Summary
Die Gewinnung einer reinen Population von Fibroblasten ist entscheidend für die Untersuchung ihrer Rolle bei der Wundreparatur und Fibrose. Beschrieben ist eine detaillierte Methode, um Fibroblasten und Myofibroblasten von unverletzten und verletzten Mausherzen zu isolieren, gefolgt von der Charakterisierung ihrer Reinheit und Funktionalität durch Immunfluoreszenz, RTPCR, Fluoreszenz-unterstützte Zellsortierung und Kollagen-Gel-Kontraktion.
Abstract
Herzfibrose als Reaktion auf Verletzungen ist eine physiologische Reaktion auf die Wundheilung. Es wurden Anstrengungen unternommen, um Fibroblasten-Subtypen zu untersuchen und zu zielen, die Fibrose mildern. Die Fibroblastenforschung wurde jedoch aufgrund des Fehlens universell akzeptabler Fibroblasten-Marker behindert, um ruhehafte sowie aktivierte Fibroblasten zu identifizieren. Fibroblasten sind eine heterogene Zellpopulation, was sie schwer zu isolieren und zu charakterisieren macht. Das vorgestellte Protokoll beschreibt drei verschiedene Methoden zur Anreicherung von Fibroblasten und Myofibroblasten aus unverletzten und verletzten Mausherzen. Die Verwendung eines Standard- und zuverlässigen Protokolls zur Isolierung von Fibroblasten wird die Untersuchung ihrer Rolle bei der Homöostase sowie der Fibrosemodulation ermöglichen.
Introduction
Herzfibroblasten, Zellen mesenchymaler Herkunft, spielen eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der elektrischen Leitung und mechanischen Kräfte im Herzen zusätzlich zur Aufrechterhaltung der Herzarchitektur während der Homöostase1. Nach der Verletzung werden diese Zellen aktiviert, erweitern und produzieren extrazelluläre Matrixproteine (ECM)2. Viele präklinische Studien haben Fibroblasten als kritische zelluläre Regulatoren aufgedeckt, die die strukturelle Integrität eines verletzten Herzens3 sowie Haupteffektorzellen, die für die unkontrollierte Produktion und Ablagerung von ECM-Proteinen verantwortlich sind, aufrecht erhalten, was zu einer steifen Narbenbildung und Herzinsuffizienzführt 4. Fibroblasten sind eine heterogene Gruppe von Zellen, was es schwierig macht, ihre reparative Funktion von pro-fibrotischen maladaptiven Eigenschaften zu sezieren. Kürzlich wurde die funktionelle Heterogenität von zwei unterschiedlichen Fibroblasten-Subtypen nach Einer Myokardverletzung definiert, was auf die Möglichkeit hindeutet, verschiedene Fibroblasten-Subtypen zu isolieren und ihre Rolle bei der Wundheilung zu untersuchen5.
Die Gewinnung einer reinen Fibroblastenpopulation ist entscheidend für die Abgrenzung ihrer funktionellen Rolle bei Derinstandunden- und Fibrose. Das Vorhandensein mehrerer Fibroblastenmarker, die andere Zelltypen erkennen, macht es jedoch schwierig, eine im Wesentlichen reine Fibroblastenpopulation zu isolieren6. Mehrere elegante Studien haben clevere Wege entwickelt, um Herzfibroblasten von unverletztem und verletztem Myokard zu isolieren. Die beliebteste und etablierteste Methode zur Anreicherung von Fibroblasten ist durch selektive Adhäsion nach enzymatischer Gewebeverdauung7.
Zusätzlich wurde die fluoreszenaktivierte Zellsortierung (FACS) von Fibroblasten auf Basis von Zelloberflächenantigenen erfolgreich beschrieben8. In der Studie wurden die mesenchymalen Zellen nach enzymatischer Verdauung als Lineage-negativ (Lin: Ter119-CD45-CD31)und gp38-positiv (gp38+) aus Mausherzen sortiert. Gp38+ve-Zellen wurden aufgrund ihrer Koexpression von col1-1 und anderen mesenchymalen Markern als Fibroblasten bestätigt. Obwohl die meisten Gewebeverdauungen nach dem Austeilen des Ventrikels in einer Petrischale abgeschlossen sind, hat eine aktuelle Studie die Verwendung einer direkten Nadelenzymperfusion des linken Ventrikels untersucht, um Myozyten und Nicht-Myozyten zu isolieren, die Fibroblasten enthalten9. Fibroblasten wurden dann in diesem Fall durch selektive Haftung isoliert.
Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung und Anreicherung von Fibroblasten mit drei Methoden. Die erste ist eine bereits etablierte Methode mit selektiver Adhäsion von Fibroblasten nach enzymatischer Verdauung. Die zweite Methode wird verwendet, um in erster Linie verletzungsinduzierte Alpha glatte Muskel exsemitenDe Myofibroblasten zu isolieren. Die dritte Methode beinhaltet die sequenzielle, magnetische Erschöpfung einer enzymverdauten Herzzellsuspension von hämatopoetischen und endotheliaalen Zellen. Nach erschöpfender Erschöpfung werden Fibroblasten/Myofibroblasten basierend auf dem Vorhandensein des Antigens MEFSK4 unter Verwendung magnetischer Perlen isoliert. Kürzlich wurde MEFSK4 als Antigen beschrieben, das sowohl bei ruhelösenden als auch bei aktivierten Fibroblasten vorliegt, was es zu einem geeigneten Marker für die Fibroblasten-Identifikation und -Isolierung macht. Natürlich haben alle hier beschriebenen Methoden einzigartige Einschränkungen. Es wird daher dringend empfohlen, die Reinheit der isolierten Zellpopulation durch Strömungsanalyse, Immunfärbung und semiquantitative Echtzeit-PCR zu überprüfen. Diese Methoden können jedoch erweitert werden, und zusätzliche Marker können hinzugefügt werden, um andere kontaminierende Populationen auszuschließen, bevor die Fibroblasten- und Myofibroblastenpopulationen für wichtige Experimente verwendet werden.
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Protocol
Diese Studie hält strikt an den Empfehlungen des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health fest. Der Vanderbilt University Institutional Animal Care and Use Committee genehmigte das Protokoll (Protokollnummer: M1600076-01).
1. Herzsektion
- Lösungsvorbereitung
- KHB-Puffer
- Mit einem Rührstab langsam 9,4 g Krebs-Henseleit-Pufferpulver (KHB) in 900 ml DDI-Wasser auflösen.
HINWEIS: Puffer wird ausfallen, wenn zu schnell oder zu lange gerührt. Der KHB-Puffer muss während der Fibroblastenisolation kalt sein. - 2,9 mM CaCl2 und 24 mM NaHCO3hinzufügen. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,2–7,3 ein und verdünnen Sie ihn auf ein Volumen von 1 L mit dH2O.
- Mit einem sterilen Filter (0,22 m) bis zu 4 °C lagern. Auf Eis oder bei 4 °C für die Dauer der Isolation.
- Mit einem Rührstab langsam 9,4 g Krebs-Henseleit-Pufferpulver (KHB) in 900 ml DDI-Wasser auflösen.
- Kollagenase Verdauungscocktail
- Bereiten Sie Verdauungscocktail am Tag der Fibroblasten-Isolierung vor. Bestimmen Sie das geeignete Volumen des Verdauungscocktails entsprechend der Anzahl der Herzen; 5 ml Cocktail pro 1 Herz.
- Bereiten Sie kollagennasemischung (siehe Tabelle der Materialien) und DNase I gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
- Für 20 ml Gesamtvergärungscocktail 17,5 l DNase I, 180 l 1 M HEPES und 500 l Kollagenase zu einem leeren 50 ml konischen Rohr geben.
- Fügen Sie ein ausreichendes Volumen von Hanks Balanced Salt Lösung (HBSS) mit Ca2+ und Mg2+ hinzu, um ein Gesamtvolumen von 20 ml zu erhalten.
- Red Blood Cell (RBC) Lysepuffer
- Bestimmen Sie das benötigte Gesamtvolumen basierend auf der Anzahl der Herzen (5 ml/Herz). Verdünnen Sie den 10x RBC Lyse-Lagerpuffer mit dH2O auf 1x.
- Fibroblastenmedien: 10% FBS in DMEM F-12
- Fügen Sie 10% FBS zu DMEM-F12 mit L-Glutamin und HEPES hinzu. Fügen Sie 10 U/ml Penicillin/Streptomycin, 2,5 g/ml Antimykotika und 2,5 g/ml Mykoplasmen prophylaktisch hinzu (siehe Materialtabelle). Bei 4 °C lagern.
- KHB-Puffer
- Herzsektion
- Bereiten Sie eine 6 Brunnenplatte auf Eis mit 2 ml kaltem KHB pro Brunnen vor, um Herzen während der Zerlegung zu speichern. Verwenden Sie autoklavierte chirurgische Schere und Zange.
- Euthanisieren Sie Mäuse im Alter von 12 Wochen oder älter durch Isofluran-Überdosierung, und folgen Sie mit zervikalen Dislokation.
- Alternativ können Sie bei aktivierter Fibroblastenisolation einen Myokardinfarkt bei 12 Wochen alten Mäusen durch koronare Arterienligation10induzieren. Euthanisieren Sie die Mäuse 8-10 Tage nach der Verletzung.
- Sprühen Sie Körper mit 70% Ethanol und orientieren, so dass die ventrale Seite dem Experimentator gegenüber steht. Anhänge anheften oder zurückhalten, um Interferenzen zu vermeiden.
- Schneiden Sie die Bauchhaut und den Muskel auf, aber vermeiden Sie das Durchstechen der Leber. Schneiden Sie vertikal in Richtung des Brustbeins, und öffnen Sie vorsichtig den Thorax, während das Piercing des Herzens zu vermeiden. Fahren Sie fort, durch den Brustkorb zu schneiden, um das Herz freizulegen.
- Heben Sie das Herz mit Zangen sanft aus der Brust und schneiden Sie alle Lungen oder überschüssiges Gewebe ab, das an der Außenseite des Herzens befestigt ist. Entfernen Sie den Ventrikel und legen Sie ihn in einen Brunnen von 6 Brunnenplatten mit kaltem KHB. Setzen Sie die Herzen auf diese Weise fort, bis alle Proben isoliert wurden.
- Enzymatische Dissoziation des Herzens
- Mit Zangen, immer wieder drücken und agitieren das Herz in KHB, um überschüssiges Blut zu entfernen. Übertragen Sie das Herz auf eine saubere sterile 10 cm2 Platte. Mit einer einschneidigen Klinge, schnell das Herz in kleine Stücke zerkleinern.
- Fügen Sie 1 ml Kollagennase-Verdauungscocktail hinzu und weiter hacken, bis die Stücke klein genug sind, um sie mit einer 1 ml Mikropipette zu übertragen. Stücke auf ein 50 ml konisches Rohr mit einer 1 ml Mikropipette übertragen. Waschplatte 2x mit 2 ml Kollagenase-Verdauungscocktail.
HINWEIS: Das Abschneiden eines Teils der Pipettenspitze kann helfen, größere Herzstücke zu sammeln, die sonst in der Pipettenspitze stecken bleiben könnten. - Konische Röhre bei 37 °C für 30 min mit Schaukeln oder Rührung inkubieren. Sicheres Rohr nach Bedarf. 10x mit einer 5 ml Pipette aufheben, bis der Inhalt homogen ist, und das konische Rohr bei 37 °C für 15 min mit Drehung oder Rührung inkubieren.
- 10x mit einer 10 ml Pipet bis homogen aussetzen. Setzen Sie ein 40 m'm-Zellensieb ein, indem Sie den Filter mit 1–2 ml KHB-Puffer auf einem neuen 50 ml konischen Rohr benetzen. Fügen Sie 25 ml KHB-Puffer zur Verdauungssuspension hinzu, suspendieren und filtern Sie durch ein grundiertes 40-m-Zellsieb. Ändern Sie den Filter nach Bedarf.
HINWEIS: Wenn sich die Filtration verlangsamt, kann ein leicht esbendes Rohr oder die Verwendung einer 1 ml Mikropipette zum Ziehen einer Suspension von der Unterseite des Filters der Zellsuspension helfen, ein teilweise blockiertes 40-m-Zellsieb zu durchlaufen. - Zentrifuge bei 400 x g und 4 °C für 10 min. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 1x RBC-Lysepuffer (5 ml/Herz) wieder auf. Inkubieren Sie für 2 min bei Raumtemperatur (RT).
- Zentrifuge bei 400 x g und RT für 10 min. Überstand entfernen und dann waschen, indem Sie Pellet in 1 ml KHB-Puffer wieder aufhängen.
- Fügen Sie 9 ml KHB-Puffer hinzu und filtern Sie durch grundiertes 40-m-Zellsieb in ein neues 50 ml konisches Rohr. Zentrifuge bei 400 x g und RT für 10 min.
- Entfernen Sie den Überstand, setzen Sie sich in 1 ml Fibroblastenmedium oder PBS wieder aus, und bestimmen Sie die Zellnummer. Fibroblasten können mit den drei unten beschriebenen Methoden isoliert werden.
2. Isolierung von Fibroblasten von Dereinzelsuspension
- Fibroblastenisolierung: Differentialbeschichtung (Abbildung 1)
- Bereiten Sie eine 6-Well-Platte vor, indem Sie 2 ml Fibroblastenmedien pro Brunnen hinzufügen und die Platte wirbeln, um den Brunnenboden zu bedecken.
- Resuspend Zellen in 1 ml Medien pro Herz. Platte 1 ml Zellsuspension pro Brunnen, so dass ein Herz (theoretisch) pro Brunnen plattiert wird. Zum Beispiel würden sechs Herzen in 6 ml Medien resuspendiert und dann in sechs Brunnen mit 1 ml Zellsuspension pro Brunnen plattiert.
- Wirbelplatte, um Zellen gleichmäßig zu verteilen. Fügen Sie ein zusätzliches 1–2 ml Medium pro Brunnen für ein Gesamtvolumen von bis zu 5 ml pro Bohrgut hinzu und brüten Bei 37 °C für 4 h.
- Fibroblasten werden durch selektive Haftung nach 4 h getrennt. Entfernen Sie ungebundene und abgestorbene Zellen, indem Sie Medien entfernen. Angebundene Zellen mit 2 ml PBS waschen und 2–4 ml sterile Fibroblastenmedien pro Brunnen hinzufügen. Bei 37 °C bis zur Konvergung inkubieren. Wechseln Sie alle 2–4 Tage die Medien.
- Fibroblastisolation: FACS mit einem GFP-Reporter-Mausmodell (Abbildung 1)
- FACS-Puffer
- Bereiten Sie 15 ml von 5% fetalem Rinderserum (FBS) in dPBS ohne Ca2+ und Mg2+vor. Auf Eis oder bei 4°C aufbewahren.
- FC-Blockerlösung
- Bereiten Sie 0,5 L FC-Blocker (gereinigte Anti-Maus-CD16/CD32) in 25 l FACS (1:50 Verdünnung) vor. Pro Probe sind 25 L FC-Blockerlösung erforderlich. Auf Eis oder bei 4 °C aufbewahren.
- Probenvorbereitung und Antikörperfärbung
HINWEIS: Antikörperverdünnungen können im Voraus vorbereitet werden, aber dies kann Licht- oder Temperaturexposition riskieren.- Bereiten Sie 7AAD oder Ghost Dye violett 510 vor, das ist 2x die erforderliche Verdünnung im FACS-Puffer. Siehe Tabelle 1 für Antikörper und Verdünnungen.
- 500.000 frisch isolierte Zellen in 25 L FC-Blockerlösung aussetzen, um eine unspezifische Bindung der FC-Antikörperregion an einen FC-Rezeptor zu verhindern. 5 min bei RT inkubieren.
- Fügen Sie 7AAD oder Ghost Dye violett 510 Antikörper auf das endige Volumen von 25 l Zellsuspension. Inkubieren Sie für 30-60 min auf Eis im Dunkeln.
- Waschen durch Erneutaussetzen in 1 ml FACS-Puffer. Zentrifuge bei 500 x g für 5 min bei 4°C.
- Resuspend Pellet in empfohlener Durchflusszytometrie Probenvolumen des FACS-Puffers (300 l) und Übertragung in Diedurchflusszytometrierohr.
- Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS)
HINWEIS: GFP-SMA Reportermäuse waren ein Beitrag von Dr. Ivo Kalajzic11. Diese Maus drückt GFP unter dem Alpha-Glattmuskelzell-Promotor aus. SMA wurde als Marker für aktivierte Fibroblasten (Myofibroblasten)12verwendet.- Für aktivierte Fibroblasten (SMA, die Myofibroblasten ausdrücken) Isolation, induzieren Myokardinfarkt bei 12 Wochen alten GFP-SMA-Mäusen durch koronare Arterienligation. Opfern Sie die Mäuse 8-10 Tage nach der Verletzung.
- Nach der einzelzelligen Suspension aus den verletzten Mäuseherzen sortieren Sie sMA+ve Fibroblasten nach grünem fluoreszierendem Protein (GFP). Verwenden Sie unbefleckte, nicht verletzte Fibroblasten, um das Hintergrundsignal im GFP-Kanal nach der Kompensation einzustellen.
- Gate für lebende GFP+ve Zellen durch Gating für 7AAD-ve/GFP+ve Zellen oder Ghost Dye violett 510-ve/GFP+ve Zellen und sortieren GFP exemitenklich sMA+ve Myofibroblasten. Sammeln Sie die Zellen in Fibroblastenmedien.
- FACS-Puffer
- Fibroblastenisolation: magnetische Perlenisolierung von Fibroblasten (Abbildung 1)
- Ausgleichspuffer
HINWEIS: Bereiten Sie immer einen neuen Puffer für Isolierungen vor.- Bereiten Sie 0,5% BSA und 2 mM EDTA in PBS vor. Entgasen Sie den Puffer, indem Sie die Lösung rühren, während Sie ein Vakuum am Deckel des Behälters befestigen.
HINWEIS: Rühren entfernt überschüssiges Gas aus der Lösung, die dann durch das Vakuum entfernt wird, so dass Blasen die Trennsäule bei der Verwendung nicht verstopfen.
- Bereiten Sie 0,5% BSA und 2 mM EDTA in PBS vor. Entgasen Sie den Puffer, indem Sie die Lösung rühren, während Sie ein Vakuum am Deckel des Behälters befestigen.
- Magnetische Etikettierung: CD45+ hämatopoetische Zellen
- Zentrifuge isolierte Zellen von Mäuseherzen bei 500 x g für 5 min, dann entfernen Sie den Überstand.
- Setzen Sie das Zellpellet in 1 ml Ausgleichspuffer wieder auf. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
- Zentrifugieren Sie die Zellsuspension wie oben und setzen Sie das Zellpellet in 90 L Ausgleichspuffer pro 1 x 107 Gesamtzellen wieder auf. Fügen Sie 10 L CD45+ magnetische Perlen pro 1 x 107 Gesamtzellen hinzu. Gut mischen und mindestens 15 min bei 4°C inkubieren.
- Waschen Sie Zellen durch Zugabe von 2 ml Gleichgewichtspuffer pro 1 x 107 Gesamtzellen, dann Zentrifuge bei 500 x g für 10 min bei 4°C.
- Überstand entfernen, die Zellen mit einem Hämozytometer zählen und bis zu 1 x 107 Gesamtzellen in 2 ml Ausgleichspuffer wieder aussetzen. Wenn mehr als 107 Zellen vorhanden sind, skalieren Sie den Puffer linear. Übergeben Sie Zellen durch einen 40-mm-Filter, um zu verhindern, dass Zellaggregationen die Trennsäulenmatrix verstopfen.
- Magnetische Trennung: CD45+ hämatopoetische Zellen
- Legen Sie die Trennsäule in das Magnetfeld eines geeigneten Separators und einer Ausgleichssäule mit mindestens 3 ml PBS.
- Sammeln Sie nicht beschriftete Zellen im Flowthrough (FT) und waschen Sie die Säule 3x mit 3 ml Ausgleichspuffer. Sammeln Sie Wähes mit FT. Entfernen Sie die Spalte aus dem Trennzeichen. Platzieren Sie die Säule auf einem 15 ml konischen Rohr.
- Spülen Sie magnetisch beschriftete CD45+ Zellen aus, indem Sie 5 ml Ausgleichspuffer auf die Säule pfeifen und die Zellen mit einem mit der Säule gelieferten Kolben fest eintauchen.
- Zentrifugeneluent sowie FT/Waschfraktionen bei 500 x g. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
- Magnetische Etikettierung und Trennung: CD31+ Endothelzellen
- Wiederholungsprotokoll für CD45+ magnetische Etikettierung und Trennung (Abschnitte 2.3.2–2.3.3), außer CD31+ magnetische Perlen verwenden, um mit dem FT zu inkubieren und Teile aus der CD45+ Isolierung zu waschen.
- Magnetische Etikettierung und Trennung: MEFSK4+ Fibroblasten
- Wiederholen Sie das Protokoll für CD45+ magnetische Etikettierung mit dem MEFSK4 Anti-Feeder-APC-Antikörper anstelle von Magnetperlen. Zentrifugieren Sie die FT- und Wash-Teile aus der CD31+ Isolierung bei 500 x g für 5 min, dann entfernen Sie Überstand. Setzen Sie das Zellpellet in 1 ml Ausgleichspuffer aus, und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
- Fügen Sie 10 L MEFSK4 Anti-Feeder-APC-Antikörper pro 1 x 107 Zellen hinzu. Mindestens 15 min bei 4 °C inkubieren.
- Waschen Sie MEFSK4-Antikörpergebundene Zellen, indem Sie 5 ml Ausgleichspuffer pro 1 x 107 Gesamtzellen hinzufügen, dann Zentrifuge bei 500 x g für 5 min.
- Entfernen Sie Überstand und Resuspend in Anti-APC-Perlen, mit dem gleichen Volumen von MEFSK4 Anti-Feeder-APC-Antikörper verwendet. 15 min bei 4 °C auf Eis bebrüten.
- Zentrifugieren bei 500 x g für 10 min. Überstand entfernen, in 2 ml Gleichgewichtspuffer pro 1 x 107 Gesamtzellen wieder aufsetzen und mit der magnetischen Trennung fortfahren, wie zuvor beschrieben (Abschnitt 2.3.3). Magnetisch getrennte MEFSK4+ve/ CD45-ve/CD31-ve Fibroblasten können für Reinheitsanalysen und andere nachgeschaltete Anwendungen verwendet werden.
- Ausgleichspuffer
3. Reinheits- und Funktionsanalyse der isolierten Fibroblastenpopulation
- FACS-Populationsreinheitsanalyse: SMA-GFP-Zellanalyse (Abbildung 2)
- Heben Sie frisch isolierte Zellen in 25 l fc Blockerlösung ab, um die unspezifische Bindung von Antikörpern zu verhindern. 5 min bei RT inkubieren.
- Optional: Fügen Sie 25 L 7AAD oder Ghost Farbstoff violett 510 zur Zellsuspension hinzu. Inkubieren Sie für 30-60 min auf Eis im Dunkeln.
- Waschen durch Erneutaussetzen in 1 ml FACS-Puffer. Zentrifuge bei 500 x g für 5 min.
- Pellet in 50 L FACS-Puffer resuspendieren. Cd31-PE-, CD45-APC- und AN2/NG2-Antikörper direkt zur Zellsuspension hinzufügen. 15 min auf Eis inkubieren (Tabelle 1).
- Waschen durch Erneutanhalten in 1 ml FACS-Puffer. Zentrifuge bei 400 x g für 5 min.
- Fügen Sie Esel Anti-Ratte AlexaFluor 405 sekundären Antikörper zu den Zellen, die mit unkonjugierten primären Antikörper gekennzeichnet sind. 30 min auf Eis bebrüten.
- Waschen durch Erneutaussetzen in 1 ml FACS-Puffer. Zentrifuge bei 400 x g für 5 min.
- Resuspend Pellet in empfohlener Durchflusszytometrie Probenvolumen des FACS-Puffers (300 l) und Übertragung in ein beschriftetes Durchflusszytometrierohr für die Strömungsanalyse.
HINWEIS: Die FACS-Analyse zur Charakterisierung der Expression von MEFSK4-Antigen auf isolierte Fibroblasten wird in Abschnitt 3.3 beschrieben.
- Fibroblasten-Reinheitsanalyse: Immunfluoreszenz (Abbildung 3A)
- Samen 30.000 primäre Fibroblasten (P0-P1) pro Brunnen auf Decklippen in einer 24 Brunnenplatte und Kultur bis 80% konfluent platziert. Oder konzentrieren Sie sortierte CD45+ und CD31+ Zellen (30.000 Zellen pro Brunnen) auf einem Deckzettel von Cytospin bei 400 x x g (eine Methode, die verwendet wird, um Zellen direkt und gleichmäßig auf einen Deckzettel in einer 24-Well-Platte zu deponieren).
- Fix Zellen mit kaltem Aceton für 15 min. Waschen Sie 3x mal mit PBS.
- Blockrutschen in 10% Ziegenserum. Inkubationsschlitten mit primären Antikörpern über Nacht (Tabelle 2).
- Schlitten 3x in PBS waschen. Sekundärantikörper für 2 h inkubieren (Tabelle 2).
- Gegenfleck-Rutschen und mounten Sie mit einem Tropfen DAPI in langsam verblassenden Montagemedien.
- FACS-Populationsreinheitsanalyse: MEFSK4-Sondierung (Abbildung 3B)
- Heben Sie frisch isolierte Zellen in 25 l FC-Blockerlösung aus, um die unspezifische Bindung von Antikörpern zu verhindern. 5 min bei RT inkubieren.
- Optional: Fügen Sie 25 L 7AAD oder Ghost Farbstoff violett 510 zur Zellsuspension hinzu. Inkubieren Sie für 30-60 min auf Eis im Dunkeln.
- Waschen durch Erneutaussetzen in 1 ml FACS-Puffer. Zentrifuge bei 500 x g für 5 min.
- Pellet in 50 L FACS-Puffer resuspendieren. Fügen Sie MEFSK4-Antikörper direkt zur Zellsuspension hinzu. 15 min auf Eis brüten (Tabelle 1).
- Waschen durch Erneutaussetzen in 1 ml FACS-Puffer. Zentrifuge bei 400 x g für 5 min.
- Fügen Sie Ratte IgG-APC zu den Zellen hinzu (Tabelle 1). 30 min auf Eis bebrüten.
- Waschen durch Erneutaussetzen in 1 ml FACS-Puffer. Zentrifuge bei 400 x g für 5 min.
- Resuspend Pellet in empfohlener Durchflusszytometrie Probenvolumen des FACS-Puffers (300 l) und Übertragung in Durchflusszytometrierohr für die Strömungsanalyse.
- Fibroblasten-Reinheitsanalyse: semiquantitative Echtzeit-rtPCR (Abbildung 3C)
- RNA-Isolation und semiquantitative Echtzeit-PCR
- Nach der Anreicherung von Fibroblasten kannen Sie RNA mit einem RNA-Isolationskit isolieren (siehe Tabelle der Materialien). Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers.
- Vervollständigen Sie die DNA-Synthese des ersten Strangs mit einem cDNA-Synthesekit (siehe Tabelle der Materialien),die den Anweisungen des Herstellers folgend.
- Führen Sie semiquantitative Echtzeit-PCR5durch.
- Fibroblasten-Funktionsanalyse: Kollagen-Gel-Kontraktilitätstest (Abbildung 4)
- Kollagenlösung
- Bereiten Sie 20 mM HEPES und 44 mM NaHCO3 in DMEM vor. 1,67 mg Rattenkollagen typ 1 pro 1 ml DMEM mit HEPES und NaHCO3hinzufügen.
- TGF-ergänzung DMEM
- Bereiten Sie 10% FBS in DMEM mit Antibiotika und Anti-Pilz. Fügen Sie TGF zu einer Endkonzentration von 1 ng/ml hinzu.
- Zell/Kollagen-Mischung und Beschichtung
- Bereiten Sie die Zellsuspension (P3-P5) vor und bestimmen Sie das erforderliche Volumen, um 3,3 x 105 Zellen zu erhalten.
- Fügen Sie das Suspensionsvolumen mit 3,3 x 105 Zellen zu einer ausreichenden Kollagenlösung hinzu, um 1 ml Gesamtvolumen zu erhalten.
HINWEIS: Die Konzentration von Rattenkollagen Typ 1 sollte jetzt 1,5 mg/ml betragen. - In einer 48-Well-Platte, Samen 300 l Zell-Kollagen-Mix pro Brunnen (ca. 1 x 105 Zellen/ Well). Bei 37 °C für 15–20 min inkubieren, bis gegelt wird.
- Verwenden Sie eine 30 G Nadel, um Gel von den Brunnenwänden zu trennen. Fügen Sie jedem Brunnen 600 L TGF und FBS hinzu, die DMEM ergänzen. Bildschilder auf einem reflektierenden Scanner bei 24 h und 48 h.
HINWEIS: Alle Immunfluoreszenzexperimente wurden an einer Durchflusszytometriemaschine durchgeführt, die mit drei Lasern (405 nm, 488 nm und 640 nm) ausgestattet ist. Die Daten wurden mit Hilfe einer Flow Data Acquiring Software (Tabelle der Materialien) erfasst. Weitere Datenanalysen wurden mit einer Flow-Data-Analyse-Software durchgeführt. AlexaFluor 405 und Ghost Dye Violet 510 wurden mit dem 405 nm Laser begeistert und mit einem 450/50 BP bzw. 525/50 BP Filter gesammelt. GFP und PE wurden durch den 488 nm Laser begeistert und mit den Filtern 530/30 BP bzw. 575/26 BP gesammelt. Entweder APC oder AlexaFluor 647 wurde durch den 640 nm Laser begeistert und mit einem 670/14 BP Filter gesammelt. Alle Zellsortierungsexperimente wurden an einer Durchflusszytometriemaschine(Materialtabelle) durchgeführt, die mit vier Lasern (405 nm, 488 nm, 561 nm und 640 nm) ausgestattet war. 7-AAD wurde mit dem 561 nm Laser aufgeregt und mit einem 670/14 BP Filter gesammelt. GFP und Ghost Dye Violet 510 wurden mit den gleichen Laser/Filter-Kombinationen wie oben beschrieben gesammelt. Alle Sortierexperimente nutzten eine 100 Umdüse mit einer 17 psi Druckkonfiguration für eine erhöhte nachgeschaltete Lebensfähigkeit der Zielzellen.
- Kollagenlösung
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Representative Results
Strömungs-Gating-Schema demonstriert Myofibroblast-Isolation mit SMA-GFP-Reportermäusen
Unverletzte Herzen zeigten keine nachweisbaren GFP+ Zellen im Mausmodell des SMA-GFP-Reporters; Daher wurden sie verwendet, um ein Tor für das Hintergrundsignal des GFP-Kanals nach der Kompensation zu errichten (Abbildung 2). SMA+ Zellen wurden auf der Grundlage des Vorhandenseins der GFP-Expression aus dem verletzten linken Ventrikel 10 Tage nach MI sortiert. Ein kleiner Prozentsatz der endotheliale (GFP+/CD31+ Zellen; SD = 3,8 % bei 0,0164; n = 5) und hämatopoetische (GFP+/CD45+ Zellen; SD = 3,18 % bei 0,0112; n = 5) Zellen exprimiert enprimieren auch GFP in den verletzten SMA-GFP-Mausherzen (Abbildung 2A). GFP+/CD31-/CD45-Zellen drückten jedoch keinen Pericytenmarker aus.
Unverletzte (ruheverstümmelnde) und verletzte (aktivierte, sMA+GFP+) zellierte Fibroblasten-Marker
GFP+-Zellen, die von SMA-GFP-Mäusen isoliert wurden, exprimierten sMA, KollagenTyp 1 Alpha-1-Kette (COL1-1), Vimentin und Periostin, wenn sie durch IF-Analyse analysiert wurden. Nicht verletzte Fibroblasten, die durch selektive Adhäsion isoliert wurden, exprimiert enden, aber keine Expression der aktivierten Fibroblasten zeigten: SMA, Periostin und COL11 (Abbildung 3A). Sowohl unverletzte als auch aktivierte Fibroblasten exprimiert das MEFSK4-Antigen, wenn es durch Strömungsanalyse analysiert wurde (Abbildung 3B). Magnetisch isolierte MEFSK4+ve-Zellen aus unverletzten Mäuseherzen drückten Marker von Fibroblasten aus: Col1a1, pdgfr, und Periostin. Im Gegensatz dazu hatten magnetisch isolierte CD45- und CD31-positive Zellen eine vernachlässigbare Expression von Fibroblastenmarkern.
Fibroblasten und Myofibroblasten zeigten die Fähigkeit, Kollagen zu ziehen
In der Zellkultur auf steifem Kunststoff haben Sich Fibroblasten gezeigt, dass sie Kollagengele in Gegenwart von TGF-Präzistkontrakten zusammenziehen, was ihre funktionelle Leistungsfähigkeit der Kontraktion13,14demonstriert. Diese In-vitro-Charakteristik von Fibroblasten ist der Bindegewebskontraktion, die während der Gewebereparatur sowie anderen biologischen Prozessen auftritt, sehr ähnlich. Sowohl unverletzte Fibroblasten, isoliert durch selektive Adhäsion, als auch Myofibroblasten, isoliert und sortiert von SMA-GFP-Mäusen, zeigten eine Fähigkeit, kollagen zu veranlagen (Abbildung 4).
Abbildung 1: Schematische Fibroblastenisolation mit drei verschiedenen Ansätzen. (A) Differentialbeschichtung, (B) GFP+ Zellsortierung von SMA-positiven Zellen und (C) magnetische Rinnsbasierte Isolierung von Fibroblasten. Repräsentatives helles Feld der Zellen in der Kultur nach Differentialbeschichtung. Maßstabsleiste = 50 M. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: FACS-Analyse einzelner Zellen, die nach MI aus den Herzherzen von SMA-GFP-Mäusen isoliert wurden. (A) Repräsentatives FACS-Gating-Schema, das GFP+-Zellen demonstriert, die CD31, CD45 oder AN2 von SMA-GFP-Mäusen mit dem Ausdruck von CD31, CD45 oder AN2 belegen, verletzten 10 Tage nach dem Myokardinfarkt (MI) Die Herzen. (B) Grafische Quantifizierung der vorgelegten FACS-Daten für Post-MI-Herzen; n = 5 Experimente wurden unabhängig voneinander durchgeführt (***p < 0.0001, berechnet mit einwegig ANOVA mit Tukeys Mehrfachvergleichstest). Diese Figur ist von Saraswati et al.10adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Reinheitsanalysen von Fibroblasten, die von unverletzten und verletzten Mäuseherzen isoliert sind. (A) Immunfluoreszenzfärbung von Zellpopulationen (P0) aus dem Herzen von unverletzten oder verletzten SMA-GFP-Mäusen, sortiert nach FACS. Sowohl unverletzte als auch aktivierte Zellen exprimieren Fibroblasten (FB) Marker, wie COL11, und Vimentin, aber nicht hämatopoetische Marker CD45 oder den endotheliale Marker CD31. Zellen, die aus verletzten Mäusen isoliert wurden, exprimierte aktivierte Fibroblastenmarker, SMA und Periostin, die nicht in den Zellen vorhanden waren, die von unverletzten Mäuseherzen isoliert wurden. Nuclei wurden mit DAPI gefärbt, n = 3 Experimente wurden unabhängig voneinander durchgeführt. Scale bar = 100 m . (B) Repräsentatives FACS-Overlay-Histogramm von unverletzten und aktivierten Fibroblasten (P3–P5), die die Expression des Fibroblastenmarkers MEF-SK4 zeigen. Für eine Negativkontrolle wurde Ratten-IgG verwendet, n = 2 Experimente wurden unabhängig durchgeführt. (C) Relative Faltenänderung von Col11, Pdgfraund Postn Transkripten in unverletzten MEKSK4+ve-Fibroblasten, n = 3 Experimente wurden unabhängig durchgeführt (*p < 0,05, wie mit zweiseitiger ANOVA mit Tukeys Mehrfachvergleichstest berechnet). (A) und (B) sind von Saraswati et al.10adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Funktionelle Charakterisierung von Fibroblasten, die von unverletzten und verletzten Mausherzen isoliert sind. Repräsentative Figur der Kollagen-Gelkontraktion in Gegenwart von unverletzten und verletzten aktivierten SMA+ Fibroblasten (P3–P5). Die Grafik stellt die prozentuale Veränderung des ursprünglichen Gelbereichs nach 24 h und 48 h Kontraktion dar, wenn sie mit unverletzten und verletzten aktivierten SMA+ Fibroblasten inkubiert wird, n = 2 Experimente wurden unabhängig voneinander durchgeführt. Diese Figur ist von Saraswati et al.10adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Antikörper | Zellziel | Verdünnung |
| 7AAD | Abgestorbene Zellen | 1:1000 |
| Geisterfarbstoff violett 510 | Abgestorbene Zellen | 1:1000 |
| APC-CD45 | Hämatopoetische Zellen | 1:200 |
| PE-CD31 | Endothelzellen | 1:200 |
| Anti-AN2/NG2 | Pericytes | 1:11 |
| Esel Anti-Ratte alexa Fluor 405 | Sekundärer Antikörper | 1:100 |
| Anti-Feeder-Zellen-APC (MEFSK4) | Fibroblasten | 1:100 |
| Ratte IgG-APC | Isotype-Steuerung | 1:100 |
Tabelle 1: FACS Farbstoffe und Antikörper.
| Primärer Antikörper | Verdünnung | |
| •glatter Muskelaktin (SMA) | 1:1000 | |
| Fibroblastenspezifisches Protein 1 (FSP1)1:250 | 1:100 | |
| COL 1 | 1:1000 | |
| Periostin | 1:100 | |
| Vimentin | 1:200 | |
| CD31 | 1:250 | |
| CD45 | 1:250 | |
| Sekundärer Antikörper | Verdünnung | |
| Ziege Anti-Maus Alexa Fluor 488 | 1:200 | |
| Ziege Anti-Kaninchen-FITC | 1:200 | |
| Ziege Anti-Kaninchen-Cy3 | 1:200 | |
| Ziege Antiratat Alexa Fluor 488 | 1:200 | |
| Ziege Antiratat Alexa Fluor 647 | 1:200 | |
Tabelle 2: Primäre und sekundäre Antikörper mit Immunfluoreszenz.
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Discussion
Fibroblasten sind eine heterogene Gruppe von Zellen, die durch verschiedene Marker identifiziert werden. Die Proteinmarker, die verwendet wurden, um Fibroblasten zu identifizieren, sind Discoidin-Domänenrezeptor 2 (DDR2), Fibronectin, Vimentin, Kollagen I und III und Thy115,,16,17,18,19,20. Während Vimentin verwendet wurde, um unverletzte stille Herz-Fibroblasten zu identifizieren, wurden Fibroblasten-spezifisches Protein 1, SMA und Periostin nachweislich verletzungsinduzierte aktivierte Fibroblasten identifiziert, wobei sMA der häufigste Marker zum Nachweis aktivierter Fibroblasten6,12,21ist. Darüber hinaus haben Tcf21- und MEFSK4-Proteine in jüngster Zeit Anerkennung bei der Erkennung sowohl von ruhestillenden Fibroblasten, die in nicht verletztem Herzgewebe gefunden wurden, als auch bei aktivierten Fibroblasten einschließlich Myofibroblasten, die in verletzten Mausherzen gefundenwurden, erlangt 21,22.
Dieses Protokoll verwendet drei verschiedene Ansätze, um Fibroblasten und aktivierte Fibroblasten einschließlich Myofibroblasten zu isolieren und anzureichern. Die Fähigkeit des Fibroblasten, bevorzugt an Kunststoff zu haften, wird im ersten Ansatz zur Isolierung verwendet. Nach enzymatischer Verdauung mit Liberase wird die einzellige Suspension von Zellen auf einer Kunststoffschale gesät, um bevorzugt haften zu können. Die Unfähigkeit vieler Nicht-Fibroblasten-Zellen, an der Polystyroloberfläche von Petrischalen zu haften, ermöglicht es uns, alle Medien aus der Schale zu entfernen und bei einer relativ reinen Population von Fibroblasten zu bleiben. Ein Vorbehalt der Verwendung dieser Technik ist, obwohl Fibroblasten bevorzugt an der Polystyrolschale haften, einige kontaminierende Nicht-Fibroblasten-Zellen können auch anhaften, so dass eine nicht-homogene Population von Zellen.
Die zweite Isolationstechnik nutzt FACS, um Myofibroblasten von anderen Zellen zu trennen. Im hier verwendeten transgenen Mausmodell wird GFP ausschließlich zusammen mit dem SMA ausgedrückt, so dass Myofibroblasten, die SMA enthalten, von einer FACS-Maschine durch die fluoreszierenden Fähigkeiten von GFP erkannt werden können. Dieses Isolationsverfahren ermöglicht es uns, eine Population von Zellen zu erhalten, die etwa 99% Myofibroblast ist. Die Reinheitsanalysen dieser Zellen wurden von Saraswati et al.10ausführlich beschrieben.
Die dritte Isolationstechnik ist eine effiziente Möglichkeit, sowohl unverletzte als auch aktivierte Fibroblasten durch magnetische Perlentrennung der MEFSK4-Exemittierzelle zu isolieren. Durch die Möglichkeit, eine einzellige Suspension an Anti-CD45- und Anti-CD31-Magnetperlen zu binden und aufgrund von Magnetfeldeffekten in einer Matrix immobilisiert zu werden, ermöglichte dies die Trennung aller hämatopoetischen sowie endotheliaalen Zellen, die die Fibroblastenisolation. Da MEFSK4 vor kurzem als zuverlässiger Marker zur Identifizierung von Fibroblasten verwendet wurde, kann ein Antikörper angewendet werden, der an MEFSK4-exzessende Zellen bindet. Nach der Bindung einer magnetischen Perle an den Antikörper, wodurch ein Komplex entsteht, der die Isolierung von Fibroblasten ermöglicht, wird der magnetische Perlenzellkomplex durch eine Matrix in einem Magnetfeld geleitet und eine hoch angereicherte Fibroblastenpopulation erhalten. Die Reinheit der isolierten Fibroblastenpopulation sollte durch Immunfärbungs-, RTPCR- und Durchflusszytometrie-Analysen beurteilt werden.
Wie bei jeder anderen Technik gibt es Einschränkungen bei den in diesem Manuskript beschriebenen Techniken. Die Einschränkung des selektiven Haftprotokolls und der magnetischen Perlenisolierung besteht darin, dass diese Methoden nicht zwischen stillen und aktivierten Fibroblasten unterscheiden. Um aktivierte Fibroblasten zu bereichern, sollte die Isolierung 8-10 Tage nach einem Myokardinfarkt durchgeführt werden. Darüber hinaus ist es wichtig, die Reinheit der Isolierung mit anderen Fibroblastenmarkern zu überprüfen. MEFSK4-positive Fibroblastenreinheit wurde nur von RTPCR nachgewiesen, es wird empfohlen, (durch Immunfärbung und Durchflusszytometrieanalyse) mit anderen Fibroblastenmarkern und Markern zu testen, die kontaminierende Zelltypen einschließlich hämatopoetischer (CD45), Endothel (CD31) und Pericyten (AN2). Wenn möglich, könnten andere fibroblastenspezifische Marker verwendet werden, um die Fibroblastenpopulation weiter zu sortieren oder magnetisch zu isolieren.
Die Verwendung von SMA-GFP-Mäusen zur Isolierung und Sortierung von Myofibroblasten ist eine zuverlässige Technik, um eine aktivierte Fibroblastenpopulation zu erhalten. In der Strömungsanalyse wurde jedoch ein vernachlässigbarer Prozentsatz hämatopoetischer und endotheliale Zellen beobachtet. Um diese Technik zu verbessern, sollten die Zellen CD45+ve/CD31+ve und AN2+ve aus der GFP+ve /sMA+ve-Zellensortierung ausgeschlossen werden. Da das SMA ein weithin akzeptierter Marker von Myofibroblasten ist, ist das Mausmodell für Reporter-Mausen ein wertvolles Werkzeug, das genutzt werden sollte, um Myofibroblasten im Zusammenhang mit Myokardverletzungen zu untersuchen.
Es gibt mehrere wichtige Schritte zur Fehlerbehebung, die berücksichtigt werden müssen. Die Verdauungszeit kann verkürzt werden, wenn die Zelllebensfähigkeit und ausbeutend beeinflusst wird. Ein Rührstab sollte nicht verwendet werden, um die Verdauungsmischung zu rühren, da dies die Zelllebensfähigkeit beeinträchtigt. Die Röhre sollte auf einer Wippe oder in einem Schüttelinkubator gesichert werden, um die Verdauungsmischung sanft zu rühren. Das 10x mit einer 5 ml oder 10 ml Pipette verdauten Gewebe wieder aufzuhängen, ist entscheidend für die richtige Trennung der Zellen.
Die richtige rote Blutzelllyse der einzelzelligen Suspension muss genutzt werden, wenn Zellen durch Durchflusszytometrie sortiert oder analysiert werden sollen. Für die magnetische Perlenisolierung ist die Entgasung des Puffers unerlässlich, um das Einbringen von Luftblasen in der Säule zu verhindern. Die für die magnetische Perlenzellisolation verwendete Säule sollte nicht zwischen verschiedenen magnetisch-konjugierten Zellen wiederverwendet werden. Beispielsweise sollte eine neue Spalte verwendet werden, um CD45+ Zellen zu trennen, die nach der Elution der CD45+ Zellen verworfen werden sollen, und dann eine weitere neue Spalte für die CD31+ Zellisolation. In unseren Händen haben wir keine Kontamination von Pericyten in isolierten/sortierten Fibroblasten gesehen. MEFSK4 erkennt jedoch nachweislich Pericyten22. Es wird daher empfohlen, einen zusätzlichen Schritt zu verwenden, um Pericyte (AN2) aus den einzelnen Zellen zu sortieren/magnetisch zu deplete. Obwohl dieses Protokoll bei 12 Wochen alten Mäusen validiert ist, kann die Technik für jüngere oder ältere Mäuse verwendet werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Autoren möchten Dr. Ivo Kalajzic für die SMA-GFP-Mäuse danken. Die in dieser Publikation berichtete Forschung wurde vom National Institute of General Medical Sciences der National Institutes of Health (NIH) unter der Award-Nummer R01GM118300 (S.S.), National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering des NIH unterstützt. unter Award Number R21EB019509 (P.P.Y.) und Scientist Development Grant der American Heart Association unter Award Number 17SDG33630187 (S.S.). Flow-Zytometrie-Analysen wurden am VUMC Flow Cytometry Shared Resource durchgeführt, das vom Vanderbilt Ingram Cancer Center (P30 CA68485) und dem Vanderbilt Digestive Disease Research Center (DK058404) unterstützt wird.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Acetone | |||
| Anti-fungal (Amphotericin B-solubilized; Fungizone) | Sigma Aldrich | A9528 | |
| Bovine Serium Albumin (BSA) | Sigma | 9048-46-8 | |
| Calcium chloride | |||
| Citrate Buffer | |||
| Collagenase blend (Liberase Blendzyme 3 TH) | Roche Applied Science | ||
| DAPI | |||
| DDI water | |||
| DI water | |||
| DMEM-F12 with L-Glutamine and HEPES | Life technologies | 11330057 | |
| Dnase I(20U/mL) | BioRad | 7326828 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (dPBS) without Ca2+ and Mg2+ | Gibco | 13190-144 | |
| 70% Ethanol | |||
| FC Blocker (Purified anti-mouse CD16/CD32) | Tonbo Biosciences | 70-0161 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 16000044 | |
| 10% goat serum | |||
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 21-023-CV | |
| 1M HEPES | Corning | 25-060-Ci | |
| Krebs-Henseleit Buffer powder | Sigma | K3753 | |
| Mycoplasma prophylactic (Plasmocin) | Invivogen | ant-mpp | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | |||
| 10x Red Blood Cell Lysis Buffer | Miltenyi | 130-094-183 | |
| Slow-fade Mounting Media | |||
| Sodium azide | |||
| Sodium bicarbonate | |||
| TGFβ | |||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Type 1 Rat Collagen | |||
| Antibodies | |||
| 7AAD (stock: 1 mg/mL solution in DMSO) | Molecular Probes | A1310 | dilution = 1:1000; RRID = |
| CD45-APC | BD Bioscience | 559864 | dilution = 1:200; RRID = AB_398672 |
| CD31-PE | BD Bioscience | 553373 | dilution = 1:200; RRID = AB_394819 |
| CD31 | BD Biosciences | 553370 | dilution = 1:250; RRID = AB_394816 |
| CD45 | BD Biosciences | 553076 | dilution = 1:250; RRID = AB_394606 |
| COL 1α1 | MD Bioproducts | 203002 | dilution = 1:1000; RRID = |
| Ghost dye violet 510 (Formulation: 1 uL/test in DMSO) | Tonbo Biosciences | 13-0870 | dilution = 1:1000; RRID = |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11029 | dilution = 1:200; RRID = AB_138404 |
| Goat anti-rabbit-Cy3 | Southern Biotech | 4050-02 | dilution = 1:200; RRID = AB_2795952 |
| Goat anti-rabbit-FITC | Jackson Immunoresearch Laboratories | 711-165-152 | dilution = 1:200; RRID = AB_2307443 |
| Goat anti-rat Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11006 | dilution = 1:200; RRID = AB_2534074 |
| Goat anti-rat Alexa Fluor 647 | Thermo-Fisher | A21247 | dilution = 1:200; RRID = AB_141778 |
| Periostin | Santa Cruz | SC67233 | dilution = 1:100; RRID = AB_2166650 |
| Vimentin | Sigma Aldrich | V2258 | dilution = 1:200; RRID = AB_261856 |
| α-smooth muscle actin (αSMA) | Sigma Aldrich | A2547 | dilution = 1:1000; RRID = AB_476701 |
| Fibroblast specific protein 1 (FSP1) | Millipore 07-2274 | 07-2274 | dilution = 1:100; RRID = AB_10807552 |
| CD45 Magnetic Beads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| CD31 Magnetic Beads | Miltenyi Biotec | 130-087-418 | |
| Anti-feeder cells-APC (MEFSK4) | Miltenyi Biotec | 130-102-900 | dilution = 1:100; RRID = AB_2660619 |
| anti-APC Beads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| Rat IgG-APC | Miltenyi Biotec | 130-103-034 | dilution = 1:100; RRID = AB_2661598 |
| Donkey anti-rat Alexa Fluor405 | Abcam | ab175670 | dilution = 1:100 |
| anti-AN2/NG2 | Miltenyi Biotec | 130-097-455 | dilution = 1:11; RRID = AB_2651235 |
| Other Materials | |||
| 0.22 µm Filter | Thermo Scientific | 723-2520 | |
| 10 cm2 Cell Culture Dish | Corning | 430167 | |
| 10 mL Pipet | Fisherbrand | 13-678-11E | |
| 40 µm Cell Strainer | Fisherbrand | 22363547 | |
| 5 mL Pipet | Fisherbrand | 13-678-11D | |
| 50 mL Conical Tube | Falcon | 352070 | |
| 6-well Plate | Corning | 3506 | |
| Flow Cytometry Tubes | Falcon | 352058 | |
| Forceps | |||
| Rocker | |||
| Single Edge Blade | PAL | 62-0177 | |
| Surgical Scissors | |||
| GFP-αSMA Reporter Mice | |||
| MACS Separator Magnetic Field | |||
| MACS Separation Column | |||
| Coverslips | |||
| Qaigen Rneasy Mini Kit | Qaigen | 74104 | |
| Ambion RNAqueous Micro Total Isolation Kit | Ambion | AM1931 | |
| BioRad iScript cDNA Syntehsis Kit | BioRad | 1708891 | |
| 48-well Plate | |||
| 30G Needle | |||
| 3 Laser Flow Cytometry Machine (BD LSRFortessa) | BD Biosciences | ||
| 4 Laser Flow Cytometry Machine (BD FACSAria III) | BD Biosciences | ||
| Flow Data Acquiring Software (BD FACSDiva Software v8.0a) | BD Biosciences | ||
| Flow Data Analysis Software (FlowJo Software) | BD Biosciences |
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