Biology

בידוד ואפיון של מבוגרים ופיברותקיעות לב ומיופיברופיצוצים

Published: March 12, 2020 doi: 10.3791/60909

Meiling Melzer¹, David Beier¹, Pampee P. Young^1,2, Sarika Saraswati¹

¹Department of Pathology, Microbiology, and Immunology, Vanderbilt University Medical Center, ²American Red Cross, National Headquarters

Summary

קבלת אוכלוסייה טהורה של פיברותקיעות חיונית כדי ללמוד את תפקידם בתיקון פצעים פיברוזיס. המתואר כאן היא שיטה מפורטת כדי לבודד את הפיברוכדורים ומיוריסותליות מלבבות העכבר שנפגעו ונפצעו ולאחר מכן אפיון הטוהר והפונקציונליות שלהם על ידי immunofluorescence RTPCR, מיון תאים בסיוע פלואורסצנטית, ו התכווצות ג'ל לקולגן.

Abstract

פיברוזיס של הלב בתגובה לפציעה היא תגובה פיזיולוגית לריפוי הפצע. המאמצים נעשו כדי ללמוד ולמקד את סוגי בפיברוהפיצוץ המרכך פיברוזיס. עם זאת, מחקר פיברולפיצוץ כבר הפריע בשל חוסר של סמנים מקובלים בגידולים המקובלים לזהות שקט כמו גם הפעלת פיברופיצוצים. פיברותקיעות הם אוכלוסיית תאים הטרוגניים, מה שמקשה עליהם לבודד ולאפיין. הפרוטוקול המוצג מתאר שלוש שיטות שונות להעשיר את הגידולים השונים והמייופיברוונים מלבבות העכבר הפצועים. באמצעות פרוטוקול רגיל ואמין כדי לבודד הפיברוכדורים יאפשר לימוד תפקידם הומאוסטזיס כמו גם פיברוזיס אפנון.

Introduction

פיברותקיעות לב, תאים של מוצא mesenchymal, לשחק תפקיד משמעותי בשמירה על הולכה חשמלית וכוחות מכניים בלב בנוסף תחזוקה של אדריכלות לב במהלך הומאוסטזיס¹. בעקבות פציעה, תאים אלה מופעלים, להרחיב, ולייצר מטריצה החילוץ (ECM) חלבונים². מחקרים רבים קדם קליניים חשפו פיברומופיצוצים כמו הרגולטורים הסלולר קריטי השומרים על השלמות המבנית של הלב הפצוע³ , כמו גם התאים העיקריים אפקטור אחראי על ייצור לא מסומנת והפקדת חלבונים ecm, וכתוצאה מכך היווצרות צלקת נוקשה אי ספיקת לב⁴. פיברותקיעות הם קבוצה הטרודוגני של תאים, מה שהופך אותו מאתגר לנתח את הפונקציה שלהם מתמנת מפני מאפיינים מסתגלת pro-פיברוטיק. לאחרונה, הטרוגניות תפקודית של שני תת שונים בפיברוהפיצוץ בעקבות פציעה שריר הלב הוגדרו, המציין את האפשרות של בידוד שונים סוגי הפיצוץ בפיברומות ולימוד תפקידם בפצע ריפוי⁵.

קבלת האוכלוסייה טהור פיברוהפיצוץ הוא חיוני בתיחום התפקיד הפונקציונלי שלהם בתיקון פיברוזיס. עם זאת, הנוכחות של סמנים מרובים פיברומסט המכירים סוגי תאים אחרים להפוך אותו מאתגר לבודד את האוכלוסייה טהור באופן משמעותי הפיברובלסט⁶. מספר מחקרים אלגנטיים המציאו דרכים חכמות כדי לבודד פיברוהכדורים מפני שריר הלב נפצע ופצע. השיטה הפופולרית ביותר ומבוססת היטב של העשרת הגידולים היא דרך הדבקה סלקטיבית בעקבות עיכול הרקמה האנזימטית⁷.

בנוסף, מיון תא מופעל על-ידי קרינה פלואורסצנטית (FACS) של פיברותקיעות מבוסס על משטח תאים אנטיגנים שתוארו בהצלחה⁸. במחקר, בעקבות העיכול האנזימטי, התאים המסנכטיים ממוינים כשושלת שלילית (לין^{: Ter119-}^CD45-CD31-) וgp38-חיובי (gp38⁺⁾מלבבות העכבר. Gp38^{+ ve} תאים אושרו להיות פיברופיצוצים מבוסס על שיתוף הביטוי שלהם של col1α1 וסמנים mesenchymal אחרים. למרות שרוב העיכול הרקמות מושלם לאחר שהוא מבתר את החדר בצלחת פטרי, מחקר שנערך לאחרונה חקר את השימוש במחט האנזים הישיר של החדר השמאלי כדי לבודד מיוציטים ולא מיאלוציטים אשר כוללים פיברופיצוצים⁹. במקרה זה בודלו באמצעות הדבקה סלקטיבית.

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד וההעשרה של הפיברותקיעות בשלוש שיטות. הראשונה היא שיטה מבוססת הכוללת הדבקה סלקטיבית של פיברומטיות בעקבות העיכול האנזימטי. השיטה השנייה משמש בעיקר בידוד פציעה המושרה אלפא שרירים המבטא מיופיברופיצוצים. השיטה השלישית כוללת רציפים, דלדול מגנטי של השעיית תאי לב אנזימים מתעכלים של תאי המטפאות ואנדותל. בעקבות דלדול, פיברותקיעות/מיופיברופיצוצים מבודדים מבוסס על נוכחות של אנטיגן MEFSK4 באמצעות חרוזים מגנטיים. לאחרונה, MEFSK4 תוארה כאנטיגן נוכח על השקט כמו גם הפעלת פיברותקיעות, מה שהופך אותו סמן מתאים לזיהוי פיברוהפיצוץ ובידוד. כמובן, לכל השיטות המתוארות כאן יש מגבלות ייחודיות. לכן מומלץ מאוד לבדוק את הטוהר של אוכלוסיית התאים המבודדים באמצעות ניתוח זרימה, כתמים, וכמותי למחצה-PCR בזמן אמת. עם זאת, ניתן להרחיב את המתודולוגיות הללו, וניתן להוסיף סמנים נוספים כדי שלא לכלול אוכלוסיות מזהם אחרות לפני ניצול הפיברוהפיצוץ ואוכלוסיות מיופיברומות לניסויים מכריעים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

מחקר זה מקיים בקפדנות את ההמלצות במדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המכון הלאומי לבריאות. הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים באוניברסיטת ואנדרבילט אישרה את הפרוטוקול (מספר פרוטוקול: M1600076-01).

1. ניתוח לב

הכנה לפתרון
1. מאגר KHB
  1. באמצעות מהומה בר, לאט לפזר 9.4 g של מאגר Krebs-Henseleit (KHB) אבקה ב 900 mL של מים DDI.
    הערה: המאגר יקצר אם הוא מעורבב מהר מדי או במשך זמן רב מדי. מאגר KHB חייב להיות קר במהלך בידוד פיברוהפיצוץ.
  2. הוסף 2.9 mM CaCl₂ ו 24 מ"מ נחקו₃. כוונן את ה-pH ל-7.2 – 7.3 ודלל לנפח של 1 ל' עם dH₂O.
  3. שימוש במסנן סטרילי (0.22 μm), מאחסן ב-4 ° צ' עד 4 שבועות. המשיכו בקרח או בארבע מעלות צלזיוס למשך הבידוד.
2. קולגנאז קוקטייל עיכול
  1. הכינו קוקטייל עיכול ביום של בידוד פיברובלסט. לקבוע את הנפח המתאים של קוקטייל העיכול בהתאם למספר לבבות; 5 מ ל של קוקטייל לכל 1 לב.
  2. הכנת מיזוג הקולגן (ראה טבלת חומרים) ו-DNase אני על פי הוראות היצרן.
  3. עבור 20 מ ל של קוקטייל העיכול הכולל, להוסיף 17.5 μL של DNase I, 180 μL של 1 M HEPES, ו 500 μL של הקוליטאז כדי ל50 רוקן את צינור ה-mL.
  4. הוסף נפח מספיק של הפתרון של מלח מאוזן של האנק (HBSS) עם Ca^{2 +} ו-Mg^{2 +} כדי להשיג נפח כולל של 20 מ ל.
3. מאגר לליזה תא דם אדום (RBC)
  1. קבע את הנפח הכולל הדרוש בהתבסס על מספר לבבות (5 מ ל/לב). דלל את מאגר המלאי של 10 x RBC לפירוק 1x באמצעות dH₂O.
4. מדיה פיברובלסט: 10% FBS בשנת DMF-12
  1. הוסף 10% FBS כדי Dמאמ-F12 עם L-גלוטמין ו-HEPES. הוסף/י/סטרפטומיצין/מניעת הפניצילין (ראה טבלת חומרים), 2.5 μg/ml נגד פטריות, 2.5 μg/ml. חנות ב -4 ° c.
ניתוח לב
1. הכינו צלחת 6 היטב על הקרח עם 2 מ ל של KHB קר לכל טוב לאחסן לבבות במהלך הניתוח. שימוש אוטומטי מספריים ומלקחיים כירורגיים.
2. להרוג עכברים בגיל 12 ומעלה על ידי מנת יתר של isofלוריאן, ולעקוב אחר פריקה צוואר הרחם.
3. לחילופין, עבור הבידוד המופעל בידוד, לגרום אוטם שריר הלב ב 12 שבועות עכברים ישנים על ידי העברה עורק כלילי¹⁰. המתת חסד העכברים 8 – 10 ימים לאחר הפציעה.
4. תרסיס גוף עם 70% אתנול ו המזרח כך הצד הגחוני פונה לניסויים. להצמיד או לרסן תוספות כדי למנוע הפרעות.
5. חותכים את עור הבטן ואת השריר פתוח אבל להימנע פירסינג בכבד. חותכים אנכית לכיוון עצם החזה, ופותחים בזהירות את החזה תוך הימנעות פירסינג של הלב. המשיכו לחתוך את הצלעות. כדי לחשוף את הלב
6. באמצעות מלקחיים, להרים בעדינות את הלב מתוך החזה, לחתוך את כל הריאות או רקמות עודף המצורפת אל מחוץ ללב. להסיר את החדר ואת המקום בבאר אחת של 6 צלחת היטב עם KHB קר. המשך לנתח את הלבבות באופן זה עד שכל הדגימות מבודדות.
דיסוציאציה של לב אנזימטית
1. באמצעות מלקחיים, לסחוט שוב ושוב מתפרעים את הלב ב-KHB כדי להסיר עודף דם. העבר את הלב לצלחת נקייה של 10 ס מ² . באמצעות להב בודד קצה, במהירות להחיש את הלב לחתיכות קטנות.
2. להוסיף 1 מ ל של הקולגן העיכול קוקטייל ולהמשיך מועט עד חתיכות קטנות מספיק כדי להעביר עם 1 mL מיקרופיפטה. להעביר חתיכות לצינור 50 mL עם מיקרופיפטה 1 mL. לשטוף את הצלחת 2x עם 2 מ ל של הקולגן העיכול קוקטייל.
  הערה: גזירת חלק מעצת הפיפטה יכולה לסייע באיסוף פיסות לב גדולות יותר שעלולות להיתקע בקצה הפיפטה.
3. מיכל הצינור החרוט ב 37 ° c במשך 30 דקות עם נדנדה או עצבנות. . צינור מאובטח לפי הצורך השהה מחדש 10x עם 5 מ ל מחית מחמד עד שהתוכן הינו הומוגניים, והוא משלב את צינורית החרוט ב-37 ° צ' במשך 15 דקות עם סיבוב או עצבנות.
4. השהה מחדש 10x עם מחית 10 mL עד הומוגנית. פריים 40 יקרומטר מסננת תא על ידי הרטבת את המסנן עם 1 – 2 מ ל של מאגר khb על גבי צינור חדש 50 mL חרוט. הוסף 25 מ ל של מאגר khb כדי השעיית העיכול, השעיה מחדש, ולסנן דרך מסננת תא מ40 יקרומטר. שנה את המסנן בהתאם לצורך.
  הערה: כאשר סינון מאט, הקשה בקלות על צינור או באמצעות מיקרופיפטה 1 mL כדי לצייר השעיה מהצד התחתון של מסנן יכול לעזור ההשעיה תא לעבור דרך מסננת התאים חסומים חלקית 40 יקרומטר.
5. צנטריפוגה ב 400 x g ו 4 ° צ' עבור 10 דקות. הסר את הסופרנטאנט והשהה מחדש את הגלולה במאגר להסרת 1 x rbc (5 מ ל/לב). דגירה עבור 2 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
6. צנטריפוגה ב 400 x g ו RT עבור 10 דקות. הסר supernatant ולאחר מכן לשטוף על ידי השעיית גלולה 1 מ ל של מאגר khb.
7. הוסף 9 מ ל של מאגר khb ומסנן דרך מסננת תא מ40 יקרומטר לתוך צינור חדש 50 mL. צנטריפוגה ב 400 x g ו RT עבור 10 דקות.
8. הסר את הסופרנטאנט, השהה מחדש 1 מ ל של מדיה בפיברובלסט או PBS, וקבע את מספר הטלפון. ניתן לבודד את הפיברותקיעות בשלוש השיטות השונות המתוארות להלן.

2. בידוד של פיברותקיעות מתא יחיד הבולם

בידוד פיברובלסט: ציפוי משלים (איור 1)
1. הכינו צלחת 6-היטב על-ידי הוספת 2 מ ל של מדיה פיברולפיצוץ לבאר ומתערבל את הצלחת לכסות את התחתון היטב.
2. השהה תאים מחדש ב-1 מ ל של מדיה בכל לב. צלחת 1 מ ל של השעיית תא בצורה כזו שהלב (תיאורטית) מצופה בטוב. לדוגמה, שישה לבבות יהיה מושהה מחדש 6 מ ל של מדיה, ולאחר מכן מצופה שש בארות עם 1 mL של השעיית תא לכל טוב.
3. צלחת מערבולת כדי לפזר תאים באופן שווה. הוסיפו מדיה נוספת של 1 – 2 מ ל לכל היותר עבור נפח כולל של עד 5 מ"ל לכל טוב, ו-מודטה ב 37 ° c עבור 4 h.
4. פיברותקיעות תהיה מופרדת על ידי הדבקה סלקטיבית לאחר 4 שעות. הסר תאים שאינם מחוברים ומתים על-ידי הסרת מדיה. שטוף תאים מחוברים עם 2 מ ל של PBS ולהוסיף 2 – 4 מ"ל מדיה סטרילית הפיצוץ החיטוי לכל טוב. מודטה ב 37 ° c עד שוטפת. שנה את המדיה כל יומיים עד 4 ימים.
בידוד פיברובלסט: FACS באמצעות מודל העכבר הכתבת GFP (איור 1)
1. מאגר FACS
  1. להכין 15 מ ל של 5% סרום בפרה עוברית (FBS) ב dPBS ללא Ca^{2 +} ו-Mg^{2 +}. החנות בקרח או ב -4 ° c.
2. פתרון חוסמי FC
  1. הכינו 0.5 μL חוסם FC (מטוהרים נגד עכבר CD16/CD32) ב 25 μL של FACS (1:50 דילול). 25 μL של פתרון חוסמי FC נדרש לכל מדגם. החנות בקרח או ב -4 ° c.
3. הכנה לדוגמה ומכתים נוגדנים
  הערה: הנוגדן יכול להיות מוכן מראש, אבל זה עלול לסכן אור או טמפרטורה חשיפה.
  1. הכינו 7AAD מ או צבע רפאים סגול 510 כי הוא 2x הדילול הנדרש מאגר FACS. ראו שולחן 1 לנוגדנים ולדילול.
  2. השהה מחדש 500,000 תאים מבודדים טריים ב 25 μL של פתרון חוסם FC כדי למנוע איגוד ספציפי של אזור הנוגדן FC לקולטן FC. דגירה עבור 5 דקות ב RT.
  3. הוסף 7AAD מ או צבע רפאים סגול 510 נוגדן לנפח הסופי של 25 μL של השעיית תא. דגירה של 30-60 דקות על הקרח בחושך.
  4. כביסה באמצעות השעיית מחדש ב-1 mL של מאגר FACS. צנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.
  5. השהה מחדש את הגלולה בזרימה המומלצת cy, try לדוגמה נפח של מאגר FACS (300 μL) והעברה לצינור הצינורית cy, לזרום.
4. מיון תאים עם הפעלה פלואורסצנטית (FACS)
  הערה: עכברים מכתב GFP-αSMA היו תרומה של ד ר איבו קאלאג'זץ '¹¹. עכבר זה מבטא GFP תחת תא אלפא שריר חלק (αSMA) מקדם. αSMA שימש כסמן של הפיברוכדורים המופעל (מיופיברופיצוצים)¹².
  1. עבור פיברובלסט המופעל (αSMA ביטוי מיופיברופיצוץ) בידוד, לגרום אוטם שריר הלב בתוך 12 השבוע בן GFP-αSMA עכברים על ידי הארכה עורק כלילי. להקריב את העכברים 8 – 10 ימים לאחר הפציעה.
  2. בעקבות השעיה תא יחיד מן הלבבות עכברים פצועים, למיין αSMA^{+ ve} פיברופיצוצים עבור חלבון פלורסנט ירוק (gfp). השתמש בפיברופיצוצים לא מוכתמות כדי להגדיר את אות הרקע בפיצוי שלאחר התשלום בערוץ GFP.
  3. שער לחיות GFP^{+ ve} תאים על ידי המשך 7aad מ^-ve/gfp⁺ תאים או צבע רפאים סגול 510^-ve/GFP^{+ Ve} תאים ולמיין gfp המבטא αSMA^{+ ve} מיופיברופיצוצים. לאסוף את התאים בתקשורת פיברובלסט.
בידוד פיברובלסט: בידוד מגנטי מבוסס חרוז של פיברותקיעות (איור 1)
1. מאגר שיווציה
  הערה: הכינו תמיד מאגר טרי לבודדים.
  1. להכין 0.5% BSA ו 2 מ"מ EDTA ב-PBS. דגה את המאגר על ידי ערבוב הפתרון תוך הצמדת ואקום למכסה של המיכל.
    הערה: הערבוב מסיר גזים עודפים מהפתרון שהוסר לאחר מכן דרך הוואקום, כך שבועות לא סותמים את עמודת ההפרדה בעת השימוש.
2. תיוג מגנטי: CD45⁺ תאי המטפאות
  1. צנטריפוגה תאים מבודדים מן עכברים לבבות ב 500 x g עבור 5 דקות, ולאחר מכן להסיר את supernatant.
  2. השהה מחדש את הגלולה בתא 1 מ ל של מאגר שיווציה. לספור את התאים באמצעות הומוציטומטר.
  3. צנטריפוגה את ההשעיה התא כמו מעל והשהה מחדש את הגלולה תא ב 90 μL מאגר משקל לכל 1 x 10⁷ כולל תאים. הוסף 10 μL של CD45⁺ חרוזים מגנטיים לכל 1 x 10⁷ כולל תאים. מערבבים היטב ומשלבים לפחות 15 דקות ב -4 ° c.
  4. לשטוף את התאים על ידי הוספת 2 מ ל מאגר משקל עבור 1 x 10⁷ סך הכל תאים, אז צנטריפוגה ב 500 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c.
  5. הסר supernatant, לספור את התאים באמצעות הומוציטוטומטר לשחזר עד 1 x 10⁷ כולל תאים ב 2 מ ' של מאגר שיווציה. אם יותר מ-10^שבעה תאים קיימים, קנה מידה ליניארי של המאגר. העבר תאים באמצעות מסנן של 40 יקרומטר כדי למנוע צבירות של תאים מסתימת מטריצת עמודת ההפרדה.
3. הפרדה מגנטית: CD45⁺ תאי המטפאות
  1. מקם את עמודת ההפרדה בשדה המגנטי של מפריד מתאים ועמודה מתאימה עם לפחות 3 מ ל של PBS.
  2. לאסוף תאים ללא תווית ב flowthrough (FT), ולשטוף את העמודה 3x עם 3 מ ל של מאגר שיווציה. איסוף שוטף עם FT. הסר את העמודה ממפריד. מקם את העמודה בשפופרת חרוט של 15 מ ל.
  3. לרוקן את התווית CD45⁺ תאים על ידי ליטוף 5 מ ל של מאגר שיווציה על העמודה ואת צולל בחוזקה את התאים עם בוכנה שסופקו עם העמודה.
  4. משחרר הצנטריפוגה, כמו גם FT/לשטוף שברים ב 500 x g. לספור את התאים באמצעות הומוציטומטר.
4. תיוג והפרדה מגנטיים: CD31⁺ תאים אנדותל
  1. לחזור על הפרוטוקול עבור CD45⁺ מגנטי תיוג והפרדה (סעיפים 2.3.2 – 2.3.3), למעט להשתמש בחרוזים CD31⁺ מגנטי כדי לדגירה עם FT ולשטוף חלקים מCD45⁺ בידוד.
5. תיוג והפרדה מגנטיים: MEFSK4⁺ פיברותקיעות
  1. הפרוטוקול חזור על CD45⁺ תיוג מגנטי באמצעות הנוגדן MEFSK4 anti-משתמש-APC במקום חרוזים מגנטיים. צנטריפוגה את FT ולשטוף חלקים מן CD31⁺ בידוד ב 500 × g עבור 5 דקות, ואז להסיר supernatant. השהה מחדש את הגלולה ב-1 מ ל של מאגר שיווציה, וספור את התאים באמצעות הומוציטומטר.
  2. הוסף 10 μL של MEFSK4 anti-מאכיל-APC עבור 1 x 10⁷ תאים. מודטה לפחות 15 דקות ב -4 ° c.
  3. לשטוף את התאים MEFSK4 נוגדן על ידי הוספת 5 מ ל של מאגר equilibration לכל 1 x 10⁷ כולל תאים, ואז צנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דקות.
  4. הסר supernatant ולהשעות מחדש בחרוזים נגד APC, באמצעות אותו כמות של MEFSK4 anti-מאכיל-APC בשימוש. מודקון על הקרח במשך 15 דקות ב -4 ° c.
  5. צנטריפוגה ב 500 x g עבור 10 דקות. הסר supernatant, להשעות מחדש ב 2 מ ל של מאגר שיווציה לכל 1 x 10⁷ כולל תאים, ולהמשיך עם הפרדה מגנטית כפי שתוארה בעבר (סעיף 2.3.3). מגנטוסטי מופרדים MEFSK4^{+ ve}/CD45^-ve/cda 31^-ve פיברותקיעות יכול לשמש ניתוח טוהר ויישומים אחרים במורד הזרם.

3. בדיקת טוהר ופונקציונליות של אוכלוסיית פיברובלסט מבודדים

ניתוח טוהר של אוכלוסיית FACS: αSMA-GFP ניתוח תאים (איור 2)
1. השהה מחדש תאים מבודדים טריים ב -25 μL של הפתרון של חוסם Fc כדי למנוע את האיגוד הלא ספציפי של נוגדנים. דגירה עבור 5 דקות ב RT.
2. אופציונלי: להוסיף 25 μL של 7AAD מ או צבע רפאים סגול 510 להשעיה התא. דגירה של 30-60 דקות על הקרח בחושך.
3. כביסה באמצעות השעיית מחדש ב-1 mL של מאגר FACS. צנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דקות.
4. השהה מחדש את הגלולה ב-50 μL של מאגר FACS. הוסף CD31-PE, CD45-APC, ו AN2/NG2 נוגדנים ישירות ההשעיה התא. דגירה עבור 15 דקות על הקרח (שולחן 1).
5. כביסה באמצעות השעיית מחדש ב-1 מאגר FACS. צנטריפוגה ב 400 x g עבור 5 דקות.
6. הוסף חמור נגד חולדה AlexaFluor 405 נוגדן משני לתאים המסומנים עם נוגדן ראשוני מצועם. מודקון למשך 30 דקות על הקרח.
7. כביסה באמצעות השעיית מחדש ב-1 mL של מאגר FACS. צנטריפוגה ב 400 x g עבור 5 דקות.
8. השהה מחדש את הגלולה בזרימה המומלצת cy, try לדוגמה נפח של מאגר FACS (300 μL) והעברה לצינור שכותרתו הזרמת cy, לצורך ניתוח זרימה.
  הערה: ניתוח FACS כדי לאפיין את הביטוי של אנטיגן MEFSK4 על פיברותקיעות מבודדים מתואר בסעיף 3.3.
ניתוח טוהר פיברובלסט: אימונולואונציה (איור 3א)
1. זרעים 30,000 הגידול הראשוני (P0-P1) לכל גם על שמיכות ממוקם ב 24 צלחת ותרבות עד 80% confluent. או להתרכז מיון CD45⁺ ו CD31⁺ תאים (30,000 תאים לכל טוב) על שמיכות על ידי ציטוספין ב 400 x × g (שיטה המשמשת להפקיד תאים ישירות ובאופן שווה על גבי coverslip ב 24 צלחת הבאר).
2. תקן תאים עם אצטון קר עבור 15 דקות. שטוף 3x פעמים עם PBS.
3. לחסום שקופיות ב 10% סרום עז. דגירה שקופיות עם נוגדנים העיקרי לילה (טבלה 2).
4. לשטוף שקופיות 3 x ב-PBS. מודיית נוגדנים משניים עבור 2 h (שולחן 2).
5. שקופיות מפני כתמים ו-mount עם טיפה אחת של DAPI במדיה הרכבה איטית בעמעום.
ניתוח טוהר של אוכלוסיית FACS: MEFSK4 בודק (איור 3ב)
1. השהה מחדש תאים מבודדים טריים ב-25 μL של הפתרון של חוסם FC כדי למנוע את האיגוד הלא ספציפי של נוגדנים. דגירה עבור 5 דקות ב RT.
2. אופציונלי: להוסיף 25 μL של 7AAD מ או צבע רפאים סגול 510 להשעיה התא. דגירה של 30-60 דקות על הקרח בחושך.
3. כביסה באמצעות השעיית מחדש ב-1 mL של מאגר FACS. צנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דקות.
4. השהה מחדש את הגלולה ב-50 μL של מאגר FACS. להוסיף נוגדן MEFSK4 ישירות השעיית התא. דגירה עבור 15 דקות על הקרח (שולחן 1).
5. כביסה באמצעות השעיית מחדש ב-1 mL של מאגר FACS. צנטריפוגה ב 400 x g עבור 5 דקות.
6. הוסף עכברוש IgG-APC לתאים (שולחן 1). מודקון למשך 30 דקות על הקרח.
7. כביסה באמצעות השעיית מחדש ב-1 mL של מאגר FACS. צנטריפוגה ב 400 x g עבור 5 דקות.
8. השהה מחדש את הגלולה בזרימה המומלצת cy, try לדוגמה נפח של מאגר FACS (300 μL) והעברה לזרם cy, להזרים צינור לניתוח זרימה.
ניתוח של טוהר פיברובלסט: בזמן אמת כמותי (איור 3ג)
1. רנ א בידוד ו-PCR כמותי בזמן אמת
2. בעקבות העשרת הפיברוטידים, בידוד RNA באמצעות ערכת בידוד RNA (ראו טבלת חומרים). בצע את הוראות היצרן.
3. השלם סינתזה DNA הראשון באמצעות ערכת סינתזה cDNA (ראה טבלת חומרים), בעקבות הוראות היצרן.
4. בצע כמותי למחצה בזמן אמת-PCR⁵.
ניתוח הפונקציונליות של פיברובלסט: שיטת קולגן ג'ל (איור 4)
1. תמיסת קולגן
  1. הכינו 20 מ"מ HEPES ו 44 mM נחקו₃ ב-dmem. הוסף 1.67 מ"ג מסוג 1 קולגן העכברוש ל 1 מ ל של DMEM עם HEPES ו-נחקו₃.
2. מTGFβ בתוספת הזיכרון
  1. הכינו 10% FBS בתוספת אנטיביוטיקה ואנטי פטרייתי. הוסף TGFβ לריכוז הסופי של 1 ng/mL.
3. תא/קולגן תערובת וציפוי
  1. להכין השעיה התא (P3-P5) ולקבוע נפח נדרש כדי להשיג 3.3 x 10⁵ תאים.
  2. הוסף נפח ההשעיה עם 3.3 x 10⁵ תאים מספיק קולגן פתרון כדי להשיג 1 mL נפח כולל.
    הערה: קולגן סוג עכברוש 1 ריכוז צריך כעת להיות 1.5 mg/mL.
  3. ב 48 צלחת הבאר, זרעים 300 μL של תא-קולגן ערבוב לכל טוב (~ 1 x 10⁵ תאים/טוב). מודקון ב 37 ° צ' במשך 15 – 20 דקות עד gelled.
  4. השתמשו במחט של 30 גר' כדי לסייע בהפרדת ג'ל מהקירות. הוסף 600 μL של TGFβ ו-FBS שנוספו DMEM לכל טוב. לוחיות תמונה על סורק רפלקטיבי. בשעה 24 h ו 48 h
    הערה: כל הניסויים Immunofluorescence בוצעו על מכונת הזרימה cy, מצויד בשלושה לייזרים (405 nm, 488 nm, ו 640 nm). הנתונים נרכשו באמצעות זרימת נתונים לרכישת תוכנה (רשימת חומרים). ניתוח נתונים נוסף בוצע באמצעות תוכנה לניתוח נתוני זרימה. AlexaFluor 405 ו צבע רפאים ויולט 510 היו נרגשים עם לייזר ננומטר 405 ונאסף באמצעות BP 450/50 ומסנן BP 525/50, בהתאמה. GFP ו-PE התרגשו על ידי לייזר 488 ננומטר ונאסף באמצעות 530/30 BP ו 575/26 מסנני BP, בהתאמה. או APC או AlexaFluor 647 היה נרגש על ידי לייזר 640 nm ונאסף באמצעות מסנן BP 670/14. כל הניסויים תא מיון בוצעו על מכונת הזרמת cy, (טבלה של חומרים) מצויד ארבע לייזרים (405 nm, 488 nm, 561 nm ו 640 nm). 7-עמ מ היה נרגש באמצעות 561 ננומטר לייזר ואסף עם מסנן BP 670/14. GFP ו Ghost צבען סגול 510 נאספו באמצעות אותו שילובים לייזר/סינון כפי שמתואר לעיל. כל הניסויים מיון מנוצל זרבובית 100 um עם הגדרות לחץ psi 17 כדי להגדיל את הכדאיות הזרם של תאי היעד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מערכת זרימה להפגנת בידוד מיופיברופיצוץ באמצעות עכברים αSMA-GFP
לבבות שלא נפגעו הראו לא ניתן לגילוי בתאי הαSMA-^gfp במודל העכבר העיתונאי; מכאן, הם שימשו להקמת שער לאות הרקע של הערוץ GFP לאחר פיצוי (איור 2). αSMA⁺ תאים ממוינים בהתבסס על נוכחות של ביטוי gfp מן החדר השמאלי פצועים 10 ימים אחרי MI. אחוז קטן של אנדותל (GFP +/cd31 + תאים; SD = 3.8% ± 0.0164; n = 5) והמטפיאה (GFP +/cd45 + תאים; SD = 3.18% ± 0.0112; n = 5) התאים הביעו גם GFP בליבם הפגוע αSMA-GFP של העכבר (איור 2א). עם זאת, התאים GFP +/CD31-/CD45-לא הביעו AN2, סמן לקרום הלב.

לא נפגע (השקט) ופצע (מופעל, αSMA⁺gfp +) תאים הביעו סמנים הפיצוץ
GFP + תאים מבודדים מ-αSMA-GFP עכברים הביעו αSMA, סוג קולגן 1 אלפא 1 שרשרת (COL1α1), vimentin, ו קרום כאשר נותחו על ידי ניתוח IF. מבודד פיברומוגים מבודדים על ידי הדבקה סלקטיבית הביע vimentin אך לא הפגין ביטוי של הסמנים המופעל הסרת הפיצוץ: αSMA, פריסטין, ו COL1α1 (איור 3A). שניהם בלתי נפגעים ופעילים מופעלים הביעו את האנטיגן MEFSK4 כאשר נותחו על-ידי ניתוח זרימה (איור 3ב). בידוד מגנטיים MEFSK4 + תאים מלבבות עכברים שלא נפגעו הביעו סמנים של פיברומוטים: Col1a1, pdgfrα, ו פריסטין. לעומת זאת, בידוד מגנטיים CD45 CD31 תאים חיוביים היה זניח ביטוי של סמנים הפיצוץ.

פיברותקיעות ומיופיברופיצוצים הפגינו את היכולת לכווץ קולגן
בתרבות התא על פלסטיק נוקשה, פיברופיצוצים הוכחו חוזה ג'ל קולגן בנוכחות TGFβ, הוכחת היכולת הפונקציונלית שלהם של התכווצות¹³^,¹⁴. זה מאפיין מתורבת של פיברותקיעות דומה מאוד התכווצות רקמת החיבור שקורה במהלך תיקון רקמות, כמו גם תהליכים ביולוגיים אחרים. שניהם בלתי-נפגעים, מבודדים על ידי הדבקה סלקטיבית, ומיופיברופיצוצים, מבודדים וממוינים מעכברים αSMA-GFP, הפגינו יכולת לכווץ קולגן (איור 4).

איור 1: סכמטית של בידוד פיברובלסט באמצעות שלוש גישות שונות. (א) ציפוי משלים, (ב) gfp + תא מיון של תאים חיוביים αSMA, ו (ג) מגנטי חרוז מבוסס בידוד של פיברוהפיצוצים. מייצג שדה בהיר של תאים בתרבות בעקבות ציפוי דיפרנציאלי. סרגל קנה מידה = 50 μM. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: ניתוח FACS של תאים בודדים מבודדים מαSMA-GFP לבבות עכברים בעקבות MI. (א) הנציג FACS התוכנית הוכחתgfp + תאים שיתוף ביטוי CD31, CD45, או AN2 מפני עכברים αSMA gfp נפצע לבבות 10 ימים לאחר אוטם שריר הלב (MI). (ב) כימות גרפית של נתוני facs המוצגים עבור לבבות שלאחר MI; n = 5 ניסויים בוצעו באופן עצמאי (* * * p < 0.0001 כמחושב באמצעות ANOVA בכיוון אחד עם מבחן השוואות מרובות של Tukey). דמות זו מותאמת מתוך שסאראאטי ואח '¹⁰. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: ניתוח הטוהר של הפיברובדים מבודדים מליבם של עכברים פצועים ופגועים. (א) אימונוoforסנס כתמים של אוכלוסיות תאים (P0) מלב של לא פצועים, או נפצע ΑSMA-gfp עכברים מיון של facs. שני תאים שאינם פצועים ומופעלים לבטא פיברוהפיצוץ (FB) סמנים, כגון COL1α1, ו vimentin, אבל לא סמן המטהטיק CD45 או סימן האנדותל CD31. תאים מבודדים נפגעו αSMA-GFP עכברים לב הביע סמנים הפעלת פיברוהפיצוץ, αSMA, ו פריסטין, אשר לא היו נוכחים בתאים מבודדים מליבם עכברים שלא נפגעו. גרעינים היו מוכתמים DAPI, n = 3 ניסויים בוצעו באופן עצמאי. סרגל בקנה מידה = 100 μm. (ב) נציג facs היסטוגרמה של שכבת-על של הסרת כיסוי בלתי פצועים ומופעלים (P3 – P5) מראה את הביטוי של הסמן הפיברובסט-SK4. עבור שליטה שלילית, השתמשו בעכבר IgG, n = 2 ניסויים בוצעו באופן עצמאי. (ג) שינוי מתקפל יחסי של Col1α1, pdgfrα, ו postn התעתיקים של MEKSK4 + ve פיברופיצוצים, n = 3 ניסויים בוצעו באופן עצמאי (* p < 0.05 כפי שמחושב באמצעות ANOVA דו כיוון עם מבחן השוואות מרובות של tukey). (א) ו-(ב) מותאמים לסאראאטי ואח '¹⁰. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: האפיון הפונקציונלי של הגידולים המבודדים מליבם של העכבר הפצוע. הדמות המייצגת של כיווץ ג'ל הקולגן בנוכחות של αSMA⁺ פיברותקיעות מופעל (P3 – P5). הגרף מייצג את שינוי אחוזי השינוי באזור הג הראשוני לאחר 24 שעות ו 48 h של התכווצות כאשר מודבטים עם פצועים ופצועים מופעלים αSMA⁺ פיברותקיעות, n = 2 ניסויים בוצעו באופן עצמאי. דמות זו מותאמת מתוך שסאראאטי ואח '¹⁰. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

נוגדן	מטרת התא	דילול
שלמה כהן	תאים מתים	1:1000
צבע רפאים סגול 510	תאים מתים	1:1000
APC-CD45	תאים ממטבטיים	1:200
PE-CD31	תאים אנדותל	1:200
anti-AN2/NG2	קרום הלב	1:11
חמור נגד חולדה אלקסה פלואו 405	נוגדן משני	1:100
התאים נגד ממזין-APC (MEFSK4)	Fibroblasts	1:100
עכבר IgG-APC	בקרת איזוtype	1:100

שולחן 1: צבעי FACS ונוגדנים.

נוגדן ראשוני		דילול
α-השריר החלקה אקטין (αSMA)		1:1000
חלבון פיברופיצוץ ספציפי 1 (FSP1) 1:250		1:100
COL 1α1		1:1000
פריסטין		1:100
וימנטין		1:200
CD31		1:250
CD45		1:250

נוגדן משני		דילול
עז נגד עכברים אלקסה פלואור 488		1:200
עז נגד ארנבת-FITC		1:200
עז אנטי-ראביט-Cy3		1:200
עז נגד חולדה אלקסה פלואור 488		1:200
עז נגד חולדה אלקסה פלואור 647		1:200

שולחן 2: נוגדנים ראשוניים ומשניים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פיברותקיעות הם קבוצה הטרודוגני של תאים, מזוהה על ידי קבוצה מגוונת של סמנים. סמני החלבון ששימשו לזיהוי פיברוהטיים הם discoidin לקולטן תחום 2 (DDR2), fibronectin, vimentin, קולגן אני ו III, ו Thy1¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰. בעוד vimentin נעשה שימוש כדי לזהות השקט השקטים ביותר, חלבון פיברוביסט, חלבונים ספציפיים αSMA, ו-קרום הגוף הוכחו לזהות פיברופיצוצים מופעל המושרה, עם αSMA להיות סמן הנפוץ ביותר כדי לזהות פיברוהפיצוצים הופעל⁶^,¹²^,²¹. בנוסף, חלבונים Tcf21 ו-MEFSK4 זכו להכרה האחרונה בזיהוי שתי הריחות השקטים שנמצאו ברקמת לב שלא נפגעו, כמו גם הפעלת פיברופיצוצים כולל מיופיברופיצוצים שנמצאו בלבבות העכבר הפצועים²¹^,²².

פרוטוקול זה מנצל שלוש גישות שונות כדי לבודד ולהעשיר את הגידולים הפעילים, כולל מיופיברופיצוצים. היכולת של הפיברובלסט לדבוק בפלסטיק משמשת בגישה הראשונה לבידוד. בעקבות העיכול האנזימטי עם ליבראז, השעיית התא היחיד של תאים נזרע על צלחת פלסטיק כדי להיות מעדיף לדבוק. חוסר היכולת של תאים רבים שאינם פיברוה, לדבוק במשטח הפוליסטירן של מנות פטרי מאפשר לנו להסיר את כל המדיה ממנה ולהישאר עם אוכלוסייה טהורה יחסית של פיברותקיעות. אזהרה של שימוש בטכניקה זו היא למרות שפיברוהעלולים להיות מעדיפים לדבוק בצלחת הקלקר, כמה תאים מזהם שאינם פיברוהפיצוץ עשוי גם לצרף, השארת אוכלוסיה שאינה הומוגנית של תאים.

טכניקת הבידוד השני משתמשת ב-FACS כדי להפריד בין αSMA המבטאת מיופיברוונים מתאים אחרים. במודל העכבר הטרנסגניים המועסקים כאן, GFP מבוטא באופן בלעדי יחד עם αSMA, ולכן מיופיברופיצוצים המכילים αSMA יכול להיות מזוהה על ידי מכונת FACS דרך יכולות פלורסנט של GFP. הליך בידוד זה מאפשר לנו להשיג אוכלוסייה של תאים שהיא כ 99% מיופיברוסט. ניתוחי הטוהר של תאים אלה תוארו בהרחבה על ידי שסאראאטי ואח '¹⁰.

טכניקת הבידוד השלישית היא דרך יעילה לבידוד הן בלתי-פצועות והן מופעלות באמצעות הפרדה מגנטית מבוססת-חרוזים של MEFSK4 המבטא תא. על ידי מתן השעיה תא יחיד לאגד anti-CD45 ו anti-CD31 חרוזים מגנטיים ולהיות מאוגד במטריצה בשל השפעות שדה מגנטי, זה איפשר את ההפרדה של כל המטפאות, כמו גם התאים האנדותל שייתכן שזוהם ה בידוד פיברובלסט. כפי MEFSK4 כבר שימש לאחרונה סמן אמין כדי לזהות פיברופיצוצים, נוגדן כי יהיה לאגד MEFSK4 להביע תאים הוא מסוגל להיות מיושם. לאחר כריכת חרוז מגנטי אל הנוגדן, יצירת מורכב המאפשר בידוד של הפיברותקיעות, מורכבות תא חרוז מגנטי עובר דרך מטריצה בשדה מגנטי, והוא מקבל מאוד מועשר באוכלוסיית הפיברוביסט. הטוהר של האוכלוסייה מבודדים פיברוהפיצוץ צריך להיות מוערך על ידי כתמים חיסוני, RTPCR, וזרימה cy, לנסות ניתוח.

כמו בכל טכניקה אחרת, יש מגבלות עם הטכניקות המתוארות בכתב יד זה. המגבלה של פרוטוקול הדבקה סלקטיבית ובידוד מגנטי מבוסס חרוז היא כי שיטות אלה אינם מבדילים בין השקט והפעלת פיברופיצוצים. על מנת להעשיר את הפיברופיצוצים הפעילים, הבידוד צריך להתבצע 8 – 10 ימים לאחר אוטם שריר הלב. בנוסף, חשוב לבדוק את טוהר הבידוד עם סמנים אחרים בפיברוביסט. MEFSK4-הטוהר פיברוהגל הוכיחה רק על ידי RTPCR, מומלץ לבדוק (על ידי הדלקת החיסוני והזרימה cy, לנסות הניתוח) עם סמנים וסמנים אחרים בפיברוהפיצוץ המכירים סוגי תאים מזהם כולל המטפיאה (CD45), אנדותל (CD31) וכלי קרום הלב (AN2). במידת האפשר, ניתן להשתמש בסמנים ספציפיים אחרים המשמשים למיון או לבידוד מגנטיים של אוכלוסיית הפיברובלסט.

שימוש בעכברים αSMA-GFP כדי לבודד ולמיין מיופיברופיצוצים היא טכניקה אמינה כדי לקבל את האוכלוסייה המופעלת פיברובלסט. עם זאת, אחוז זניח של תאי המטפאות והאנדותל נצפתה בניתוח הזרימה. כדי לשפר את הטכניקה, CD45 + ve/CD31 + ve ו AN2 + ve תאים צריך להיות מחוץ GFP^{+ ve}/αSMA^{+ ve} מיון התא. מאז αSMA הוא סמן מקובל נרחב של מיופיברופיצוצים, מודל αSMA-GFP הכתב העכבר הוא כלי רב ערך כי יש לנצל כדי ללמוד מיופיברופיצוצים בהקשר של פציעות שריר הלב.

קיימים מספר שלבים קריטיים לפתרון בעיות שיש לקחת בחשבון. ניתן להקטין את זמן העיכול אם הכדאיות והתשואה של התא מושפעות. בר מהומה לא צריך לשמש כדי לערבב את תערובת העיכול, כמו זה משפיע על הכדאיות התא. הצינור צריך להיות מאובטח על הנדנדה או בחממה רועד כדי להתסיס את תערובת העיכול בעדינות. השעיית הרקמה מתעכל 10x עם מיכל של 5 מ ל או 10 מל ' מ הכרחי עבור דיסוציאציה נכונה של תאים.

תקין תא דם אדום הפירוק של השעיה התא היחיד חייב להיות מנוצל אם התאים הולכים להיות מיון או מנותח על ידי cy, הזרמת לנסות. עבור בידוד חרוז מגנטי, המטה של המאגר חיוני כדי למנוע את המבוא של בועות אוויר בעמודה. העמודה המשמשת עבור בידוד התא חרוז מגנטי לא צריך לעשות שימוש חוזר בין תאים שונים חרוז מחדש מצועם. לדוגמה, יש להשתמש בעמודה חדשה כדי להפריד בין CD45⁺ תאים, שיש למחוק לאחר המחיקה של התאים CD45⁺ , ולאחר מכן עוד אחד חדש עבור בידוד CD31⁺ תא. בידינו, לא ראינו זיהום של קרום הלב בפיברוהציטים מבודדים/ממוינים. עם זאת, MEFSK4 הוכח לזהות את קרום הלב²². לכן מומלץ להשתמש בצעד נוסף כדי למיין/לרוקן מגנציטים (AN2) מתאים בודדים. למרות שפרוטוקול זה מאומת בעכברים בני 12 שבועות, הטכניקה עשויה לשמש לעכברים צעירים או ישנים יותר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

המחברים רוצים להודות ד ר איבו Kalajzic עבור העכברים αSMA-GFP. מחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המוסדות הלאומיים לבריאות (NIH) תחת הפרס מספר R01GM118300 (האס), המכון הלאומי להדמיה ביו-רפואית וביוהנדסה של NIH תחת הפרס מספר R21EB019509 (P.P.Y.), ומענק פיתוח המדען של איגוד הלב האמריקני תחת הפרס מספר 17SDG33630187 (אס). מנתח זרימה cy, בוצעו ב-VUMC זרימה Cy, משאב משותף אשר נתמך על ידי מרכז הסרטן של ואנדרבילט Ingram (P30 CA68485) ואת מחלת העיכול ואנדרבילט מרכז המחקר (DK058404).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Acetone
Anti-fungal (Amphotericin B-solubilized; Fungizone)	Sigma Aldrich	A9528
Bovine Serium Albumin (BSA)	Sigma	9048-46-8
Calcium chloride
Citrate Buffer
Collagenase blend (Liberase Blendzyme 3 TH)	Roche Applied Science
DAPI
DDI water
DI water
DMEM-F12 with L-Glutamine and HEPES	Life technologies	11330057
Dnase I(20U/mL)	BioRad	7326828
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (dPBS) without Ca2+ and Mg2+	Gibco	13190-144
70% Ethanol
FC Blocker (Purified anti-mouse CD16/CD32)	Tonbo Biosciences	70-0161
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life technologies	16000044
10% goat serum
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) with Ca2+ and Mg2+	Corning	21-023-CV
1M HEPES	Corning	25-060-Ci
Krebs-Henseleit Buffer powder	Sigma	K3753
Mycoplasma prophylactic (Plasmocin)	Invivogen	ant-mpp
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
1x Phosphate-Buffered Saline (PBS)
10x Red Blood Cell Lysis Buffer	Miltenyi	130-094-183
Slow-fade Mounting Media
Sodium azide
Sodium bicarbonate
TGFβ
Trypan Blue Stain (0.4%)	Gibco	15250-061
Type 1 Rat Collagen
Antibodies
7AAD (stock: 1 mg/mL solution in DMSO)	Molecular Probes	A1310	dilution = 1:1000; RRID =
CD45-APC	BD Bioscience	559864	dilution = 1:200; RRID = AB_398672
CD31-PE	BD Bioscience	553373	dilution = 1:200; RRID = AB_394819
CD31	BD Biosciences	553370	dilution = 1:250; RRID = AB_394816
CD45	BD Biosciences	553076	dilution = 1:250; RRID = AB_394606
COL 1α1	MD Bioproducts	203002	dilution = 1:1000; RRID =
Ghost dye violet 510 (Formulation: 1 uL/test in DMSO)	Tonbo Biosciences	13-0870	dilution = 1:1000; RRID =
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488	Molecular Probes	A11029	dilution = 1:200; RRID = AB_138404
Goat anti-rabbit-Cy3	Southern Biotech	4050-02	dilution = 1:200; RRID = AB_2795952
Goat anti-rabbit-FITC	Jackson Immunoresearch Laboratories	711-165-152	dilution = 1:200; RRID = AB_2307443
Goat anti-rat Alexa Fluor 488	Molecular Probes	A11006	dilution = 1:200; RRID = AB_2534074
Goat anti-rat Alexa Fluor 647	Thermo-Fisher	A21247	dilution = 1:200; RRID = AB_141778
Periostin	Santa Cruz	SC67233	dilution = 1:100; RRID = AB_2166650
Vimentin	Sigma Aldrich	V2258	dilution = 1:200; RRID = AB_261856
α-smooth muscle actin (αSMA)	Sigma Aldrich	A2547	dilution = 1:1000; RRID = AB_476701
Fibroblast specific protein 1 (FSP1)	Millipore 07-2274	07-2274	dilution = 1:100; RRID = AB_10807552
CD45 Magnetic Beads	Miltenyi Biotec	130-052-301
CD31 Magnetic Beads	Miltenyi Biotec	130-087-418
Anti-feeder cells-APC (MEFSK4)	Miltenyi Biotec	130-102-900	dilution = 1:100; RRID = AB_2660619
anti-APC Beads	Miltenyi Biotec	130-090-855
Rat IgG-APC	Miltenyi Biotec	130-103-034	dilution = 1:100; RRID = AB_2661598
Donkey anti-rat Alexa Fluor405	Abcam	ab175670	dilution = 1:100
anti-AN2/NG2	Miltenyi Biotec	130-097-455	dilution = 1:11; RRID = AB_2651235
Other Materials
0.22 µm Filter	Thermo Scientific	723-2520
10 cm2 Cell Culture Dish	Corning	430167
10 mL Pipet	Fisherbrand	13-678-11E
40 µm Cell Strainer	Fisherbrand	22363547
5 mL Pipet	Fisherbrand	13-678-11D
50 mL Conical Tube	Falcon	352070
6-well Plate	Corning	3506
Flow Cytometry Tubes	Falcon	352058
Forceps
Rocker
Single Edge Blade	PAL	62-0177
Surgical Scissors
GFP-αSMA Reporter Mice
MACS Separator Magnetic Field
MACS Separation Column
Coverslips
Qaigen Rneasy Mini Kit	Qaigen	74104
Ambion RNAqueous Micro Total Isolation Kit	Ambion	AM1931
BioRad iScript cDNA Syntehsis Kit	BioRad	1708891
48-well Plate
30G Needle
3 Laser Flow Cytometry Machine (BD LSRFortessa)	BD Biosciences
4 Laser Flow Cytometry Machine (BD FACSAria III)	BD Biosciences
Flow Data Acquiring Software (BD FACSDiva Software v8.0a)	BD Biosciences
Flow Data Analysis Software (FlowJo Software)	BD Biosciences

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the Cardiac Fibroblast. Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).
Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction: From Inflammation to Fibrosis. Circulatory Research. 119 (1), 91-112 (2016).
Duan, J., et al. Wnt1/betacatenin injury response activates the epicardium and cardiac fibroblasts to promote cardiac repair. EMBO Journal. 31 (2), 429-442 (2012).
Shinde, A. V., Frangogiannis, N. G. Fibroblasts in myocardial infarction: a role in inflammation and repair. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 70, 74-82 (2014).
Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing. Nature Communications. 10 (1), 3027 (2019).
Kong, P., Christia, P., Saxena, A., Su, Y., Frangogiannis, N. G. Lack of specificity of fibroblast-specific protein 1 in cardiac remodeling and fibrosis. American Journal of Physiology -Heart and Circulatory Physiology. 305 (9), 1363-1372 (2013).
Furtado, M. B., Nim, H. T., Boyd, S. E., Rosenthal, N. A. View from the heart: cardiac fibroblasts in development, scarring and regeneration. Development. 143 (3), 387-397 (2016).
Stellato, M., Czepiel, M., Distler, O., Blyszczuk, P., Kania, G. Identification and Isolation of Cardiac Fibroblasts From the Adult Mouse Heart Using Two-Color Flow Cytometry. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 105 (2019).
Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulatory Research. 119 (8), 909-920 (2016).
Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing. Nature Communications. 10 (1), 3027 (2019).
Kalajzic, Z., et al. Use of an alpha-smooth muscle actin GFP reporter to identify an osteoprogenitor population. Bone. 43 (3), 501-510 (2008).
Travers, J. G., Kamal, F. A., Robbins, J., Yutzey, K. E., Blaxall, B. C. Cardiac Fibrosis: The Fibroblast Awakens. Circulatory Research. 118 (6), 1021-1040 (2016).
Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (3), 1274-1278 (1979).
Montesano, R., Orci, L. Transforming growth factor beta stimulates collagen-matrix contraction by fibroblasts: implications for wound healing. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 85 (13), 4894-4897 (1988).
Goldsmith, E. C., et al. Organization of fibroblasts in the heart. Developmental Dynamics. 230 (4), 787-794 (2004).
Bagchi, R. A., Lin, J., Wang, R., Czubryt, M. P. Regulation of fibronectin gene expression in cardiac fibroblasts by scleraxis. Cell Tissue Research. 366 (2), 381-391 (2016).
Goodpaster, T., et al. An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 347-358 (2008).
Chapman, D., Weber, K. T., Eghbali, M. Regulation of fibrillar collagen types I and III and basement membrane type IV collagen gene expression in pressure overloaded rat myocardium. Circulatory Research. 67 (4), 787-794 (1990).
Vasquez, C., Benamer, N., Morley, G. E. The cardiac fibroblast: functional and electrophysiological considerations in healthy and diseased hearts. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 380-388 (2011).
Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 42 (5), 991-1000 (2007).
Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
Pinto, A. R., et al. Revisiting Cardiac Cellular Composition. Circulatory Research. 118 (3), 400-409 (2016).

Biology

בידוד ואפיון של מבוגרים ופיברותקיעות לב ומיופיברופיצוצים

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.