Summary
获得成纤维细胞的纯种群对于研究其在伤口修复和纤维化中的作用至关重要。这里描述的是一种详细的方法，从未受伤和受伤的小鼠心脏中分离成纤维细胞和肌纤维细胞，然后通过免疫荧光、RTPCR、荧光辅助细胞分拣和胶原蛋白凝胶收缩。
Abstract
心脏纤维化对损伤的反应是伤口愈合的生理反应。已努力研究和靶向减轻纤维化的纤维细胞亚型。然而，由于缺乏普遍接受的成纤维细胞标记来识别静止和活化成纤维细胞，成纤维细胞的研究一直受到阻碍。纤维细胞是异质细胞群，难以分离和特征化。提出的协议描述了三种不同的方法来丰富纤维细胞和肌纤维细胞从未受伤和受伤的小鼠心脏。使用标准可靠的协议来分离成纤维细胞，可以研究它们在平衡和纤维化调制中的作用。
Introduction
心脏成纤维细胞，中质源细胞，除了在平衡1期间维持心脏结构外，在维持心脏的电传导和机械力方面起着重要作用。损伤后，这些细胞被激活，膨胀，并产生细胞外基质（ECM）蛋白质2。许多临床前研究表明，成纤维细胞是维持受伤心脏3的结构完整性的关键细胞调节器，以及负责ECM蛋白无节制生产和沉积的主要作用细胞，导致硬性疤痕形成和心力衰竭4。纤维细胞是一组异质细胞，很难从亲纤维的不适应特性中剖析它们的恢复功能。最近，确定了心肌损伤后两种不同成纤维细胞亚型的功能异质性，表明可以隔离不同的纤维细胞亚型，并研究其在伤口愈合中的作用。
获得纯成纤维细胞种群对于界定其在修复和纤维化中的作用至关重要。然而，多重纤维细胞标记的存在，识别其他细胞类型，使得分离一个基本上纯成纤维细胞种群6具有挑战性。一些优雅的研究已经设计了巧妙的方法来分离心脏成纤维细胞从未受伤和受伤的心肌。最流行和成熟的方法来丰富成纤维细胞是通过选择性粘附后酶组织消化7。
此外，基于细胞表面抗原的成纤维细胞荧光激活细胞分拣（FACS）也已成功描述8。在这项研究中，在酶消化之后，从小鼠心脏对间皮细胞按系系阴性（林：Ter119+CD45+CD31+）和gp38阳性（gp38+）分类。−Gp38_ve细胞根据col1+1和其他间质标记的共同表达被确认为成纤维细胞。虽然大多数组织消化是在解剖出培养皿中的心室后完成的，但最近一项研究调查了左心室中直接注入针头酶以分离肌细胞和非肌细胞（包括成纤维细胞9）的研究。在这种情况下，纤维细胞通过选择性粘附分离。
该协议使用三种方法描述了成纤维细胞的分离和浓缩。第一种是一种已经确立的方法，即酶消化后有选择性地粘附成纤维细胞。第二种方法主要用于主要分离损伤引起的阿尔法平滑肌肉表达肌纤维细胞。第三种方法涉及血液细胞和内皮细胞酶消化的心脏细胞悬浮液的连续磁耗竭。耗竭后，纤维细胞/肌纤维细胞根据抗原MEFSK4的存在而使用磁珠进行分离。最近，MEFSK4被描述为一种抗原，存在于静止和活化成纤维细胞上，使其成为纤维细胞识别和隔离的合适标记。当然，这里描述的所有方法都有独特的局限性。因此，强烈建议通过流量分析、免疫染色和半定量实时PCR来检查分离细胞群的纯度。然而，这些方法可以扩大，并添加额外的标记，以排除其他污染人群之前，利用成纤维细胞和肌纤维细胞种群进行关键的实验。
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Protocol
这项研究严格坚持《国家卫生研究院实验室动物护理和使用指南》中的建议。范德比尔特大学机构动物护理和使用委员会批准了该协议（协议号：M1600076-01）。
1. 心脏解剖
- 解决方案准备
- KHB 缓冲器
- 使用搅拌棒，在 900 mL DDI 水中缓慢溶解 9.4 克克雷布斯-亨塞莱特缓冲液 （KHB） 粉末。
注：如果搅拌速度过快或搅拌时间过长，缓冲器会沉淀。KHB 缓冲液在纤维化隔离期间必须冷。 - 添加 2.9 mM CaCl2和 24 mM NaHCO3。将 pH 调整到 7.2~7.3，用 dH2O 稀释至 1 L 的体积。
- 使用无菌过滤器 （0.22 μm），在 4 °C 下储存长达 4 周。在隔离期间，保持冰上或4°C。
- 使用搅拌棒，在 900 mL DDI 水中缓慢溶解 9.4 克克雷布斯-亨塞莱特缓冲液 （KHB） 粉末。
- 胶原酶消化鸡尾酒
- 在纤维细胞分离当天准备消化鸡尾酒。根据心脏数量确定适当的消化量;每颗心脏5 mL鸡尾酒。
- 根据制造商的说明制备胶原酶混合物（参见材料表）和DNase I。
- 对于20 mL的总消化鸡尾酒，在空50mL锥形管中加入17.5μL的DNase I，180μL的1M HEPES，500μL的胶原酶。
- 添加足够的汉克平衡盐溶液 （HBSS） 与 Ca2+和 Mg2+的容量，以获得 20 mL 的总体积。
- 红血球 （RBC） 水热缓冲液
- 根据心脏数量（5 mL/心脏）确定所需的总体积。使用 dH2O 将 10 倍 RBC 水石液液缓冲液稀释至 1 倍。
- 纤维化介质：DMEM F-12 中的 10% FBS
- 将 10% 的 FBS 添加到 DMEM-F12 中，加入 L-谷氨酰胺和 HEPES。加入10 U/mL青霉素/链霉素、2.5微克/mL抗真菌和2.5微克/mL支原体预防（见材料表）。储存在 4 °C。
- KHB 缓冲器
- 心脏解剖
- 在冰上准备一个6孔板，每口井有2 mL的冷KHB，在解剖过程中将心脏储存在一起。使用自切除手术剪刀和钳子。
- 在12周大或12周以上的小鼠因异氟拉涅过量而安乐死，并随后进行宫颈脱位。
- 或者，对于活化成纤维细胞分离，通过冠状动脉结扎10诱导12周大小鼠心肌梗死。受伤后8-10天对小鼠进行安乐死。
- 喷雾体与70%乙醇和定向，使腹侧面向实验者。固定或抑制附属物以防止干扰。
- 切开腹部皮肤和肌肉，但避免刺穿肝脏。垂直切向胸骨，小心地打开胸腔，同时避免心脏穿孔。继续切开肋骨以露出心脏。
- 使用钳子，轻轻地将心脏从胸部抬起来，切掉任何附着在心脏外侧的肺或多余的组织。拆下心室，放入 6 孔板的一口中，并带有冷 KHB。继续以这种方式解剖心脏，直到所有样本被分离。
- 心脏的酶分离
- 使用钳子，反复挤压和搅拌KHB的心脏，以消除多余的血液。将心脏转移到10厘米2板的清洁无菌。使用单刃刀片，快速将心脏切成小块。
- 加入1 mL胶原酶消化鸡尾酒，继续切碎，直到碎片足够小，可以用1 mL微移液转移。将碎片转移到带有 1 mL 微移管的 50 mL 锥形管中。用 2 mL 胶原酶消化鸡尾酒洗涤板 2x。
注： 切断移液器尖端的一部分可以帮助收集较大的心脏碎片，否则可能会卡在移液器尖端。 - 在37°C孵育锥形管30分钟，摇摇晃动或搅拌。根据需要固定管。用 5 mL 移液器重新悬浮 10 倍，直到内容物均匀，并在 37 °C 下用旋转或搅拌孵育锥形管 15 分钟。
- 用 10 mL 移液重新悬浮 10 倍，直到均匀。通过在新的 50 mL 锥形管上用 1⁄2 mL KHB 缓冲液润湿滤网，将 40 μm 细胞滤网加注。通过注底40μm细胞滤网，将25 mL的KHB缓冲液添加到消化悬浮液、重新悬浮和过滤中。根据需要更改筛选器。
注：随着过滤速度变慢，轻轻敲击管或使用 1 mL 微移液器从过滤器底面拉悬架可以帮助细胞悬浮液通过部分堵塞的 40 μm 细胞滤网。 - 在 400 x g和 4 °C 下离心 10 分钟。取出上清液，并在 1x RBC 赖塞缓冲液（5 mL/心脏）中重新悬浮颗粒。在室温 （RT） 下孵育 2 分钟。
- 在 400 x g和 RT 下离心 10 分钟。去除上清液，然后通过在 KHB 缓冲液的 1 mL 中重新悬浮颗粒来洗涤。
- 加入9 mL KHB缓冲液，并通过引注40μm细胞滤网过滤到新的50 mL锥形管中。在 400 x g和 RT 下离心 10 分钟。
- 取出上清液，重新悬浮在1 mL的成纤维细胞介质或PBS中，并确定细胞数。纤维细胞可以通过下面描述的三种不同的方法进行分离。
2. 从单细胞悬浮物中分离成纤维细胞
- 纤维化隔离：差分电镀 （图 1）
- 准备一个6孔板，通过添加2 mL的成纤维化介质每孔和旋转板覆盖井底。
- 将细胞悬浮在每心脏1 mL的介质中。板 1 mL 细胞悬浮每个孔，使一个心脏（理论上）被镀每个孔。例如，六颗心将重新悬浮在6 mL的介质中，然后镀入6口井，每口孔有1 mL的细胞悬浮液。
- 旋转板均匀分布细胞。每口井再加1⁄2 mL介质，每口井总体积可达5 mL，并在37°C下孵育4小时。
- 纤维细胞将在4小时后通过选择性粘附分离。用2 mL PBS清洗附着细胞，每口加入2~4 mL无菌成纤维细胞培养液。在37°C孵育，直到汇入。每 2⁄4 天更换一次介质。
- 纤维化隔离：使用GFP报告鼠标模型的FACS （图1）
- FACS 缓冲区
- 准备15 mL的5%胎儿牛血清（FBS）在dPBS没有Ca2+和Mg2+。储存在冰上或4°C。
- FC阻滞器解决方案
- 在 25 μL 的 FACS（1：50 稀释）中制备 0.5 μL FC 阻滞剂（纯化抗鼠标 CD16/CD32）。每个样品需要25μL的FC阻滞剂溶液。储存在冰上或4°C。
- 样品制备和抗体染色
注：抗体稀释物可以提前准备，但这可能会有光线或温度暴露的风险。- 准备 7AAD 或幽灵染料紫紫 510，这是 FACS 缓冲液中所需稀释的 2 倍。有关抗体和稀释物，请参阅表 1。
- 在FC阻滞剂溶液的25μL中重新悬浮500，000个新鲜分离的细胞，以防止FC抗体区域与FC受体的非特异性结合。在RT孵育5分钟。
- 将 7AAD 或幽灵染料紫紫 510 抗体添加到细胞悬浮液的最终体积 25 μL 中。在黑暗中的冰上孵育30~60分钟。
- 通过在 1 mL 的 FACS 缓冲液中重新挂起来洗涤。在 500 x g下离心 5 分钟，在 4°C 下。
- 在FACS缓冲液（300 μL）的建议流细胞学样品体积中重新悬浮颗粒，并转移到流式细胞测量管。
- 荧光激活细胞分拣 （FACS）
注：GFP-_SMA记者老鼠是伊沃·卡拉伊齐奇博士11的贡献。此小鼠表示 GFP 下 α 平滑肌肉细胞 （#SMA） 促进.*SMA已被用作活性成纤维细胞（肌纤维细胞）的标记12。- 对于激活性成纤维细胞（*SMA表达肌纤维细胞）分离，通过冠状动脉结扎诱导12周大GFP-_SMA小鼠心肌梗死。受伤后8-10天牺牲小鼠。
- 在受伤的小鼠心脏单细胞悬浮后，为绿色荧光蛋白 （GFP） 对 βSMA_ve成纤维细胞进行排序。使用未染色的未受伤的成纤维细胞在补偿后在 GFP 通道中设置背景信号。
- 通过浇注 7AAD-ve/GFP+ve细胞或幽灵染料紫色 510-ve /GFP+ve细胞和排序 GFP 表达 _SMA_ve肌瘤细胞的活 GFP_ve细胞的门。收集成纤维细胞介质中的细胞。
- FACS 缓冲区
- 纤维细胞分离：成纤维细胞的磁珠分离（图1）
- 平衡缓冲区
注： 始终为隔离准备新的缓冲区。- 在 PBS 中准备 0.5% BSA 和 2 mM EDTA。在将真空附着在容器盖上时，搅拌溶液，对缓冲液进行脱气。
注： 搅拌可去除溶液中多余的气体，然后通过真空去除，这样气泡在使用时不会堵塞分离柱。
- 在 PBS 中准备 0.5% BSA 和 2 mM EDTA。在将真空附着在容器盖上时，搅拌溶液，对缓冲液进行脱气。
- 磁性标记：CD45+造血细胞
- 将小鼠心脏分离的细胞在500 x g下分离5分钟，然后去除上清液。
- 在1 mL的平衡缓冲液中重新悬浮细胞颗粒。使用血细胞计对细胞进行计数。
- 将细胞悬浮液如上所示离心，并在每1 x 107个总细胞中重新悬浮90 μL平衡缓冲液。每 1 x 107个单元加入 10 μL CD45+磁珠。混合良好，在4°C孵育至少15分钟。
- 通过每1 x 107个单元加入2 mL平衡缓冲液来清洗细胞，然后在500 x g下在4°C下10分钟离心。
- 去除上清液，使用血细胞计计数细胞，并在2 mL平衡缓冲液中重新悬浮至1 x 107总细胞。如果存在超过 10个 7个单元格，则线性缩放缓冲区。通过 40 μm 过滤器传递细胞，以防止细胞聚合堵塞分离柱矩阵。
- 磁分离：CD45+造血细胞
- 将分离柱放置在具有至少 3 mL PBS 的合适分离柱和平衡柱的磁场中。
- 收集流通 （FT） 中未标记的单元格，用 3 mL 平衡缓冲液洗涤列 3x。使用 FT 收集处理，从分隔器中删除列。将柱放在 15 mL 锥形管上。
- 通过将 5 mL 的平衡缓冲液移解到柱上，用柱状随附的柱塞牢固地将细胞浸平，将磁性标记的 CD45+细胞冲洗出来。
- 离心机脱位以及FT/洗涤分数在500 x g。使用血细胞计对细胞进行计数。
- 磁性标记和分离：CD31+内皮细胞
- 重复 CD45+磁标和分离（第 2.3.2⁄2.3.3 节）的协议，但使用 CD31+磁珠孵育 FT 和从 CD45+隔离中洗涤部分除外。
- 磁性标记和分离：MEFSK4+成纤维
- 使用 MEFSK4 抗馈送-APC 抗体代替磁珠重复 CD45+磁标标记协议。将 FT 和洗涤部分从 CD31中分离 5 分钟，然后去除上清液。将细胞颗粒重新悬浮在1 mL的平衡缓冲液中，并使用血细胞计对细胞进行计数。
- 每1 x 107细胞加入10μL的MEFSK4抗进料-APC抗体。在4°C下孵育至少15分钟。
- 洗涤MEFSK4抗体结合细胞，每1 x 107总细胞加入5 mL的平衡缓冲液，然后在500 x g下离心5分钟。
- 使用相同体积的MEFSK4抗馈送-APC抗体，去除上清液并重新悬浮在抗APC珠中。在4°C下在冰上孵育15分钟。
- 在500 x g下离心10分钟。去除上清液，重新悬浮在每1 x 107总细胞2 mL的平衡缓冲液中，然后按照前面所述进行磁分离（第2.3.3节）。磁分离的 MEFSK4+ve/ CD45-ve/CD31-ve成纤维细胞可用于纯度分析和其他下游应用。
- 平衡缓冲区
3. 孤立成纤维细胞种群的纯度和功能分析
- FACS种群纯度分析：*SMA-GFP细胞分析（图2）
- 在Fc阻滞剂溶液的25μL中重新悬浮新鲜分离的细胞，以防止抗体的非特异性结合。在RT孵育5分钟。
- 可选：将25μL的7AAD或幽灵染料紫罗兰510添加到细胞悬浮液中。在黑暗中的冰上孵育30~60分钟。
- 通过在 1 mL 的 FACS 缓冲液中重新挂起来洗涤。在 500 x g下离心 5 分钟。
- 在FACS缓冲液的50μL中重新悬浮颗粒。将 CD31-PE、CD45-APC 和 AN2/NG2 抗体直接添加到细胞悬浮液中。在冰上孵育15分钟（表1）。
- 通过在 1 mL FACS 缓冲液中重新挂起来洗涤。在 400 x g下离心 5 分钟。
- 将驴子抗大鼠AlexaFluor 405次抗体添加到标有未结合原抗体的细胞中。在冰上孵育30分钟。
- 通过在 1 mL 的 FACS 缓冲液中重新挂起来洗涤。在 400 x g下离心 5 分钟。
- 在 FACS 缓冲液 （300 μL） 的建议流细胞测量样本体积中重新悬浮颗粒，并转移到标记的流细胞测量管进行流量分析。
注：FACS分析来描述MEFSK4抗原在分离的成纤维细胞上表达的特征，第3.3节对此进行了描述。
- 纤维细胞纯度分析：免疫荧光（图3A）
- 每口30，000个原发性纤维化（P0-P1）种子，放置在24孔板的盖玻片上，培养至80%的汇合体。或者将排序的CD45+和CD31+细胞（每口30，000个细胞）集中在400 x×g的囊速上g（一种用于直接均匀地沉积在24孔板盖玻片上的方法）。+
- 用冷丙酮固定细胞15分钟，用PBS洗涤3次。
- 块状幻灯片在10%山羊血清。孵育滑轨与主要抗体过夜（表2）。
- 在 PBS 中洗涤幻灯片 3 倍。孵育2小时二次抗体（表2）。
- 反染色滑动，并在缓慢淡入淡出的安装介质中一滴 DAPI 安装。
- FACS种群纯度分析：MEFSK4探测（图3B）
- 在FC阻滞剂溶液的25μL中重新悬浮新鲜分离的细胞，以防止抗体的非特异性结合。在RT孵育5分钟。
- 可选：将25μL的7AAD或幽灵染料紫罗兰510添加到细胞悬浮液中。在黑暗中的冰上孵育30~60分钟。
- 通过在 1 mL 的 FACS 缓冲液中重新挂起来洗涤。在 500 x g下离心 5 分钟。
- 在FACS缓冲液的50μL中重新悬浮颗粒。将MEFSK4抗体直接添加到细胞悬浮液中。在冰上孵育15分钟（表1）。
- 通过在 1 mL 的 FACS 缓冲液中重新挂起来洗涤。在 400 x g下离心 5 分钟。
- 将大鼠 IgG-APC 添加到细胞中（表 1）。在冰上孵育30分钟。
- 通过在 1 mL 的 FACS 缓冲液中重新挂起来洗涤。在 400 x g下离心 5 分钟。
- 在FACS缓冲液（300 μL）的建议流细胞测量样品体积中重新悬浮颗粒，并转移到流细胞测量管进行流量分析。
- 纤维化纯度分析：半定量实时rtPCR（图3C）
- RNA分离和半定量实时PCR
- 在成纤维细胞富集后，使用RNA分离试剂盒分离RNA（参见材料表）。按照制造商的说明操作。
- 按照制造商的说明，使用 cDNA 合成试剂盒（参见材料表）完成第一链 DNA 合成。
- 执行半定量实时PCR5。
- 纤维化功能分析：胶原蛋白凝胶收缩性测定（图4）
- 胶原蛋白溶液
- 在 DMEM 中准备 20 mM HEPES 和 44 mM NaHCO3。加入1.67毫克的1型大鼠胶原蛋白每1 mLDMEM与HEPES和NaHCO3。
- TGF® 补充 DMEM
- 在DMEM中制备10%的FBS，并辅以抗生素和抗真菌。将 TGF® 添加到最终浓度为 1 纳克/mL。
- 细胞/胶原混合物和电镀
- 准备细胞悬浮液 （P3-P5），并确定所需的体积以获得 3.3 x 105 个单元。
- 将悬浮体积与 3.3 x 105细胞添加到足够的胶原蛋白溶液中，以获得 1 mL 的总体积。
注：大鼠胶原蛋白1型浓度现在应该为1.5毫克/mL。 - 在48孔板中，每口孔的种子300μL的细胞胶原混合物（+1 x 105细胞/孔）。在37°C孵育15~20分钟，直到凝胶化。
- 使用 30 G 针帮助将凝胶从井壁中分离出来。在每个油井中加入 600 μL TGF® 和 FBS 补充 DMEM。24 小时和 48 小时反光扫描仪上的图像板。
注：所有免疫荧光实验都是在配备三个激光器（405 nm、488 nm 和 640 nm）的流式细胞测量机上进行的。数据是使用流数据采集软件（材料表）获得的。使用流数据分析软件执行进一步的数据分析。AlexaFluor 405 和幽灵染料紫罗兰 510 对 405 nm 激光感到兴奋，并分别使用 450/50 BP 和 525/50 BP 过滤器进行采集。GFP 和 PE 对 488 nm 激光器感到兴奋，并分别使用 530/30 BP 和 575/26 BP 滤清器进行收集。APC 或 AlexaFluor 647 对 640 nm 激光器感到兴奋，并使用 670/14 BP 滤光片进行采集。所有细胞分拣实验均在配备四台激光器（405 nm、488 nm、561 nm 和 640 nm）的流式细胞测量机（材料表）上进行。7-AAD 使用 561 nm 激光器激发，并使用 670/14 BP 滤光片进行收集。GFP 和幽灵染料紫罗兰 510 使用上述相同的激光/过滤器组合进行收集。所有分拣实验都使用了具有 17 psi 压力配置的 100 um 喷嘴，提高了目标单元的下游可行性。
- 胶原蛋白溶液
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Representative Results
使用 βSMA-GFP 报告小鼠显示肌纤维细胞分离的流量浇注方案
未受伤的心脏在βSMA-GFP报告鼠模型中显示没有可检测的GFP+细胞;因此，它们被用来为补偿后GFP通道的背景信号建立一个门（图2）。*SMA=细胞根据在MI后10天从受伤左心室的GFP表达情况排序。一小部分内皮细胞（GFP+/CD31+） 细胞;SD = 3.8% = 0.0164;n = 5） 和造血性 （GFP+/CD45+ 细胞）;SD = 3.18% = 0.0112;n = 5） 细胞在受伤的βSMA-GFP小鼠心脏中也表示GFP（图2A）。然而，GFP+/CD31-/CD45-细胞没有表达AN2，一个环细胞标记。
未受伤（静止）和受伤（激活，*SMA+GFP+）细胞表达成纤维细胞标记
通过IF分析分析，从βSMA-GFP小鼠分离的GFP®细胞表示βSMA、胶原蛋白类型1α-1链（COL1+1）、维他汀和围罗汀。通过选择性粘附分离的未受伤的成纤维细胞表示维他汀，但没有显示激活的成纤维细胞标记的表达：βSMA、围联汀和COL1+1（图3A）。通过流量分析分析时，未伤害和活化成纤维细胞均表示MEFSK4抗原（图3B）。磁性分离的MEFSK4_ve细胞从未受伤的小鼠心脏表达成纤维细胞的标记：Col1a1，pdgfr®和围罗汀。相比之下，磁分离的CD45和CD31阳性细胞的成纤维细胞标记表达可以忽略不计。
纤维细胞和肌纤维细胞证明了收缩胶原蛋白的能力
在硬塑料的细胞培养中，成纤维细胞在TGF®的存在下收缩胶原蛋白凝胶，证明了其收缩功能能力13，14。,14这种成纤维细胞的体外特征与组织修复和其他生物过程中发生的结缔组织收缩非常相似。通过选择性粘附分离的未受伤的成纤维细胞和肌纤维细胞，从βSMA-GFP小鼠中分离出来并分类，证明了收缩胶原蛋白的能力（图4）。
图1：使用三种不同的方法进行纤维细胞隔离的原理图。（A） 差分电镀， （B） GFP+ 细胞分拣αSMA阳性细胞， 和 （C） 基于磁珠的磁珠分离成纤维细胞.差异电镀后培养细胞的代表性明亮场。比例尺 = 50 μM。请点击这里查看此图形的较大版本。
图2：对MI后从βSMA-GFP小鼠心脏分离的单个细胞的FACS分析。（A） 代表 FACS 门控方案，演示 GFP® 细胞共同表达 CD31、CD45 或 AN2 来自 βSMA-GFP 小鼠在心肌梗死 （MI） 10 天后心脏受伤。（B） 为 MI 后心脏提供的 FACS 数据进行图形量化;n = 5 个实验是独立进行的（\p < 0.0001，使用图基的多重比较测试的单向 ANOVA 计算）。这个数字是从萨拉斯瓦蒂等人10.请点击此处查看此图形的较大版本。
图3：从未受伤和受伤的小鼠心脏分离的成纤维细胞的纯度分析。（A） 免疫荧光染色细胞群 （P0） 从未受伤或受伤的 βSMA-GFP 小鼠的心脏分类 FACS.未受伤和激活的细胞都表达成纤维细胞 （FB） 标记，如 COL1+1 和 vimentin，但不包括造血标记 CD45 或内皮标记 CD31。从受伤的βSMA-GFP小鼠心脏分离的细胞表示活性成纤维细胞标记、βSMA和围骨汀，这些标记存在于从未受伤的小鼠心脏分离的细胞中。核被DAPI染色，n = 3实验独立进行。刻度杆 = 100 μm. （B） 代表 FACS 叠加未受伤和激活的成纤维细胞 （P3_P5） 的直方图，显示成纤维细胞标记 MEF-SK4 的表达。对于负控制，使用大鼠IgG，n = 2实验独立进行。（C） Col1+1、Pdgfr®和未受伤的 MEKSK4_ve 成纤维细胞中的Postn转录的相对折叠变化，n = 3 实验独立进行（\p < 0.05，使用图基的多重比较测试使用双向 ANOVA 计算）。 Pdgfrα（A）和（B）改编自萨拉斯瓦蒂等人10。请点击此处查看此图形的较大版本。
图4：从未受伤和受伤的小鼠心脏分离的成纤维细胞的功能特征。在未受伤和受伤的活性炭性βSMA+成纤维细胞（P3+P5）的情况下，胶原蛋白凝胶收缩的代表性数字。该图表示在24小时和48小时收缩后初始凝胶区域的百分比变化，当孵育未受伤和受伤的激活βSMA+成纤维细胞时，n = 2 实验是独立进行的。这个数字是从萨拉斯瓦蒂等人10.请点击此处查看此图形的较大版本。
| 抗体 | 单元格目标 | 稀释 |
| 7AAD | 死细胞 | 1:1000 |
| 幽灵染料紫罗兰 510 | 死细胞 | 1:1000 |
| APC-CD45 | 造血细胞 | 1:200 |
| PE-CD31 | 内皮细胞 | 1:200 |
| 抗AN2/NG2 | 佩里西提斯 | 1:11 |
| 驴抗大鼠阿莱克萨氟405 | 二次抗体 | 1:100 |
| 抗馈送电池-APC （MEFSK4） | 成 纤维 细胞 | 1:100 |
| 大鼠 IgG-APC | 等型控制 | 1:100 |
表1：FACS染料和抗体。
| 原抗体 | 稀释 | |
| *平滑肌肉作用（#SMA） | 1:1000 | |
| 纤维化蛋白 1 （FSP1）1：250 | 1:100 | |
| COL 1+1 | 1:1000 | |
| 佩里奥斯坦 | 1:100 | |
| 维门丁 | 1:200 | |
| CD31 | 1:250 | |
| CD45 | 1:250 | |
| 二次抗体 | 稀释 | |
| 山羊防鼠亚历克萨·弗卢488 | 1:200 | |
| 山羊抗兔-FITC | 1:200 | |
| 山羊抗兔-Cy3 | 1:200 | |
| 山羊抗大鼠亚历克萨·弗卢488 | 1:200 | |
| 山羊抗大鼠亚历克萨·弗卢647 | 1:200 | |
表2：免疫荧光原抗体和继发抗体。
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Discussion
纤维细胞是一个异质细胞组，由不同的标记组识别。用于识别成纤维细胞的蛋白质标记物是二叶素域受体2（DDR2）、纤维素、维他丁、胶原蛋白I和III，以及Thy1 15、16、17、18、19、20。15,16,17,18,19,20维门汀已用于识别未受伤的静止心脏成纤维细胞，成纤维细胞特定蛋白1，βSMA和围骨蛋白已被证明识别损伤引起的活化成纤维细胞，与βSMA是最常见的标记，以检测激活性成纤维细胞6,6，12，21。,21此外，Tcf21和MEFSK4蛋白在识别未受伤的心脏组织中发现的静止纤维化以及活化纤维细胞（包括受伤的小鼠心脏21、22,22中的肌纤维细胞）方面获得了认可。
该协议采用三种不同的方法来分离和丰富成纤维细胞和活化成纤维细胞，包括肌纤维细胞。纤维细胞优先粘附在塑料上的能力用于第一种隔离方法。在用自由球酶进行酶消化后，细胞的单细胞悬浮液被播种在塑料盘上，以优先粘附。许多非成纤维细胞无法粘附在培养皿的聚苯乙烯表面，使我们能够从菜中取出所有介质，并保持相对纯净的成纤维细胞种群。使用这种技术的一个警告是，虽然成纤维细胞会优先粘附在聚苯乙烯盘中，但一些污染的非纤维细胞也可能附着，留下非同质细胞群。
第二种分离技术利用FACS将表达肌纤维细胞的βSMA与其他细胞分离。在此采用的转基因小鼠模型中，GFP 与 αSMA 一起专门表示，因此含有 βSMA 的肌纤维细胞可通过 GFP 的荧光功能检测到含有 βSMA的肌纤维细胞。这种分离程序使我们能够获得大约99%的肌纤维细胞群。萨拉斯瓦蒂等人对这些细胞的纯度分析进行了广泛的描述。
第三种隔离技术是通过基于磁珠的MEFSK4表达细胞的磁珠分离来分离未受伤和活化成纤维细胞的有效方法。通过允许单个细胞悬浮液与抗CD45和反CD31磁珠结合，由于磁场效应而在基质中固定，这允许分离任何可能污染的造血细胞和内皮细胞。纤维细胞分离。由于MEFSK4最近被用作识别成纤维细胞的可靠标记物，能够应用一种与MEFSK4表达细胞结合的抗体。将磁珠与抗体结合后，形成允许分离成纤维细胞的复合体后，磁珠细胞复合体通过磁场中的基质，获得高富集性成纤维细胞群。通过免疫染色、RTPCR和流细胞学分析来评估分离的成纤维细胞种群的纯度。
与任何其他技术一样，本手稿中描述的技术也有局限性。选择性粘附协议和基于磁珠的隔离的局限性是这些方法不区分静止和活化成纤维细胞。为了丰富活化成纤维细胞，在心肌梗死后应进行8-10天的隔离。此外，与其他成纤维细胞标记一起检查隔离的纯度也很重要。MEFSK4阳性成纤维细胞纯度仅通过RTPCR证明，建议用识别污染细胞类型（包括造血（CD45）的其他纤维细胞标记和标记进行（通过免疫染色和流动细胞测量分析）进行测试。内皮 （CD31） 和围骨 （AN2）。如果可能，其他成纤维细胞特定标记可用于进一步分类或磁力分离成纤维细胞群。
使用βSMA-GFP小鼠分离和排序肌纤维细胞是获得活化成纤维细胞群的可靠技术。然而，在流分析中观察到了溶血细胞和内皮细胞的可忽略百分比。为了改进此技术，CD45_ve/CD31_ve 和 AN2_ve 单元应排除在 GFP_ve/_SMA_ve单元排序中。由于βSMA是一个被广泛接受的肌瘤细胞标记，βSMA-GFP报告鼠标模型是一个有价值的工具，应该利用研究心肌梗塞在心肌损伤的背景下。
有几个关键的故障排除步骤需要考虑。如果细胞的生存能力和产量受到影响，消化时间可以缩短。搅拌棒不应用于搅拌消化混合物，因为这会影响细胞的生存能力。管子应固定在摇臂上或摇动培养箱中，以轻轻搅拌消化混合物。用5 mL或10 mL移液器重新悬浮消化的组织10倍，对于细胞的适当分离至关重要。
如果细胞要通过流动细胞测定进行排序或分析，则必须利用单个细胞悬浮液的正确红细胞系统化。对于磁珠隔离，缓冲液脱气对于防止柱内出现任何气泡至关重要。用于磁珠细胞分离的柱不应在不同磁珠偶联细胞之间重复使用。例如，应使用新列来分离 CD45+单元格，该列应在 CD45+单元被转外后丢弃，然后用于 CD31+单元隔离的另一个新列。在我们手中，我们没有看到分离/分类成纤维细胞中的渗透物污染。然而，MEFSK4已被证明能识别环细胞22。因此，建议使用额外的步骤从单个细胞中分清/磁化耗尽过冰细胞 （AN2）。虽然这种协议在12周大的小鼠身上得到验证，但这项技术可用于较年轻的或年龄较大的小鼠。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者要感谢伊沃·卡拉伊齐奇博士对βSMA-GFP小鼠的感谢。本出版物中报告的研究得到了国家卫生研究院国家普通医学研究所（NIH）的支持，编号为R01GM118300（S.S.），国家国家卫生研究院生物医学成像和生物工程研究所根据编号 R21EB019509 （P.P.Y.） 和美国心脏协会的科学家发展补助金，奖励编号 17SDG33630187 （S.S.）。流动细胞测量分析在VUMC流细胞测量共享资源处进行，该资源由范德比尔特英格拉姆癌症中心（P30 CA68485）和范德比尔特消化疾病研究中心（DK0058404）支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Acetone | |||
| Anti-fungal (Amphotericin B-solubilized; Fungizone) | Sigma Aldrich | A9528 | |
| Bovine Serium Albumin (BSA) | Sigma | 9048-46-8 | |
| Calcium chloride | |||
| Citrate Buffer | |||
| Collagenase blend (Liberase Blendzyme 3 TH) | Roche Applied Science | ||
| DAPI | |||
| DDI water | |||
| DI water | |||
| DMEM-F12 with L-Glutamine and HEPES | Life technologies | 11330057 | |
| Dnase I(20U/mL) | BioRad | 7326828 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (dPBS) without Ca2+ and Mg2+ | Gibco | 13190-144 | |
| 70% Ethanol | |||
| FC Blocker (Purified anti-mouse CD16/CD32) | Tonbo Biosciences | 70-0161 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 16000044 | |
| 10% goat serum | |||
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 21-023-CV | |
| 1M HEPES | Corning | 25-060-Ci | |
| Krebs-Henseleit Buffer powder | Sigma | K3753 | |
| Mycoplasma prophylactic (Plasmocin) | Invivogen | ant-mpp | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | |||
| 10x Red Blood Cell Lysis Buffer | Miltenyi | 130-094-183 | |
| Slow-fade Mounting Media | |||
| Sodium azide | |||
| Sodium bicarbonate | |||
| TGFβ | |||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Type 1 Rat Collagen | |||
| Antibodies | |||
| 7AAD (stock: 1 mg/mL solution in DMSO) | Molecular Probes | A1310 | dilution = 1:1000; RRID = |
| CD45-APC | BD Bioscience | 559864 | dilution = 1:200; RRID = AB_398672 |
| CD31-PE | BD Bioscience | 553373 | dilution = 1:200; RRID = AB_394819 |
| CD31 | BD Biosciences | 553370 | dilution = 1:250; RRID = AB_394816 |
| CD45 | BD Biosciences | 553076 | dilution = 1:250; RRID = AB_394606 |
| COL 1α1 | MD Bioproducts | 203002 | dilution = 1:1000; RRID = |
| Ghost dye violet 510 (Formulation: 1 uL/test in DMSO) | Tonbo Biosciences | 13-0870 | dilution = 1:1000; RRID = |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11029 | dilution = 1:200; RRID = AB_138404 |
| Goat anti-rabbit-Cy3 | Southern Biotech | 4050-02 | dilution = 1:200; RRID = AB_2795952 |
| Goat anti-rabbit-FITC | Jackson Immunoresearch Laboratories | 711-165-152 | dilution = 1:200; RRID = AB_2307443 |
| Goat anti-rat Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11006 | dilution = 1:200; RRID = AB_2534074 |
| Goat anti-rat Alexa Fluor 647 | Thermo-Fisher | A21247 | dilution = 1:200; RRID = AB_141778 |
| Periostin | Santa Cruz | SC67233 | dilution = 1:100; RRID = AB_2166650 |
| Vimentin | Sigma Aldrich | V2258 | dilution = 1:200; RRID = AB_261856 |
| α-smooth muscle actin (αSMA) | Sigma Aldrich | A2547 | dilution = 1:1000; RRID = AB_476701 |
| Fibroblast specific protein 1 (FSP1) | Millipore 07-2274 | 07-2274 | dilution = 1:100; RRID = AB_10807552 |
| CD45 Magnetic Beads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| CD31 Magnetic Beads | Miltenyi Biotec | 130-087-418 | |
| Anti-feeder cells-APC (MEFSK4) | Miltenyi Biotec | 130-102-900 | dilution = 1:100; RRID = AB_2660619 |
| anti-APC Beads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| Rat IgG-APC | Miltenyi Biotec | 130-103-034 | dilution = 1:100; RRID = AB_2661598 |
| Donkey anti-rat Alexa Fluor405 | Abcam | ab175670 | dilution = 1:100 |
| anti-AN2/NG2 | Miltenyi Biotec | 130-097-455 | dilution = 1:11; RRID = AB_2651235 |
| Other Materials | |||
| 0.22 µm Filter | Thermo Scientific | 723-2520 | |
| 10 cm2 Cell Culture Dish | Corning | 430167 | |
| 10 mL Pipet | Fisherbrand | 13-678-11E | |
| 40 µm Cell Strainer | Fisherbrand | 22363547 | |
| 5 mL Pipet | Fisherbrand | 13-678-11D | |
| 50 mL Conical Tube | Falcon | 352070 | |
| 6-well Plate | Corning | 3506 | |
| Flow Cytometry Tubes | Falcon | 352058 | |
| Forceps | |||
| Rocker | |||
| Single Edge Blade | PAL | 62-0177 | |
| Surgical Scissors | |||
| GFP-αSMA Reporter Mice | |||
| MACS Separator Magnetic Field | |||
| MACS Separation Column | |||
| Coverslips | |||
| Qaigen Rneasy Mini Kit | Qaigen | 74104 | |
| Ambion RNAqueous Micro Total Isolation Kit | Ambion | AM1931 | |
| BioRad iScript cDNA Syntehsis Kit | BioRad | 1708891 | |
| 48-well Plate | |||
| 30G Needle | |||
| 3 Laser Flow Cytometry Machine (BD LSRFortessa) | BD Biosciences | ||
| 4 Laser Flow Cytometry Machine (BD FACSAria III) | BD Biosciences | ||
| Flow Data Acquiring Software (BD FACSDiva Software v8.0a) | BD Biosciences | ||
| Flow Data Analysis Software (FlowJo Software) | BD Biosciences |
References
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