Summary
線維芽細胞の純粋な集団を得ることは、創傷修復および線維化におけるその役割を研究するために重要である。ここでは、線維芽細胞と筋線維芽細胞を、傷つけていないマウスの心臓から分離し、その後、免疫蛍光、RTPCR、蛍光支援細胞選別による純度と機能性の特徴付け、およびコラーゲンゲル収縮。
Abstract
傷害に応答した心臓線維症は、創傷治癒に対する生理学的応答である。線維症を軽減する線維芽細胞サブタイプを研究し、標的にするための努力がなされている。しかし、線維芽細胞の研究は、活性化線維芽細胞と同様に静止を同定するために普遍的に許容される線維芽細胞マーカーの欠如のために妨げられてきた。線維芽細胞は異種細胞集団であり、分離して特徴付けることを困難にする。提示されたプロトコルは、傷つけていないマウスの心臓から線維芽細胞および筋線維芽細胞を豊かにする3つの異なる方法を記述する。標準的で信頼性の高いプロトコルを使用して線維芽細胞を分離することで、ホメオスタシスと線維症変調における役割の研究が可能になります。
Introduction
心臓線維芽細胞は、間葉起源の細胞、ホメオスタシス中の心臓アーキテクチャの維持に加えて心臓における電気伝導および機械的力を維持する上で重要な役割を果たす1。傷害後、これらの細胞は活性化され、増殖し、細胞外マトリックス(ECM)タンパク質2を産生する。多くの前臨床試験では、負傷した心臓3の構造的完全性を維持する重要な細胞レギュレータとして線維芽細胞が明らかになり、ECMタンパク質の未チェック産生および堆積を担う主なエフェクター細胞が、硬い瘢痕形成および心不全4を引き起こした。線維芽細胞は細胞の異種グループであり、線維化不適応性から修復機能を解剖することは困難です。近年、心筋損傷後の2つの異なる線維芽細胞サブタイプの機能的不均一性が定義されており、異なる線維芽細胞サブタイプを単離し、創傷治癒におけるそれらの役割を研究する可能性を示す5。
純粋な線維芽細胞集団を得ることは、修復および線維化における機能的役割をデリデートする上で極めて重要である。しかし、他の細胞型を認識する複数の線維芽細胞マーカーの存在は、実質的に純粋な線維芽細胞集団6を単離することが困難となる。いくつかのエレガントな研究は、怪我をしていない心筋症や負傷した心筋から心臓線維芽細胞を分離する巧妙な方法を考案しました。線維芽細胞を濃縮する最も一般的かつ確立された方法は、酵素組織消化に続く選択的接着を介してである 7.
また、細胞表面抗原に基づく線維芽細胞の蛍光活性化細胞選別(FACS)が8に記載され、正常に説明されている。この研究では、酵素消化に続いて、間葉系細胞を、マウスの心臓から系統陰性(Lin: Ter119-CD45 -CD31−)およびgp38陽性(gp38+)としてソートした。−+Gp38+ve細胞は、col1α1および他の間葉マーカーのそれらの共発現に基づいて線維芽細胞であることが確認された。ほとんどの組織消化はペトリ皿の中で心室を解剖した後に完了するが、最近の研究では、線維芽細胞を含む筋細胞および非筋細胞を単離するために左心室の直接針酵素灌流の使用を調査した。次いで線維芽細胞を選択的接着によってこの場合に単離した。
このプロトコルは、3つの方法を用いた線維芽細胞の分離および濃縮について説明する。1つ目は、酵素消化後の線維芽細胞の選択的接着を含む既に確立された方法である。第2の方法は、主に筋線維芽細胞を発現する傷害誘発アルファ平滑筋を単離するために使用される。第3の方法は、造血細胞および内皮細胞の酵素消化心細胞懸濁液の逐次的な磁気枯渇を伴う。枯渇後、線維芽細胞/筋線維芽細胞は、磁気ビーズを使用して抗原MEFSK4の存在に基づいて単離される。近年、MEFSK4は、活性化線維芽細胞と同様に静止症に存在する抗原として説明されており、線維芽細胞の同定および単離に適したマーカーとなっています。当然ながら、ここで説明するすべての方法には固有の制限があります。したがって、フロー解析、免疫染色、および半定量的リアルタイムPCRにより、単離された細胞集団の純度を確認することを強くお勧めします。しかし、これらの方法論は、上に拡大することができ、重要な実験のために線維芽細胞および筋線維芽細胞集団を利用する前に、他の汚染集団を除外するために追加のマーカーを追加することができる。
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Protocol
この研究は、国立衛生研究所の実験動物のケアと使用のためのガイドの勧告を厳密に支持します。ヴァンダービルト大学の施設動物のケアと使用委員会は、プロトコルを承認しました (プロトコル番号: M1600076-01).
1. 心臓解剖
- ソリューションの準備
- KHB バッファ
- 攪拌棒を使用して、9.4gのクレブス・ヘンセライトバッファー(KHB)粉末を900mLのDDI水にゆっくりと溶解する。
メモ:バッファーは、あまりにも速く、またはあまりにも長いのために攪拌した場合沈殿します。KHBバッファーは、線維芽細胞の分離中に冷たくなければなりません。 - 2.9 mM CaCl2と 24 mM NaHCO3を追加します。pHを7.2~7.3に調整し、dH2Oで1Lの体積に希釈します。
- 滅菌フィルター(0.22 μm)を使用して、4°Cで最大4週間保管してください。氷の上または4°Cで分離の期間を保ちます。
- 攪拌棒を使用して、9.4gのクレブス・ヘンセライトバッファー(KHB)粉末を900mLのDDI水にゆっくりと溶解する。
- コラゲナーゼ消化カクテル
- 線維芽細胞の分離の日に消化カクテルを準備します。心臓の数に応じて消化カクテルの適切な量を決定します。1心臓あたり5mLのカクテル。
- メーカーの指示に従ってコラゲナーゼブレンド(材料表参照)とDNase Iを準備します。
- 20 mLの全消化カクテルに対して、DNase Iの17.5 μL、1M HEPESの180 μL、500 μLのコラゲナーゼを空の50 mL円錐形チューブに加えます。
- Ca2+とMg2+で十分な量のハンクのバランス塩溶液(HBSS)を加え、合計20mLの総容積を得る。
- 赤血球(RBC)のリシスバッファー
- 心臓の数(5 mL/心臓)に基づいて必要な総体積を決定します。dH2Oを使用して10倍のRBCライシスストックバッファーを1倍に希釈します。
- 繊維芽細胞媒体:DMEM F-12中の10%FBS
- L-グルタミンとHEPESでDMEM-F12に10%FBSを加えます。10 U/mLペニシリン/ストレプトマイシン、2.5 μg/mL抗真菌、および2.5 μg/mLマイコプラズマ予防を加える(材料表を参照)。4 °Cで保管。
- KHB バッファ
- 心臓解剖
- 解剖中に心臓を保存するために井戸あたり2 mLの冷たいKHBで氷の上に6ウェルプレートを準備します。オートクレーブされた外科用ハサミと鉗子を利用する。
- イオブルランの過剰摂取により12週齢以上でマウスを安楽死させ、子宮頸部脱臼に従う。
- あるいは、活性化線維芽細胞単離のために、冠動脈結紮10によって12週齢マウスにおいて心筋梗塞を誘発する。マウスを安楽死させる 8- 10 怪我の後の日.
- 70%エタノールと配向体をスプレーして、腹側が実験者に向かいます。干渉を防ぐために付属物を固定または拘束します。
- 腹部の皮膚と筋肉を切り開きますが、肝臓を突き刺さないようにしてください。胸骨に向かって垂直に切り、心臓の突き刺しを避けながら胸郭を慎重に開きます。胸部を切り抜いて心臓を露出し続けます。
- 鉗子を使用して、心臓を胸からそっと持ち上げ、心臓の外側に付着した肺または余分な組織を切り取ります。心室を取り外し、冷たいKHBと6ウェルプレートの1つの井戸に置きます。すべてのサンプルが分離されるまで、この方法で心臓を解剖し続けます。
- 心の酵素解離
- 鉗子を使用して、KHBで心臓を繰り返し圧迫し、攪拌して余分な血液を除去する。きれいな無菌10 cm2プレートに心臓を移します。単一の刃を使用して、すぐに小片に心臓をミンチ。
- コラゲナーゼ消化カクテルを1 mL加え、1 mLマイクロピペットで転写できるほど小さくなるまでミンチを続けます。1 mL マイクロピペットを用いて50 mL円錐形チューブに入る。コラゲエーゼ消化カクテル2mLでプレート2倍を洗います。
注:ピペットチップの一部を切断すると、ピペットチップに詰まりてしまう可能性のある大きな心臓部分を収集するのに役立ちます。 - 37°Cで30分間、揺れや攪拌で円錐管をインキュベートします。必要に応じてチューブを固定します。内容物が均質になるまで5 mLピペットで10倍再懸濁し、37°Cで円錐チューブを回転または攪拌で15分間インキュベートします。
- 均質になるまで10mLピペットで10倍を再懸濁します。新しい50 mL円錐形チューブの上に1-2 mLのKHBバッファーでフィルターを湿らせ、40 μmのセルストレーナーをプライムします。25 mL の KHB バッファーを加え、消化懸濁液、再中断、およびプライミングされた 40 μm のセルストレーナーを介してフィルター処理します。必要に応じてフィルタを変更します。
注:ろ過が遅くなるにつれて、軽くタップチューブをタップするか、フィルターの下側からサスペンションを引くために1 mLマイクロピペットを使用すると、細胞懸濁液が部分的にブロックされた40 μm細胞ストレーナーを通過するのを助けることができます。 - 400 x gで遠心分離機、4 °C で 10 分間上清を取り除き、1x RBC リシス バッファー (5 mL/心臓) でペレットを再懸濁します。室温(RT)で2分間インキュベートする。
- 400 x gで遠心分離機、RT を 10 分間は取り除き、KHB バッファーの 1 mL にペレットを再懸濁して洗浄します。
- 新しい50 mL円錐形の管にプライミングされた40 μmの細胞のストレーナーを通してKHBの緩衝およびフィルターの9 mLを加える。400 x gで遠心分離機、RT 10分間。
- 上清を取り除き、線維芽細胞培地またはPBSの1mLで再懸濁し、細胞数を決定する。線維芽細胞は、以下に説明する3つの異なる方法によって単離され得る。
2. 単細胞懸濁液からの線維芽細胞の分離
- 線維芽細胞分離:差動めっき(図1)
- 1ウェルあたり2mLの線維芽細胞培地を加え、プレートを旋回してウェルボトムを覆い、6ウェルプレートを準備します。
- 心臓あたり1mLの培地で細胞を再懸濁する。1つの心臓(理論的には)がウェル当たりめっきされるようなウェル当たりの細胞懸濁液のプレート1mL。例えば、6つの心臓は6mLの培地で再懸濁され、その後、ウェルあたり1mLの細胞懸濁液を有する6つのウェルにメッキされる。
- セルを均等に分配する旋回プレート。井戸あたり最大5 mLの合計容量に1~2mLのメディアを追加し、37 °Cで4時間インキュベートします。
- 線維芽細胞は、4時間後に選択的接着によって分離されます。PBSの2 mLで取り付けられた細胞を洗浄し、ウェルあたり2〜4 mLの無菌線維芽細胞培地を加えます。コンフルエントになるまで37°Cでインキュベートする。メディアを 2 ~ 4 日ごとに変更します。
- 線維芽細胞分離: GFP レポーター マウス モデルを使用した FACS (図 1)
- FACS バッファ
- Ca2+とMg2+なしでdPBSで5%胎児ウシ血清(FBS)の15 mLを準備します。氷の上または4°Cで保管してください。
- FCブロッカーソリューション
- FACS(1:50希釈)の25 μLで0.5 μL FCブロッカー(精製アンチマウスCD16/CD32)を準備します。25 μLのFCブロッカーソリューションは、サンプルごとに必要です。氷の上または4°Cで保管してください。
- 試料調製および抗体染色
注:抗体希釈は事前に調製できますが、光や温度暴露の危険性があります。- FACSバッファに必要な希釈液を2倍にする7AADまたはゴースト染料バイオレット510を準備します。抗体および希釈については、表 1を参照してください。
- FCブロッカー溶液25μLで50万個の新しい細胞を再懸濁し、FC受容体への非特異的結合を防止します。RTで5分間インキュベートします。
- 7AADまたはゴースト染料バイオレット510抗体を細胞懸濁液の最終容積25μLに加えます。暗闇の中で氷の上で30〜60分間インキュベートします。
- 1 mLのFACSバッファーで再懸濁して洗浄します。遠心分離機は500×gで5分4°Cで。 g
- FACSバッファー(300 μL)の推奨フローサイトメトリーサンプル量でペレットを再懸濁し、フローサイトメトリーチューブに移します。
- 蛍光活性化細胞分類(FACS)
注:GFP-αSMAレポーターマウスは、イヴォ・カラジッチ博士11からの貢献でした。このマウスは、α平滑筋細胞(αSMA)プロモーター下でGFPを発現する。αSMAは活性化線維芽細胞(筋線維芽細胞)12のマーカーとして使用されている。- 活性化線維芽細胞(筋線維芽細胞を発現するαSMA)単離の場合、冠状動脈結紮により12週齢のGFP-αSMAマウスにおいて心筋梗塞を誘発する。怪我の8~10日後にマウスを犠牲にしてください。
- 負傷したマウスの心臓からの単一細胞懸濁液に続いて、緑色蛍光タンパク質(GFP)のαSMA+ve線維芽細胞を選別する。GFPチャネルのポスト補償にバックグラウンド信号を設定するために、無傷の線維芽細胞を使用してください。
- 7AAD-ve/GFP+ve細胞またはゴースト染料バイオレット510-ve/GFP+ve細胞をゲーティングして生きたGFP+ve細胞用ゲートと並べ替えgFP αSMA+ve筋線維芽細胞。線維芽細胞培地で細胞を収集します。
- FACS バッファ
- 線維芽細胞の分離:繊維芽細胞の磁気ビーズベースの分離(図1)
- 平衡バッファー
注: 分離のために常に新しいバッファーを準備してください。- PBSで0.5%BSAと2 mM EDTAを準備します。容器の蓋に真空を取り付けながら溶液を攪拌して緩衝液を脱気する。
注:攪拌すると、真空を通して除去される溶液から余分なガスを取り除き、使用時に気泡が分離カラムを詰まらせないようにします。
- PBSで0.5%BSAと2 mM EDTAを準備します。容器の蓋に真空を取り付けながら溶液を攪拌して緩衝液を脱気する。
- 磁気ラベリング: CD45+造血細胞
- 遠心分離機はマウスの心臓から500xggで5分間細胞を単離し、上清を取り除いた。
- 細胞ペレットを平衡バッファーの1 mLに再懸濁させる。ヘモサイトメーターを使用して細胞を数えます。
- 上記のように細胞懸濁液を遠心分離し、合計1 x 107個の細胞当たり90μL平衡バッファーで細胞ペレットを再懸濁した。1 x 107の合計セルあたり10 μLのCD45+磁気ビーズを加えます。+よく混ぜ、4°Cで少なくとも15分間インキュベートします。
- 細胞を1 x 107の細胞あたり2mL平衡バッファーを加え、4°Cで10分間500 x gで遠心分離機を加えて細胞を洗浄します。
- 上清を取り除き、ヘモサイトメーターを使用して細胞を数え、2 mLの平衡バッファー内の合計1 x 107個の細胞を再懸濁します。10 個を超えるセルがある場合は、バッファーを直線的にスケーリングします。細胞が分離カラム行列を詰まらせるのを防ぐために、40 μmのフィルタを通して細胞を通過させます。
- 磁気分離: CD45+造血細胞
- 適切なセパレータの磁場に分離カラムを配置し、少なくとも3 mLのPBSでカラムを平衡化します。
- フロースルー(FT)内のラベルのない細胞を収集し、3 mLの平衡バッファーでカラム3xを洗浄します。FT でのスワッシュを収集します。柱を15 mLの円錐形チューブに置きます。
- 5 mLの平衡バッファーをカラムにピペット処理し、カラムに付属のプランジャーで細胞をしっかりと突っ込むことで、磁気的にラベル付けされたCD45+セルを洗い流します。
- 遠心分離機の溶出性だけでなく、FT/500 x gで分数を洗浄する.ヘモサイトメーターを使用して細胞を数えます。
- 磁気標識と分離: CD31+内皮細胞
- CD45+磁気標識と分離 (セクション 2.3.2 ~ 2.3.3) の繰り返しプロトコルは、FT と共にインキュベートし、CD45+分離から部分を洗浄するために CD31+磁気ビーズを使用する以外は.
- 磁気標識と分離: MEFSK4+線維芽細胞
- 磁気ビーズの代わりにMEFSK4抗フィーダーAPC抗体を用いたCD45+磁気標識用プロトコルを繰り返します。FTとウォッシュ部分をCD31+分離部から500×gで5分間遠心gし、上清を取り除きます。細胞ペレットを平衡バッファーの1mLに再懸濁し、ヘミック計を用いて細胞をカウントする。
- 1 x 107細胞あたり10μLのMEFSK4抗フィーダーAPC抗体を加えます。4°Cで少なくとも15分間インキュベートする。
- MEFSK4抗体結合細胞を、合計1 x 107個の細胞あたり5mLの平衡バッファーを加え、500 x gで5分間遠心分離機を加えます。
- 使用するMEFSK4抗フィーダー-APC抗体の同じ量を使用して、抗APCビーズで上清を除去し、再中断します。氷の上で4°Cで15分間インキュベートします。
- 500 x gで遠心分離して 10 分間上澄を除去し、全セル 1 x 107セル当たり 2 mL の平衡バッファーで再懸濁し、前述のように磁気分離を進めます (セクション 2.3.3)。磁気的に分離されたMEFSK4+ve/CD45-ve/CD31-ve線維芽細胞は、純度分析および他の下流用途に使用することができる。
- 平衡バッファー
3. 単離線維芽細胞集団の純度と機能性解析
- FACSの人口純度分析:αSMA-GFP細胞分析(図2)
- 25 μLのFcブロッカー溶液で、分離し直した細胞を再懸濁して、抗体の非特異的結合を防止します。RTで5分間インキュベートします。
- 任意:細胞懸濁液に7AADまたはゴースト染料510の25 μLを加えます。暗闇の中で氷の上で30〜60分間インキュベートします。
- 1 mLのFACSバッファーで再懸濁して洗浄します。500 x gで 5 分間の遠心分離機。
- ペレットを50 μLのFACSバッファに再懸濁します。CD31-PE、CD45-APC、およびAN2/NG2抗体を細胞懸濁液に直接加えます。氷上で15分間インキュベートする(表1)。
- 1 mL FACS バッファーで再中断して洗浄します。400 x gで 5 分間遠心分離機。
- ロバ抗ラットAlexaFluor 405二次抗体を非共役一次抗体で標識した細胞に加える。氷の上で30分間インキュベートします。
- 1 mLのFACSバッファーで再懸濁して洗浄します。400 x gで 5 分間遠心分離機。
- FACSバッファ(300 μL)の推奨フローサイトメトリーサンプル量でペレットを再中断し、フロー分析のために標識されたフローサイトメトリーチューブに転送します。
注:単離線維芽細胞上のMEFSK4抗原の発現を特徴付けるFACS分析は、セクション3.3に記載されている。
- 線維芽細胞の純度分析:免疫蛍光(図3A)
- 種子30,000原発性線維芽細胞(P0-P1)は、80%コンフルエントまで24ウェルプレートと培養に入れられたカバーリップにウェルあたり。または、400 x× gのサイトスピンによってカバースリップにCD45+およびCD31+細胞(ウェルあたり30,000細胞あたり30,000細胞)を選別して濃縮する(細胞を24ウェルプレートのカバースリップに直接均等に堆積させるために使用される方法)。+ +
- 冷たいアセトンで細胞を15分間固定し、PBSで3倍洗います。
- 10%ヤギの血清のスライドをブロックします。一次抗体を一晩でインキュベートするスライド (表 2)。
- PBSでスライド3倍を洗います。2hの二次抗体をインキュベートする(表2)。
- カウンターステインスライド、およびスローフェードマウントメディアでDAPIのワンドロップでマウントします。
- FACSの人口純度分析: MEFSK4プローブ (図 3B)
- 25 μLのFCブロッカー溶液で、分離し直した細胞を再懸濁して、抗体の非特異的結合を防止します。RTで5分間インキュベートします。
- 任意:細胞懸濁液に7AADまたはゴースト染料510の25 μLを加えます。暗闇の中で氷の上で30〜60分間インキュベートします。
- 1 mLのFACSバッファーで再懸濁して洗浄します。500 x gで 5 分間の遠心分離機。
- ペレットを50 μLのFACSバッファに再懸濁します。MEFSK4抗体を細胞懸濁液に直接加えます。氷上で15分間インキュベート(表1)
- 1 mLのFACSバッファーで再懸濁して洗浄します。400 x gで 5 分間遠心分離機。
- ラット IgG-APC を細胞に加える (表 1)。氷の上で30分間インキュベートします。
- 1 mLのFACSバッファーで再懸濁して洗浄します。400 x gで 5 分間遠心分離機。
- FACSバッファ(300 μL)の推奨フローサイトメトリーサンプル量でペレットを再懸濁し、フロー分析のためにフローサイトメトリーチューブに転送します。
- 繊維芽細胞純度分析: 半定量リアルタイム rtPCR (図 3C)
- RNAの分離と半定量的リアルタイム PCR
- 線維芽細胞の濃縮に続いて、RNA分離キットを使用してRNAを単離する(材料表を参照)。製造元の指示に従います。
- cDNA合成キットを使用した最初の鎖DNA合成を完了します(材料表を参照)、メーカーの指示に従ってください。
- 半定量的リアルタイム PCR5を実行します。
- 線維芽細胞機能解析:コラーゲンゲル収縮性アッセイ(図4)
- コラーゲン溶液
- DMEMで20 mM HEPESと44 mM NaHCO3を準備します。ヘペスとNaHCO3とDMEMの1 mLあたり1ラットコラーゲンの1.67mgを追加します。
- TGFβ補充 DMEM
- 抗生物質と抗真菌剤を補ったDMEMで10%FBSを調製する。最終濃度の1 ng/mLにTGFβを加えます。
- 細胞/コラーゲン混合物およびめっき
- 細胞懸濁液(P3-P5)を調製し、3.3 x 105細胞を得るために必要な体積を決定する。
- 3.3 x 105細胞の懸濁液を十分なコラーゲン溶液に加えるとともに、合計1mLの体積を得る。
注:ラットコラーゲンタイプ1濃度は1.5mg/mLになります。 - 48ウェルプレートでは、1ウェルあたり300μLの細胞-コラーゲンミックス(〜1 x 105細胞/ウェル)を混合します。37°Cで15~20分間インキュベートして、ゲル化するまでインキュベートします。
- 30G針を使用して、ゲルを井戸壁から分離します。TGFβとFBSの600 μLを各ウェルに加えます。反射スキャナー上のイメージプレートは24時間と48時間です。
注:すべての免疫蛍光実験は、3つのレーザー(405 nm、488 nm、および640 nm)を搭載したフローサイトメトリーマシン上で行われました。データはフローデータ取得ソフトウェアを使用して取得されました (資料一覧)。さらに、フローデータ解析ソフトを用いてデータ解析を行った。AlexaFluor 405とゴーストダイバイオレット510は405 nmレーザーで励起し、それぞれ450/50 BPと525/50 BPフィルタを使用して収集しました。GFPとPEは488 nmレーザーで励起され、それぞれ530/30 BPおよび575/26 BPフィルターを使用して収集された。APCまたはAlexaFluor 647は640 nmレーザーで励起され、670/14 BPフィルターを使用して収集された。全ての細胞選別実験は、4つのレーザー(405nm、488 nm、561 nmおよび640 nm)を搭載したフローサイトメトリーマシン(材料表)上で行った。7-AADは561 nmレーザーを使用して励起され、670/14 BPフィルターで収集された。GFPとゴーストダイバイオレット510は、上記と同じレーザー/フィルターの組み合わせを使用して収集した。すべての選別実験では、17個のpsi圧力構成を備えた100umノズルを利用して、標的細胞の下流生存率を高める。
- コラーゲン溶液
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Representative Results
αSMA-GFPレポーターマウスを用いた筋線維芽細胞の分離を実証するフロー・ガッティング・スキーム
傷つけていない心臓は、αSMA-GFPレポーターマウスモデルで検出可能なGFP+細胞を示さなかった。したがって、GFPチャネルポスト補償のバックグラウンド信号のゲートを確立するために使用されました(図2)。αSMA+細胞は、MIの10日後に負傷した左心室からのGFP発現の存在に基づいて選別した。内皮のごく一部 (GFP+/CD31+ 細胞;SD = 3.8% ± 0.0164;n = 5) および造血 (GFP+/CD45+ 細胞;SD = 3.18% ± 0.0112;n = 5) 細胞は、負傷したαSMA-GFPマウスの心臓においてもGFPを発現した(図2A)。しかし、GFP+/CD31-/CD45-細胞はAN2、ペリサイトマーカーを発現しなかった。
負傷していない(静止)および負傷(活性化、αSMA+GFP+)細胞は線維芽細胞マーカーを発現した
αSMA-GFPマウスから単離されたGFP+細胞は、αSMA、コラーゲン1型α-1鎖(COL1α1)、ビメンチン、およびペリオスチンをIF分析により分析した。選択的接着によって単離された傷ついていない線維芽細胞はビメンチンを発現したが、活性化線維芽細胞マーカーの発現を実証しなかった:αSMA、ペリオスチン、およびCOL1α1(図3A)。フロー解析により解析した場合、無傷の線維芽細胞と活性化線維芽細胞の両方がMEFSK4抗原を発現した(図3B)。傷つけていないマウスの細胞から磁気的に単離されたMEFSK4+ve細胞は、線維芽細胞のマーカーを発現した:Col1a1、pdgfrα、およびペリオスチン。これに対し、磁気的に単離されたCD45およびCD31陽性細胞は、線維芽細胞マーカーの発現がごくわずかである。
線維芽細胞と筋線維芽細胞は、コラーゲンを収縮する能力を実証した
硬質プラスチック上の細胞培養において、線維芽細胞はTGFβの存在下でコラーゲンゲルを収縮させることが示されており、収縮13,14,14のそれらの機能能力を実証している。線維芽細胞のこのインビトロ特性は、組織修復中に起こる結合組織の収縮と他の生物学的プロセスと非常によく似ています。いずれも、負傷していない線維芽細胞は、選択的接着によって単離され、筋線維芽細胞と、αSMA-GFPマウスから単離および選別され、コラーゲンを収縮させる能力を示した(図4)。
図1:3つの異なるアプローチを用いた線維芽細胞の分離の概略図。(A)差動めっき、(B)αSMA陽性細胞のGFP+細胞選別、および(C)線維芽細胞の磁気ビーズベースの単離。細胞の代表的な明るいフィールドは、次いでの培養で、微分めっきに続く。スケールバー= 50 μM.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:MIに続くαSMA-GFPマウス心臓から単離された単一細胞のFACS分析。(A)ΑSMA-GFPマウスからCD31、CD45、またはAN2を同時発現させるGFP+細胞を示すFACS格子化スキームの代表は、心筋梗塞(MI)の10日後に心臓を負傷させた。(B) ポスト MI 心臓に対して提示された FACS データのグラフィカルな定量化。n = 5つの実験を独立して行った(Tukeyの多重比較検定を用いた一方向ANOVAを用いて計算した***p<0.0001)。この図は、サラスワティら10から適応しています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:傷つかずのマウスの心臓から分離された線維芽細胞の純度分析。(A)負傷していない心臓からの細胞集団(P0)の免疫蛍光染色、またはFACSによって分類されたαSMA-GFPマウスを負傷させた。いずれも、負傷していない細胞および活性化細胞はいずれも、COL1α1、ビメンチンなどの線維芽細胞(FB)マーカーを発現するが、造血マーカーCD45や内皮マーカーCD31ではない。負傷したαSMA-GFPマウスから分離された細胞は、心臓を活性化線維芽細胞マーカー、αSMA、およびペリオスチンを発現し、これは、傷ついていないマウスの心臓から単離された細胞には存在しなかった。核をDAPIで染色し、n=3実験を独立して行った。スケールバー=100μm(B)代表FACSは、線維芽細胞マーカーMEF-SK4の発現を示す、傷つかずの活性化線維芽細胞(P3-P5)のヒストグラムをオーバーレイする。B陰性対照のために、ラットIgGを使用し、n=2実験を独立して実施した。(C)傷つけていないMEKSK4+ve線維芽細胞におけるCol1α1、Pdgfrα、およびポステン転写物の相対折り畳み変化を、n=3実験を独立して行った(*p< 0.05 Tukeyの多重比較検定を用いて双方向ANOVAを用いて計算した)。 Pdgfrα(A)および(B)は、サラスワティら10から適応される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:傷つかずのマウス心臓から分離された線維芽細胞の機能的特徴付け負傷していない、および負傷した活性化αSMA+線維芽細胞(P3-P5)の存在下でのコラーゲンゲル収縮の代表的な図。グラフは、負傷せず、負傷した活性化されたαSMA+線維芽細胞と共にインキュベートした場合の収縮の24時間および48時間後の初期ゲル領域における割合変化を表し、n=2実験を独立して実施した。この図は、サラスワティら10から適応しています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 抗体 | セルターゲット | 希釈 |
| 7AAD | 死んだ細胞 | 1:1000 |
| ゴースト染料バイオレット510 | 死んだ細胞 | 1:1000 |
| APC-CD45 | 造血細胞 | 1:200 |
| PE-CD31 | 内皮細胞 | 1:200 |
| 反AN2/NG2 | ペリサイト | 1:11 |
| ロバアンチラットアレクサフルーオール405 | 二次抗体 | 1:100 |
| 抗フィーダー細胞 -APC (MEFSK4) | 線 維 芽 細胞 | 1:100 |
| ラット IgG-APC | アイソタイプコントロール | 1:100 |
表1:FACS染料及び抗体。
| 一次抗体 | 希釈 | |
| α平滑筋アクチン(αSMA) | 1:1000 | |
| 線維芽細胞特異的タンパク質1(FSP1)1:250 | 1:100 | |
| コル 1α1 | 1:1000 | |
| ペリオスチン | 1:100 | |
| ビメンチン | 1:200 | |
| CD31 | 1:250 | |
| CD45 | 1:250 | |
| 二次抗体 | 希釈 | |
| ヤギアンチマウスアレクサフルオール488 | 1:200 | |
| ヤギの抗ウサギ-FITC | 1:200 | |
| ヤギの抗ウサギ-Cy3 | 1:200 | |
| ヤギアンチラットアレクサフルオール488 | 1:200 | |
| ヤギアンチラットアレクサフルオール647 | 1:200 | |
表2:免疫蛍光原第二抗体。
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Discussion
線維芽細胞は、細胞の異種群であり、多様なマーカーの集合によって同定される。線維芽細胞の同定に用いられてきたタンパク質マーカーは、フィディスコジジンドメイン受容体2(DDR2)、フィブロネクチン、ビメンチン、コラーゲンIおよびIII、およびthy1 15、16、17、18、19、20である。15,16,17,18,19,20ビメンチンは、損傷していない静止性心筋線維芽細胞を同定するために使用されてきたのに対し、線維芽細胞特異的タンパク質1、αSMA、およびペリオスチンは傷害誘発性活性化線維芽細胞を同定することが示されており、αSMAは活性化線維芽細胞66、12、2112,21を検出する最も一般的なマーカーである。さらに、Tcf21およびMEFSK4タンパク質は、傷害されていない心臓組織に見られる静止線維芽細胞と、負傷したマウス心臓21,22に見られる筋線維芽細胞を含む活性化線維芽細胞の両方を認識する上で最近の認識を22得ている。
このプロトコルは、線維芽細胞および活性化線維芽細胞を含む活性化線維芽細胞を分離し、豊かにするための3つの異なるアプローチを利用する。プラスチックに優先的に付着する線維芽細胞の能力は、分離のための最初のアプローチで使用されます。リベラーによる酵素消化に続いて、細胞の単一細胞懸濁液をプラスチック皿に播種して優先的に付着させる。多くの非線維芽細胞がペトリ皿のポリスチレン表面に付着できないことにより、私たちは皿からすべての培地を取り除き、線維芽細胞の比較的純粋な集団にとどまることができます。この技術を用いることの注意点は、線維芽細胞がポリスチレン皿に優先的に付着するが、いくつかの汚染非線維芽細胞も付着し、細胞の非均質な集団を残すことである。
第2の分離技術は、FACSを利用して、筋線維芽細胞を発現するαSMAを他の細胞から分離する。ここで用いるトランスジェニックマウスモデルでは、GFPはαSMAと一緒に排他的に発現されるため、αSMAを含む筋線維芽細胞はGFPの蛍光能力を通じてFACSマシンによって検出することができる。この分離手順により、約99%の筋線維芽細胞である細胞の集団を得ることが可能になります。これらの細胞の純度分析は、サラスワティら10によって広く記述されている。
第3の分離技術は、MEFSK4発現細胞の磁気ビーズベースの分離によって、無傷および活性化線維芽細胞の両方を分離する効率的な方法である。単一の細胞懸濁液が抗CD45および抗CD31磁気ビーズに結合し、磁場効果のためにマトリックスに固定化されるようにすることで、造血細胞と内皮細胞の分離が可能になり、線維芽細胞の分離。MEFSK4は最近、線維芽細胞を同定する信頼できるマーカーとして使用されてきたので、MEFSK4発現細胞に結合する抗体を適用することができる。磁気ビーズを抗体に結合した後、線維芽細胞の単離を可能にする複合体を作り出し、磁気ビーズ細胞複合体を磁場中のマトリックスを通過させ、高く富化した線維芽細胞集団を得る。単離された線維芽細胞集団の純度は、免疫染色、RTPCR、およびフローサイトメトリー分析によって評価されるべきである。
他の手法と同様に、この原稿に記載されている技術には制限があります。選択的接着プロトコルと磁気ビーズベースの絶縁の制限は、これらの方法が静止と活性化線維芽細胞を区別しないことである。活性化線維芽細胞を豊かにするためには、心筋梗塞後8~10日の間に分離を行う必要があります。さらに、他の線維芽細胞マーカーとの分離の純度を確認することが重要です。MEFSK4陽性線維芽細胞純度はRTPCRのみで実証されており、造血を含む汚染細胞タイプを認識する他の線維芽細胞マーカーおよびマーカー(CD45)を用いて(免疫染色およびフローサイトメトリー分析による)試験することが推奨される。内皮(CD31)、およびペリサイト(AN2)を含む。可能であれば、他の線維芽細胞特異的マーカーは、線維芽細胞集団をさらに並べ替えまたは磁気的に単離するために使用することができる。
αSMA-GFPマウスを用いて筋線維芽細胞を分離および選別することは、活性化線維芽細胞集団を得るための信頼できる技術である。しかしながら、流動解析では造血細胞および内皮細胞のごく一定の割合が観察されている。この手法を改善するために、CD45+ve/CD31+ve および AN2+ve 細胞を GFP+ve/αSMA+veセルのソートから除外する必要があります。αSMAは筋線維芽細胞の広く認められたマーカーであるため、αSMA-GFPレポーターマウスモデルは、心筋損傷の文脈で筋線維芽細胞を研究するために利用されるべき貴重なツールです。
考慮する必要があるいくつかの重要なトラブルシューティング手順があります。細胞の生存率と収率が影響を受ける場合、消化時間を短縮することができます。これは細胞の生存率に影響を与えるので、攪拌バーは消化混合物をかき混ぜるために使用されるべきではありません。チューブは、優しく消化混合物を攪拌するためにロッカーまたは揺れるインキュベーターに固定する必要があります。消化した組織を5 mLまたは10 mLピペットで10倍再懸濁させることは、細胞の適切な解離のために重要です。
細胞がフローサイトメトリーによって選別または分析される場合、単一細胞懸濁液の適切な赤血球のリシスを利用しなければならない。磁気ビーズの分離のために、列に気泡が入るのを防ぐためにバッファーの脱気が不可欠です。磁気ビーズ細胞分離に使用されるカラムは、異なる磁気ビーズ共役細胞間で再利用してはならない。たとえば、CD45+セルを分離するために新しい列を使用する必要があります、 CD45+セルの溶出後に廃棄する必要があります、 CD31+細胞の分離のための別の新しい列。私たちの手の中では、孤立/選別された線維芽細胞中のペリサイトの汚染は見られていません。しかしながら、MEFSK4は、ペリサイト22を認識することが示されている。したがって、単一細胞からペリサイト(AN2)を選別/磁気的に破壊するために追加のステップを使用することをお勧めします。このプロトコルは12週齢のマウスで検証されるが、この技術は若いマウスまたは古いマウスに使用することができる。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
著者らは、αSMA-GFPマウスに対するイヴォ・カラジッチ博士に感謝したいと考えています。本論文で報告された研究は、国立衛生研究所の国立総合医学研究所(NIH)が、NIHの国立生物医学イメージング・バイオエンジニアリング研究所の賞番号R01GM118300(S.S.)の下で支援を受けました。賞番号R21EB019509(P.P.Y.)、および賞番号17SDG33630187(S.S.)の下で米国心臓協会の科学者育成助成金の下で。フローサイトメトリー分析は、ヴァンダービルト・イングラムがんセンター(P30 CA68485)とヴァンダービルト消化器疾患研究センター(DK058404)が支援するVUMCフローサイトメトリー共有リソースで行われました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Acetone | |||
| Anti-fungal (Amphotericin B-solubilized; Fungizone) | Sigma Aldrich | A9528 | |
| Bovine Serium Albumin (BSA) | Sigma | 9048-46-8 | |
| Calcium chloride | |||
| Citrate Buffer | |||
| Collagenase blend (Liberase Blendzyme 3 TH) | Roche Applied Science | ||
| DAPI | |||
| DDI water | |||
| DI water | |||
| DMEM-F12 with L-Glutamine and HEPES | Life technologies | 11330057 | |
| Dnase I(20U/mL) | BioRad | 7326828 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (dPBS) without Ca2+ and Mg2+ | Gibco | 13190-144 | |
| 70% Ethanol | |||
| FC Blocker (Purified anti-mouse CD16/CD32) | Tonbo Biosciences | 70-0161 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 16000044 | |
| 10% goat serum | |||
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 21-023-CV | |
| 1M HEPES | Corning | 25-060-Ci | |
| Krebs-Henseleit Buffer powder | Sigma | K3753 | |
| Mycoplasma prophylactic (Plasmocin) | Invivogen | ant-mpp | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | |||
| 10x Red Blood Cell Lysis Buffer | Miltenyi | 130-094-183 | |
| Slow-fade Mounting Media | |||
| Sodium azide | |||
| Sodium bicarbonate | |||
| TGFβ | |||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Type 1 Rat Collagen | |||
| Antibodies | |||
| 7AAD (stock: 1 mg/mL solution in DMSO) | Molecular Probes | A1310 | dilution = 1:1000; RRID = |
| CD45-APC | BD Bioscience | 559864 | dilution = 1:200; RRID = AB_398672 |
| CD31-PE | BD Bioscience | 553373 | dilution = 1:200; RRID = AB_394819 |
| CD31 | BD Biosciences | 553370 | dilution = 1:250; RRID = AB_394816 |
| CD45 | BD Biosciences | 553076 | dilution = 1:250; RRID = AB_394606 |
| COL 1α1 | MD Bioproducts | 203002 | dilution = 1:1000; RRID = |
| Ghost dye violet 510 (Formulation: 1 uL/test in DMSO) | Tonbo Biosciences | 13-0870 | dilution = 1:1000; RRID = |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11029 | dilution = 1:200; RRID = AB_138404 |
| Goat anti-rabbit-Cy3 | Southern Biotech | 4050-02 | dilution = 1:200; RRID = AB_2795952 |
| Goat anti-rabbit-FITC | Jackson Immunoresearch Laboratories | 711-165-152 | dilution = 1:200; RRID = AB_2307443 |
| Goat anti-rat Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11006 | dilution = 1:200; RRID = AB_2534074 |
| Goat anti-rat Alexa Fluor 647 | Thermo-Fisher | A21247 | dilution = 1:200; RRID = AB_141778 |
| Periostin | Santa Cruz | SC67233 | dilution = 1:100; RRID = AB_2166650 |
| Vimentin | Sigma Aldrich | V2258 | dilution = 1:200; RRID = AB_261856 |
| α-smooth muscle actin (αSMA) | Sigma Aldrich | A2547 | dilution = 1:1000; RRID = AB_476701 |
| Fibroblast specific protein 1 (FSP1) | Millipore 07-2274 | 07-2274 | dilution = 1:100; RRID = AB_10807552 |
| CD45 Magnetic Beads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| CD31 Magnetic Beads | Miltenyi Biotec | 130-087-418 | |
| Anti-feeder cells-APC (MEFSK4) | Miltenyi Biotec | 130-102-900 | dilution = 1:100; RRID = AB_2660619 |
| anti-APC Beads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| Rat IgG-APC | Miltenyi Biotec | 130-103-034 | dilution = 1:100; RRID = AB_2661598 |
| Donkey anti-rat Alexa Fluor405 | Abcam | ab175670 | dilution = 1:100 |
| anti-AN2/NG2 | Miltenyi Biotec | 130-097-455 | dilution = 1:11; RRID = AB_2651235 |
| Other Materials | |||
| 0.22 µm Filter | Thermo Scientific | 723-2520 | |
| 10 cm2 Cell Culture Dish | Corning | 430167 | |
| 10 mL Pipet | Fisherbrand | 13-678-11E | |
| 40 µm Cell Strainer | Fisherbrand | 22363547 | |
| 5 mL Pipet | Fisherbrand | 13-678-11D | |
| 50 mL Conical Tube | Falcon | 352070 | |
| 6-well Plate | Corning | 3506 | |
| Flow Cytometry Tubes | Falcon | 352058 | |
| Forceps | |||
| Rocker | |||
| Single Edge Blade | PAL | 62-0177 | |
| Surgical Scissors | |||
| GFP-αSMA Reporter Mice | |||
| MACS Separator Magnetic Field | |||
| MACS Separation Column | |||
| Coverslips | |||
| Qaigen Rneasy Mini Kit | Qaigen | 74104 | |
| Ambion RNAqueous Micro Total Isolation Kit | Ambion | AM1931 | |
| BioRad iScript cDNA Syntehsis Kit | BioRad | 1708891 | |
| 48-well Plate | |||
| 30G Needle | |||
| 3 Laser Flow Cytometry Machine (BD LSRFortessa) | BD Biosciences | ||
| 4 Laser Flow Cytometry Machine (BD FACSAria III) | BD Biosciences | ||
| Flow Data Acquiring Software (BD FACSDiva Software v8.0a) | BD Biosciences | ||
| Flow Data Analysis Software (FlowJo Software) | BD Biosciences |
References
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