我们之前在纳米孔测序平台上验证了基于安普利子全基因组Usutu病毒(USUV)测序的协议。在这里,我们更详细地描述了使用的方法,并确定纳米孔R10流动单元的误差率。
全基因组测序可用于描述和追踪病毒爆发。基于纳米孔的全基因组测序方案已经描述了几种不同的病毒。这些方法采用一种基于合成体重叠的方法,可用于靶向特定病毒或一组基因相关的病毒。除了确认病毒的存在外,测序还可用于基因组流行病学研究,跟踪病毒并揭示病毒的起源、储存和传播方式。对于此类应用程序,了解与所用平台关联的错误率可能产生的影响至关重要。临床和公共卫生环境中的常规应用要求记录协议中的每一个重要变化。此前,通过直接比较光明网测序,验证了纳米孔测序平台上全基因组Usutu病毒测序的协议(R9.4流细胞)。在这里,我们用R10流单元和Illumina测序的比较为例,描述了用于确定所需读取覆盖率的方法。
第三代序列技术的迅速发展使我们能够在病毒爆发期间向接近实时测序的方向前进。这种及时提供遗传信息有助于确定病毒病原体的起源和演变。然而,下一代测序领域的黄金标准仍然是第二代测序仪。这些技术依赖于特定且耗时的技术,如乳液 PCR 或克隆桥扩增期间的克隆放大。第三代测序仪更便宜,手持,并附带简化的图书馆准备方法。特别是序列设备体积小,购买价格低,使其成为可部署、可现场排序的有趣候选对象。例如,在塞拉利昂埃博拉病毒爆发期间,以及巴西正在进行的阿尔博病毒疫情调查11、2、32期间,3可以看到这种情况。但是,报告的高错误率4可能会限制可以使用纳米孔测序的应用。
纳米孔测序正在迅速发展。新产品定期在市场上上市。例如,例如一维平方套件,能够测序DNA分子的两股,从而提高被叫碱5的精度,以及R10流动细胞的发展,该细胞测量孔6中两个不同实例的电流变化。此外,改进的生物信息工具,如改进基调用将提高基调用7的精度。最常用的基呼叫者之一(例如 Albacore)在 9个月期间已更新至少 12 次。最近,制造商还发布了一款名为触发器的新型基底调用,这是在默认的纳米孔软件8中实现的。所有这些改进共同将导致更精确的序列,并降低纳米孔定序器的误差率。
乌苏图病毒(USUV)是一种蚊子传播的病毒,其家族是Flaviviridae,其阳性RNA基因组约为11,000个核苷酸。USUV主要影响大灰猫头鹰和黑鸟9,9,10,虽然其他鸟类也容易受到USUV感染11。最近,USUV也在啮齿动物和精明动物中被发现,尽管它们在病毒传播中的潜在作用仍不得而知。在人类中,无症状感染在献血者13、14、15、1614,15,16中被描述为无症状感染,而USUV感染也报告与脑炎或脑炎17、18,18有关。13在荷兰,USUV于2016年首次在野生鸟类中被发现10只,2018年首次发现无症状的献血者14只。自首次发现USUV以来,在随后几年中报告了疫情,目前正在进行监测,包括全基因组测序,以监测一种阿尔博病毒在以前幼稚的人群中出现和传播。
与其他病毒,如埃博拉病毒,寨卡病毒和黄热病病毒33,19,20,19,我们开发了一个底漆设置序列全长20USUV21。这种基于聚合酶链反应(PCR)的方法允许从高度宿主污染的样品类型(如样品中的脑样本)中回收全长USUV基因组,其Ct值约为32。与基因组测序相比,基于安培的测序方法具有更高的灵敏度和更高的特异性。使用基于安培的方法的局限性是,序列应相似,以便设计适合所有菌株的底漆,并且引物是根据我们目前对病毒多样性的知识设计的。
鉴于第三代测序的不断发展和改进,需要定期评估测序仪的误差率。在这里,我们描述了一种使用USUV直接评估纳米孔对光明照测序性能的方法。此方法应用于使用最新的 R10 流单元生成的序列,并且使用最新版本的触发器基调用执行基调用。
纳米孔测序是不断发展的,因此需要一种方法来监测误差率。在这里,我们描述了一个工作流来监视纳米孔定序器的误差率。这在释放新流单元或释放基调用的新版本后非常有用。但是,这对于想要设置和验证自己的排序协议的用户也很有用。
不同的软件和对齐工具可以产生不同的结果33。在本手稿中,我们旨在使用常用且具有明确文档的免费软件包。在某些情况下,可能会优先考虑商业工具,这些工具通常具有更用户友好的界面,但必须付费。将来,此方法可以应用于同一个示例,以防序列技术或基调用软件进行重大修改,在每次更新基调用方或 flowcell 后,应优先执行,但考虑到当前开发的速度,这只能在重大更新后完成。
测序误差率的降低使得对多路复用的样本数量增加。因此,纳米孔测序越来越接近于取代传统的实时PCR进行诊断检测,流感病毒诊断已经是这种情况。此外,误差率的降低提高了该技术测序的可用性,例如确定小变型和高通量无偏基因组测序。
协议中的一个关键步骤是需要提供紧密、可靠的参考序列。引素基于目前关于病毒多样性的知识,可能需要偶尔更新一次。设置基于安培的测序方法的另一个关键点是基底器浓度的平衡,以获得安培深度的平衡。这样,在序列运行时可以多路复用更多样本,并显著降低成本。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了欧洲联盟地平线2020研究和创新方案根据第643476号赠款协议(COMPARE)提供的资金。
Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | |
dNTPs | Qiagen | 201900 | |
FLO-MIN106 R10 flowcell | Nanopore | R10 flowcell | |
KAPA Hyperplus libarary preparation kit | Roche | 7962436001 | |
Library Loading Bead Kit | Nanopore | EXP-LLB001 | |
Ligation Sequencing Kit 1D | Nanopore | SQK-LSK109 | |
Native Barcoding Kit 1D 1-12 | Nanopore | EXP-NBD103 | |
Native Barcoding Kit 1D 13-24 | Nanopore | EXP-NBD104 | |
NEB Blunt/TA Ligase Master Mix | NEB | M0367S | |
NEB Next Quick Ligation Module | NEB | E6056 | |
NEB Next Ultra II End Repair / dA-Tailing Module | NEB | E7546S | |
Protoscript II Reverse Transcriptase | NEB | M0368X | |
Q5 High-Fidelity polymerase | NEB | M0491 | |
Qubit dsDNA HS Assay kit | Thermo Fisher | Q32851 | |
Random Primers | Promega | C1181 | |
RNAsin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2111 |