontroll og 1 fra et lemurduftmerke) er vist i figur 1. Antallet og den relative overfloden av komponentene varierte fra utvalg til prøve på tvers av ulike studieemner. Imidlertid var seks forbindelser (benzaldehyd, 2-etyl-1-hexanol, p-cresol, cis-p-mentha-2,8-dien-1-ol, 2-pinen-4-one, pentadecane) til stede i alle prøver.
Resultatene av denne studien antydet at rød-ruffed lemurer bruker duftmarkering for å formidle informasjon om kjønn og kvinnelig alder, med ano-genital merking spiller en rolle i sosio-seksuell kommunikasjon.
Et annet representativt utfall etter bruk av denne protokollen var vår studie av fruktbarhet reklame av kvinnelige oliven bavianer (Papio anubis) (Vaglio et al. upubliserte data). Vi identifiserte totalt 74 flyktige forbindelser fra analysen av 385 kvinnelige bavian vaginal luktprøver. Disse forbindelsene inkluderte en rekke naturlig forekommende luktholdige flyktige forbindelser som ketoner, alkoholer, aldehyder, terpener, flyktige fettsyrer og hydrokarboner. Typiske kromatogrammer som brukes til å sammenligne blank kontroll og kvinnelige bavian vaginal luktprøver fra fruktbare og ikke-fruktbare perioder er vist i figur 2. Vi undersøkte sammenhengene mellom vaginal luktprofiler og seksuell mottakelighet for kvinnelige bavianer. Våre resultater viste at den totale mengden vaginal lukt er forskjellig med fruktbarhet som tyder på at lukt kan spille en rolle i å signalisere kvinnelig bavian fruktbarhet. Vi fant også forskjeller i vaginal lukt mellom gruppetyper, men vi kunne ikke skille effekten av gruppesammensetning, kvinnelig alder og paritet.
Figur 1. Eksempel på kromatogrammer; (øverste kromatogram -'kontroll') kontrollprøven, som viser forurensninger; (bunnkromatogram -'lemur duftmerke') en voksen kvinnelig rød-ruffed lemur ano-genital lukt sekreter, viser forurensninger og meningsfulle biologiske forbindelser. Røde piler indikerer de seks meningsfulle biologiske forbindelsene som ble funnet i alle prøver: (a) benzaldehyd; (b) 2-etyl-1hexanol; (c) p-cresol; (d) cis-p-mentha-2,8-dien-1-ol; (e) 2-pinen-4-en; (f) pentadekane. Denne figuren er endret fra Janda et al.12. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Eksempel på chromatogram fra (øverste kromatogram -'kontroll') kontrollprøve, som viser forurensninger; (midtre kromatogram -'bavian ikke-fruktbar lukt') kvinnelig olivenbavian, vaginal luktprøve fra ikke-fruktbar periode; og (bunnkromatogram -'bavian fruktbar lukt') kvinnelig oliven bavian, vaginal luktprøve fra fruktbar periode. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Oppbevaringstid (minutter) | Foreløpig sammensatt ID | Molekylvekt |
| 3.906 | Heksanal | 100 |
| 6.057 | 5-metyl-3-heksanone | 114 |
| 7.413 | Alfa-pinene | 136 |
| 8.077 | 1-isopropyl-4-metylenbicyclo[3.1.0]hex-2-en | 134 |
| 8.268 | Benzaldehyd | 106 |
| 8.623 | 3,7,7-trimetyl-1,3,5-cycloheptatriene | 134 |
| 9.096 | Fenol | 94 |
| 9.269 | 6-metoksy-5-hepten-2-en | 126 |
| 10.72 | 2-etyl-1-heksanol | 130 |
| 12.362 | p-Cresol | 108 |
| 12.553 | cis-Verbenol | 152 |
| 13.385 | cis-p-Mentha-2,8-dien-1-ol | 152 |
| 14.104 | 1,7,7-Trimethylbicyclo[2.2.1]hepta-2-en | 152 |
| 14.536 | L-Pinocarveol | 152 |
| 14.791 | trans-Verbenol | 152 |
| 15.605 | p-Etyl-fenol | 122 |
| 15.928 | Terpinen-4-ol | 154 |
| 16.415 | Alfa-terpineol | 154 |
| 16.615 | Myrtenol | 152 |
| 17.047 | 2-Pinen-4-en | 150 |
| 18.252 | Karvone | 150 |
| 19.217 | p-Mentha-1,8-dien-3-en | 150 |
| 23.283 | 4,7,7-Trimethylbicyclo[4.1.0]hept-3-ene-2-en | 150 |
| 23.443 | Tetradekanisk | 198 |
| 25.094 | Geranylacetone | 194 |
| 25.899 | Isomethylionone | 206 |
| 26.513 | Pentadecane | 212 |
| 30.871 | 2,6,10-Trimethylpentadecane | 254 |
| 32.208 | Heptadecane | 240 |
| 32.372 | 2,6,10-Trimethylhexadecane | 268 |
| 34.446 | n-Tetracosane | 338 |
| 34.591 | 2,6,10,14-Tetramethylhexadecane | 282 |
Tabell 1. Flyktige forbindelser til stede i filterpapirprøver fra kvinnelige rød-ruffed lemur ano-genital lukt sekresjoner identifisert foreløpig ved hjelp av ChemStation programvare og NIST masse spektral databaser, versjon MSD F.01.01.2317. Denne tabellen er endret fra Janda et al.12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bruk av kontrollprøver, både miljøkontroller opprettet på tidspunktet for prøveinnsamling og systememner, er avgjørende for tolkningen av duftmerkeprøvene. Eventuelle topper som tilskrives prøvetakingsmiljøet eller det instrumentelle systemet, må utelukkes fra duftmerkeprøver, slik at bare toppene av interesse inkluderes i enhver tolkning. Disse kontrollene kan også spille en rolle i å vurdere og overvåke instrumentets "helse".
Protokollen inkluderer trinn for å kondisjonere fiberen før og etter hver ekstraksjon. Dette gjøres enklere ved bruk av en auto-sampler og sikrer at det ikke er krysskontaminering fra prøve til prøve.
Hovedbegrensningen på metodikken gjelder selve prøvene. Etter innsamling er det viktig at de lagres og transporteres på riktig måte. Komponentene av spesifikk interesse er flyktige, og disse kan lett gå tapt, eller konsentrasjonene deres endres. For tiden lagres og transporteres prøver frosset, vanligvis ved -20 °C. Som et resultat er det en betydelig kostnad involvert i lagring og transport av disse prøvene. Forsinkelser i transport av prøver til laboratoriet for analyse vil øke disse kostnadene ytterligere og kan potensielt påvirke resultatene oppnådd fra duftmerkene. Videre forskning er nødvendig for å forstå effekten av tid og lagring på de analytiske resultatene hentet fra prøver. Siden komponentene av særlig betydning er de mer flyktige komponentene i duftmerkene, er det mulig at nivåene av disse komponentene kan endre utvalgssamlingen etter prøve. Det kan også tas hensyn til potensielle bakterieeffekter i enkelte utvalgstyper. For eksempel, i alkoholtesting av urinprøver, kan bakterier som er tilstede i urinen produsere alkohol og dermed øke nivåene av alkohol som oppdages.
Dagens metodikk oppfyller alle kravene som tidligere er skissert. Det gir gode kvalitetsresultater hvorfra ytterligere informasjon om sammensetningen av duftmerker oppnås. Analysen er imidlertid en laboratoriebasert teknikk som er avhengig av prøvene som sendes til laboratoriet. En potensiell løsning på denne begrensningen vil være ved bruk av bærbar GC-MS-instrumentering, instrumenter som kan tas inn i feltet der prøvene tas. Denne tilnærmingen vil lindre behovet for å lagre og transportere prøver og vil muliggjøre sanntidsanalyse av duftmerker som potensielt gir større informasjon om de mest flyktige komponentene i merkene. Flere bærbare GC-MS-instrumenter er tilgjengelige. De bruker forskjellig teknologi til det som finnes i laboratoriebasert instrumentering, men bør gi sammenlignbare resultater. Bruken av HS-SPME-ekstraksjonsteknikken er fortsatt anvendelig. Men som et resultat av å være bærbar, tilbyr instrumentene ikke muligheten til automatisert prøveintroduksjon; Likevel, hvis prøver analyseres så snart de er samlet inn, vil daglige prøvenumre sannsynligvis være håndterbare for manuell injeksjon. Også ved feltutvinning bør det tas hensyn til at SPME-fiberen ikke fanger miljøkjemikalier før bruk. Tilgjengelige instrumenter er for tiden batteridrevne, noe som muliggjør total bærbarhet, men med levering av en eller annen form for strømforsyning (til og med en liten generator), kan disse instrumentene betjenes i lengre perioder. Disse instrumentene av sin natur er ofte designet for å være enkle å betjene, med minimal opplæring og kunnskap som kreves. Dette betyr at det kanskje ikke er nødvendig for høyt utdannede operatører å bli utplassert med instrumentet, og at de kan betjenes av de som samler prøvene. Detaljert tolkning av analytiske resultater kan oppnås eksternt eller når instrumentet vender tilbake til basen.
En annen stor begrensning med metoder ved hjelp av SPME-fibre er at det er mulig å analysere bare kjemiske forbindelser som eksisterer i overflod i prøvene. Spesielt finnes langt større mengder av kjemikaliet i prøvene selv når mengden molekyler er subthreshold for analysen ved hjelp av SPME-fibre. I tillegg, i sammenheng med luktsekretjoner frigjort av dyreduftmerker og andre animalske kjemiske signaler, har individuelle dyr en tendens til å bruke kjemiske forbindelser i små mengder for å kommunisere med andre dyr og / eller oppdage olfaktoriske signaler fra materialer. Med andre ord kan de forskjellige ytelsene til dyreneser og SPME-ekstraksjon utgjøre en stor utfordring for suksessen til denne prøvetakingsteknikken.
Fremtidig utvikling av dagens metodikk kan baseres rundt prøvetaking med utredning av bruk av alternative sorbente materialer eller sorbente rør for bruk med termiske desorpsjonssystemer. En slik utvikling kan gå en eller annen måte å hjelpe til med å prøve lagrings- og transportforhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Keith Holding for hans hjelp med kjemiske analyser ved Rosalind Franklin Science Center, Wolverhampton og Ben Mantle for produksjonen av videoen. Vi er også takknemlige til prof. Gloriano Moneti, Dr. Giuseppe Pieraccini og medlemmene av University of Florence's Mass Spectrometry Center, Firenze, og til prof. Luca Calamai og Dr. Marco Michelozzi fra CNRs ARCA Lab, Firenze, for deres hjelp med å sette opp denne metodikken. Forskningsprosjektene som inkluderte prøvetakings- og analysemetodene beskrevet i manuskriptet ble støttet av to Marie Skłodowska-Curie Intra European Fellowships (Grant Agreement IDs: 327083, 703611), et lite tilskudd ('Den sensoriske berikede primaten') fra Primate Society of Great Britain, og et lite forskningsstipend ('Har jegersamlere en spesiell luktesans?') fra British Academy/The Leverhulme Trust til S.V. Laboratoriearbeidet som var nødvendig for å sette opp denne metodikken fikk også støtte fra Fakultet for vitenskap og ingeniørvitenskap (Wolverhampton) til S.V.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL autosampler vials | Agilent | 5188-5392 | 10 ml screwtop vials with |
| 18 mm vial caps | Agilent | 8010-0139 | Magnetic with PTFE/silicone septa |
| Autosampler | Agilent | GC120 PAL autosampler | |
| Capillary column | Agilent | HP5-MS | 30 m x 0.25 mm; 0.25 µm |
| Data analysis software | Agilent | - | ChemStation |
| Gas Chromatograph | Agilent | 7890B | |
| Inlet septa | Agilent | 5182-3442 | Merlin microseal |
| Mass Selective Detector | Agilent | 5977A | |
| Reporting software | Microsoft | - | Excel |
| Spectral library | NIST | - | NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library |
| Spectral library search program | NIST | - | MS Search v.2.2 |
| Splitless Inlet liner | Agilent | 5190-4048 | |
| SPME fibres | Agilent | SU57345U | 65 µm PDMS/DVB fibre |
References
- Wyatt, T. D. Pheromones and Animal Behavior: Chemical Signals and Signatures. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2014).
- Heymann, E. W. The neglected sense-olfaction in primate behavior, ecology, and evolution. American Journal of Primatology. 68 (6), 519-524 (2006).
- Drea, C. M., Boulet, M., DelBarco-Trillo, J. The "secret" in secretions: Methodological considerations in deciphering primate olfactory communication. American Journal of Primatology. 75 (7), 621-642 (2013).
- Vaglio, S., et al. Sternal gland scent-marking signals sex, age, rank and group identity in captive mandrills. Chemical Senses. 41 (2), 177-186 (2016).
- Marneweck, C., Jürgens, A., Shrader, A. M. Dung odours signal sex, age, territorial and oestrous state in white rhinos. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 284 (1846), (2016).
- Shear, W. A., Jones, T. H., Miras, H. M. A possible phylogenetic signal in milliped chemical defenses. Biochemical Systematics and Ecology. 35, 838-842 (2007).
- Kimura, R. Volatile substances in feces, urine and urine-marked feces of feral horses. Canadian Journal of Animal Science. 81 (3), 411-420 (2001).
- Vaglio, S., Minicozzi, P., Bonometti, E., Mello, G., Chiarelli, B. Volatile signals during pregnancy: a possible chemical basis for mother-infant recognition. Journal of Chemical Ecology. 35 (1), 131-139 (2009).
- Setchell, J. M., et al. Chemical composition of scent-gland secretions in an Old World monkey (Mandrillus sphinx): influence of sex, male status, and individual identity. Chemical Senses. 35 (3), 205-220 (2010).
- Setchell, J. M., et al. Odour signals MHC genotype in an Old World monkey. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 278 (1703), 274-280 (2011).
- Pawliszyn, J. Solid phase microextraction: theory and practice. , Wiley-VCH. New York, US. (1997).
- Janda, E. D., Perry, K., Hankinson, E., Walker, D., Vaglio, S. Sex differences in scent-marking in captive red-ruffed lemurs. American Journal of Primatology. 81 (1), 22951 (2019).
