Summary
La obtención de una población pura de fibroblastos es crucial para estudiar su papel en la reparación de heridas y fibrosis. Aquí se describe un método detallado para aislar fibroblastos y miofibroblastos de corazones de ratón no lesionados y lesionados seguidos de la caracterización de su pureza y funcionalidad por inmunofluorescencia, RTPCR, clasificación celular asistida por fluorescencia, y contracción del gel de colágeno.
Abstract
La fibrosis cardíaca en respuesta a una lesión es una respuesta fisiológica a la cicatrización de heridas. Se han hecho esfuerzos para estudiar y atacar los subtipos de fibroblastos que mitigan la fibrosis. Sin embargo, la investigación de fibroblastos se ha visto obstaculizada debido a la falta de marcadores de fibroblastos universalmente aceptables para identificar fibroblastos en reposo y activados. Los fibroblastos son una población de células heterogéneas, lo que dificulta su aislamiento y caracterización. El protocolo presentado describe tres métodos diferentes para enriquecer los fibroblastos y los miofibroblastos de los corazones de ratón no lesionados y heridos. El uso de un protocolo estándar y fiable para aislar los fibroblastos permitirá el estudio de sus funciones en la homeostasis, así como la modulación de la fibrosis.
Introduction
Los fibroblastos cardíacos, células de origen mesenquimal, desempeñan un papel importante en el mantenimiento de la conducción eléctrica y las fuerzas mecánicas en el corazón, además del mantenimiento de la arquitectura cardíaca durante la homeostasis1. Después de la lesión, estas células se activan, se expanden y producen proteínas de matriz extracelular (ECM)2. Muchos estudios preclínicos han revelado fibroblastos como reguladores celulares críticos que mantienen la integridad estructural de un corazón lesionado3, así como las principales células efectoras responsables de la producción y deposición sin control de proteínas ECM, lo que resulta en la formación de cicatrices rígidas y la insuficiencia cardíaca4. Los fibroblastos son un grupo heterogéneo de células, lo que hace difícil diseccionar su función reparadora de las propiedades de la maladaptiveificación profibrosca. Recientemente, se ha definido la heterogeneidad funcional de dos subtipos de fibroblastos distintos después de una lesión miocárdica, lo que indica la posibilidad de aislar diferentes subtipos de fibroblastos y estudiar su papel en la cicatrización de heridas5.
La obtención de una población de fibroblastos puros es crucial para delinear su papel funcional en la reparación y la fibrosis. Sin embargo, la presencia de múltiples marcadores de fibroblastos que reconocen otros tipos de células hacen que sea difícil aislar a una población de fibroblastos sustancialmente pura6. Varios estudios elegantes han ideado formas inteligentes de aislar fibroblastos cardíacos de miocardio no lesionado y lesionado. El método más popular y bien establecido de fibroblastos enriquecedores es a través de la adhesión selectiva después de la digestión del tejido enzimático7.
Además, la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) de fibroblastos a base de antígenos de superficie celular se ha descrito con éxito8. En el estudio, después de la digestión enzimática, las células mesenquimales se clasificaron como negativos de linaje (Lin: Ter119-CD45-CD31)y gp38-positivo (gp38+) de los corazones del ratón. Se confirmó que las células Gp38+ve eran fibroblastos en función de su coexpresión de col1-1 y otros marcadores mesenquimales. Aunque la mayoría de la digestión tisular se completa después de disección del ventrículo en una placa de Petri, un estudio reciente ha investigado el uso de una perfusión directa de la enzima aguja del ventrículo izquierdo para aislar los miocitos y los no miocitos que incluyen fibroblastos9. Los fibroblastos fueron aislados por adhesión selectiva en este caso.
Este protocolo describe el aislamiento y el enriquecimiento de los fibroblastos utilizando tres métodos. El primero es un método ya establecido que implica la adhesión selectiva de fibroblastos después de la digestión enzimática. El segundo método se utiliza para aislar principalmente el músculo liso alfa inducido por lesiones que expresa miofibroblastos. El tercer método consiste en el agotamiento secuencial y magnético de una suspensión celular cardíaca digerida enzimática de células hematopoyéticas y endoteliales. Tras el agotamiento, los fibroblastos/miofibroblastos se aíslan en función de la presencia del antígeno MEFSK4 utilizando perlas magnéticas. Recientemente, MEFSK4 ha sido descrito como un antígeno presente en fibroblastos inactivos y activados, por lo que es un marcador adecuado para la identificación y aislamiento de fibroblastos. Naturalmente, todos los métodos descritos aquí tienen limitaciones únicas. Por lo tanto, es muy recomendable comprobar la pureza de la población celular aislada mediante análisis de flujo, inmunomanchay y PCR semicuantitativo en tiempo real. Sin embargo, estas metodologías se pueden ampliar, y se pueden agregar marcadores adicionales con el fin de excluir otras poblaciones contaminantes antes de utilizar las poblaciones de fibroblastos y miofibroblastos para experimentos cruciales.
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Protocol
Este estudio mantiene estrictamente las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Vanderbilt aprobó el protocolo (número de protocolo: M1600076-01).
1. Disección cardíaca
- Preparación de la solución
- Buffer KHB
- Con una barra de agitación, disuelva lentamente 9,4 g de polvo de tampón Krebs-Henseleit (KHB) en 900 ml de agua DDI.
NOTA: El búfer se precipitará si se agita demasiado rápido o durante demasiado tiempo. El tampón KHB debe estar frío durante el aislamiento de fibroblastos. - Añadir 2,9 mM CaCl2 y 24 mM NaHCO3. Ajuste el pH a 7.2–7.3 y diluya a un volumen de 1 L con dH2O.
- Usando un filtro estéril (0,22 m), conservar a 4 oC durante un máximo de 4 semanas. Mantener en hielo o a 4 oC durante el aislamiento.
- Con una barra de agitación, disuelva lentamente 9,4 g de polvo de tampón Krebs-Henseleit (KHB) en 900 ml de agua DDI.
- Cóctel de digestión de colagenasa
- Preparar el cóctel de digestión el día del aislamiento de fibroblastos. Determinar el volumen adecuado de cóctel de digestión de acuerdo con el número de corazones; 5 ml de cóctel por 1 corazón.
- Preparar la mezcla de colagenasa (ver Tabla de Materiales)y DNase I de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Para 20 ml de cóctel de digestión total, añadir 17,5 ml de DNase I, 180 ml de 1 M HEPES y 500 ml de colagenasa a un tubo cónico vacío de 50 ml.
- Agregue un volumen suficiente de la solución de sal equilibrada (HBSS) de Hank con Ca2+ y Mg2+ para obtener un volumen total de 20 ml.
- Tampón de lisis de glóbulos rojos (RBC)
- Determinar el volumen total necesario en función del número de corazones (5 ml/corazón). Diluir el búfer de stock de lisis RBC 10x a 1x usando dH2O.
- Medios de fibroblastos: 10% FBS en DMEM F-12
- Añadir 10% FBS a DMEM-F12 con L-glutamina y HEPES. Añadir 10 U/ml de penicilina/estreptomicina, antifúngica de 2,5 g/ml y 2,5 g/ml de micoplasma profiláctico (ver Tabla de materiales). Conservar a 4oC.
- Buffer KHB
- Disección cardíaca
- Preparar una placa de 6 pozos sobre hielo con 2 ml de KHB frío por pozo para almacenar los corazones en durante la disección. Utilice tijeras quirúrgicas autoclaves y fórceps.
- Euthanizar ratones a las 12 semanas de edad o más por sobredosis de isoflurano, y seguir con la luxación cervical.
- Alternativamente, para el aislamiento activado de fibroblastos, induzca el infarto de miocardio en ratones de 12 semanas de edad por ligadura de arteria coronaria10. Eutanasia a los ratones 8-10 días después de una lesión.
- Rocíe el cuerpo con 70% de etanol y oriente para que el lado ventral esté orientado hacia el experimentador. Anclar o restringir los apéndices para evitar interferencias.
- Corta la piel abdominal y el músculo abierto, pero evita perforar el hígado. Corte verticalmente hacia el esternón, y abra cuidadosamente el tórax evitando perforar el corazón. Continúe cortando a través de la caja torácica para exponer el corazón.
- Con fórceps, levante suavemente el corazón del pecho, cortando cualquier pulmón o exceso de tejido unido al exterior del corazón. Retire el ventrículo y colóquelo en un pozo de 6 pocillos con KHB frío. Continúe diseccionando corazones de esta manera hasta que todas las muestras hayan sido aisladas.
- Disociación enzimática del corazón
- Usando fórceps, apriete y agite repetidamente el corazón en KHB para eliminar el exceso de sangre. Transfiera el corazón a una placa limpia estéril de 10 cm2. Usando una hoja de un solo borde, pique rápidamente el corazón en trozos pequeños.
- Añadir 1 ml de cóctel de digestión de colagenasa y continuar picando hasta que las piezas sean lo suficientemente pequeñas como para transferirlas con una micropipette de 1 ml. Transfiera las piezas a un tubo cónico de 50 ml con un micropipeta de 1 ml. Placa de lavado 2x con 2 ml de cóctel de digestión de colagenasa.
NOTA: Cortar una parte de la punta de la pipeta puede ayudar a recoger trozos de corazón más grandes que de otro modo podrían quedar atascados en la punta de la pipeta. - Incubar el tubo cónico a 37oC durante 30 min con mecedor o agitación. Asegure el tubo según sea necesario. Resuspender 10x con una pipeta de 5 ml hasta que el contenido sea homogéneo, e incubar el tubo cónico a 37oC durante 15 min con rotación o agitación.
- Resuspender 10x con una pipeta de 10 ml hasta que sea homogéneo. Cemusla un colador de células de 40 m humedeciendo el filtro con 1-2 ml de tampón KHB en la parte superior de un nuevo tubo cónico de 50 ml. Agregue 25 ml de tampón KHB a la suspensión de digestión, resuspenda y filtre a través de un colador de células cebado de 40 m. Cambie el filtro según sea necesario.
NOTA: A medida que la filtración se ralentiza, el tubo de roscado leve o el uso de un micropipeta de 1 ml para extraer la suspensión de la parte inferior del filtro pueden ayudar a que la suspensión celular pase a través de un colador de células parcialmente bloqueado de 40 m. - Centrífuga a 400 x g y 4 oC durante 10 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 1 tampón de lisis RBC (5 ml/corazón). Incubar durante 2 min a temperatura ambiente (RT).
- Centrífuga a 400 x g y RT durante 10 min. Retire el sobrenadante y luego lave resuperando el pellet en 1 ml de tampón KHB.
- Agregue 9 ml de tampón KHB y filtre a través del colador de celda saqueador de 40 m en un nuevo tubo cónico de 50 ml. Centrífuga a 400 x g y RT durante 10 min.
- Retire el sobrenadante, resuspenda en 1 ml de medios fibroblastos o PBS, y determine el número de células. Los fibroblastos se pueden aislar mediante los tres métodos diferentes que se describen a continuación.
2. Aislamiento de fibroblastos de la suspensión de una sola célula
- Aislamiento de fibroblastos: revestimiento diferencial (Figura 1)
- Prepare una placa de 6 pocillos añadiendo 2 ml de medios de fibroblastos por poca y girando la placa para cubrir el fondo del pozo.
- Resuspender las células en 1 ml de medios por corazón. Placa 1 ml de suspensión celular por pozo tal que un corazón (teóricamente) está siendo chapado por pozo. Por ejemplo, seis corazones serían resuspendidos en 6 ml de medios, luego chapados en seis pozos con 1 ml de suspensión celular por pozo.
- Gire la placa para distribuir uniformemente las células. Añadir un medio adicional de 1–2 ml por pozo para un volumen total de hasta 5 ml por pozo, e incubar a 37 oC durante 4 h.
- Los fibroblastos se separarán por adhesión selectiva después de 4 h. Eliminar las células no conectadas y muertas mediante la eliminación de medios. Lave las células adheridas con 2 ml de PBS y agregue medios de fibroblastos estériles de 2-4 ml por poca. Incubar a 37oC hasta que confluente. Cambie los medios cada 2-4 días.
- Aislamiento de fibroblastos: FACS utilizando un modelo de ratón de reportero GFP (Figura 1)
- Buffer FACS
- Preparar 15 ml de suero bovino fetal 5% (FBS) en dPBS sin Ca2+ y Mg2+. Conservar en hielo o a 4oC.
- Solución bloqueadora de FC
- Preparar el bloqueador de FC de 0,5 l (CD16/CD32 antiratón purificado) en 25 s de FACS (dilución 1:50). Se requieren 25 ml de solución de bloqueador de FC por muestra. Conservar en hielo o a 4oC.
- Preparación de muestras y tinción de anticuerpos
NOTA: Las diluciones de anticuerpos se pueden preparar con antelación, pero esto puede correr el riesgo de exposición a la luz o a la temperatura.- Preparar 7AAD o tinte fantasma violeta 510 que es 2 veces la dilución requerida en tampón FACS. Consulte la Tabla 1 para anticuerpos y diluciones.
- Resuspenda 500.000 células recién aisladas en 25 sl de solución de bloqueador fc para evitar la unión inespecífica de la región de anticuerpos FC a un receptor FC. Incubar durante 5 min a RT.
- Añadir 7AAD o Ghost dye violeta 510 anticuerpo al volumen final de 25 l de suspensión celular. Incubar durante 30-60 minutos sobre hielo en la oscuridad.
- Lavar por resustitución en 1 mL de tampón FACS. Centrífuga a 500 x g durante 5 min a 4oC.
- Resuspenda el pellet en el volumen de muestra de citometría de flujo recomendado del tampón FACS (300 l) y transfiera al tubo de citometría de flujo.
- Clasificación de células activada por fluorescencia (FACS)
NOTA: Los ratones reportero de GFP-SMA fueron una contribución del Dr. Ivo Kalajzic11. Este ratón expresa GFP bajo el promotor de la célula muscular alfa suave ( SMA). Se ha utilizado como marcador de fibroblastos activados (miofibroblastos)12.- Para el aislamiento de fibroblastos activado (SMA que expresa miofibroblasto), inducir el infarto de miocardio en ratones GFP-SMA de 12 semanas de edad por ligadura de arteria coronaria. Sacrificar a los ratones 8-10 días después de la lesión.
- Después de la suspensión de una sola célula de los corazones de los ratones lesionados, coterte los fibroblastos de la sma+ve para la proteína fluorescente verde (GFP). Utilice fibroblastos no lesionados no manchados para establecer la señal de fondo en la post-compensación del canal GFP.
- Puerta para células GFP vivas+ve por gating para 7AAD-ve/GFP+ve células o tinte fantasmal violeta 510-ve/GFP+ve células y ordenar GFP expresando "SMA+ ve miofibroblastos". Recoger las células en medios fibroblastos.
- Buffer FACS
- Aislamiento de fibroblastos: aislamiento magnético a base de perlas de fibroblastos (Figura 1)
- Búfer de equilibrio
NOTA: Prepare siempre un búfer nuevo para los aislamientos.- Preparar 0.5% BSA y 2 mM EDTA en PBS. Desgasifique el tampón revolviendo la solución mientras se conecta un vacío a la tapa del recipiente.
NOTA: La agitación elimina el exceso de gas de la solución que luego se elimina a través del vacío, de forma que las burbujas no obstruyan la columna de separación al usarla.
- Preparar 0.5% BSA y 2 mM EDTA en PBS. Desgasifique el tampón revolviendo la solución mientras se conecta un vacío a la tapa del recipiente.
- Etiquetado magnético: CD45+ células hematopoyéticas
- Centrifugar células aisladas de los corazones de ratones a 500 x g durante 5 min, luego eliminar el sobrenadante.
- Resuspenda el pellet celular en 1 ml de tampón de equilibrio. Cuente las células usando un hemocaquímetro.
- Centrifugar la suspensión celular como arriba y resuspender el gránulo celular en tampón de equilibrio de 90 l por 1 x 107 células totales. Añadir 10 sL de CD45+ perlas magnéticas por 1 x 107 celdas totales. Mezclar bien e incubar durante al menos 15 min a 4oC.
- Lave las células agregando un búfer de equilibrio de 2 ml por 1 x 107 células totales, luego centrifugar a 500 x g durante 10 min a 4 oC.
- Retire el sobrenadante, cuente las células usando un hemocitómetro y resuspenda hasta 1 x 107 células totales en 2 ml de tampón de equilibrio. Si hay más de 107 celdas, escale el búfer linealmente. Pase las celdas a través de un filtro de 40 m para evitar que las agregaciones de celdas obstruyan la matriz de columnas de separación.
- Separación magnética: CD45+ células hematopoyéticas
- Coloque la columna de separación en el campo magnético de un separador adecuado y equilibre la columna con al menos 3 ml de PBS.
- Recoja las células sin etiquetar en el flujo (FT), y lave la columna 3x con 3 mL del buffer del equilibrio. Retire los lavados con FT. Retire la columna del separador. Coloque la columna en un tubo cónico de 15 ml.
- Enjuague las células CD45+ etiquetadas magnéticamente pipeteando 5 ml de tampón de equilibrio en la columna y hundiendo firmemente las células con un émbolo suministrado con la columna.
- Eluyente de centrífuga, así como fracciones FT/wash a 500 x g. Cuente las células usando un hemocaquímetro.
- Etiquetado y separación magnética: CD31+ células endoteliales
- Protocolo de repetición para CD45+ etiquetado magnético y separación (secciones 2.3.2–2.3.3), excepto utilizar CD31+ perlas magnéticas para incubar con el FT y lavar porciones del CD45+ aislamiento.
- Etiquetado y separación magnética: MEFSK4+ fibroblastos
- Protocolo de repetición para CD45+ etiquetado magnético utilizando el anticuerpo antialimentador MEFSK4 en lugar de perlas magnéticas. Centrifugar las porciones FT y Wash del CD31+ aislamiento a 500 o g durante 5 min, luego eliminar el sobrenadante. Resuspenda el pellet celular en 1 ml de tampón de equilibrio y cuente las células usando un hemocitómetro.
- Añadir 10 l de anticuerpo antialimentador-APC MEFSK4 por cada 1 x 107 células. Incubar durante al menos 15 min a 4oC.
- Lave las células unidas a anticuerpos MEFSK4 agregando 5 ml de tampón de equilibrio por 1 x 107 células totales, luego centrifugar a 500 x g durante 5 min.
- Retire el sobrenadante y resuspende en perlas anti-APC, utilizando el mismo volumen de anticuerpo santi-alimentador-APC MEFSK4 utilizado. Incubar sobre hielo durante 15 min a 4oC.
- Centrífuga a 500 x g durante 10 min. Retire el sobrenadante, resuspenda en 2 ml de tampón de equilibrio por 1 x 107 células totales, y proceda con la separación magnética como se describió anteriormente (sección 2.3.3). Los fibroblastos MEFSK4+ve/ CD45-ve/CD31-ve se pueden utilizar para análisis de pureza y otras aplicaciones posteriores.
- Búfer de equilibrio
3. Análisis de pureza y funcionalidad de la población aislada de fibroblastos
- Análisis de la pureza de la población facS: análisis de células de La AMA-GFP (Figura 2)
- Resuspenda las células recién aisladas en 25 ml de solución bloqueadora de Fc para evitar la unión inespecífica de anticuerpos. Incubar durante 5 min a RT.
- Opcional: añadir 25 s l de 7AAD o tinte fantasmal violeta 510 a la suspensión celular. Incubar durante 30-60 minutos sobre hielo en la oscuridad.
- Lavar por resustitución en 1 mL de tampón FACS. Centrífuga a 500 x g durante 5 min.
- Resuspenda el pellet en 50 l de tampón FACS. Agregue los anticuerpos CD31-PE, CD45-APC y AN2/NG2 directamente a la suspensión celular. Incubar durante 15 minutos sobre hielo (Tabla 1).
- Lávese resuponiendo en búfer FACS de 1 ml. Centrífuga a 400 x g durante 5 min.
- Añadir burro anti-rata AlexaFluor 405 anticuerpo secundario a las células etiquetadas con anticuerpo primario no conjugado. Incubar durante 30 minutos sobre hielo.
- Lavar por resustitución en 1 mL de tampón FACS. Centrífuga a 400 x g durante 5 min.
- Resuspenda el pellet en el volumen de muestra de citometría de flujo recomendado de tampón FACS (300 l) y transfiera a un tubo de citometría de flujo etiquetado para el análisis de flujo.
NOTA: El análisis FACS para caracterizar la expresión del antígeno MEFSK4 en fibroblastos aislados se describe en la sección 3.3.
- Análisis de pureza de fibroblastos: inmunofluorescencia(Figura 3A)
- Semilla 30,000 fibroblastos primarios (P0-P1) por pozo en cubreobjetos colocados en una placa de 24 pozos y cultivo hasta 80% confluente. O concentrar las células CD45+ y CD31+ ordenadas (30.000 células por pozo) en un cubreobjetos por citospin a 400 x a g (un método utilizado para depositar las células directa y uniformemente en un cubreobjetos en una placa de 24 pocillos).
- Fijar las células con acetona fría durante 15 min. Lavar 3 veces con PBS.
- Bloquee los portaobjetos en suero de cabra al 10%. Incubar diapositivas con anticuerpos primarios durante la noche (Tabla 2).
- Lave los portaobjetos 3x en PBS. Incubar anticuerpos secundarios durante 2 h(Tabla 2).
- Se desliza contramancha y se monta con una gota de DAPI en medios de montaje de difuminado lento.
- Análisis de pureza de la población FACS: sondeo MEFSK4 (Figura 3B)
- Resuspenda las células recién aisladas en 25 ml de solución de bloqueador de FC para evitar la unión inespecífica de anticuerpos. Incubar durante 5 min a RT.
- Opcional: añadir 25 s l de 7AAD o tinte fantasmal violeta 510 a la suspensión celular. Incubar durante 30-60 minutos sobre hielo en la oscuridad.
- Lavar por resustitución en 1 mL de tampón FACS. Centrífuga a 500 x g durante 5 min.
- Resuspenda el pellet en 50 l de tampón FACS. Añadir anticuerpos MEFSK4 directamente a la suspensión celular. Incubar durante 15 minutos sobre hielo (Tabla 1).
- Lavar por resustitución en 1 mL de tampón FACS. Centrífuga a 400 x g durante 5 min.
- Agregue la rata IgG-APC a las células (Tabla 1). Incubar durante 30 minutos sobre hielo.
- Lavar por resustitución en 1 mL de tampón FACS. Centrífuga a 400 x g durante 5 min.
- Resuspenda el pellet en el volumen de muestra de citometría de flujo recomendado de tampón FACS (300 l) y transfiera al tubo de citometría de flujo para el análisis de flujo.
- Análisis de pureza de fibroblastos: rtPCR en tiempo real semicuantitativo(Figura 3C)
- Aislamiento de ARN y PCR semicuantitativo en tiempo real
- Tras el enriquecimiento de fibroblastos, aísle el ARN utilizando un kit de aislamiento de ARN (ver Tabla de Materiales). Siga las instrucciones del fabricante.
- Complete la síntesis de ADN de la primera cadena utilizando un kit de síntesis de ADNc (ver Tabla de Materiales),siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Realice PCR5semicuantitativo en tiempo real.
- Análisis de la funcionalidad de fibroblastos: ensayo de contractilidad de gel de colágeno (Figura 4)
- Solución de colágeno
- Preparar 20 mM HEPES y 44 mM NaHCO3 en DMEM. Añadir 1,67 mg de colágeno de rata tipo 1 por 1 ml de DMEM con HEPES y NaHCO3.
- DMEM suplementado por TGF
- Preparar 10% FBS en DMEM complementado con antibióticos y antifúngicos. Añadir TGF a una concentración final de 1 ng/mL.
- Mezcla de células/colágeno y revestimiento
- Prepare la suspensión celular (P3-P5) y determine el volumen necesario para obtener 3.3 x 105 células.
- Añadir volumen de suspensión con 3,3 x 105 células a suficiente solución de colágeno para obtener 1 ml de volumen total.
NOTA: La concentración de colágeno de rata tipo 1 ahora debe ser de 1,5 mg/ml. - En una placa de 48 pocillos, semilla de 300 l de mezcla de colágeno celular por poca (1 x 105 células/pozo). Incubar a 37oC durante 15-20 min hasta que se gelifique.
- Utilice una aguja de 30 G para ayudar a separar el gel de las paredes del pozo. Añadir 600 l de TGFá y FBS DMEM suplementado a cada pocto. Placas de imagen en un escáner reflectante a 24 h y 48 h.
NOTA: Todos los experimentos de inmunofluorescencia se realizaron en una máquina de citometría de flujo equipada con tres láseres (405 nm, 488 nm y 640 nm). Los datos se adquirieron utilizando un software de adquisición de datos de flujo(Tabla de materiales). Se realizó un análisis de datos adicional utilizando un software de análisis de datos de flujo. AlexaFluor 405 y Ghost Dye Violet 510 fueron excitados con el láser de 405 nm y recogidos usando un filtro de 450/50 BP y 525/50 BP, respectivamente. GFP y PE fueron excitados por el láser de 488 nm y recogidos utilizando los filtros 530/30 BP y 575/26 BP, respectivamente. APC o AlexaFluor 647 fue excitado por el láser de 640 nm y recogido usando un filtro de 670/14 BP. Todos los experimentos de clasificación celular se realizaron en una máquina de citometría de flujo(Tabla de materiales)equipada con cuatro láseres (405 nm, 488 nm, 561 nm y 640 nm). 7-AAD se entusiasmó con el láser de 561 nm y se recogió con un filtro de 670/14 BP. GFP y Ghost Dye Violet 510 fueron recogidos usando las mismas combinaciones láser/filtro como se describió anteriormente. Todos los experimentos de clasificación utilizaron una boquilla de 100 um con una configuración de presión de 17 psi para aumentar la viabilidad aguas abajo de las células de destino.
- Solución de colágeno
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Representative Results
Esquema de medición de flujo que demuestra el aislamiento de miofibroblastos utilizando ratones reportero de la SMA-GFP
Los corazones no lesionados no mostraron células GFP+ detectables en el modelo de ratón de reportero de la SMA-GFP; por lo tanto, se utilizaron para establecer una puerta para la señal de fondo de la post-compensación del canal GFP(Figura 2). Las células de la AMA+ se clasificaron en función de la presencia de la expresión de GFP del ventrículo izquierdo lesionado 10 días después de la MI. Un pequeño porcentaje de endotelial (células GFP+/CD31+; SD a 3,8% a 0,0164; n a 5) y hematopoyético (células GFP+/CD45+; SD a 3,18% a 0,0112; n 5) las células también expresaron GFP en los corazones de ratón lesionados de La SMA-GFP(Figura 2A). Sin embargo, las células GFP+/CD31-/CD45- no expresaban AN2, un marcador de pericyte.
Células no lesionadas (en reposo) y lesionadas (activadas, SMA+GFP+) expresaron marcadores de fibroblastos
Células de GFP+ aisladas de ratones de la AMA-GFP expresadas en la cadena alfa-1 de colágeno (COL1-1), vimentina y periostina cuando se analiza mediante análisis IF. Fibroblastos no lesionados aislados por adhesión selectiva expresaron vimentina pero no demostraron expresión de los marcadores de fibroblastos activados: SSMA, periostina y COL1-1(Figura 3A). Tanto los fibroblastos no lesionados como los activados expresaron el antígeno MEFSK4 cuando se analizan mediante análisis de flujo(Figura 3B). Las células MEFSK4+ve aisladas magnéticamente de los corazones de ratones no lesionados expresaron marcadores de fibroblastos: Col1a1, pdgfr y periostin. Por el contrario, las células positivas CD45 y CD31 aisladas magnéticamente tenían una expresión insignificante de marcadores de fibroblastos.
Los fibroblastos y los miofibroblastos demostraron la capacidad de contraer colágeno
En el cultivo celular de plástico rígido, se ha demostrado que los fibroblastos contraen geles de colágeno en presencia de TGF, lo que demuestra su capacidad funcional de contracción13,14. Esta característica in vitro de los fibroblastos es muy similar a la contracción del tejido conectivo que ocurre durante la reparación del tejido, así como otros procesos biológicos. Ambos fibroblastos no lesionados, aislados por adhesión selectiva, y miofibroblastos, aislados y ordenados de ratones de la A.SMA-GFP, demostraron una capacidad para contraer colágeno(Figura 4).
Figura 1: Esquema del aislamiento de fibroblastos utilizando tres enfoques diferentes. (A) chapado diferencial, (B) clasificación celular GFP+ de células positivas de la ACM, y (C) aislamiento magnético basado en perlas de fibroblastos. Campo brillante representativo de las celdas en cultivo después de chapado diferencial. Barra de escala de 50 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Análisis FACS de células individuales aisladas de los corazones de ratones de la SMA-GFP siguiendo mi. (A) Esquema representativo de medición FACS que demuestre que las células GFP+ co-expresan CD31, CD45 o AN2 de ratones de la AMA-GFP lesionaron corazones 10 días después del infarto de miocardio (MI). (B) cuantificación gráfica de los datos FACS presentados para los corazones post-MI; N - 5 experimentos se realizaron de forma independiente (***p < 0.0001 calculado utilizando ANOVA unidireccional con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey). Esta figura está adaptada de Saraswati et al.10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Análisis de pureza de fibroblastos aislados de corazones de ratones no lesionados e lesionados. (A) La tinción de inmunofluorescencia de las poblaciones celulares (P0) del corazón de ratones no lesionados, o lesionados de la SMA-GFP, ordenada por FACS. Tanto las células no lesionadas como las activadas expresan marcadores de fibroblastos (FB), como COL1-1, y vimentina, pero no el marcador hematopoyético CD45 o el marcador endotelial CD31. Células aisladas de los ratones lesionados de la SMA-GFP corazón expresaron marcadores de fibroblastos activados, SMA, y periostina, que no estaban presentes en las células aisladas de los corazones de ratones no lesionados. Los núcleos se tiñieron con DAPI, los experimentos n.o 3 se realizaron de forma independiente. Barra de escala a 100 m. (B) histograma representativo de superposición FACS de fibroblastos no lesionados y activados (P3–P5) que muestra la expresión del marcador de fibroblastos MEF-SK4. Para un control negativo, se utilizaron IgG de rata, se realizaron experimentos de n a 2 de forma independiente. (C) Cambio de pliegue relativo de las transcripciones Col1-1, Pdgfry Postn en fibroblastos MEKSK4+ve no lesionados, n a 3 experimentos se realizaron de forma independiente (*p < 0,05 según se calcula utilizando ANOVA bidireccional con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey). (A) y (B) están adaptados de Saraswati et al.10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Caracterización funcional de fibroblastos aislados de corazones de ratón no lesionados y heridos. Figura representativa de la contracción del gel de colágeno en presencia de no lesionados y lesionados activados s-SMA+ fibroblastos (P3–P5). El gráfico representa el cambio porcentual en el área inicial del gel después de 24 h y 48 h de contracción cuando se incuba con incubado con sin lesiones y lesionados activados ssMA+ fibroblastos, n 2 experimentos se realizaron de forma independiente. Esta figura está adaptada de Saraswati et al.10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Anticuerpo | Objetivo celular | Dilución |
| 7AAD | Células muertas | 1:1000 |
| Tinte fantasma violeta 510 | Células muertas | 1:1000 |
| APC-CD45 | Células hematopoyéticas | 1:200 |
| PE-CD31 | Células endoteliales | 1:200 |
| anti-AN2/NG2 | Pericytes | 1:11 |
| Burro anti-rata alexa fluor 405 | Anticuerpo secundario | 1:100 |
| Células antialimentador-APC (MEFSK4) | Fibroblastos | 1:100 |
| Rata IgG-APC | Control de isotipos | 1:100 |
Tabla 1: Colorantes y anticuerpos FACS.
| Anticuerpo primario | Dilución | |
| • Actina muscular suave (SMA) | 1:1000 | |
| Proteína específica de fibroblastos 1 (FSP1)1:250 | 1:100 | |
| COL 1-1 | 1:1000 | |
| Periostin | 1:100 | |
| Vimentin | 1:200 | |
| CD31 | 1:250 | |
| CD45 | 1:250 | |
| Anticuerpo secundario | Dilución | |
| Cabra antiratón Alexa Fluor 488 | 1:200 | |
| Cabra anticonejo-FITC | 1:200 | |
| Cabra anticonejo-Cy3 | 1:200 | |
| Cabra antirrata Alexa Fluor 488 | 1:200 | |
| Cabra antirrata Alexa Fluor 647 | 1:200 | |
Tabla 2: Anticuerpos primarios y secundarios de inmunofluorescencia.
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Discussion
Los fibroblastos son un grupo heterogéneo de células, identificado por un conjunto diverso de marcadores. Los marcadores proteicos que se han utilizado para identificar fibroblastos son el receptor 2 de dominio de discoidina (DDR2), la fibronectina, la vimentina, el colágeno I y III, y El Thy115,,16,17,18,19,20. Mientras que se ha demostrado que la vimentina para identificar fibroblastos cardíacos en reposo no lesionados, proteína específica de fibroblastos 1, SMA y periostina identifica los fibroblastos activados inducidos por lesiones, siendo el marcador más común para detectar fibroblastos activados6,12,21. Además, las proteínas Tcf21 y MEFSK4 han ganado un reconocimiento reciente al reconocer tanto los fibroblastos en reposo encontrados en el tejido cardíaco no lesionado como los fibroblastos activados, incluidos los miofibroblastos encontrados en los corazones de ratón heridos21,,22.
Este protocolo utiliza tres enfoques diferentes para aislar y enriquecer los fibroblastos y fibroblastos activados, incluidos los miofibroblastos. La capacidad del fibroblasto para adherirse preferentemente al plástico se utiliza en el primer enfoque para el aislamiento. Después de la digestión enzimática con liberase, la suspensión de una sola célula de las células se sembra en un plato de plástico para adherirse preferentemente. La incapacidad de muchas células no fibroblastas para adherirse a la superficie de poliestireno de los platos Petri nos permite eliminar todos los medios del plato y permanecer con una población relativamente pura de fibroblastos. Una advertencia de utilizar esta técnica es que los fibroblastos se adhieren preferentemente al plato de poliestireno, algunas células contaminantes no fibroblastas también pueden adherirse, dejando una población no homogénea de células.
La segunda técnica de aislamiento utiliza FACS para separar los miofibroblastos que expresan el SMa de otras células. En el modelo de ratón transgénico empleado aquí, GFP se expresa exclusivamente junto con el SMA, por lo que los miofibroblastos que contienen la A-SMA pueden ser detectados por una máquina FACS a través de las capacidades fluorescentes de GFP. Este procedimiento de aislamiento nos permite obtener una población de células que es aproximadamente 99% miofibroblasto. Los análisis de pureza de estas células han sido ampliamente descritos por Saraswati et al.10.
La tercera técnica de aislamiento es una manera eficiente de aislar fibroblastos no lesionados y activados mediante la separación magnética basada en perlas de la célula expressante MEFSK4. Al permitir que una suspensión de una sola célula se uniera a las cuentas magnéticas anti-CD45 y anti-CD31 y se inmovilizara en una matriz debido a efectos de campo magnético, esto permitió la separación de cualquier célula hematopoyética, así como endotelial que puede haber contaminado la aislamiento de fibroblastos. Como MEFSK4 se ha utilizado recientemente como un marcador confiable para identificar fibroblastos, un anticuerpo que se unirá a MEFSK4 expressing cells es capaz de ser aplicado. Después de unir un cordón magnético al anticuerpo, creando un complejo que permite el aislamiento de fibroblastos, el complejo de células de cuentas magnéticas se pasa a través de una matriz en un campo magnético, y se obtiene una población de fibroblastos altamente enriquecida. La pureza de la población aislada de fibroblastos debe evaluarse mediante análisis de inmunomanchas, RTPCR y citometría de flujo.
Como con cualquier otra técnica, hay limitaciones con las técnicas descritas en este manuscrito. La limitación del protocolo de adhesión selectiva y el aislamiento magnético basado en perlas es que estos métodos no diferencian entre fibroblastos inactivos y activados. Con el fin de enriquecer los fibroblastos activados, el aislamiento debe realizarse de 8 a 10 días después del infarto de miocardio. Además, es importante comprobar la pureza del aislamiento con otros marcadores de fibroblastos. La pureza positiva de los fibroblastos MEFSK4 ha sido demostrada sólo por RTPCR, se recomienda probar (mediante análisis de inmunomanchas y citometría de flujo) con otros marcadores y marcadores de fibroblastos que reconocen los tipos de células contaminantes, incluyendo hematopoyético (CD45), endotelial (CD31) y pericíticos (AN2). Si es posible, se podrían utilizar otros marcadores específicos de fibroblastos para clasificar o aislar magnéticamente la población de fibroblastos.
El uso de ratones sMA-GFP para aislar y clasificar miofibroblastos es una técnica confiable para obtener una población de fibroblastos activados. Sin embargo, se ha observado un porcentaje insignificante de células hematopoyéticas y endoteliales en el análisis de flujo. Para mejorar esta técnica, las células CD45+ve/CD31+ve y AN2+ve deben excluirse de la clasificación de celdas GFP+ve/-SMA+ve. Dado que el modelo de ratón de reportero de la SMA-GFP es una herramienta valiosa que debe ser explotada para estudiar miofibroblastos en el contexto de lesiones miocárdicas.
Hay varios pasos cruciales de solución de problemas que deben tenerse en cuenta. El tiempo de digestión puede disminuir si la viabilidad celular y el rendimiento se ven afectados. No se debe utilizar una barra de agitación para agitar la mezcla de digestión, ya que esto afecta a la viabilidad celular. El tubo debe fijarse en un balancín o en una incubadora de agitación para agitar suavemente la mezcla de digestión. La resposición del tejido digerido 10x con una pipeta de 5 ml o 10 ml es crucial para la disociación adecuada de las células.
La lisis adecuada de los glóbulos rojos de la suspensión de una sola célula debe utilizarse si las células van a ser ordenadas o analizadas por citometría de flujo. Para el aislamiento magnético de cuentas, la desgasificación del tampón es esencial para evitar la introducción de cualquier burbuja de aire en la columna. La columna utilizada para el aislamiento magnético de la célula del cordón no debe reutilizarse entre diferentes células conjugadas con perlas magnéticas. Por ejemplo, se debe utilizar una nueva columna para separar CD45+ celdas, que se deben descartar después de la elución de las celdas CD45+, luego otra nueva para el CD31+ aislamiento de celda. En nuestras manos, no hemos visto contaminación de pericytes en fibroblastos aislados/ordenados. Sin embargo, MEFSK4 ha demostrado reconocer pericidas22. Por lo tanto, se recomienda utilizar un paso adicional para ordenar/agotar magnéticamente los pericitas (AN2) de las células individuales. Aunque este protocolo se valida en ratones de 12 semanas de edad, la técnica se puede utilizar para ratones más jóvenes o mayores.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores quieren dar las gracias al Dr. Ivo Kalajzic por los ratones de la SMA-GFP. La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) bajo el Número de Premio R01GM118300 (S.S.), Instituto Nacional de Imagen Biomédica y Bioingeniería del NIH bajo el Número de Premio R21EB019509 (P.P.Y.), y la Beca de Desarrollo Científico de la Asociación Americana del Corazón bajo el Premio Número 17SDG33630187 (S.S.). Los análisis de citometría de flujo se realizaron en el recurso compartido de citometría de flujo VUMC, que cuenta con el apoyo del Vanderbilt Ingram Cancer Center (P30 CA68485) y el Vanderbilt Digestive Disease Research Center (DK058404).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Acetone | |||
| Anti-fungal (Amphotericin B-solubilized; Fungizone) | Sigma Aldrich | A9528 | |
| Bovine Serium Albumin (BSA) | Sigma | 9048-46-8 | |
| Calcium chloride | |||
| Citrate Buffer | |||
| Collagenase blend (Liberase Blendzyme 3 TH) | Roche Applied Science | ||
| DAPI | |||
| DDI water | |||
| DI water | |||
| DMEM-F12 with L-Glutamine and HEPES | Life technologies | 11330057 | |
| Dnase I(20U/mL) | BioRad | 7326828 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (dPBS) without Ca2+ and Mg2+ | Gibco | 13190-144 | |
| 70% Ethanol | |||
| FC Blocker (Purified anti-mouse CD16/CD32) | Tonbo Biosciences | 70-0161 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 16000044 | |
| 10% goat serum | |||
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 21-023-CV | |
| 1M HEPES | Corning | 25-060-Ci | |
| Krebs-Henseleit Buffer powder | Sigma | K3753 | |
| Mycoplasma prophylactic (Plasmocin) | Invivogen | ant-mpp | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | |||
| 10x Red Blood Cell Lysis Buffer | Miltenyi | 130-094-183 | |
| Slow-fade Mounting Media | |||
| Sodium azide | |||
| Sodium bicarbonate | |||
| TGFβ | |||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Type 1 Rat Collagen | |||
| Antibodies | |||
| 7AAD (stock: 1 mg/mL solution in DMSO) | Molecular Probes | A1310 | dilution = 1:1000; RRID = |
| CD45-APC | BD Bioscience | 559864 | dilution = 1:200; RRID = AB_398672 |
| CD31-PE | BD Bioscience | 553373 | dilution = 1:200; RRID = AB_394819 |
| CD31 | BD Biosciences | 553370 | dilution = 1:250; RRID = AB_394816 |
| CD45 | BD Biosciences | 553076 | dilution = 1:250; RRID = AB_394606 |
| COL 1α1 | MD Bioproducts | 203002 | dilution = 1:1000; RRID = |
| Ghost dye violet 510 (Formulation: 1 uL/test in DMSO) | Tonbo Biosciences | 13-0870 | dilution = 1:1000; RRID = |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11029 | dilution = 1:200; RRID = AB_138404 |
| Goat anti-rabbit-Cy3 | Southern Biotech | 4050-02 | dilution = 1:200; RRID = AB_2795952 |
| Goat anti-rabbit-FITC | Jackson Immunoresearch Laboratories | 711-165-152 | dilution = 1:200; RRID = AB_2307443 |
| Goat anti-rat Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11006 | dilution = 1:200; RRID = AB_2534074 |
| Goat anti-rat Alexa Fluor 647 | Thermo-Fisher | A21247 | dilution = 1:200; RRID = AB_141778 |
| Periostin | Santa Cruz | SC67233 | dilution = 1:100; RRID = AB_2166650 |
| Vimentin | Sigma Aldrich | V2258 | dilution = 1:200; RRID = AB_261856 |
| α-smooth muscle actin (αSMA) | Sigma Aldrich | A2547 | dilution = 1:1000; RRID = AB_476701 |
| Fibroblast specific protein 1 (FSP1) | Millipore 07-2274 | 07-2274 | dilution = 1:100; RRID = AB_10807552 |
| CD45 Magnetic Beads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| CD31 Magnetic Beads | Miltenyi Biotec | 130-087-418 | |
| Anti-feeder cells-APC (MEFSK4) | Miltenyi Biotec | 130-102-900 | dilution = 1:100; RRID = AB_2660619 |
| anti-APC Beads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| Rat IgG-APC | Miltenyi Biotec | 130-103-034 | dilution = 1:100; RRID = AB_2661598 |
| Donkey anti-rat Alexa Fluor405 | Abcam | ab175670 | dilution = 1:100 |
| anti-AN2/NG2 | Miltenyi Biotec | 130-097-455 | dilution = 1:11; RRID = AB_2651235 |
| Other Materials | |||
| 0.22 µm Filter | Thermo Scientific | 723-2520 | |
| 10 cm2 Cell Culture Dish | Corning | 430167 | |
| 10 mL Pipet | Fisherbrand | 13-678-11E | |
| 40 µm Cell Strainer | Fisherbrand | 22363547 | |
| 5 mL Pipet | Fisherbrand | 13-678-11D | |
| 50 mL Conical Tube | Falcon | 352070 | |
| 6-well Plate | Corning | 3506 | |
| Flow Cytometry Tubes | Falcon | 352058 | |
| Forceps | |||
| Rocker | |||
| Single Edge Blade | PAL | 62-0177 | |
| Surgical Scissors | |||
| GFP-αSMA Reporter Mice | |||
| MACS Separator Magnetic Field | |||
| MACS Separation Column | |||
| Coverslips | |||
| Qaigen Rneasy Mini Kit | Qaigen | 74104 | |
| Ambion RNAqueous Micro Total Isolation Kit | Ambion | AM1931 | |
| BioRad iScript cDNA Syntehsis Kit | BioRad | 1708891 | |
| 48-well Plate | |||
| 30G Needle | |||
| 3 Laser Flow Cytometry Machine (BD LSRFortessa) | BD Biosciences | ||
| 4 Laser Flow Cytometry Machine (BD FACSAria III) | BD Biosciences | ||
| Flow Data Acquiring Software (BD FACSDiva Software v8.0a) | BD Biosciences | ||
| Flow Data Analysis Software (FlowJo Software) | BD Biosciences |
References
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