हमने पहले नैनोपोर अनुक्रमण मंच पर एम्प्लिस-आधारित पूरे जीनोम Usutu वायरस (USUV) अनुक्रमण के लिए एक प्रोटोकॉल मान्य किया था। यहां, हम अधिक विस्तार से उपयोग किए जाने वाले तरीकों का वर्णन करते हैं और नैनोपोर आर 10 प्रवाह सेल की त्रुटि दर निर्धारित करते हैं।
पूरे जीनोम अनुक्रमण की विशेषता और वायरल प्रकोप का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । नैनोपोर स्थित पूरे जीनोम अनुक्रमण प्रोटोकॉल कई अलग-अलग वायरस के लिए वर्णित किए गए हैं। ये दृष्टिकोण एक अतिव्यापी एम्प्लिस-आधारित दृष्टिकोण का उपयोग करते हैं जिसका उपयोग आनुवंशिक रूप से संबंधित वायरस के विशिष्ट वायरस या समूह को लक्षित करने के लिए किया जा सकता है। वायरस की उपस्थिति की पुष्टि के अलावा, अनुक्रमण जीनोमिक महामारी विज्ञान अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, वायरस को ट्रैक करने और मूल, जलाशयों और संचरण के तरीकों को जानने के लिए । ऐसे अनुप्रयोगों के लिए, उपयोग किए गए प्लेटफ़ॉर्म से जुड़े त्रुटि दर के संभावित प्रभावों को समझना महत्वपूर्ण है। नैदानिक और सार्वजनिक स्वास्थ्य सेटिंग्स में नियमित आवेदन की आवश्यकता है कि यह प्रोटोकॉल में हर महत्वपूर्ण परिवर्तन के साथ प्रलेखित है । इससे पहले, नैनोपोर अनुक्रमण मंच पर पूरे जीनोम Usutu वायरस अनुक्रमण के लिए एक प्रोटोकॉल को इलुमिना अनुक्रमण की सीधी तुलना करके मान्य (R9.4 फ्लोसेल) किया गया था। यहां, हम एक उदाहरण के रूप में R10 प्रवाह सेल और Illumina अनुक्रमण के बीच तुलना का उपयोग कर, आवश्यक पढ़कवरेज निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया विधि का वर्णन ।
तीसरी पीढ़ी के अनुक्रम प्रौद्योगिकियों में तेजी से विकास हमें वायरल प्रकोपों के दौरान वास्तविक समय अनुक्रमण के करीब की ओर आगे बढ़ने की अनुमति देता है । आनुवंशिक जानकारी की यह समय पर उपलब्धता वायरल रोगजनकों की उत्पत्ति और विकास को निर्धारित करने के लिए उपयोगी हो सकती है। अगली पीढ़ी के क्षेत्रों में सोने के मानक हालांकि अनुक्रमण, अभी भी दूसरी पीढ़ी के अनुक्रमक हैं । ये तकनीकें पायस पीसीआर या क्लोनल ब्रिज प्रवर्धन के दौरान क्लोनल प्रवर्धन जैसी विशिष्ट और समय लेने वाली तकनीकों पर भरोसा करती हैं। तीसरी पीढ़ी के अनुक्रमक सस्ते, हाथ से आयोजित होते हैं और सरलीकृत पुस्तकालय तैयार करने के तरीकों के साथ आते हैं। विशेष रूप से अनुक्रम डिवाइस के छोटे आकार और कम खरीद मूल्य यह तैनाती योग्य, क्षेत्रबद्ध अनुक्रमण के लिए एक दिलचस्प उंमीदवार बनाता है । उदाहरण के लिए सिएरा लियोन में इबोला वायरस फैलने के दौरान और ब्राजील में चल रहे आर्बोवायरस फैलने की जांचकेदौरान देखा जा सकता है 1 ,2,,3. हालांकि, रिपोर्ट की गई उच्च त्रुटि दर4 उन अनुप्रयोगों को सीमित कर सकती है जिनके लिए नैनोपोर अनुक्रमण का उपयोग किया जा सकता है।
नैनोपोर अनुक्रमण जल्दी विकसित हो रहा है। नए उत्पाद नियमित आधार पर बाजार में उपलब्ध हैं। उदाहरण के लिए इसके उदाहरण 1डी चुकता किट हैं जो डीएनए अणु की दोनों किस्में अनुक्रमण को सक्षम बनाता है, जिससे उक्त ठिकानों5 की सटीकता और R10 प्रवाह कोशिका का विकास बढ़ाया जाता है जो पोर6में दो अलग-अलग उदाहरणों पर वर्तमान में परिवर्तन को मापता है। इसके अलावा बेसकॉलिंग में सुधार जैसे बेहतर बायो-इन्फॉर्मेटिक टूल्स बेसकॉलिंग7की सटीकता में सुधार करेंगे । सबसे अधिक बार उपयोग किए जाने वाले बेसकॉलर में से एक, (उदाहरण के लिए, अल्बाकोर), 9 महीने की समय अवधि5में कम से कम 12 बार अपडेट किया गया है। हाल ही में निर्माता ने फ्लिप-फ्लॉप नामक एक उपन्यास बेसकॉलर भी जारी किया, जिसे डिफॉल्ट नैनोपोर सॉफ्टवेयर8में लागू किया गया है। एक साथ, इन सभी सुधारों से अधिक सटीक दृश्यों का नेतृत्व होगा और नैनोपोर सीक्वेंसर की त्रुटि दर में कमी आएगी।
Usutu वायरस (USUV) एक मच्छर जनित Arbovirus परिवार के Flaviviridae है और यह लगभग ११,००० न्यूक्लियोटाइड्स के एक सकारात्मक फंसे आरएनए जीनोम है । यूएसयूवी मुख्य रूप से महान ग्रे उल्लू और ब्लैकबर्ड्स9,10को प्रभावित करता है , हालांकि अन्य पक्षी प्रजातियां भी यूएसयूवी संक्रमण11के लिए अतिसंवेदनशील होती हैं । हाल ही में, यूएसयूवी की पहचान कृंतक और श्रे में भी की गई थी, हालांकि वायरस के संचरण में उनकी संभावित भूमिकाअज्ञात 12बनी हुई है। मनुष्यों में, रक्तदाताओं में स्पर्शोन्मुख संक्रमण13,,14,,15,,16 का वर्णन किया गया है जबकि यूएसयूवी संक्रमण ों को भी इंसेफेलाइटिस या मेनिंगो-इंसेफेलाइटिस17,,18से संबद्ध होने की सूचना मिली है । नीदरलैंड में, यूएसयूवी को पहली बार 201610 में जंगली पक्षियों में और 201814में स्पर्शोन्मुख रक्तदाताओं में पाया गया था। USUV के प्रारंभिक पता लगाने के बाद से, प्रकोप बाद के वर्षों के दौरान सूचित किया गया है और निगरानी, पूरे जीनोम अनुक्रमण सहित, वर्तमान में उभरने और एक पहले भोले आबादी में एक arbovirus के प्रसार की निगरानी के लिए चल रही है ।
इबोला वायरस, जीका वायरस और येलो फीवर वायरस3,,19,,20जैसे अन्य वायरसों के लिए जो बताया गया है, उसके समान हमने पूर्ण लंबाई USUV21को अनुक्रम करने के लिए एक प्राइमर सेट विकसित किया है । यह पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (पीसीआर) -आधारित दृष्टिकोण लगभग 32 के सीटी मूल्य तक के नमूनों में मस्तिष्क के नमूनों की तरह अत्यधिक मेजबान-दूषित नमूना प्रकारों से पूर्ण लंबाई वाले यूएसयूवी जीनोम की वसूली के लिए अनुमति देता है। एम्प्लिस आधारित अनुक्रमण दृष्टिकोण के लाभ मेटाजेनोमिक अनुक्रमण और उच्च विशिष्टता की तुलना में एक उच्च संवेदनशीलता है। एक एम्प्लिकन आधारित दृष्टिकोण का उपयोग करने की सीमाएं हैं कि दृश्यों को सभी उपभेदों को फिटिंग करने वाले प्राइमर को डिजाइन करने के लिए समान होना चाहिए और प्राइमर्स वायरस विविधता के बारे में हमारे वर्तमान ज्ञान पर डिज़ाइन किए गए हैं।
तीसरी पीढ़ी अनुक्रमण में निरंतर विकास और सुधार को देखते हुए, नियमित आधार पर अनुक्रमक की त्रुटि दर का मूल्यांकन करने की आवश्यकता है। यहां, हम एक उदाहरण के रूप में यूएसयूवी का उपयोग करके इलुमिना अनुक्रमण के खिलाफ सीधे नैनोपोर के प्रदर्शन का मूल्यांकन करने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं। यह विधि नवीनतम R10 प्रवाह सेल के साथ उत्पन्न दृश्यों पर लागू होती है और फ्लिप-फ्लॉप बेसकॉलर के नवीनतम संस्करण के साथ बेसकॉलिंग की जाती है।
नैनोपोर अनुक्रमण लगातार विकसित हो रहा है और इसलिए त्रुटि दर की निगरानी के लिए तरीकों की आवश्यकता है। यहां, हम नैनोपोर सीक्वेंसर की त्रुटि दर की निगरानी के लिए एक कार्यप्रवाह का वर्णन करते हैं। यह एक नए प्रवाह सेल की रिहाई के बाद उपयोगी हो सकता है, या यदि बेसकॉलिंग की नई रिलीज जारी की जाती है। हालांकि, यह उन उपयोगकर्ताओं के लिए भी उपयोगी हो सकता है जो अपने स्वयं के अनुक्रमण प्रोटोकॉल को सेट-अप और मान्य करना चाहते हैं।
विभिन्न सॉफ्टवेयर और संरेखण उपकरण33अलग-अलग परिणाम दे सकते हैं। इस पांडुलिपि में, हमने स्वतंत्र रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर पैकेजों का उपयोग करने का लक्ष्य दिया है जिनका आमतौर पर उपयोग किया जाता है, और जिनके पास स्पष्ट दस्तावेज हैं। कुछ मामलों में, वाणिज्यिक उपकरणों को वरीयता दी जा सकती है, जिसमें आम तौर पर अधिक उपयोगकर्ता के अनुकूल इंटरफेस होते हैं लेकिन इसके लिए भुगतान किया जाना चाहिए। भविष्य में, इस विधि को एक ही नमूने पर लागू किया जा सकता है यदि अनुक्रम प्रौद्योगिकी या बेसकॉलिंग सॉफ्टवेयर में बड़े संशोधनों को तरजीही रूप से पेश किया जाता है तो यह बेसकॉलर या फ्लोसेल के प्रत्येक अपडेट के बाद किया जाना चाहिए, हालांकि वर्तमान विकास की गति को देखते हुए यह भी प्रमुख अपडेट के बाद ही किया जा सकता है।
अनुक्रमण में त्रुटि दर में कमी से नमूनों की संख्या अधिक होने की अनुमति होती है। इस प्रकार, नैनोपोर अनुक्रमण नैदानिक परख के लिए पारंपरिक वास्तविक समय पीसीआरएस की जगह के करीब हो रही है, जो पहले से ही इंफ्लूएंजा वायरस निदान के लिए मामला है । इसके अलावा, त्रुटि दर में कमी से इस तकनीक अनुक्रमण की उपयोगिता बढ़ जाती है, उदाहरण के लिए मामूली वेरिएंट के निर्धारण के लिए और उच्च-थ्रूपुट निष्पक्ष मेटाजेनोमिक अनुक्रमण के लिए।
प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम यह है कि करीबी, विश्वसनीय संदर्भ दृश्यों को उपलब्ध होने की आवश्यकता है। प्राइमर वायरस विविधता के बारे में वर्तमान ज्ञान पर आधारित हैं और हर बार एक समय में अपडेट करने की आवश्यकता हो सकती है। एक और महत्वपूर्ण बिंदु जब एक एम्प्लिकेट आधारित अनुक्रमण दृष्टिकोण की स्थापना प्राइमर एकाग्रता के संतुलन के लिए एम्प्लिकेट गहराई में एक भी संतुलन मिल रहा है । यह एक अनुक्रम रन पर अधिक नमूनों की मल्टीप्लेक्सिंग को सक्षम बनाता है और परिणामस्वरूप लागत में काफी कमी आती है।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को ग्रांट एग्रीमेंट नंबर 643476 (तुलना) के तहत यूरोपियन यूनियन के होराइजन २०२० रिसर्च एंड इनोवेशन प्रोग्राम से फंडिंग मिली है ।
Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | |
dNTPs | Qiagen | 201900 | |
FLO-MIN106 R10 flowcell | Nanopore | R10 flowcell | |
KAPA Hyperplus libarary preparation kit | Roche | 7962436001 | |
Library Loading Bead Kit | Nanopore | EXP-LLB001 | |
Ligation Sequencing Kit 1D | Nanopore | SQK-LSK109 | |
Native Barcoding Kit 1D 1-12 | Nanopore | EXP-NBD103 | |
Native Barcoding Kit 1D 13-24 | Nanopore | EXP-NBD104 | |
NEB Blunt/TA Ligase Master Mix | NEB | M0367S | |
NEB Next Quick Ligation Module | NEB | E6056 | |
NEB Next Ultra II End Repair / dA-Tailing Module | NEB | E7546S | |
Protoscript II Reverse Transcriptase | NEB | M0368X | |
Q5 High-Fidelity polymerase | NEB | M0491 | |
Qubit dsDNA HS Assay kit | Thermo Fisher | Q32851 | |
Random Primers | Promega | C1181 | |
RNAsin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2111 |