Summary
A obtenção de uma população pura de fibroblastos é crucial para estudar seu papel na reparação de feridas e fibrose. Descrito aqui é um método detalhado para isolar fibroblastos e miofibroblastos de corações de camundongos ilesos e feridos seguido susceptência de sua pureza e funcionalidade por imunofluorescência, RTPCR, triagem celular assistida por fluorescência, e contração de gel de colágeno.
Abstract
Fibrose cardíaca em resposta à lesão é uma resposta fisiológica à cicatrização de feridas. Esforços têm sido feitos para estudar e direcionar subtipos de fibroblastos que mitigam a fibrose. No entanto, a pesquisa de fibroblastos tem sido dificultada devido à falta de marcadores de fibroblastos universalmente aceitáveis para identificar quiescentes, bem como fibroblastos ativados. Os fibroblastos são uma população de células heterogêgenas, tornando-os difíceis de isolar e caracterizar. O protocolo apresentado descreve três métodos diferentes para enriquecer fibroblastos e miofibroblastos de corações de camundongos ilesos e feridos. O uso de um protocolo padrão e confiável para isolar fibroblastos permitirá o estudo de seus papéis na homeostase, bem como na modulação da fibrose.
Introduction
Fibroblastos cardíacos, células de origem mesenquimal, desempenham um papel significativo na manutenção da condução elétrica e forças mecânicas no coração, além da manutenção da arquitetura cardíaca durante a homeostase1. Após a lesão, essas células são ativadas, expandem e produzem proteínas de matriz extracelular (ECM)2. Muitos estudos pré-clínicos revelaram os fibroblastos como reguladores celulares críticos que mantêm a integridade estrutural de um coração ferido3, bem como as principais células eficazes responsáveis pela produção e deposição de proteínas ECM não controladas, resultando em formação de cicatrizes rígidas e insuficiência cardíaca4. Os fibroblastos são um grupo heterogêneo de células, tornando desafiador dissecar sua função reparadora de propriedades antiadaptativas pró-fibroticas. Recentemente, foi definida a heterogeneidade funcional de dois subtipos distintos de fibroblastos após lesão do miocárdio, indicando a possibilidade de isolar diferentes subtipos de fibroblastos e estudar seu papel na cicatrização de feridas5.
A obtenção de uma população pura de fibroblastos é crucial para delinear seu papel funcional na reparação e fibrose. No entanto, a presença de múltiplos marcadores de fibroblastos que reconhecem outros tipos de células torna difícil isolar uma população de fibroblastos substancialmente pura6. Vários estudos elegantes criaram maneiras inteligentes de isolar fibroblastos cardíacos de miocárdio ileso e ferido. O método mais popular e bem estabelecido de enriquecer fibroblastos é através de adesão seletiva após digestão de tecido enzimático7.
Além disso, a classificação celular ativada por fluorescência (FACS) de fibroblastos baseados em antígenos de superfície celular foi descrita com sucesso8. No estudo, após a digestão enzimática, as células mesenquimais foram classificadas como linhagem-negativa (Lin: Ter119−CD45−CD31−) e gp38-positivo (gp38+) de corações de rato. As células Gp38+ve foram confirmadas como fibroblastos com base em sua co-expressão de col1α1 e outros marcadores mesenquimais. Embora a maior parte da digestão tecidual seja concluída após dissecar o ventrículo em uma placa de Petri, um estudo recente investigou o uso de uma perfusão direta de enzima de agulha do ventrículo esquerdo para isolar miócitos e não-miócitos que incluem fibroblastos9. Os fibroblastos foram então isolados por adesão seletiva neste caso.
Este protocolo descreve o isolamento e o enriquecimento de fibroblastos usando três métodos. O primeiro é um método já estabelecido envolvendo a adesão seletiva de fibroblastos após digestão enzimática. O segundo método é usado para isolar principalmente o músculo alfa liso induzido por lesões expressando miofibroblastos. O terceiro método envolve o esgotamento sequencial e magnético de uma suspensão celular cardíaca digerida por enzimas de células hematopoiéticas e endoteliais. Após o esgotamento, fibroblastos/miofibroblastos são isolados com base na presença do antígeno MEFSK4 usando contas magnéticas. Recentemente, MEFSK4 foi descrito como um antígeno presente em quiescente, bem como fibroblastos ativados, tornando-se um marcador adequado para identificação e isolamento de fibroblastos. Naturalmente, todos os métodos descritos aqui têm limitações únicas. Por isso, é altamente recomendável verificar a pureza da população celular isolada por análise de fluxo, imunocoloração e PCR semi-quantitativo em tempo real. No entanto, essas metodologias podem ser expandidas, e marcadores adicionais podem ser adicionados a fim de excluir outras populações contaminantes antes de utilizar as populações de fibroblastos e miofibroblastos para experimentos cruciais.
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Protocol
Este estudo mantém rigorosamente as recomendações do Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde. O Comitê de Cuidados e Uso Institucional de Animais da Universidade Vanderbilt aprovou o protocolo (número de protocolo: M1600076-01).
1. Dissecção do coração
- Preparação da solução
- Tampão KHB
- Usando uma barra de agitação, dissolva lentamente 9,4 g de tampão Krebs-Henseleit (KHB) em pó em 900 mL de água DDI.
NOTA: O buffer se precipitará se for mexido muito rápido ou por muito tempo. O tampão KHB deve estar frio durante o isolamento do fibroblasto. - Adicionar 2,9 mM CaCl2 e 24 mM NaHCO3. Ajuste o pH para 7,2-7,3 e diluir para um volume de 1 L com dH2O.
- Utilizando um filtro estéril (0,22 μm), armazene a 4 °C por até 4 semanas. Mantenha-se no gelo ou a 4 °C durante a duração do isolamento.
- Usando uma barra de agitação, dissolva lentamente 9,4 g de tampão Krebs-Henseleit (KHB) em pó em 900 mL de água DDI.
- Coquetel de digestão colagenase
- Prepare o coquetel de digestão no dia do isolamento do fibroblasto. Determinar o volume adequado do coquetel de digestão de acordo com o número de corações; 5 mL de coquetel por 1 coração.
- Prepare a mistura de colagem (ver Tabela de Materiais) e DNase I de acordo com as instruções do fabricante.
- Para 20 mL de coquetel de digestão total, adicione 17,5 μL de DNase I, 180 μL de 1 M HEPES e 500 μL de colagem a um tubo cônico vazio de 50 mL.
- Adicione um volume suficiente da solução de Sal Balanceado da Hank (HBSS) com Ca2+ e Mg2+ para obter um volume total de 20 mL.
- Tampão de lse de glóbulos vermelhos (RBC)
- Determine o volume total necessário com base no número de corações (5 mL/coração). Diluir o buffer de estoque de lysis rbc 10x para 1x usando dH2O.
- Mídia fibroblasto: 10% FBS no DMEM F-12
- Adicione 10% de FBS ao DMEM-F12 com L-glutamina e HEPES. Adicionar 10 Penicilina/estreptomicina 10 U/mL, 2,5 μg/mL antifúngico e 2,5 μg/mL profilático de mycoplasma (ver Tabela de Materiais). Armazene a 4 °C.
- Tampão KHB
- Dissecção cardíaca
- Prepare uma placa de 6 poços no gelo com 2 mL de KHB frio por poço para armazenar corações durante a dissecção. Utilize tesouras cirúrgicas e fórceps autoclaved.
- Eutanásia de camundongos com 12 semanas de idade ou mais por overdose de isoflurano, e seguir com luxação cervical.
- Alternativamente, para o isolamento ativado do fibroblasto, induzir o infarto do miocárdio em camundongos de 12 semanas de idade por ligadura da artéria coronária10. Eutanie os ratos 8-10 dias após a lesão.
- Corpo de pulverização com 70% de etanol e oriente para que o lado ventral esteja voltado para o experimentador. Pino ou conter apêndices para evitar interferências.
- Corte a pele abdominal e os músculos abertos, mas evite perfurar o fígado. Corte verticalmente em direção ao esterno e abra cuidadosamente o tórax, evitando perfurar o coração. Continue a cortar a caixa torácica para expor o coração.
- Usando fórceps, levante suavemente o coração para fora do peito, cortando qualquer pulmão ou tecido em excesso ligado à parte externa do coração. Retire o ventrículo e coloque em um poço de 6 bem com KHB frio. Continue a dissecar corações desta maneira até que todas as amostras tenham sido isoladas.
- Dissociação enzimática do coração
- Usando fórceps, aperte repetidamente e agite o coração em KHB para remover o excesso de sangue. Transfira o coração para uma placa de 10 cm2 estéril limpa. Usando uma única lâmina de borda, pique rapidamente o coração em pequenos pedaços.
- Adicione 1 mL de coquetel de digestão colagenase e continue picando até que as peças sejam pequenas o suficiente para transferir com uma micropipette de 1 mL. Transfira as peças para um tubo cônico de 50 mL com uma micropipete de 1 mL. Placa de lavagem 2x com 2 mL de coquetel de digestão colagenase.
NOTA: Cortar uma parte da ponta da pipeta pode ajudar a coletar pedaços maiores de coração que podem ficar presos na ponta da pipeta. - Incubar tubo cônico a 37 °C por 30 min com balanço ou agitação. Tubo de fixação conforme necessário. Refique 10x com uma tubulação de 5 mL até que o conteúdo seja homogêneo e incuba ruminar o tubo cônico a 37 °C por 15 min com rotação ou agitação.
- Refique 10x com uma pipeta de 10 mL até ficar homogêneo. Cubra um filtro de células de 40 μm, mumendo o filtro com 1-2 mL de tampão KHB em cima de um novo tubo cônico de 50 mL. Adicione 25 mL de tampão KHB à suspensão de digestão, resuspenda e filtre através de um filtro de células de 40 μm. Mude o filtro conforme necessário.
NOTA: À medida que a filtragem diminui, tocar levemente o tubo ou usar uma micropipeta de 1 mL para retirar a suspensão da parte inferior do filtro pode ajudar a suspensão celular a passar por um filtro de células parcialmente bloqueado de 40 μm. - Centrifugação a 400 x g e 4 °C por 10 min. Remova o sobrenadante e resuspenda a pelota em 1x tampão de lyse RBC (5 mL/coração). Incubar por 2 min à temperatura ambiente (RT).
- Centrifugação a 400 x g e RT por 10 min. Remova o sobrenadante e depois lave resuspendendo a pelota em 1 mL de tampão KHB.
- Adicione 9 mL de tampão KHB e filtre através do filtro de células de 40 μm em novo tubo cônico de 50 mL. Centrífuga a 400 x g e RT por 10 min.
- Remova o sobrenadante, resuspenda em 1 mL de mídia fibroblasto ou PBS e determine o número da célula. Fibroblastos podem ser isolados pelos três métodos diferentes descritos abaixo.
2. Isolamento de fibroblastos de suspensão de célula única
- Isolamento fibroblasto: revestimento diferencial(Figura 1)
- Prepare uma placa de 6 poços adicionando 2 mL de mídia fibroblasto por poço e girando a placa para cobrir o fundo do poço.
- Resuspender células em 1 mL de mídia por coração. Placa de 1 mL de suspensão celular por poço de tal forma que um coração (teoricamente) está sendo banhado por poço. Por exemplo, seis corações seriam resuspensos em 6 mL de mídia, depois banhados em seis poços com 1 mL de suspensão celular por poço.
- Placa de redemoinho para distribuir uniformemente as células. Adicione uma mídia adicional de 1-2 mL por poço para um volume total de até 5 mL por poço e incubar a 37 °C por 4 h.
- Os fibroblastos serão separados por adesão seletiva após 4 h. Remova células não ligadas e mortas removendo a mídia. Lave as células anexadas com 2 mL de PBS e adicione 2-4 mL de mídia fibroblasta estéril por poço. Incubar a 37 °C até confluente. Mude a mídia a cada 2 ou 4 dias.
- Isolamento fibroblasto: FACS usando um modelo de mouse repórter GFP (Figura 1)
- Buffer FACS
- Preparar 15 mL de 5% de soro bovino fetal (FBS) em dPBS sem Ca2+ e Mg2+. Armazene no gelo ou a 4°C.
- Solução de bloqueador fc
- Prepare o bloqueador FC de 0,5 μL (cd16/CD32 anti-mouse purificado) em 25 μL de FACS (diluição de 1:50). 25 μL de solução bloqueadora FC é necessária por amostra. Armazene no gelo ou a 4 °C.
- Preparação da amostra e coloração de anticorpos
NOTA: As diluições de anticorpos podem ser preparadas com antecedência, mas isso pode arriscar a exposição à luz ou à temperatura.- Prepare 7AAD ou corantes fantasma violeta 510 que é 2x a diluição necessária no tampão FACS. Consulte a Tabela 1 para anticorpos e diluições.
- Resuspender 500.000 células recém-isoladas em 25 μL de solução bloqueadora FC para evitar a vinculação inespecífica da região de anticorpos FC a um receptor FC. Incubar por 5 min no RT.
- Adicione 7AAD ou corantes ghost violeta 510 ao volume final de 25 μL de suspensão celular. Incubar por 30-60 min no gelo no escuro.
- Lave-se resuspendendo em 1 mL de tampão FACS. Centrífuga a 500 x g por 5 min a 4°C.
- Ressuspensão da pelota no volume de amostra de citometria de fluxo recomendado do tampão FACS (300 μL) e transferência para tubo de citometria de fluxo.
- Classificação celular ativada por fluorescência (FACS)
NOTA: Os ratos repórteres da GFP-αSMA foram uma contribuição do Dr. Ivo Kalajzic11. Este rato expressa GFP o promotor alfa de células musculares lisas (αSMA). αSMA tem sido usado como um marcador de fibroblastos ativados (miofibroblastos)12.- Para isolamento ativado do fibroblasto (αSMA expressando miofibroblasto), induzir o infarto do miocárdio em camundongos GFP-αSMA de 12 semanas de idade por ligadura da artéria coronária. Sacrifique os ratos 8-10 dias após a lesão.
- Após a suspensão de células únicas dos corações dos camundongos feridos, classifique αSMA+ve fibroblastos para proteína fluorescente verde (GFP). Use fibroblastos não contaminados para definir o sinal de fundo no canal GFP após a compensação.
- Portão para células GFP ao vivo+ve gating para 7AAD-ve/GFP+ve células ou corante fantasma violeta 510-ve/GFP+ve células e classificar GFP expressando αSMA+ve miofibroblastos. Colete as células na mídia de fibroblastos.
- Buffer FACS
- Isolamento do fibroblasto: isolamento magnético baseado em miomas(Figura 1)
- Tampão de equilíbrio
NOTA: Prepare sempre o buffer fresco para isolamentos.- Preparar 0,5% BSA e 2 mM EDTA em PBS. Desgase o tampão mexendo a solução enquanto prende um vácuo na tampa do recipiente.
NOTA: A agitação remove o excesso de gás da solução que é então removida através do vácuo de tal forma que as bolhas não entupam a coluna de separação após o uso.
- Preparar 0,5% BSA e 2 mM EDTA em PBS. Desgase o tampão mexendo a solução enquanto prende um vácuo na tampa do recipiente.
- Rotulagem magnética: CD45+ células hematopoiéticas
- Centrifugação isolada células de corações de camundongos a 500 x g por 5 min, em seguida, remova o sobrenadante.
- Resuspenda a pelota celular em 1 mL de tampão de equilíbrio. Conte as células usando um hemocytometro.
- Centrifugar a suspensão celular como acima e resuspender a pelota celular em tampão de equilíbrio de 90 μL por 1 x 107 células totais. Adicione 10 μL de CD45+ contas magnéticas por 1 x 107 células totais. Misture bem e incubar por pelo menos 15 min a 4°C.
- Lave as células adicionando 2 mL de tampão de equilíbrio por 1 x 107 células totais, em seguida, centrífuga a 500 x g para 10 min a 4°C.
- Remova o sobrenadante, conte as células usando um hemocytometro e resuspenda até 1 x 107 células totais em 2 mL de tampão de equilíbrio. Se houver mais de 107 células, dimensione o buffer linearmente. Passe as células através de um filtro de 40 μm para evitar que as agregações celulares obstruam a matriz da coluna de separação.
- Separação magnética: CD45+ células hematopoiéticas
- Coloque a coluna de separação no campo magnético de um separador adequado e equilibre a coluna com pelo menos 3 mL de PBS.
- Coletar células não rotuladas no fluxo (FT) e lavar a coluna 3x com 3 mL de tampão de equilíbrio. Coletar lava-ouças com FT. Remova a coluna do separador. Coloque a coluna em um tubo cônico de 15 mL.
- Limpe as células CD45+ rotuladas magneticamente, pipetando 5 mL de tampão de equilíbrio na coluna e mergulhando firmemente as células com um êmbolo fornecido com a coluna.
- Centrífuga eluente, bem como frações ft/lavagem a 500 x g. Conte as células usando um hemocytometro.
- Rotulagem magnética e separação: CD31+ células endoteliais
- Repetir protocolo para CD45+ rotulagem magnética e separação (seções 2.3.2-2.3.3), exceto usar CD31+ contas magnéticas para incubar com o FT e lavar porções do isolamento CD45+ .
- Rotulagem magnética e separação: MEFSK4+ fibroblastos
- Repetir protocolo para rotulagem magnética CD45+ usando o anticorpo antialimentador-APC MEFSK4 em vez de contas magnéticas. Centrifugar as porções FT e Wash do CD31+ isolamento a 500 × g por 5 min, em seguida, remover sobrenadante. Ressuspensa a pelota celular em 1 mL de tampão de equilíbrio e conte as células usando um hemocytometro.
- Adicione 10 μL de anticorpo antialimentador-APC MEFSK4 por 1 x 107 células. Incubar por pelo menos 15 min a 4 °C.
- Lave as células ligadas ao anticorpo MEFSK4 adicionando 5 mL de tampão de equilíbrio por 1 x 107 células totais, depois centrífuga a 500 x g por 5 min.
- Remova o sobrenadante e resuspenda em contas anti-APC, usando o mesmo volume do anticorpo antialimentador-APC MEFSK4 usado. Incubar no gelo por 15 min a 4 °C.
- Centrifugação a 500 x g por 10 min. Remova o sobrenadante, resuspenda em 2 mL de tampão de equilíbrio por 1 x 107 células totais e prossiga com a separação magnética como descrito anteriormente (seção 2.3.3). Fibroblastos MEFSK4+ve/CD45-ve/CD31-ve podem ser usados para análises de pureza e outras aplicações a jusante.
- Tampão de equilíbrio
3. Análise de pureza e funcionalidade da população isolada de fibroblastos
- Análise da pureza populacional facs: análise celular αSMA-GFP (Figura 2)
- Resuspender células recém-isoladas em 25 μL de solução bloqueadora Fc para evitar a vinculação inespecífica de anticorpos. Incubar por 5 min no RT.
- Opcional: adicione 25 μL de 7AAD ou corantes Fantasma violeta 510 à suspensão celular. Incubar por 30-60 min no gelo no escuro.
- Lave-se resuspendendo em 1 mL de tampão FACS. Centrífuga a 500 x g por 5 min.
- Ressuspensão da pelota em 50 μL de tampão FACS. Adicione anticorpos CD31-PE, CD45-APC e AN2/NG2 diretamente à suspensão celular. Incubar por 15 min no gelo(Tabela 1).
- Lave-o ressuspensa em tampão FACS de 1 mL. Centrífuga a 400 x g por 5 min.
- Adicione o anticorpo secundário alexafluor 405 de burro às células rotuladas com anticorpo primário não conjugado. Incubar por 30 min no gelo.
- Lave-se resuspendendo em 1 mL de tampão FACS. Centrífuga a 400 x g por 5 min.
- Ressuspensão da pelota no volume de amostra de citometria de fluxo recomendado do tampão FACS (300 μL) e transferência para um tubo de citometria de fluxo rotulado para análise de fluxo.
NOTA: A análise facs para caracterizar a expressão do antígeno MEFSK4 em fibroblastos isolados é descrita na seção 3.3.
- Análise de pureza fibroblasto: imunofluorescência(Figura 3A)
- Sementes 30.000 fibroblastos primários (P0-P1) por poço em tampas colocadas em uma placa de 24 poços e cultura até 80% de confluente. Ou concentrar células classificadas CD45+ e CD31+ (30.000 células por poço) em um deslizamento de cobertura por citospin a 400 x× g (um método usado para depositar células diretamente e uniformemente em um deslizamento de cobertura em uma placa de poço de 24).
- Fixar células com acetona fria por 15 min. Lave 3x vezes com PBS.
- Bloqueie os deslizamentos em soro de cabra de 10%. Incubar slides com anticorpos primários durante a noite(Tabela 2).
- Lave slides 3x na PBS. Incubar anticorpos secundários para 2 h(Tabela 2).
- Deslizamentos de contra-mancha e montagem com uma gota de DAPI em mídia de montagem lenta.
- Análise de pureza populacional facs: sondagem MEFSK4 (Figura 3B)
- Resuspender células recém-isoladas em 25 μL de solução bloqueadora FC para evitar a vinculação inespecífica de anticorpos. Incubar por 5 min no RT.
- Opcional: adicione 25 μL de 7AAD ou corantes Fantasma violeta 510 à suspensão celular. Incubar por 30-60 min no gelo no escuro.
- Lave-se resuspendendo em 1 mL de tampão FACS. Centrífuga a 500 x g por 5 min.
- Ressuspensão da pelota em 50 μL de tampão FACS. Adicione o anticorpo MEFSK4 diretamente à suspensão celular. Incubar por 15 min no gelo (Tabela 1).
- Lave-se resuspendendo em 1 mL de tampão FACS. Centrífuga a 400 x g por 5 min.
- Adicionar o rato IgG-APC às células(Tabela 1). Incubar por 30 min no gelo.
- Lave-se resuspendendo em 1 mL de tampão FACS. Centrífuga a 400 x g por 5 min.
- Ressuspensão da pelota no volume de amostra de citometria de fluxo recomendado de tampão FACS (300 μL) e transferência para tubo de citometria de fluxo para análise de fluxo.
- Análise de pureza fibroblasto: semi-quantitativo em tempo real rtPCR(Figura 3C)
- Isolamento de RNA e PCR semiquantitativo em tempo real
- Após o enriquecimento de fibroblastos, isole o RNA usando um kit de isolamento de RNA (ver Tabela de Materiais). Siga as instruções do fabricante.
- Complete a síntese de DNA da primeira cadeia usando um kit de síntese de cDNA (ver Tabela de Materiais),seguindo as instruções do fabricante.
- Realizarpcr5 de tempo real semiquantitativo em tempo real .
- Análise da funcionalidade do fibroblasto: ensaio de contratilidade do gel de colágeno(Figura 4)
- Solução de colágeno
- Prepare 20 mM HEPES e 44 mM NaHCO3 em DMEM. Adicionar 1,67 mg de colágeno de rato tipo 1 por 1 mL de DMEM com HEPES e NaHCO3.
- DMEM suplementado por TGFβ
- Prepare 10% de FBS em DMEM suplementado com antibióticos e antifúngicos. Adicione TGFβ a uma concentração final de 1 ng/mL.
- Mistura celular/colágeno e chapeamento
- Preparar a suspensão celular (P3-P5) e determinar o volume necessário para obter 3,3 x 105 células.
- Adicione o volume de suspensão com 3,3 x 105 células à solução de colágeno suficiente para obter 1 mL de volume total.
NOTA: A concentração de colágeno de rato tipo 1 deve agora ser de 1,5 mg/mL. - Em uma placa de 48 poços, semente300 μL de mistura célula-colágeno por poço (~1 x 105 células/bem). Incubar a 37 °C por 15-20 min até gel.
- Use uma agulha de 30 G para ajudar a separar o gel das paredes do poço. Adicione 600 μL de TGFβ e FBS complementado DMEM a cada poço. Placas de imagem em um scanner reflexivo às 24 h e 48 h.
NOTA: Todos os experimentos de imunofluorescência foram realizados em uma máquina de citometria de fluxo equipada com três lasers (405 nm, 488 nm e 640 nm). Os dados foram adquiridos por meio de um software de aquisição de dados de fluxo (Tabela de Materiais). A análise de dados foi realizada por meio de software de análise de dados de fluxo. AlexaFluor 405 e Ghost Dye Violet 510 foram animados com o laser de 405 nm e coletados usando um filtro de 450/50 BP e 525/50 BP, respectivamente. GFP e PE foram animados pelo laser de 488 nm e coletados usando os filtros 530/30 BP e 575/26 BP, respectivamente. APC ou AlexaFluor 647 foram animados pelo laser de 640 nm e coletados usando um filtro de 670/14 BP. Todos os experimentos de triagem celular foram realizados em uma máquina de citometria de fluxo(Tabela de Materiais)equipada com quatro lasers (405 nm, 488 nm, 561 nm e 640 nm). 7-AAD foi animado usando o laser de 561 nm e coletado com um filtro de 670/14 BP. GFP e Ghost Dye Violet 510 foram coletados usando as mesmas combinações laser/filtro descritas acima. Todos os experimentos de classificação utilizaram um bocal de 100 um com uma configuração de pressão de 17 psi para maior viabilidade a jusante das células-alvo.
- Solução de colágeno
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Representative Results
Esquema de gating de fluxo demonstrando isolamento do miofibroblasto usando ratos repórterαSMA-GFP
Corações ilesos não mostraram gfp+ células detectáveis no modelo de mouse repórter αSMA-GFP; por isso, foram utilizados para estabelecer um portão para o sinal de fundo do canal GFP pós-compensação (Figura 2). αSMA+ células foram classificadas com base na presença de expressão gfp do ventrículo esquerdo ferido 10 dias após o IM. Uma pequena porcentagem de células endoteliais (GFP+/CD31+; DP = 3,8% ± 0,0164; n = 5) e hematopoiético (células GFP+/CD45+; DP = 3,18% ± 0,0112; n = 5) as células também expressaram GFP nos corações do rato αSMA-GFP lesionados(Figura 2A). No entanto, as células GFP+/CD31-/CD45 não expressam AN2, um marcador de pericito.
Células não feridas (quiescentes) e feridas (ativadas, αSMA+GFP+) expressaram marcadores de fibroblastos
Células GFP+ isoladas de camundongos αSMA-GFP expressaram αSMA, cadeia alfa-1 alfa-1 tipo colágeno (COL1α1), vimentina e periostina quando analisadas pela análise if. Fibroblastos não feridos isolados por adesão seletiva expressaram vimentina, mas não demonstraram expressão dos marcadores de fibroblastos ativados: αSMA, periostina e COL1α1(Figura 3A). Tanto os fibroblastos não feridos quanto os ativados expressaram o antígeno MEFSK4 quando analisados pela análise de fluxo(Figura 3B). Células MEFSK4+ve magneticamente isoladas de corações de camundongos não feridos expressaram marcadores de fibroblastos: Col1a1, pdgfrα e periostina. Em contraste, as células positivas CD45 e CD31 magneticamente isoladas tinham expressão insignificante de marcadores fibroblastos.
Fibroblastos e miofibroblastos demonstraram a capacidade de contrair colágeno
Na cultura celular em plástico rígido, os fibroblastos têm sido mostrados para contrair géis de colágeno na presença de TGFβ, demonstrando sua capacidade funcional de contração13,14. Esta característica in vitro dos fibroblastos é muito semelhante à contração do tecido conjuntivo que acontece durante a reparação tecidual, bem como outros processos biológicos. Ambos os fibroblastos não feridos, isolados por adesão seletiva, e miofibroblastos, isolados e classificados a partir de camundongos αSMA-GFP, demonstraram uma capacidade de contrair colágeno(Figura 4).
Figura 1: Esquema de isolamento fibroblasto utilizando três abordagens diferentes. (A) revestimento diferencial, (B) triagem celular gfp+ de células αSMA positivas, e (C) isolamento baseado em esferas magnéticas de fibroblastos. Campo brilhante representativo das células na cultura seguindo o revestimento diferencial. Barra de escala = 50 μM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Análise facs de células únicas isoladas dos corações dos camundongos αSMA-GFP após o Mi. (A) O esquema de gating do Representante FACS demonstrando células GFP+ que expressam CD31, CD45 ou AN2 de camundongos αSMA-GFP feriram corações 10 dias após o infarto do miocárdio (MI). (B) Quantificação gráfica dos dados FACS apresentados para corações pós-MI; n = 5 experimentos foram realizados independentemente (***p < 0,0001 conforme calculado utilizando ANOVA unidirecional com o teste de múltiplas comparações de Tukey). Esta figura é adaptada de Saraswati et al.10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Análises de pureza de fibroblastos isolados de corações de camundongos ilesos e feridos. (A) Coloração de imunofluorescência de populações celulares (P0) do coração de camundongos αSMA-GFP feridos classificados pelo FACS. Ambas as células não feridas e ativadas expressam marcadores de fibroblasto (FB), como COL1α1, e vimentina, mas não o marcador hematopoiético CD45 ou o marcador endotelial CD31. Células isoladas do coração dos camundongos αSMA-GFP feridos expressaram marcadores ativados de fibroblastos, αSMA e periostina, que não estavam presentes nas células isoladas de corações de camundongos ilesos. Os núcleos foram manchados com DAPI, n = 3 experimentos foram realizados de forma independente. Barra de escala = 100 μm. (B) Histograma de sobreposição de facs representativos de fibroblastos ilesos e ativados (P3-P5) mostrando a expressão do marcador fibroblasto MEF-SK4. Para um controle negativo, foi utilizado o IgG do rato, n = 2 experimentos foram realizados independentemente. (C) Mudança de dobra relativa de Col1α1, Pdgfrαe Transcrições postn em fibroblastos MEKSK4+ve ilesos, n = 3 experimentos foram realizados independentemente (*p < 0,05 conforme calculado usando ANOVA bidirecional com o teste de múltiplas comparações de Tukey). (A) e (B) são adaptados de Saraswati et al.10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Caracterização funcional de fibroblastos isolados de corações de camundongos ilesos e feridos. Figura representativa da contração do gel de colágeno na presença de αSMA+ fibroblastos ativados ilesas e lesionados (P3-P5). O gráfico representa a mudança percentual na área inicial do gel após 24h e 48 h de contração quando incubado com αSMA + fibroblastos ativadose lesionados, n = 2 experimentos foram realizados independentemente. Esta figura é adaptada de Saraswati et al.10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Anticorpo | Alvo celular | Diluição |
| 7AAD | Células mortas | 1:1000 |
| Corantes fantasmas violeta 510 | Células mortas | 1:1000 |
| APC-CD45 | Células hematopoiéticas | 1:200 |
| PE-CD31 | Células endoteliais | 1:200 |
| anti-AN2/NG2 | Pericitos | 1:11 |
| Burro anti-rato alexa fluor 405 | Anticorpo Secundário | 1:100 |
| Células antialimentadoras-APC (MEFSK4) | Fibroblastos | 1:100 |
| Rato IgG-APC | Controle do Isótipo | 1:100 |
Tabela 1: Corantes facs e anticorpos.
| Anticorpo Primário | Diluição | |
| actina muscular α-lisa (αSMA) | 1:1000 | |
| Proteína específica do fibroblasto 1 (FSP1)1:250 | 1:100 | |
| COL 1α1 | 1:1000 | |
| Periostina | 1:100 | |
| Vimentin | 1:200 | |
| CD31 | 1:250 | |
| CD45 | 1:250 | |
| Anticorpo Secundário | Diluição | |
| Cabra anti-rato Alexa Fluor 488 | 1:200 | |
| Cabra anti-coelho-FITC | 1:200 | |
| Cabra anti-coelho-Cy3 | 1:200 | |
| Bode anti-rato Alexa Fluor 488 | 1:200 | |
| Bode anti-rato Alexa Fluor 647 | 1:200 | |
Tabela 2: Anticorpos primários e secundários de imunofluorescência.
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Discussion
Os fibroblastos são um grupo heterogêneo de células, identificados por diversos conjuntos de marcadores. Os marcadores proteicos utilizados para identificar fibroblastos são receptor de domínio de discoidin a 2 (DDR2), fibronectina, vimentina, colágeno I e III, e Thy115,16,17,18,19,20. Considerando que a vimentina tem sido usada para identificar fibroblastos cardíacos quiescentes não lesados, a proteína específica do fibroblasto 1, αSMA e periostina têm sido demonstradas para identificar fibroblastos ativados induzidos por lesões, sendo αSMA o marcador mais comum para detectar fibroblastos ativados6,12,21. Além disso, as proteínas Tcf21 e MEFSK4 ganharam reconhecimento recente ao reconhecer tanto fibroblastos quiescentes encontrados em tecido cardíaco não lesionado quanto fibroblastos ativados, incluindo miofibroblastos encontrados em corações de camundongos feridos21,22.
Este protocolo utiliza três abordagens diferentes para isolar e enriquecer fibroblastos e fibroblastos ativados, incluindo miofibroblastos. A capacidade do fibroblasto de aderir preferencialmente ao plástico é usada na primeira abordagem para o isolamento. Após a digestão enzimática com liberase, a suspensão celular única das células é semeada em um prato plástico para aderir preferencialmente. A incapacidade de muitas células não-fibroblastos aderirem à superfície de poliestireno dos pratos de Petri nos permite remover todas as mídias do prato e permanecer com uma população relativamente pura de fibroblastos. Uma ressalva do uso desta técnica é que, embora os fibroblastos aderem preferencialmente ao prato de poliestireno, algumas células não fibroblastas contaminantes também podem se anexar, deixando uma população não homogênea de células.
A segunda técnica de isolamento utiliza o FACS para separar αSMA expressando miofibroblastos de outras células. No modelo de mouse transgênico empregado aqui, gfp é exclusivamente expresso juntamente com αSMA, de modo que miofibroblastos contendo αSMA podem ser detectados por uma máquina FACS através das capacidades fluorescentes de GFP. Este procedimento de isolamento nos permite obter uma população de células que é aproximadamente 99% miofibroblasto. As análises de pureza dessas células foram extensivamente descritas por Saraswati et al.10.
A terceira técnica de isolamento é uma maneira eficiente de isolar fibroblastos não feridos e ativados por separação magnética baseada em conta de células expressas MEFSK4. Ao permitir que uma única suspensão celular se ligasse a contas magnéticas anti-CD45 e anti-CD31 e se tornasse imobilizada em uma matriz devido a efeitos de campo magnético, isso permitiu a separação de quaisquer células hematopoiéticas, bem como células endoteliais que possam ter contaminado a isolamento fibroblasto. Como o MEFSK4 foi recentemente usado como um marcador confiável para identificar fibroblastos, um anticorpo que se ligará às células expressas MEFSK4 é capaz de ser aplicado. Depois de ligar uma ferida magnética ao anticorpo, criando um complexo que permite o isolamento de fibroblastos, o complexo magnético de células de ponta é passado através de uma matriz em um campo magnético, e uma população altamente enriquecida de fibroblastos é obtida. A pureza da população isolada de fibroblastos deve ser avaliada por análises de imunocoloração, RTPCR e citometria de fluxo.
Como em qualquer outra técnica, há limitações com as técnicas descritas neste manuscrito. A limitação do protocolo de adesão seletiva e isolamento baseado em contas magnéticas é que esses métodos não diferenciam entre fibroblastos quiescentes e ativados. Para enriquecer fibroblastos ativados, o isolamento deve ser realizado de 8 a 10 dias após o infarto do miocárdio. Além disso, é importante verificar a pureza do isolamento com outros marcadores de fibroblasto. A pureza do fibroblasto positivo MEFSK4 foi demonstrada apenas pela RTPCR, recomenda-se testar (por análise de imunocoloração e citometria de fluxo) com outros marcadores e marcadores de fibroblastos que reconhecem tipos celulares contaminantes, incluindo hematopoietic (CD45), endotelial (CD31) e pericitos (AN2). Se possível, outros marcadores específicos de fibroblasto poderiam ser usados para classificar ou isolar magneticamente a população de fibroblastos.
O uso de camundongos αSMA-GFP para isolar e classificar miofibroblastos é uma técnica confiável para obter uma população ativada de fibroblastos. No entanto, uma porcentagem insignificante de células hematopoiéticas e endoteliais tem sido observada na análise de fluxo. Para melhorar essa técnica, as células CD45+ve/CD31+ve e AN2+ve devem ser excluídas da classificação celular GFP+ve/αSMA+ve. Uma vez que αSMA é um marcador amplamente aceito de miofibroblastos, o modelo de mouse repórter αSMA-GFP é uma ferramenta valiosa que deve ser explorada para estudar miofibroblastos no contexto de lesões do miocárdio.
Existem várias medidas cruciais de solução de problemas que devem ser levadas em conta. O tempo de digestão pode ser reduzido se a viabilidade e o rendimento da célula forem afetados. Uma barra de agitação não deve ser usada para agitar a mistura de digestão, pois isso afeta a viabilidade celular. O tubo deve ser fixado em um roqueiro ou em uma incubadora de agitação para agitar a mistura de digestão suavemente. A resuspensão do tecido digerido 10x com uma pipeta de 5 mL ou 10 mL é crucial para a dissociação adequada das células.
A lse de glóbulos vermelhos adequada da suspensão de células únicas deve ser utilizada se as células forem classificadas ou analisadas por citometria de fluxo. Para o isolamento magnético das contaas, o desgaseamento do tampão é essencial para evitar a introdução de quaisquer bolhas de ar na coluna. A coluna usada para o isolamento de células de abelhas magnéticas não deve ser reutilizada entre diferentes células conjugadas com as abelhas magnéticas. Por exemplo, uma nova coluna deve ser usada para separar as células CD45+, que devem ser descartadas após a elusão das células CD45+ e, em seguida, outra nova para o isolamento celular CD31+ . Em nossas mãos, não vimos contaminação de pericitos em fibroblastos isolados/ordenados. No entanto, o MEFSK4 mostrou-se reconhecer os pericitos22. Recomenda-se, portanto, usar um passo adicional para separar/esgotar magneticamente pericitos (AN2) das células únicas. Embora este protocolo seja validado em camundongos de 12 semanas de idade, a técnica pode ser usada para camundongos mais jovens ou mais velhos.
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Disclosures
Os autores não têm nada para revelar.
Acknowledgments
Os autores querem agradecer ao Dr. Ivo Kalajzic pelos ratos αSMA-GFP. A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) o número de prêmio R01GM118300 (S.S.), Instituto Nacional de Imagem Biomédica e Bioengenharia do NIH o número de prêmio R21EB019509 (P.P.Y.), e Prêmio de Desenvolvimento de Cientistas da American Heart Association o número de prêmio 17SDG33630187 (S.S.). As análises de citometria de fluxo foram realizadas no Recurso Compartilhado de Citometria do Fluxo VUMC, que é apoiado pelo Vanderbilt Ingram Cancer Center (P30 CA68485) e pelo Centro de Pesquisa de Doenças Digestivas vanderbilt (DK058404).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Acetone | |||
| Anti-fungal (Amphotericin B-solubilized; Fungizone) | Sigma Aldrich | A9528 | |
| Bovine Serium Albumin (BSA) | Sigma | 9048-46-8 | |
| Calcium chloride | |||
| Citrate Buffer | |||
| Collagenase blend (Liberase Blendzyme 3 TH) | Roche Applied Science | ||
| DAPI | |||
| DDI water | |||
| DI water | |||
| DMEM-F12 with L-Glutamine and HEPES | Life technologies | 11330057 | |
| Dnase I(20U/mL) | BioRad | 7326828 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (dPBS) without Ca2+ and Mg2+ | Gibco | 13190-144 | |
| 70% Ethanol | |||
| FC Blocker (Purified anti-mouse CD16/CD32) | Tonbo Biosciences | 70-0161 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 16000044 | |
| 10% goat serum | |||
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 21-023-CV | |
| 1M HEPES | Corning | 25-060-Ci | |
| Krebs-Henseleit Buffer powder | Sigma | K3753 | |
| Mycoplasma prophylactic (Plasmocin) | Invivogen | ant-mpp | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | |||
| 10x Red Blood Cell Lysis Buffer | Miltenyi | 130-094-183 | |
| Slow-fade Mounting Media | |||
| Sodium azide | |||
| Sodium bicarbonate | |||
| TGFβ | |||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Type 1 Rat Collagen | |||
| Antibodies | |||
| 7AAD (stock: 1 mg/mL solution in DMSO) | Molecular Probes | A1310 | dilution = 1:1000; RRID = |
| CD45-APC | BD Bioscience | 559864 | dilution = 1:200; RRID = AB_398672 |
| CD31-PE | BD Bioscience | 553373 | dilution = 1:200; RRID = AB_394819 |
| CD31 | BD Biosciences | 553370 | dilution = 1:250; RRID = AB_394816 |
| CD45 | BD Biosciences | 553076 | dilution = 1:250; RRID = AB_394606 |
| COL 1α1 | MD Bioproducts | 203002 | dilution = 1:1000; RRID = |
| Ghost dye violet 510 (Formulation: 1 uL/test in DMSO) | Tonbo Biosciences | 13-0870 | dilution = 1:1000; RRID = |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11029 | dilution = 1:200; RRID = AB_138404 |
| Goat anti-rabbit-Cy3 | Southern Biotech | 4050-02 | dilution = 1:200; RRID = AB_2795952 |
| Goat anti-rabbit-FITC | Jackson Immunoresearch Laboratories | 711-165-152 | dilution = 1:200; RRID = AB_2307443 |
| Goat anti-rat Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11006 | dilution = 1:200; RRID = AB_2534074 |
| Goat anti-rat Alexa Fluor 647 | Thermo-Fisher | A21247 | dilution = 1:200; RRID = AB_141778 |
| Periostin | Santa Cruz | SC67233 | dilution = 1:100; RRID = AB_2166650 |
| Vimentin | Sigma Aldrich | V2258 | dilution = 1:200; RRID = AB_261856 |
| α-smooth muscle actin (αSMA) | Sigma Aldrich | A2547 | dilution = 1:1000; RRID = AB_476701 |
| Fibroblast specific protein 1 (FSP1) | Millipore 07-2274 | 07-2274 | dilution = 1:100; RRID = AB_10807552 |
| CD45 Magnetic Beads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| CD31 Magnetic Beads | Miltenyi Biotec | 130-087-418 | |
| Anti-feeder cells-APC (MEFSK4) | Miltenyi Biotec | 130-102-900 | dilution = 1:100; RRID = AB_2660619 |
| anti-APC Beads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| Rat IgG-APC | Miltenyi Biotec | 130-103-034 | dilution = 1:100; RRID = AB_2661598 |
| Donkey anti-rat Alexa Fluor405 | Abcam | ab175670 | dilution = 1:100 |
| anti-AN2/NG2 | Miltenyi Biotec | 130-097-455 | dilution = 1:11; RRID = AB_2651235 |
| Other Materials | |||
| 0.22 µm Filter | Thermo Scientific | 723-2520 | |
| 10 cm2 Cell Culture Dish | Corning | 430167 | |
| 10 mL Pipet | Fisherbrand | 13-678-11E | |
| 40 µm Cell Strainer | Fisherbrand | 22363547 | |
| 5 mL Pipet | Fisherbrand | 13-678-11D | |
| 50 mL Conical Tube | Falcon | 352070 | |
| 6-well Plate | Corning | 3506 | |
| Flow Cytometry Tubes | Falcon | 352058 | |
| Forceps | |||
| Rocker | |||
| Single Edge Blade | PAL | 62-0177 | |
| Surgical Scissors | |||
| GFP-αSMA Reporter Mice | |||
| MACS Separator Magnetic Field | |||
| MACS Separation Column | |||
| Coverslips | |||
| Qaigen Rneasy Mini Kit | Qaigen | 74104 | |
| Ambion RNAqueous Micro Total Isolation Kit | Ambion | AM1931 | |
| BioRad iScript cDNA Syntehsis Kit | BioRad | 1708891 | |
| 48-well Plate | |||
| 30G Needle | |||
| 3 Laser Flow Cytometry Machine (BD LSRFortessa) | BD Biosciences | ||
| 4 Laser Flow Cytometry Machine (BD FACSAria III) | BD Biosciences | ||
| Flow Data Acquiring Software (BD FACSDiva Software v8.0a) | BD Biosciences | ||
| Flow Data Analysis Software (FlowJo Software) | BD Biosciences |
References
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