Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Isolasjon og karakterisering av voksen hjertefibroblaster og myofibroblaster

Published: March 12, 2020 doi: 10.3791/60909
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1
1Department of Pathology, Microbiology, and Immunology, Vanderbilt University Medical Center, 2American Red Cross, National Headquarters

Summary

Å skaffe seg en ren populasjon av fibroblaster er avgjørende for å studere sin rolle i sårreparasjon og fibrose. Beskrevet her er en detaljert metode for å isolere fibroblaster og myofibroblaster fra uskadet og skadet musehjerter etterfulgt av karakterisering av deres renhet og funksjonalitet ved immunofluorescence, RTPCR, fluorescensassistert cellesortering, og kollagen gel sammentrekning.

Abstract

Hjertefibrose som svar på skade er en fysiologisk respons på sårheling. Det er gjort forsøk på å studere og målrette fibroblastsubtyper som reduserer fibrose. Fibroblastforskning har imidlertid blitt hindret på grunn av mangel på universelt akseptable fibroblastmarkører for å identifisere quiescent samt aktiverte fibroblaster. Fibroblaster er en heterogen cellepopulasjon, noe som gjør dem vanskelige å isolere og karakterisere. Den presenterte protokollen beskriver tre forskjellige metoder for å berike fibroblaster og myofibroblaster fra uskadede og skadde musehjerter. Ved hjelp av en standard og pålitelig protokoll for å isolere fibroblaster vil gjøre det mulig å studere sine roller i homeostase samt fibrose modulasjon.

Introduction

Hjertefibroblaster, celler av mesenchymal opprinnelse, spiller en betydelig rolle i å opprettholde den elektriske ledning og mekaniske krefter i hjertet i tillegg til vedlikehold av hjertearkitektur under homeostase1. Etter skade aktiveres, utvides disse cellene og produserer ekstracellulære matriseproteiner (ECM)proteiner 2. Mange prekliniske studier har avdekket fibroblaster som kritiske cellulære regulatorer som opprettholder den strukturelle integriteten til et skadet hjerte3, samt hovedeffektorceller som er ansvarlige for ukontrollert produksjon og avsetning av ECM-proteiner, noe som resulterer i stiv arrdannelse og hjertesvikt4. Fibroblaster er en heterogen gruppe celler, noe som gjør det utfordrende å dissekere deres reparative funksjon fra pro-fibrotiske maladaptive egenskaper. Nylig har den funksjonelle heterogeniteten til to forskjellige fibroblastsubtyper etter myokardskade blitt definert, noe som indikerer muligheten for å isolere forskjellige fibroblastsubtyper og studere deres rolle i sårheling5.

Å skaffe en ren fibroblastpopulasjon er avgjørende for å fordype sin funksjonelle rolle i reparasjon og fibrose. Imidlertid gjør tilstedeværelsen av flere fibroblastmarkører som gjenkjenner andre celletyper det utfordrende å isolere en vesentlig ren fibroblastpopulasjon6. Flere elegante studier har utviklet smarte måter å isolere hjertefibroblaster fra uskadet og skadet myokardiet. Den mest populære og veletablerte metoden for berikende fibroblaster er gjennom selektiv vedheshet etter enzymatisk vevfordøyelse7.

I tillegg har fluorescensaktivert cellesortering (FACS) av fibroblaster basert på celleoverflateantigener blitt beskrevet8. I studien, etter enzymatisk fordøyelse, ble mesenchymale cellene sortert som avstamningsnegative (Lin: Ter119−CD45−CD31−) og gp38-positiv (gp38+) fra mushjerter. Gp38+ve celler ble bekreftet å være fibroblaster basert på deres co-uttrykk for col1α1 og andre mesenchymal markører. Selv om de fleste vev fordøyelsen er fullført etter dissekere ut ventrikkelen i en Petri parabolen, en nylig studie har undersøkt bruk av en direkte nål enzym perfusjon av venstre ventrikkel for å isolere myocytter og ikke-myocytter som inkluderer fibroblaster9. Fibroblaster ble deretter isolert av selektiv vedhehesjon i dette tilfellet.

Denne protokollen beskriver isolasjon og berikelse av fibroblaster ved hjelp av tre metoder. Den første er en allerede etablert metode som involverer selektiv vedhesjon av fibroblaster etter enzymatisk fordøyelse. Den andre metoden brukes til primært å isolere skadeindusert alfa glatt muskel som uttrykker myofibroblaster. Den tredje metoden innebærer sekvensiell, magnetisk uttømming av en enzymfordøyd hjertecellesuspensjon av hematopoetiske og endotelceller. Etter uttømming isoleres fibroblaster/myofibroblaster basert på tilstedeværelsen av antigenet MEFSK4 ved hjelp av magnetiske perler. Nylig har MEFSK4 blitt beskrevet som et antigen til stede på quiescent samt aktiverte fibroblaster, noe som gjør det til en passende markør for fibroblastidentifikasjon og isolasjon. Naturligvis har alle metodene som er beskrevet her unike begrensninger. Det anbefales derfor sterkt å kontrollere renheten til den isolerte cellepopulasjonen ved strømningsanalyse, immunfarging og semikvantitativ sanntids PCR. Imidlertid kan disse metodene utvides, og flere markører kan legges til for å utelukke andre forurensende populasjoner før du bruker fibroblast og myofibroblastpopulasjoner for avgjørende eksperimenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne studien opprettholder strengt anbefalingene i Veiledningen for omsorg og bruk av laboratoriedyr ved National Institutes of Health. Vanderbilt University Institutional Animal Care and Use Committee godkjente protokollen (protokollnummer: M1600076-01).

1. Hjerte disseksjon

  1. Klargjøring av løsninger
    1. KHB buffer
      1. Ved hjelp av en rørestang oppløses du sakte 9,4 g Krebs-Henseleit buffer (KHB) pulver i 900 ml DDI-vann.
        MERK: Bufferen vil utløses hvis den røres for fort eller for lenge. KHB buffer må være kald under fibroblast isolasjon.
      2. Tilsett 2,9 mM CaCl2 og 24 mM NaHCO3. Juster pH til 7,2–7,3 og fortynn til et volum på 1 L med dH2O.
      3. Ved hjelp av et sterilt filter (0,22 μm) oppbevares ved 4 °C i opptil 4 uker. Oppbevars på is eller ved 4 °C i isolasjonstiden.
    2. Collagenase fordøyelsescocktail
      1. Forbered fordøyelsescocktail dagen for fibroblastisolasjon. Bestem riktig volum av fordøyelsescocktail i henhold til antall hjerter; 5 ml cocktail per 1 hjerte.
      2. Forbered collagenase blanding (se Materialtabellen) og DNase I i henhold til produsentens instruksjoner.
      3. For 20 ml total fordøyelsescocktail, tilsett 17,5 μL DNase I, 180 μL av 1 M HEPES og 500 μL kollagennase til et tomt 50 ml konisk rør.
      4. Legg til et tilstrekkelig volum av Hanks balanserte saltoppløsning (HBSS) med Ca2+ og Mg2+ for å få et totalt volum på 20 ml.
    3. Buffer for røde blodceller (RBC) lysis
      1. Bestem det totale volumet som trengs basert på antall hjerter (5 ml/hjerte). Fortynn 10x RBC lysis lagerbufferen til 1x ved bruk av dH2O.
    4. Fibroblast media: 10% FBS i DMEM F-12
      1. Tilsett 10% FBS til DMEM-F12 med L-glutamin og HEPES. Tilsett 10 U/ml penicillin/streptomycin, 2,5 μg/ml antisopp og 2,5 μg/ml mykoplasmaprofylaktisk (se materialtabell). Oppbevares ved 4 °C.
  2. Hjerte disseksjon
    1. Forbered en 6 brønnplate på is med 2 ml kald KHB per brønn for å lagre hjerter i under disseksjon. Bruk autoklet kirurgisk saks og tang.
    2. Euthanize mus ved 12 ukers alder eller eldre av isofluran overdose, og følg med cervical dislokasjon.
    3. Alternativt, for aktivert fibroblast isolasjon, indusere hjerteinfarkt i 12 uker gamle mus ved koronararterie ligation10. Euthanize musene 8-10 dager etter skade.
    4. Spray kroppen med 70% etanol og orient er slik at ventralsiden vender mot eksperimentereren. Pin eller behold vedlegg for å hindre forstyrrelser.
    5. Skjær magehuden og muskelen åpen, men unngå piercing leveren. Skjær vertikalt mot brystbenet, og åpne forsiktig thoraxen samtidig som du unngår piercing av hjertet. Fortsett å skjære gjennom brystkassen for å eksponere hjertet.
    6. Ved hjelp av tang, løft forsiktig hjertet ut av brystet, kutte bort lunge eller overflødig vev festet til utsiden av hjertet. Fjern ventrikkelen og legg i en brønn på 6 brønntallerken med kald KHB. Fortsett å dissekere hjerter på denne måten til alle prøver er isolert.
  3. Enzymatisk dissosiasjon av hjertet
    1. Ved hjelp av tang, gjentatte ganger klemme og agitere hjertet i KHB for å fjerne overflødig blod. Overfør hjertet til en ren steril 10 cm2 plate. Bruk et enkelt kantblad, hakk raskt hjertet i små biter.
    2. Tilsett 1 ml collagenase fordøyelsescocktail og fortsett å hakke til bitene er små nok til å overføres med en 1 ml mikropipette. Overfør bitene til et 50 ml konisk rør med en 1 ml mikropipette. Vask plate 2x med 2 ml collagenase fordøyelsescocktail.
      MERK: Å kutte av en del av pipettespissen kan bidra til å samle større hjertebiter som ellers kan bli sittende fast i pipettespissen.
    3. Inkuber konisk rør ved 37 °C i 30 min med gynge eller agitasjon. Sikre røret etter behov. Resuspend10x med en 5 ml rør til innholdet er homogent, og inkuber det koniske røret ved 37 °C i 15 min med rotasjon eller agitasjon.
    4. Resuspend10x med en 10 ml rør til homogen. Prime en 40 μm cellesil ved å fukte filteret med 1–2 ml KHB buffer på toppen av et nytt 50 ml konisk rør. Tilsett 25 ml KHB-buffer til fordøyelsesfjæring, resuspending og filtrer gjennom en primet 40 μm cellesil. Endre filteret etter behov.
      MERK: Etter hvert som filtreringen bremser, kan lett tapping av rør eller bruk av en 1 ml mikropipette for å trekke suspensjon fra undersiden av filteret hjelpe cellesuspensjonen til å passere gjennom en delvis blokkert 40 μm cellesil.
    5. Sentrifuge ved 400 x g og 4 °C i 10 min. Fjern supernatanten og resuspend pelleten i 1x RBC lysis buffer (5 ml/hjerte). Inkuber i 2 min ved romtemperatur (RT).
    6. Sentrifuge ved 400 x g og RT i 10 min. Fjern supernatant deretter vask ved å resuspendere pellet i 1 ml KHB buffer.
    7. Tilsett 9 ml KHB-buffer og filtrer gjennom primet 40 μm cellesil i nytt 50 ml konisk rør. Sentrifuge ved 400 x g og RT i 10 min.
    8. Fjern supernatanten, resuspendier i 1 ml fibroblastmedier eller PBS, og bestem cellenummeret. Fibroblaster kan isoleres ved de tre forskjellige metodene som er beskrevet nedenfor.

2. Isolering av fibroblaster fra encellede suspensjon

  1. Fibroblastisolasjon: differensialplating (Figur 1)
    1. Forbered en 6-brønnplate ved å legge til 2 ml fibroblastmedia per brønn og virvlende platen for å dekke brønnen bunn.
    2. Resuspender celler i 1 ml mediammer per hjerte. Plate 1 ml cellesuspensjon per brønn slik at ett hjerte (teoretisk) blir belagt per brønn. For eksempel ville seks hjerter bli suspendert i 6 ml medier, deretter belagt i seks brønner med 1 ml cellesuspensjon per brønn.
    3. Virvle plate for å jevnt fordele celler. Tilsett ytterligere 1–2 ml medier per brønn for et samlet volum på opptil 5 ml per brønn, og inkuber ved 37 °C i 4 timer.
    4. Fibroblaster vil bli skilt ved selektiv vedhehesjon etter 4 h. Fjern utilknyttede og døde celler ved å fjerne media. Vask vedlagte celler med 2 ml PBS og tilsett 2–4 ml sterilt fibroblastmedium per brønn. Inkuber ved 37 °C til konfluent. Bytt medier hver 2–4.
  2. Fibroblast Isolasjon: FACS ved hjelp av en GFP reporter mus modell (Figur 1)
    1. FACS-buffer
      1. Forbered 15 ml 5% føtal storfe serum (FBS) i dPBS uten Ca2 + og Mg2 +. Oppbevares på is eller ved 4 °C.
    2. FC-blokkeringsløsning
      1. Forbered 0,5 μL FC-blokkering (renset anti-mus CD16/CD32) i 25 μL AV FACS (1:50 fortynning). 25 μL FC-blokkeringsløsning er nødvendig per prøve. Oppbevares på is eller ved 4 °C.
    3. Prøveforberedelse og antistofffarging
      MERK: Antistofffortynninger kan fremstilles på forhånd, men dette kan risikere lys- eller temperatureksponering.
      1. Forbered 7AAD eller Ghost dye violet 510 som er 2x den nødvendige fortynningen i FACS-bufferen. Se tabell 1 for antistoffer og fortynninger.
      2. Resuspender 500 000 nyisolerte celler i 25 μL FC-blokkeringsløsning for å forhindre uspesifikk binding av FC-antistoffområdet til en FC-reseptor. Inkuber for 5 min på RT.
      3. Tilsett 7AAD eller Ghost dye violet 510 antistoff til det endelige volumet på 25 μL cellesuspensjon. Inkuber i 30–60 minutter på is i mørket.
      4. Vask ved å suspendere i 1 ml FACS-buffer. Sentrifuge ved 500 x g i 5 min ved 4 °C.
      5. Resuspender pellet i anbefalt flyt cytometri prøvevolum av FACS buffer (300 μL) og overføring til flow cytometri rør.
    4. Fluorescensaktivert cellesortering (FACS)
      MERK: GFP-αSMA reporter mus var et bidrag fra Dr. Ivo Kalajzic11. Denne musen uttrykker GFP under alfa glatt muskelcelle (αSMA) arrangør. αSMA har blitt brukt som en markør for aktiverte fibroblaster (myofibroblaster)12.
      1. For aktivert fibroblast (αSMA som uttrykker myofibroblast) isolasjon, indusere hjerteinfarkt i 12 uker gamle GFP-αSMA mus ved koronararterie ligation. Ofre musene 8–10 dager etter skade.
      2. Etter encellede suspensjon fra de skadede mushjertene, sorter αSMA+ve fibroblaster for grønt fluorescerende protein (GFP). Bruk ubeiset uskadet fibroblaster til å stille inn bakgrunnssignalet i GFP-kanalen etter kompensasjon.
      3. Gate for live GFP+ve celler ved gating for 7AAD-ve/GFP+ve celler eller Ghost dye violet 510-ve/GFP+ve celler og sortere GFP uttrykke αSMA+ve myofibroblasts. Samle cellene i fibroblast media.
  3. Fibroblastisolasjon: magnetisk perlebasert isolering av fibroblaster (Figur 1)
    1. Likevektsbuffer
      MERK: Lag alltid ny buffer for isolasjoner.
      1. Forbered 0,5% BSA og 2 mM EDTA i PBS. Duas bufferen ved å røre løsningen mens du fester et vakuum til lokket på beholderen.
        MERK: Omrøring fjerner overflødig gass fra løsningen som deretter fjernes gjennom vakuumet slik at bobler ikke vil tette separasjonskolonnen ved bruk.
    2. Magnetisk merking: CD45+ hematopoetiske celler
      1. Sentrifuge isolerte celler fra mus hjerter på 500 x g i 5 min, og fjern deretter supernatanten.
      2. Resuspender cellepelleten i 1 ml likevektsbuffer. Tell cellene ved hjelp av et hemocytometer.
      3. Sentrifugere cellesuspensjonen som ovenfor og resuspendercellepellet i 90 μL likevektsbuffer per 1 x 107 totale celler. Tilsett 10 μL cd45+ magnetiske perler per 1 x 107 totale celler. Bland godt og inkuber i minst 15 min ved 4 °C.
      4. Vask celler ved å legge til 2 ml likevektsbuffer per 1 x 107 totale celler, deretter sentrifuge ved 500 x g i 10 min ved 4 °C.
      5. Fjern supernatant, telle cellene ved hjelp av et hemocytometer og resuspend opptil 1 x 107 totale celler i 2 ml likevektbuffer. Hvis det finnes mer enn 107 celler, skalerbufferen lineært. Send celler gjennom et 40 μm-filter for å hindre at celleaggregasjoner tette separasjonskolonnematrisen.
    3. Magnetisk separasjon: CD45+ hematopoetiske celler
      1. Plasser separasjonskolonnen i magnetfeltet til en egnet separator og likevektskolonne med minst 3 ml PBS.
      2. Samle umerkede celler i gjennomstrømningen (FT), og vask kolonne 3x med 3 ml likevektsbuffer. Samle vasker med FT. Fjern kolonnen fra skilletegnet. Plasser kolonnen på et 15 ml konisk rør.
      3. Skyll ut magnetisk merkede CD45+ celler ved å pipettere 5 ml likevektsbuffer på kolonnen og fast stupe cellene med et stempel som følger med kolonnen.
      4. Sentrifuge unnvike lsesmiddel samt FT/vask fraksjoner ved 500 x g. Tell cellene ved hjelp av et hemocytometer.
    4. Magnetisk merking og separasjon: CD31+ endotelceller
      1. Gjenta protokollen for CD45+ magnetisk merking og separasjon (avsnitt 2.3.2–2.3.3), bortsett fra bruk CD31+ magnetiske perler til å inkubere med FT og vaske deler fra CD45+ isolasjon.
    5. Magnetisk merking og separasjon: MEFSK4+ fibroblaster
      1. Gjenta protokollen for CD45+ magnetisk merking ved hjelp av MEFSK4 anti-mater-APC-antistoffet i stedet for magnetiske perler. Sentrifuge FT og Wash deler fra CD31+ isolasjon på 500 × g i 5 min, deretter fjerne supernatant. Resuspender cellepelleten i 1 ml likevektsbuffer, og tell cellene ved hjelp av et hemocytometer.
      2. Tilsett 10 μL mefsk4 anti-mater-APC antistoff per 1 x 107 celler. Inkuber i minst 15 min ved 4 °C.
      3. Vask MEFSK4 antistoffbundne celler ved å legge til 5 ml likevektsbuffer per 1 x 107 totale celler, deretter sentrifuge ved 500 x g i 5 min.
      4. Fjern supernatant og resuspendier i anti-APC perler, ved hjelp av samme volum av MEFSK4 anti-mater-APC antistoff som brukes. Inkuber på is i 15 min ved 4 °C.
      5. Sentrifuge ved 500 x g i 10 min. Fjern supernatant, resuspend i 2 ml likevektsbuffer per 1 x 107 totale celler, og fortsett med magnetisk separasjon som tidligere beskrevet (avsnitt 2.3.3). Magnetisk separertme MEFSK4+ve/ CD45-ve/CD31-ve fibroblaster kan brukes til renhetsanalyser og andre nedstrømsapplikasjoner.

3. Renhet og funksjonalitet analyse av isolert fibroblast populasjon

  1. FACS populasjonsrenhetsanalyse: αSMA-GFP celleanalyse (figur 2)
    1. Resuspender nyisolerte celler i 25 μL fc blokkeringsløsning for å forhindre uspesifikk binding av antistoffer. Inkuber for 5 min på RT.
    2. Valgfritt: Tilsett 25 μL 7AAD eller Ghost dye violet 510 til cellesuspensjon. Inkuber i 30–60 minutter på is i mørket.
    3. Vask ved å suspendere i 1 ml FACS-buffer. Sentrifuge ved 500 x g i 5 min.
    4. Resuspender pellet i 50 μL av FACS-bufferen. Legg til CD31-PE, CD45-APC og AN2/NG2-antistoffer direkte i cellesuspensjon. Inkuber i 15 min på is (Tabell 1).
    5. Vask ved å suspendere på nytt i 1 ml FACS-buffer. Sentrifuge ved 400 x g i 5 min.
    6. Legg esel anti-rotte AlexaFluor 405 sekundærantistoff til cellene merket med unconjugated primære antistoff. Inkuber i 30 min på is.
    7. Vask ved å suspendere i 1 ml FACS-buffer. Sentrifuge ved 400 x g i 5 min.
    8. Resuspender pellet i anbefalt flyt cytometri prøvevolum av FACS buffer (300 μL) og overføre til en merket flyt cytometri rør for flytanalyse.
      MERK: FACS-analyse for å karakterisere uttrykket av MEFSK4-antigen et isolert fibroblaster er beskrevet i pkt. 3.3.
  2. Fibroblast renhet analyse: immunofluorescens (Figur 3A)
    1. Frø 30.000 primære fibroblaster (P0-P1) per brønn på coverslips plassert i en 24 brønnplate og kultur til 80% konfluent. Eller konsentrat sortert CD45+ og CD31+ celler (30.000 celler per brønn) på en coverslip av cytospin på 400 x × g (en metode som brukes til å sette inn celler direkte og jevnt på en coverslip i en 24 brønnplate).
    2. Fest celler med kald aceton i 15 min. Vask 3x ganger med PBS.
    3. Blokker lysbilder i 10% geitserum. Inkuber lysbilder med primære antistoffer over natten (Tabell 2).
    4. Vask lysbilder 3x i PBS. Inkuber sekundære antistoffer i 2 timer (Tabell 2).
    5. Counterstain glir, og monteres med en dråpe DAPI i sakte fade monteringsmedier.
  3. FACS populasjonsrenhetsanalyse: MEFSK4-sondering (Figur 3B)
    1. Resuspender nyisolerte celler i 25 μL fc blokkeringsløsning for å forhindre uspesifikk binding av antistoffer. Inkuber for 5 min på RT.
    2. Valgfritt: Tilsett 25 μL 7AAD eller Ghost dye violet 510 til cellesuspensjon. Inkuber i 30–60 minutter på is i mørket.
    3. Vask ved å suspendere i 1 ml FACS-buffer. Sentrifuge ved 500 x g i 5 min.
    4. Resuspender pellet i 50 μL av FACS-bufferen. Legg MEFSK4 antistoff direkte til cellesuspensjon. Inkuber i 15 min på is (tabell 1).
    5. Vask ved å suspendere i 1 ml FACS-buffer. Sentrifuge ved 400 x g i 5 min.
    6. Legg rotte IgG-APC til cellene (Tabell 1). Inkuber i 30 min på is.
    7. Vask ved å suspendere i 1 ml FACS-buffer. Sentrifuge ved 400 x g i 5 min.
    8. Resuspender pellet i anbefalt flyt cytometri prøvevolum av FACS buffer (300 μL) og overføring til flow cytometri rør for flytanalyse.
  4. Fibroblast renhet analyse: semi-kvantitativ sanntid rtPCR (Figur 3C)
    1. RNA-isolasjon og semikvantitativ sanntids PCR
    2. Etter berikelse av fibroblaster isolerer du RNA ved hjelp av et RNA-isolasjonssett (se Materialtabellen). Følg produsentens instruksjoner.
    3. Komplett første tråd DNA-syntese ved hjelp av et cDNA-syntesesett (se Materialtabellen), etter produsentens instruksjoner.
    4. Utfør semikvantitativ sanntid PCR5.
  5. Fibroblast funksjonalitet analyse: kollagen gel kontraktilitet analyse (Figur 4)
    1. Kollagenløsning
      1. Forbered 20 mM HEPES og 44 mM NaHCO3 i DMEM. Tilsett 1,67 mg av type 1 rottekollagen per 1 ml DMEM med HEPES og NaHCO3.
    2. TGFβ-supplert DMEM
      1. Forbered 10% FBS i DMEM supplert med antibiotika og anti-sopp. Tilsett TGFβ til en endelig konsentrasjon på 1 ng/ml.
    3. Celle/kollagenblanding og plating
      1. Klargjør cellesuspensjon (P3-P5) og bestem nødvendig volum for å få 3,3 x 105 celler.
      2. Tilsett fjæringsvolum med 3,3 x 105 celler til nok kollagenløsning for å oppnå 1 ml totalt volum.
        MERK: Konsentrasjonen av rottekollagen type 1 skal nå være 1,5 mg/ml.
      3. I en 48 brønnplate, frø 300 μL cellekollagen blanding per brønn (~ 1 x 105 celler / brønn). Inkuber ved 37 °C i 15–20 min til den ble gelled.
      4. Bruk en 30 G nål for å skille gel fra brønnveggene. Tilsett 600 μL tGFβ og FBS supplert DMEM til hver brønn. Bildeplater på en reflekterende skanner på 24 timer og 48 timer.
        MERK: Alle Immunfluorescenseksperimenter ble utført på en flow cytometrimaskin utstyrt med tre lasere (405 nm, 488 nm og 640 nm). Data ble anskaffet ved hjelpaven flow data innhenting programvare ( Table of Materials ). Videre dataanalyse ble utført ved hjelp av programvare for flytdataanalyse. AlexaFluor 405 og Ghost Dye Violet 510 var begeistret med 405 nm laser og samlet ved hjelp av en 450/50 BP og 525/50 BP filter, henholdsvis. GFP og PE var begeistret av 488 nm laser og samlet ved hjelp av 530/30 BP og 575/26 BP filtre, henholdsvis. Enten APC eller AlexaFluor 647 var begeistret av 640 nm laser og samlet ved hjelp av en 670/14 BP filter. Alle cellesorteringseksperimenter ble utført på en flow cytometrimaskin (Table of Materials) utstyrt med fire lasere (405 nm, 488 nm, 561 nm og 640 nm). 7-AAD var spent ved hjelp av 561 nm laser og samlet med en 670/14 BP filter. GFP og Ghost Dye Violet 510 ble samlet inn ved hjelp av de samme laser-/filterkombinasjonene som beskrevet ovenfor. Alle sorteringseksperimenter benyttet en 100 umm dyse med en 17 psi trykkkonfigurasjon for økt nedstrøms levedyktighet av målcellene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Flow gating ordningen demonstrere myofibroblast isolasjon ved hjelp av αSMA-GFP reporter mus
Uskadede hjerter viste ingen påviselig GFP+ celler i αSMA-GFP reporter mus modell; Derfor ble de brukt til å etablere en port for bakgrunnssignalet til GFP-kanalen etter kompensasjon (Figur 2). αSMA+ celler ble sortert basert på tilstedeværelsen av GFP-uttrykk fra det skadede venstre ventrikkelen 10 dager etter MI. En liten prosentandel av endotelceller (GFP+/CD31+-celler; SD = 3,8 % ± 0,0164; n = 5) og hematopoietiske (GFP+/CD45+ celler; SD = 3,18 % ± 0,0112; n = 5) celler uttrykte også GFP i de skadde αSMA-GFP-musehjertene (figur 2A). GFP+/CD31-/CD45-celler uttrykte imidlertid ikke AN2, en pericytmarkør.

Uskadde (quiescent) og skadde (aktiverte αSMA+GFP+) celler uttryktfibroblast markører
GFP+ celler isolert fra αSMA-GFP-mus uttrykte αSMA, kollagentype 1 alfa-1 kjede (COL1α1), vimentin og periostin når analysert av IF-analyse. Uskadde fibroblaster isolert av selektiv vedhehesjon uttrykte vimentin, men viste ikke uttrykk for de aktiverte fibroblastmarkørene: αSMA, periostin og COL1α1 (figur 3A). Både uskadde og aktiverte fibroblaster uttrykte MEFSK4-antigenet når det analyseres av strømningsanalyse (figur 3B). Magnetisk isolerte MEFSK4+ve-celler fra uskadde mushjerter uttrykte markører for fibroblaster: Col1a1, pdgfrα og periostin. I motsetning hadde magnetisk isolerte CD45- og CD31-positive celler ubetydelig uttrykk for fibroblastmarkører.

Fibroblaster og myofibroblaster viste evnen til å kontrakt kollagen
I cellekultur på stiv plast har fibroblaster vist seg å trekke kollagengeler i nærvær av TGFβ, som viser deres funksjonelle evne til sammentrekning13,14. Denne in vitro karakteristisk for fibroblaster er svært lik bindevev sammentrekning som skjer under vev reparasjon samt andre biologiske prosesser. Både uskadde fibroblaster, isolert av selektiv vedhehesjon og myofibroblaster, isolert og sortert fra αSMA-GFP-mus, viste en evne til å trekke kollagen (figur 4).

Figure 1
Figur 1: Skjematisk fibroblastisolasjon ved hjelp av tre forskjellige tilnærminger. (A) differensialplating, (B) GFP + cellesortering av αSMA positive celler, og (C) magnetisk perlebasert isolering av fibroblaster. Representativt lyst felt av cellene i kultur etter differensialplating. Skala bar = 50 μM. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: FACS-analyse av enkeltceller isolert fra αSMA-GFP mus hjerter etter MI. (A) Representativ FACS gating ordningen demonstrere GFP + celler co-uttrykke CD31, CD45, eller AN2 fra αSMA-GFP mus skadet hjerter 10 dager etter hjerteinfarkt (MI). (B) Grafisk kvantifisering av de presenterte FACS-dataene for post-MI hjerter; n = 5 eksperimenter ble utført uavhengig (***p < 0,0001 som beregnet ved hjelp av enveis ANOVA med Tukeys flere sammenligninger test). Dette tallet er tilpasset fra Saraswati et al.10. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Renhet analyser av fibroblaster isolert fra uskadet og skadet mus hjerter. (A) Immunfluorescensfarging av cellepopulasjoner (P0) fra hjertet av uskadet, eller skadde αSMA-GFP-mus sortert etter FACS. Både uskadde og aktiverte celler uttrykker fibroblast (FB) markører, som KOL1α1 og vimentin, men ikke hematopoietisk markør CD45 eller endotelmarkøren CD31. Celler isolert fra skadet αSMA-GFP mus hjerte uttryktaktiverte fibroblast markører, αSMA, og periostin, som ikke var tilstede i cellene isolert fra uskadet mus hjerter. Nuclei ble farget med DAPI, n = 3 eksperimenter ble utført uavhengig. Skalastang = 100 μm. (B) Representativ FACS overlegg histogrammet av uskadde og aktiverte fibroblaster (P3–P5) som viser uttrykket for fibroblastmarkøren MEF-SK4. For en negativ kontroll ble rotte IgG brukt, n = 2 eksperimenter ble utført uavhengig. (C) Relativ foldendring av Col1α1, Pdgfrαog Postn-transkripsjoner i uskadede MEKSK4+ve fibroblaster, n = 3 eksperimenter ble utført uavhengig (*p < 0,05 som beregnet ved hjelp av toveis ANOVA med Tukeys flere sammenligninger test). (A) og (B) er tilpasset fra Saraswati et al.10. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Funksjonell karakterisering av fibroblaster isolert fra uskadet og skadet mus hjerter. Representativ figur av kollagen gel sammentrekning i nærvær av uskadet og skadet aktivert αSMA+ fibroblaster (P3-P5). Grafen representerer prosentvis endring i det første gelområdet etter 24 timer og 48 timer med sammentrekning ved inkubert med uskadet og skadet aktivert αSMA+ fibroblaster, n = 2 eksperimenter ble utført uavhengig. Dette tallet er tilpasset fra Saraswati et al.10. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Antistoff Cellemål Fortynning
7AAD (andre) Døde celler 1:1000
Ghost dye fiolett 510 Døde celler 1:1000
APC-CD45 Hematopoetiske celler 1:200
PE-CD31 Endotelceller 1:200
anti-AN2/NG2 Pericytes (andre er i seg selv) 1:11
Esel anti-rotte alexa fluor 405 Sekundært antistoff 1:100
Antimaterceller-APC (MEFSK4) Fibroblaster 1:100
Rotte IgG-APC Isotype kontroll 1:100

Tabell 1: FACS fargestoffer og antistoffer.

Primær antistoff Fortynning
α-glatt muskel actin (αSMA) 1:1000
Fibroblast spesifikt protein 1 (FSP1)1:250 1:100
KOL 1α1 (andre er i bruk) 1:1000
Periostin (andre er isostat) 1:100
Vimentin (andre er i kraft) 1:200
Cd31 (andre kan være på denne siden) 1:250
Cd45 (andre kan være på denne siden) 1:250
Sekundært antistoff Fortynning
Geit anti-mus Alexa Fluor 488 1:200
Geit anti-kanin-FITC 1:200
Geit anti-kanin-Cy3 1:200
Geit anti-rotte Alexa Fluor 488 1:200
Geit anti-rotte Alexa Fluor 647 1:200

Tabell 2: Immunfluorescens primære og sekundære antistoffer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fibroblaster er en heterogen gruppe celler, identifisert av ulike sett med markører. Protein markører som har blitt brukt til å identifisere fibroblaster er discoidin domene reseptor 2 (DDR2), fibronectin, vimentin, kollagen I og III, og Thy115,16,17,18,19,20. Mens vimentin har blitt brukt til å identifisere uskadet quiescent hjertefibroblaster, fibroblast spesifikt protein 1, αSMA og periostin har vist seg å identifisere skadeinduserte aktiverte fibroblaster, med αSMA som den vanligste markøren for å oppdage aktiverte fibroblaster6,12,21. I tillegg har Tcf21 og MEFSK4 proteiner fått nylig anerkjennelse i å gjenkjenne både quiescent fibroblaster funnet i uskadet hjertevev samt aktiverte fibroblaster inkludert myofibroblaster funnet i skadede musehjerter21,22.

Denne protokollen benytter tre forskjellige tilnærminger for å isolere og berike fibroblaster og aktiverte fibroblaster, inkludert myofibroblaster. Fibroblastens evne til å fortrinnsrett holde seg til plast brukes i den første tilnærmingen for isolasjon. Etter enzymatisk fordøyelse med liberase, blir encellede suspensjon av celler seeded på en plasttallerken for å fortrinnsrett følge. Manglende evne til mange ikke-fibroblastceller til å holde seg til polystyrenoverflaten av Petri-retter gjør at vi kan fjerne alle medier fra parabolen og forbli hos en relativt ren populasjon av fibroblaster. En påminnelse om å bruke denne teknikken er selv om fibroblaster fortrinnsvis vil holde seg til polystyrenparabolen, kan noen forurensende ikke-fibroblastceller også festes, og etterlater en ikke-homogen populasjon av celler.

Den andre isolasjonsteknikken benytter FACS til å skille αSMA som uttrykker myofibroblaster fra andre celler. I den transgene musemodellen som brukes her, er GFP utelukkende uttrykt sammen med αSMA, slik at myofibroblaster som inneholder αSMA kan oppdages av en FACS-maskin gjennom de fluorescerende egenskapene til GFP. Denne isolasjonsprosedyren gjør det mulig for oss å få en populasjon av celler som er ca 99% myofibroblast. Renheten analyser av disse cellene har blitt grundig beskrevet av Saraswati et al.10.

Den tredje isolasjonsteknikken er en effektiv måte å isolere både uskadde og aktiverte fibroblaster ved magnetisk perlebasert separasjon av MEFSK4-uttrykkende celle. Ved å la en enkelt cellesuspensjon binde seg til anti-CD45 og anti-CD31 magnetiske perler og bli immobilisert i en matrise på grunn av magnetiske felteffekter, tillot dette separasjon av hematopoietiske samt endotelceller som kan ha forurenset fibroblast isolasjon. Som MEFSK4 har nylig blitt brukt som en pålitelig markør for å identifisere fibroblaster, et antistoff som vil binde seg til MEFSK4 uttrykkeceller er i stand til å bli brukt. Etter å ha binding en magnetisk perle til antistoffet, og skaper et kompleks som tillater isolering av fibroblaster, passeres det magnetiske perlecellekomplekset gjennom en matrise i et magnetfelt, og en svært beriket fibroblastpopulasjon oppnås. Renheten til den isolerte fibroblastpopulasjonen bør vurderes ved immunfarging, RTPCR og flow cytometrianalyser.

Som med alle andre teknikk, er det begrensninger med teknikkene som er beskrevet i dette manuskriptet. Begrensningen av selektiv vedhesjonsprotokoll og magnetisk perlebasert isolasjon er at disse metodene ikke skiller mellom quiescent og aktiverte fibroblaster. For å berike aktiverte fibroblaster, bør isolasjonen utføres 8–10 dager etter hjerteinfarkt. I tillegg er det viktig å sjekke renheten av isolasjonen med andre fibroblastmarkører. MEFSK4-positiv fibroblastrenhet er kun demonstrert av RTPCR, det anbefales å teste (ved immunfarging og flyt cytometrianalyse) med andre fibroblastmarkører og markører som gjenkjenner forurensende celletyper, inkludert hematopoetisk (CD45), endotel (CD31) og pericytes (AN2). Hvis det er mulig, kan andre fibroblastspesifikke markører brukes til å sortere eller magnetisk isolere fibroblastpopulasjonen.

Bruk av αSMA-GFP-mus for å isolere og sortere myofibroblaster er en pålitelig teknikk for å oppnå en aktivert fibroblastpopulasjon. En ubetydelig prosentandel av hematopoetiske og endotelceller er imidlertid observert i strømningsanalysen. Cd45+ve/CD31+ve- og AN2+ve-celler bør utelates fra GFP+ve/αSMA+ve cellesortering for å forbedre denne teknikken. Siden αSMA er en allment akseptert markør for myofibroblaster, er αSMA-GFP reporter musemodellen et verdifullt verktøy som bør utnyttes til å studere myofibroblaster i sammenheng med myokardskader.

Det er flere viktige feilsøkingstrinn som må tas i betraktning. Fordøyelsestiden kan reduseres hvis cellelevedyktighet og utbytte påvirkes. En rørebar bør ikke brukes til å røre fordøyelsesblandingen, da dette påvirker cellelevedyktighet. Røret skal festes på en rocker eller i en ristende inkubator for å agitere fordøyelsesblandingen forsiktig. Resuspending av det fordøyde vevet 10x med en 5 ml eller 10 ml pipette er avgjørende for riktig dissosiasjon av celler.

Riktig rødblodscellelysis av encellede suspensjon må brukes hvis cellene skal sorteres eller analyseres av flow cytometri. For magnetisk perleisolasjon er avgassing av bufferen avgjørende for å forhindre innføring av luftbobler i kolonnen. Kolonnen som brukes til magnetisk perlecelleisolering bør ikke gjenbrukes mellom forskjellige magnetiske perlekonjugerte celler. En ny kolonne bør for eksempel brukes til å skille CD45+ celler, som skal kastes etter elution av CD45+ cellene, deretter en annen ny for CD31+ celleisolasjon. I våre hender har vi ikke sett forurensning av pericyter i isolerte / sorterte fibroblaster. MEFSK4 har imidlertid vist seg å gjenkjenne pericyter22. Det anbefales derfor å bruke et ekstra trinn for å sortere ut/magnetisk tømme pericytes (AN2) fra enkeltcellene. Selv om denne protokollen er validert i 12 uker gamle mus, kan teknikken brukes til yngre eller eldre mus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil takke Dr. Ivo Kalajzic for αSMA-GFP-musene. Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av National Institute of General Medical Sciences ved National Institutes of Health (NIH) under Award Number R01GM118300 (S.S.), National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering av NIH under Award Number R21EB019509 (P.P.Y.), og Forsker Development Grant av American Heart Association under Award Number 17SDG33630187 (S.S.). Flow cytometri analyser ble utført på VUMC Flow Cytometry Shared Resource som støttes av Vanderbilt Ingram Cancer Center (P30 CA68485) og Vanderbilt Digestive Disease Research Center (DK058404).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Acetone
Anti-fungal (Amphotericin B-solubilized; Fungizone) Sigma Aldrich A9528
Bovine Serium Albumin (BSA) Sigma 9048-46-8
Calcium chloride
Citrate Buffer
Collagenase blend (Liberase Blendzyme 3 TH) Roche Applied Science
DAPI
DDI water
DI water
DMEM-F12 with L-Glutamine and HEPES Life technologies 11330057
Dnase I(20U/mL) BioRad 7326828
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (dPBS) without Ca2+ and Mg2+ Gibco 13190-144
70% Ethanol
FC Blocker (Purified anti-mouse CD16/CD32) Tonbo Biosciences 70-0161
Fetal Bovine Serum (FBS) Life technologies 16000044
10% goat serum
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) with Ca2+ and Mg2+ Corning 21-023-CV
1M HEPES Corning 25-060-Ci
Krebs-Henseleit Buffer powder Sigma K3753
Mycoplasma prophylactic (Plasmocin) Invivogen ant-mpp
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
1x Phosphate-Buffered Saline (PBS)
10x Red Blood Cell Lysis Buffer Miltenyi 130-094-183
Slow-fade Mounting Media
Sodium azide
Sodium bicarbonate
TGFβ
Trypan Blue Stain (0.4%) Gibco 15250-061
Type 1 Rat Collagen
Antibodies
7AAD (stock: 1 mg/mL solution in DMSO) Molecular Probes A1310 dilution = 1:1000; RRID =
CD45-APC BD Bioscience 559864 dilution = 1:200; RRID = AB_398672
CD31-PE BD Bioscience 553373 dilution = 1:200; RRID = AB_394819
CD31 BD Biosciences 553370 dilution = 1:250; RRID = AB_394816
CD45 BD Biosciences 553076 dilution = 1:250; RRID = AB_394606
COL 1α1 MD Bioproducts 203002 dilution = 1:1000; RRID =
Ghost dye violet 510 (Formulation: 1 uL/test in DMSO) Tonbo Biosciences 13-0870 dilution = 1:1000; RRID =
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 Molecular Probes A11029 dilution = 1:200; RRID = AB_138404
Goat anti-rabbit-Cy3 Southern Biotech 4050-02 dilution = 1:200; RRID = AB_2795952
Goat anti-rabbit-FITC Jackson Immunoresearch Laboratories 711-165-152 dilution = 1:200; RRID = AB_2307443
Goat anti-rat Alexa Fluor 488 Molecular Probes A11006 dilution = 1:200; RRID = AB_2534074
Goat anti-rat Alexa Fluor 647 Thermo-Fisher A21247 dilution = 1:200; RRID = AB_141778
Periostin Santa Cruz SC67233 dilution = 1:100; RRID = AB_2166650
Vimentin Sigma Aldrich V2258 dilution = 1:200; RRID = AB_261856
α-smooth muscle actin (αSMA) Sigma Aldrich A2547 dilution = 1:1000; RRID = AB_476701
Fibroblast specific protein 1 (FSP1) Millipore 07-2274 07-2274 dilution = 1:100; RRID = AB_10807552
CD45 Magnetic Beads Miltenyi Biotec 130-052-301
CD31 Magnetic Beads Miltenyi Biotec 130-087-418
Anti-feeder cells-APC (MEFSK4) Miltenyi Biotec 130-102-900 dilution = 1:100; RRID = AB_2660619
anti-APC Beads Miltenyi Biotec 130-090-855
Rat IgG-APC Miltenyi Biotec 130-103-034 dilution = 1:100; RRID = AB_2661598
Donkey anti-rat Alexa Fluor405 Abcam ab175670 dilution = 1:100
anti-AN2/NG2 Miltenyi Biotec 130-097-455 dilution = 1:11; RRID = AB_2651235
Other Materials
0.22 µm Filter Thermo Scientific 723-2520
10 cm2 Cell Culture Dish Corning 430167
10 mL Pipet Fisherbrand 13-678-11E
40 µm Cell Strainer Fisherbrand 22363547
5 mL Pipet Fisherbrand 13-678-11D
50 mL Conical Tube Falcon 352070
6-well Plate Corning 3506
Flow Cytometry Tubes Falcon 352058
Forceps
Rocker
Single Edge Blade PAL 62-0177
Surgical Scissors
GFP-αSMA Reporter Mice
MACS Separator Magnetic Field
MACS Separation Column
Coverslips
Qaigen Rneasy Mini Kit Qaigen 74104
Ambion RNAqueous Micro Total Isolation Kit Ambion AM1931
BioRad iScript cDNA Syntehsis Kit BioRad 1708891
48-well Plate
30G Needle
3 Laser Flow Cytometry Machine (BD LSRFortessa) BD Biosciences
4 Laser Flow Cytometry Machine (BD FACSAria III) BD Biosciences
Flow Data Acquiring Software (BD FACSDiva Software v8.0a) BD Biosciences
Flow Data Analysis Software (FlowJo Software) BD Biosciences

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the Cardiac Fibroblast. Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).
  2. Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction: From Inflammation to Fibrosis. Circulatory Research. 119 (1), 91-112 (2016).
  3. Duan, J., et al. Wnt1/betacatenin injury response activates the epicardium and cardiac fibroblasts to promote cardiac repair. EMBO Journal. 31 (2), 429-442 (2012).
  4. Shinde, A. V., Frangogiannis, N. G. Fibroblasts in myocardial infarction: a role in inflammation and repair. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 70, 74-82 (2014).
  5. Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing. Nature Communications. 10 (1), 3027 (2019).
  6. Kong, P., Christia, P., Saxena, A., Su, Y., Frangogiannis, N. G. Lack of specificity of fibroblast-specific protein 1 in cardiac remodeling and fibrosis. American Journal of Physiology -Heart and Circulatory Physiology. 305 (9), 1363-1372 (2013).
  7. Furtado, M. B., Nim, H. T., Boyd, S. E., Rosenthal, N. A. View from the heart: cardiac fibroblasts in development, scarring and regeneration. Development. 143 (3), 387-397 (2016).
  8. Stellato, M., Czepiel, M., Distler, O., Blyszczuk, P., Kania, G. Identification and Isolation of Cardiac Fibroblasts From the Adult Mouse Heart Using Two-Color Flow Cytometry. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 105 (2019).
  9. Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulatory Research. 119 (8), 909-920 (2016).
  10. Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing. Nature Communications. 10 (1), 3027 (2019).
  11. Kalajzic, Z., et al. Use of an alpha-smooth muscle actin GFP reporter to identify an osteoprogenitor population. Bone. 43 (3), 501-510 (2008).
  12. Travers, J. G., Kamal, F. A., Robbins, J., Yutzey, K. E., Blaxall, B. C. Cardiac Fibrosis: The Fibroblast Awakens. Circulatory Research. 118 (6), 1021-1040 (2016).
  13. Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (3), 1274-1278 (1979).
  14. Montesano, R., Orci, L. Transforming growth factor beta stimulates collagen-matrix contraction by fibroblasts: implications for wound healing. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 85 (13), 4894-4897 (1988).
  15. Goldsmith, E. C., et al. Organization of fibroblasts in the heart. Developmental Dynamics. 230 (4), 787-794 (2004).
  16. Bagchi, R. A., Lin, J., Wang, R., Czubryt, M. P. Regulation of fibronectin gene expression in cardiac fibroblasts by scleraxis. Cell Tissue Research. 366 (2), 381-391 (2016).
  17. Goodpaster, T., et al. An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 347-358 (2008).
  18. Chapman, D., Weber, K. T., Eghbali, M. Regulation of fibrillar collagen types I and III and basement membrane type IV collagen gene expression in pressure overloaded rat myocardium. Circulatory Research. 67 (4), 787-794 (1990).
  19. Vasquez, C., Benamer, N., Morley, G. E. The cardiac fibroblast: functional and electrophysiological considerations in healthy and diseased hearts. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 380-388 (2011).
  20. Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 42 (5), 991-1000 (2007).
  21. Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
  22. Pinto, A. R., et al. Revisiting Cardiac Cellular Composition. Circulatory Research. 118 (3), 400-409 (2016).

Tags

Biologi Utgave 157 isolasjon αSMA fluorescens aktivert cellesortering fibroblaster myofibroblast kollagengel immunofluorescens MEFSK4
Isolasjon og karakterisering av voksen hjertefibroblaster og myofibroblaster
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Melzer, M., Beier, D., Young, P. P., … More

Melzer, M., Beier, D., Young, P. P., Saraswati, S. Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts. J. Vis. Exp. (157), e60909, doi:10.3791/60909 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter