Summary
Att få en ren population av fibroblaster är avgörande för att studera deras roll i sår reparation och fibros. Beskrivs här är en detaljerad metod för att isolera fibroblaster och myofibroblaster från oskadade och skadade mus hjärtan följt av karakterisering av deras renhet och funktionalitet genom immunfluorescens, RTPCR, fluorescensassisterad cell sortering, och kollagengelkontraktion.
Abstract
Hjärtfibros som svar på skada är en fysiologisk reaktion på sårläkning. Ansträngningar har gjorts för att studera och rikta fibroblast subtyper som mildrar fibros. Emellertid, fibroblast forskning har hindrats på grund av bristen på universellt acceptabla fibroblast markörer för att identifiera quiescent samt aktiverade fibroblaster. Fibroblaster är en heterogen cellpopulation, vilket gör dem svåra att isolera och karakterisera. Det presenterade protokollet beskriver tre olika metoder för att berika fibroblaster och myofibroblaster från oskadade och skadade mushjärtan. Med hjälp av en standard och pålitlig protokoll för att isolera fibroblaster kommer att möjliggöra studier av deras roller i homeostas samt fibros modulering.
Introduction
Hjärt fibroblaster, celler av mesenkymala ursprung, spelar en viktig roll för att upprätthålla den elektriska ledning och mekaniska krafter i hjärtat förutom underhåll av hjärtarkitektur under homeostas1. Efter skada aktiveras, expanderas och produceras ecm-proteiner (extracellulärt matris)2. Många prekliniska studier har visat fibroblaster som kritiska cellulära tillsynsmyndigheter som upprätthåller den strukturella integriteten hos ett skadat hjärta3 samt huvudeffektorceller som ansvarar för okontrollerad produktion och nedfall av ECM-proteiner, vilket resulterar i stel ärrbildning och hjärtsvikt4. Fibroblaster är en heterogen grupp av celler, vilket gör det utmanande att dissekera deras reparativ funktion från pro-fibrotic maladaptiva egenskaper. Nyligen har den funktionella heterogeniteten hos två distinkta fibroblast subtyper efter hjärtinfarkt skada definierats, vilket tyder på möjligheten att isolera olika fibroblast subtyper och studera deras roll i sårläkning5.
Att få en ren fibroblast befolkningen är avgörande för att delineating deras funktionella roll i reparation och fibros. Förekomsten av flera fibroblast markörer som känner igen andra celltyper gör det svårt att isolera en väsentligen ren fibroblast population6. Flera eleganta studier har utarbetat smarta sätt att isolera hjärt fibroblaster från oskadade och skadade hjärtmuskeln. Den mest populära och väletablerade metoden för berikande fibroblaster är genom selektiv vidhäftning efter enzymatisk vävnad matsmältning7.
Dessutom har fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) av fibroblaster baserade på cellytantigener framgångsrikt beskrivits8. I studien, efter enzymatisk matsmältning, sorterades mesenkymala cellerna som härstamningsnegativa (Lin: Ter119−CD45−CD31−) och gp38-positiva (gp38+) från mushjärtan. Gp38+ve celler bekräftades vara fibroblaster baserat på deras samuttryck av col1α1 och andra mesenkymala markörer. Även om de flesta vävnad matsmältningen är klar efter dissekera ut ventrikeln i en Petri maträtt, en färsk studie har undersökt användningen av en direkt nål enzym perfusion av den vänstra ventrikeln för att isolera myocyter och icke-myocyter som inkluderar fibroblaster9. Fibroblaster isolerades sedan av selektiv vidhäftning i detta fall.
Detta protokoll beskriver isolering och anrikning av fibroblaster med hjälp av tre metoder. Den första är en redan etablerad metod som involverar selektiv vidhäftning av fibroblaster efter enzymatisk matsmältning. Den andra metoden används för att främst isolera skada-inducerad alfa glatt muskulatur uttrycker myofibroblaster. Den tredje metoden innebär sekventiell, magnetisk utarmning av en enzym-smält hjärtcell suspension av hematopoietic och endotelceller. Efter utarmning isoleras fibroblaster/myofibroblaster baserat på förekomsten av antigenet MEFSK4 med hjälp av magnetiska pärlor. Nyligen har MEFSK4 beskrivits som ett antigen som finns på quiescent samt aktiverade fibroblaster, vilket gör det till en lämplig markör för fibroblast identifiering och isolering. Naturligtvis har alla metoder som beskrivs här unika begränsningar. Det rekommenderas därför starkt att kontrollera renhet isolerade cellpopulationen genom flödeanalys, immunfärgning och semikvantitativ realtid PCR. Dessa metoder kan dock utökas, och ytterligare markörer kan läggas till för att utesluta andra förorenande populationer innan de använder fibroblast och myofibroblast populationer för avgörande experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna studie upprätthåller strikt rekommendationerna i guiden för vård och användning av laboratoriedjur vid National Institutes of Health. Vanderbilt University Institutional Animal Care and Use Committee godkände protokollet (protokollnummer: M1600076-01).
1. Hjärtdissektion
- Förberedelse av lösning
- KHB buffert
- Lös långsamt upp 9,4 g Krebs-Henseleit-buffert (KHB) i 900 ml DDI-vatten.
OBS: Bufferten fälls ut om den rörs för snabbt eller för länge. KHB buffert måste vara kallt under fibroblast isolering. - Lägg till 2,9 mM CaCl2 och 24 mM NaHCO3. Justera pH-värdet till 7,2–7,3 och späd till en volym av 1 L med dH2O.
- Förvara vid 4 °C i upp till 4 veckor med ett sterilt filter (0,22 μm). Förvaras på is eller vid 4 °C under isoleringens gång.
- Lös långsamt upp 9,4 g Krebs-Henseleit-buffert (KHB) i 900 ml DDI-vatten.
- Collagenase matsmältning cocktail
- Förbered matsmältningscocktail dagen för fibroblast isolering. Bestäm lämplig volym av matsmältningscocktail enligt antalet hjärtan; 5 ml cocktail per 1 hjärta.
- Förbered kollagenblandning (se tabell över material)och DNase I enligt tillverkarens anvisningar.
- För 20 ml total rötningscocktail ska du tillsätt 17,5 μL DNase I, 180 μL av 1 M HEPES och 500 μL kollagen i ett tomt 50 ml koniskt rör.
- Tillsätt en tillräcklig volym av Hank's Balanced Salt lösning (HBSS) med Ca2 + och Mg2 + för att få en 20 ml total volym.
- Röd blodcell (RBC) lysbuffert
- Bestäm den totala volymen som behövs baserat på antal hjärtan (5 ml/hjärta). Späd 10x RBC lysis lagerbuffert till 1x med dH2O.
- Fibroblast media: 10% FBS i DMEM F-12
- Lägg till 10% FBS till DMEM-F12 med L-glutamin och HEPES. Tillsätt 10 U/mL penicillin/streptomycin, 2,5 μg/ml anti-svamp och 2,5 μg/mL mycoplasma profylaktisk (se Tabell över material). Förvaras vid 4 °C.
- KHB buffert
- Hjärtdissektion
- Förbered en 6 brunnsplatta på is med 2 ml kall KHB per brunn för att lagra hjärtan i under dissekering. Utnyttja autoklaverade kirurgisksax och pincett.
- Avliva möss vid 12 veckors ålder eller äldre av isofluran överdos, och följ med livmoderhalscancer förskjutning.
- Alternativt, för aktiverad fibroblast isolering, inducera hjärtinfarkt i 12 veckor gamla möss genom kranskärlligation10. Avliva mössen 8–10 dagar efter skada.
- Spraykropp med 70% etanol och orientera så att den ventrala sidan är vänd mot experimentören. Nåla fast eller begränsa bihang för att förhindra störningar.
- Skär buken hud och muskler öppna men undvika piercing levern. Skär vertikalt mot bröstbenet, och försiktigt öppna bröstkorgen samtidigt som du undviker piercing av hjärtat. Fortsätt att skära genom bröstkorgen för att exponera hjärtat.
- Använd pincett, lyft försiktigt hjärtat ur bröstet, skära bort någon lunga eller överflödig vävnad fäst på utsidan av hjärtat. Ta bort ventrikeln och placera i en brunn av 6 brunnsplatta med kall KHB. Fortsätt att dissekera hjärtan på detta sätt tills alla prover har isolerats.
- Enzymatisk dissociation av hjärta
- Använda pincett, upprepade gånger pressa och agitera hjärtat i KHB för att ta bort överflödigt blod. Överför hjärtat till en ren steril 10 cm2 tallrik. Använd ett enda kantblad, finhacka snabbt hjärtat i små bitar.
- Tillsätt 1 ml kollagenmatsmältningscocktail och fortsätt färsa tills bitarna är tillräckligt små för att överföra med en 1 ml mikropipett. Överför bitar till ett 50 mL koniskt rör med en 1 mL mikropipett. Tvätta plattan 2x med 2 ml kollagenmatsmältningscocktail.
OBS: Skära av en del av pipettspetsen kan hjälpa till att samla större bitar av hjärta som annars kan fastna i pipettspetsen. - Inkubera koniskt rör vid 37 °C i 30 min med gungande eller agitation. Säkert rör efter behov. Återsuspend 10x med en 5 ml rörtills innehållet är homogent, och inkubera det koniska röret vid 37 °C i 15 min med rotation eller agitation.
- Återsuspend 10x med en 10 ml pipet tills homogen. Prime en 40 μm cell sil genom att fukta filtret med 1-2 ml KHB buffert ovanpå en ny 50 mL koniska röret. Tillsätt 25 ml KHB-buffert till upphängning, återupphängning och filter genom en primed 40 μm cellsil. Ändra filter efter behov.
OBS: När filtreringen saktar, lätt knacka röret eller använda en 1 mL micropipette att dra suspension från undersidan av filtret kan hjälpa cellen suspension passera genom en delvis blockerad 40 μm cell sil. - Centrifugera vid 400 x g och 4 °C i 10 min. Ta bort supernatanten och återsuspendera pelleten i 1x RBC lysbuffert (5 ml/hjärta). Inkubera i 2 min vid rumstemperatur (RT).
- Centrifugera vid 400 x g och RT i 10 min. Ta bort supernatanten och tvätta sedan genom att återsuspendera pelleten i 1 ml KHB-buffert.
- Tillsätt 9 ml KHB buffert och filter genom primade 40 μm cellsil i nya 50 mL koniska röret. Centrifugera vid 400 x g och RT i 10 min.
- Ta bort supernatanten, återhäng i 1 ml fibroblast media eller PBS och bestämma cellnumret. Fibroblaster kan isoleras av de tre olika metoder som beskrivs nedan.
2. Isolering av fibroblaster från encellig suspension
- Fibroblast isolering: differentialplätering (figur 1)
- Förbered en 6-brunnsplatta genom att lägga till 2 ml fibroblast media per brunn och virvlande plattan för att täcka brunnen botten.
- Återsuspendceller i 1 ml media per hjärta. Platta 1 ml cellsuspension per brunn så att ett hjärta (teoretiskt) pläteras per brunn. Till exempel skulle sex hjärtan återavbrytas i 6 ml media, sedan pläteras i sex brunnar med 1 ml cell suspension per brunn.
- Snurra plattan för att jämnt fördela celler. Lägg till ytterligare 1–2 ml media per brunn för en total volym på upp till 5 ml per brunn och inkubera vid 37 °C i 4 timmar.
- Fibroblaster kommer att separeras genom selektiv vidhäftning efter 4 h. Ta bort obundna och döda celler genom att ta bort media. Tvätta fästa celler med 2 ml PBS och tillsätt 2–4 ml sterilfibroblast media per brunn. Inkubera vid 37 °C tills konfluenta. Byt media var 2–4:e dag.
- Fibroblast Isolation: FACS med hjälp av en GFP reporter mus modell(Bild 1)
- FACS-buffert
- Förbered 15 ml 5% fetalt nötkreatur (FBS) i dPBS utan Ca2+ och Mg2+. Förvaras på is eller vid 4°C.
- FC blockerare lösning
- Förbered 0,5 μL FC-blockerare (renad anti-mouse CD16/CD32) i 25 μL FACS (1:50 utspädning). 25 μL FC-blockerare krävs per prov. Förvaras på is eller vid 4 °C.
- Provberedning och antikroppsfärgning
OBS: Antikroppsutspädningar kan beredas i förväg, men detta kan riskera ljus- eller temperaturexponering.- Förbered 7AAD- eller Ghost-färgämnet violett 510 som är 2x den utspädning som krävs i FACS-bufferten. Se tabell 1 för antikroppar och utspädningar.
- Återsuspend 500.000 nyisolerade celler i 25 μL FC blockerare lösning för att förhindra ospecifik bindning av FC antikroppar regionen till en FC-receptor. Inkubera i 5 min på RT.
- Tillsätt 7AAD- eller Ghost-färgämnet violett 510-antikroppar till den slutliga volymen av 25 μL cellsuspension. Inkubera i 30–60 min på is i mörkret.
- Tvätta genom att pausa i 1 ml FACS-buffert. Centrifugera vid 500 x g i 5 min vid 4°C.
- Återsuspendering av pelleti rekommenderad flödecytometriprovvolym av FACS-buffert (300 μL) och överför till flödecytometrirör.
- Fluorescensaktiverad cellsortering (FACS)
OBS: GFP-αSMA reporter möss var ett bidrag från Dr Ivo Kalajzic11. Denna mus uttrycker GFP under alfa glatt muskel cell (αSMA) promotorn. αSMA har använts som markör för aktiverade fibroblaster (myofibroblaster)12.- För aktiverad fibroblast (αSMA uttrycker myofibroblast) isolering, inducera hjärtinfarkt i 12 veckor gamla GFP-αSMA möss genom kranskärlligation. Offra mössen 8–10 dagar efter skada.
- Efter encellig suspension från de skadade mössens hjärtan, sortera αSMA+ve fibroblaster för grönt fluorescerande protein (GFP). Använd ofärgade oskadade fibroblaster för att ställa in bakgrundssignalen i GFP-kanalen efter kompensationen.
- Gate för levande GFP+ ve celler genom gating för 7AAD-ve /GFP+ ve celler eller Ghost färgämne violett 510-ve/GFP+ ve celler och sortera GFP uttrycker αSMA+ ve myofibroblaster.-ve Samla cellerna i fibroblast media.
- FACS-buffert
- Fibroblast isolering: magnetiska pärlor-baserad isolering av fibroblaster(figur 1)
- Equilibration buffert
OBS: Förbered alltid ny buffert för isoleringar.- Förbered 0,5% BSA och 2 mM EDTA i PBS. Avgasa bufferten genom att röra om lösningen medan du fäster ett vakuum på behållarens lock.
OBS: Omrörning tar bort överflödig gas från den lösning som sedan avlägsnas genom vakuumet så att bubblor inte täpper till separationskolonnen vid användning.
- Förbered 0,5% BSA och 2 mM EDTA i PBS. Avgasa bufferten genom att röra om lösningen medan du fäster ett vakuum på behållarens lock.
- Magnetisk märkning: CD45+ hematopoietiska celler
- Centrifugera isolerade celler från möss hjärtan på 500 x g i 5 min, sedan ta bort supernatant.
- Återupphäng cellkulanten i 1 ml jämviktsbuffert. Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer.
- Centrifugera cellsuspensionen enligt ovan och återsuspendera cellpelleten i 90 μL ekviliberingsbuffert per 1 x 107 totala celler. Tillsätt 10 μL CD45+ magnetiska pärlor per 1 x 107 totala celler. Blanda väl och inkubera i minst 15 min vid 4°C.
- Tvätta celler genom att lägga till 2 ml ekviliberingsbuffert per 1 x 107 totala celler, centrifugera sedan vid 500 x g i 10 min vid 4°C.
- Ta bort supernatant, räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer och återsuspendera upp till 1 x 107 totala celler i 2 ml jämviktsbuffert. Om det finns fler än 107 celler, skala bufferten linjärt. Skicka celler genom ett 40 μm-filter för att förhindra att cellaggregeringar täpper till separationskolonnmatrisen.
- Magnetisk separation: CD45+ hematopoietiska celler
- Placera separationskolonnen i magnetfältet i en lämplig separator och jämviktskolonn med minst 3 ml PBS.
- Samla omärkta celler i genomflödet (FT) och tvätta kolumn 3x med 3 ml jämviktsbuffert. Samla tvättar med FT. Ta bort kolumnen från separatorn. Placera kolonnen på ett 15 mL koniskt rör.
- Spola ut magnetiskt märkta CD45+ celler genom att pipetting 5 ml jämvikt buffert på kolumnen och stadigt störta cellerna med en kolv levereras med kolumnen.
- Centrifugeluent samt FT/tvättfraktioner vid 500 x g. Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer.
- Magnetisk märkning och separation: CD31+ endotelceller
- Upprepa protokollet för CD45+ magnetisk märkning och separation (avsnitt2.3.2–2.3.3), förutom använd CD31+ magnetiska pärlor för att ruva med FT och tvätta portioner från CD45+ isolering.
- Magnetisk märkning och separation: MEFSK4+ fibroblaster
- Upprepa protokollet för CD45+ magnetisk märkning med hjälp av MEFSK4 anti-feeder-APC-antikroppen istället för magnetiska pärlor. Centrifugera FT- och Wash-portionerna från CD31+ isoleringen vid 500 × g i 5 min och ta sedan bort supernatanten. Återupphäng cellpelleten i 1 ml jämviktsbuffert och räkna cellerna med en hemocytometer.
- Tillsätt 10 μL MEFSK4 anti-feeder-APC-antikroppar per 1 x 107 celler. Inkubera i minst 15 min vid 4 °C.
- Tvätta MEFSK4-celler genom att lägga till 5 ml jämviktsbuffert per 1 x 107 totala celler och centrifugera sedan vid 500 x g i 5 min.
- Ta bort supernatant och återsuspend i anti-APC pärlor, med samma volym av MEFSK4 anti-feeder-APC antikroppar som används. Inkubera på is i 15 min vid 4 °C.
- Centrifugera vid 500 x g i 10 min. Ta bort supernatant, återsuspendera i 2 ml jämviktsbuffert per 1 x 107 totala celler och fortsätt med magnetisk separation enligt tidigare beskrivna (avsnitt 2.3.3). Magnetiskt separerade MEFSK4+ve/ CD45-ve/CD31-ve fibroblaster kan användas för renhetsanalyser och andra nedströmsapplikationer.
- Equilibration buffert
3. Renhet och funktionalitet analys av isolerade Fibroblast Population
- FACS befolkningrenhetsanalys: αSMA-GFP cellanalys (figur 2)
- Återsuspend nya isolerade celler i 25 μL fc blockerare lösning för att förhindra ospecifik bindning av antikroppar. Inkubera i 5 min på RT.
- Tillval: tillsätt 25 μL 7AAD eller Ghost dye violett 510 till cellsuspension. Inkubera i 30–60 min på is i mörkret.
- Tvätta genom att pausa i 1 ml FACS-buffert. Centrifugera vid 500 x g i 5 min.
- Återsuspendpelleten i 50 μL FACS-buffert. Lägg till CD31-PE, CD45-APC och AN2/NG2-antikroppar direkt till cellfjädring. Inkubera i 15 min på is(tabell 1).
- Tvätta genom att pausa i 1 ml FACS buffert. Centrifugera vid 400 x g i 5 min.
- Lägg till åsne anti-råtta AlexaFluor 405 sekundära antikroppar till de celler som är märkta med okonjugerade primära antikroppar. Inkubera i 30 min på is.
- Tvätta genom att pausa i 1 ml FACS-buffert. Centrifugera vid 400 x g i 5 min.
- Återsuspendering av pellet i rekommenderad flödecytometriprovvolym av FACS-buffert (300 μL) och överför till ett märkt flödescytometrirör för flödesanalys.
OBS: FACS-analys för att karakterisera uttrycket av MEFSK4-antigen på isolerade fibroblaster beskrivs i avsnitt 3.3.
- Fibroblast renhet analys: immunofluorescens (figur 3A)
- Seed 30.000 primära fibroblaster (P0-P1) per brunn på täcke placeras i en 24 brunnsplatta och kultur tills 80% confluent. Eller koncentrera sorterade CD45+ och CD31+ celler (30.000 celler per brunn) på en coverslip av cytospin på 400 x × g (en metod som används för att deponera celler direkt och jämnt på en täcke i en 24 brunnsplatta).
- Fixa celler med kall aceton i 15 min. Tvätta 3x gånger med PBS.
- Block diabilder i 10% getserum. Inkubera diabilder med primära antikroppar över natten (tabell 2).
- Tvätta diabilder 3x i PBS. Inkubera sekundära antikroppar under 2 h (tabell 2).
- Counterstain glider och montera med en droppe DAPI i långsamt tonade monteringsmedia.
- FACS befolkningrenhetsanalys: MEFSK4-sondering (figur 3B)
- Återsuspend nya isolerade celler i 25 μL FC blockerare lösning för att förhindra ospecifik bindning av antikroppar. Inkubera i 5 min på RT.
- Tillval: tillsätt 25 μL 7AAD eller Ghost dye violett 510 till cellsuspension. Inkubera i 30–60 min på is i mörkret.
- Tvätta genom att pausa i 1 ml FACS-buffert. Centrifugera vid 500 x g i 5 min.
- Återsuspendpelleten i 50 μL FACS-buffert. Lägg till MEFSK4-antikroppar direkt i cellsuspensionen. Inkubera i 15 min på is (tabell 1).
- Tvätta genom att pausa i 1 ml FACS-buffert. Centrifugera vid 400 x g i 5 min.
- Lägg till råttan IgG-APC i cellerna (tabell 1). Inkubera i 30 min på is.
- Tvätta genom att pausa i 1 ml FACS-buffert. Centrifugera vid 400 x g i 5 min.
- Återsuspendering av pelleti rekommenderad flödecytometriprovvolym av FACS-buffert (300 μL) och överför till flödecytometrirör för flödesanalys.
- Fibroblast renhet analys: semi-kvantitativa realtid rtPCR(figur 3C)
- RNA-isolering och semikvantitativ realtids-PCR
- Efter anrikningen av fibroblaster, isolera RNA med hjälp aven RNA isolering kit (se Tabell över material ). Följ tillverkarens anvisningar.
- Komplett första strängen DNA-syntes med hjälp av en cDNA-synteskit (se Materialtabell), enligt tillverkarens anvisningar.
- Utför semikvantitativ pcr5i realtid .
- Fibroblast funktionalitet analys: kollagen gel contractility analys(Figur 4)
- Kollagenlösning
- Förbered 20 mM HEPES och 44 mM NaHCO3 i DMEM. Tillsätt 1,67 mg typ 1 råtta kollagen per 1 ml DMEM med HEPES och NaHCO3.
- TGFβ-kompletterad DMEM
- Förbered 10% FBS i DMEM kompletteras med antibiotika och anti-svamp. Lägg till TGFβ till en slutlig koncentration på 1 ng/mL.
- Cell/kollagenblandning och plätering
- Förbered cellsuspension (P3-P5) och bestäm önskad volym för att få 3,3 x 105 celler.
- Tillsätt fjädringsvolym med 3,3 x 105 celler till tillräckligt med kollagenlösning för att få 1 ml total volym.
OBS: Rat kollagen typ 1 koncentration bör nu vara 1,5 mg/ml. - I en 48 brunnsplatta, utsäde 300 μL cell-kollagen blandning per brunn (~ 1 x 105 celler / ja). Inkubera vid 37 °C i 15–20 min tills gelen är gel.
- Använd en 30 G-nål för att separera gel från brunnsväggarna. Tillsätt 600 μL TGFβ och FBS kompletterade DMEM till varje brunn. Bildplattor på en reflekterande skanner vid 24 h och 48 h.
OBS: Alla immunfluorescensexperiment utfördes på en flödescytometrimaskin utrustad med tre lasrar (405 nm, 488 nm och 640 nm). Data förvärvades med hjälp av ett flödesdata som hämtar programvara (Tabell över material). Ytterligare dataanalys utfördes med hjälp av flödesdataanalysprogramvara. AlexaFluor 405 och Ghost Dye Violet 510 var glada med 405 nm laser och samlas in med hjälp av en 450/50 BP och 525/50 BP filter, respektive. GFP och PE var glada över 488 nm laser och samlas in med hjälp av 530/30 BP och 575/26 BP filter, respektive. Antingen APC eller AlexaFluor 647 var upphetsad av 640 nm laser och samlas in med hjälp av en 670/14 BP filter. Alla cellsorteringsexperiment utfördes på en flödescytometrimaskin(Tabell över material)utrustade med fyra lasrar (405 nm, 488 nm, 561 nm och 640 nm). 7-AAD var upphetsad med hjälp av 561 nm laser och samlas med en 670/14 BP filter. GFP och Ghost Dye Violet 510 samlades in med samma laser/filterkombinationer enligt beskrivningen ovan. Alla sorteringsexperiment använde ett 100 um munstycke med en 17 psi tryckkonfiguration för ökad nedströms lönsamhet av målcellerna.
- Kollagenlösning
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Flöde gating system som visar myofibroblast isolering med αSMA-GFP reporter möss
Oskadade hjärtan visade inga påvisbara GFP+ celler i αSMA-GFP reporter mus modell; Därför användes de för att upprätta en grind för bakgrundssignalen från GFP-kanalen efter kompensation (figur 2). αSMA+ celler sorterades baserat på förekomsten av GFP uttryck från den skadade vänstra ventrikeln 10 dagar efter MI. En liten andel endotel (GFP+/CD31+ celler; SD = 3,8% ± 0,0164; n = 5) och hematopoietika (GFP+/CD45+-celler; SD = 3,18% ± 0,0112; n = 5) celler uttryckte också GFP i de skadade αSMA-GFP mushjärtan(figur 2A). GFP+/CD31-/CD45-cellerna uttryckte dock inte AN2, en pericytemarkör.
Oskadade (quiescent) och skadade (aktiverade, αSMA+GFP+) celler uttryckt fibroblast markörer
GFP+ celler isolerade från αSMA-GFP möss uttryckt αSMA, kollagen typ 1 alfa-1 kedja (COL1α1), vimentin och periostin när analyseras av IF analys. Oskadade fibroblaster isolerade av selektiv vidhäftning uttryckt vimentin men visade inte uttryck för de aktiverade fibroblastmarkörerna: αSMA, periostin och COL1α1 (figur 3A). Både oskadade och aktiverade fibroblaster uttryckte MEFSK4-antigenet när det analyserades genom flödesanalys (figur 3B). Magnetiskt isolerade MEFSK4+ve-celler från oskadade mösss hjärtan uttryckte markörer för fibroblaster: Col1a1, pdgfrα och periostin. Däremot hade magnetiskt isolerade CD45 och CD31 positiva celler försumbara uttryck för fibroblast markörer.
Fibroblaster och myofibroblaster visade förmågan att kontrakt kollagen
I cellodling på styv plast har fibroblaster visat sig ingå kollagengeler i närvaro av TGFβ, vilket visar deras funktionella förmåga att kontraktion13,14. Denna in vitro-egenskap hos fibroblaster är mycket lik den bindvävsammandragning som händer under vävnadsreparation samt andra biologiska processer. Både oskadade fibroblaster, isolerade av selektiv vidhäftning, och myofibroblaster, isolerade och sorterade från αSMA-GFP möss, visat en förmåga att kontrakt kollagen(figur 4).
Figur 1: Schematisk av fibroblast isolering med hjälp av tre olika metoder. (A)differentialplätering,(B)GFP+ cellsortering av αSMA-positiva celler och(C)magnetisk pärlbaserad isolering av fibroblaster. Representativt ljust fält av cellerna i kultur efter differentialplätering. Skala bar = 50 μM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: FACS-analys av enskilda celler isolerade från αSMA-GFP möss hjärtan efter MI. (A)Representativt FACS-gating-system som visar GFP+-celler som uttrycker CD31, CD45 eller AN2 från αSMA-GFP-möss skadade hjärtan 10 dagar efter hjärtinfarkt (MI). b)Grafisk kvantifiering av de presenterade FACS-uppgifterna för hjärter efter den gemensamma institutionen. n = 5 experiment utfördes självständigt (***p < 0,0001 enligt en enkelriktad ANOVA med Tukeys flera jämförelsetest). Denna siffra är anpassad från Saraswati et al.10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Renhetanalyser av fibroblaster isolerade från oskadade och skadade mösss hjärtan. (A)Immunfluorescensfärgning av cellpopulationer (P0) från hjärtat av oskadade eller skadade αSMA-GFP-möss sorterade efter FACS. Både oskadade och aktiverade celler uttrycker fibroblast (FB) markörer, såsom COL1α1, och vimentin, men inte hematopoietic markör CD45 eller endotelmarkör CD31. Celler som isolerats från skadade αSMA-GFP möss hjärta uttryckt aktiverad fibroblast markörer, αSMA, och periostin, som inte fanns i cellerna isolerade från oskadade möss hjärtan. Kärnor färgades med DAPI, n = 3 experiment utfördes självständigt. Skalstång = 100 μm. (B)RepresentativFACS överlägg histogram av oskadade och aktiverade fibroblaster (P3–P5) som visar uttrycket av fibroblastmarkören MEF-SK4. För en negativ kontroll användes rat IgG, n = 2 experiment utfördes självständigt. (C)Relativ vikförändring av Col1α1, Pdgfrαoch Postn-avskrifter i oskadade MEKSK4+ve fibroblaster, n = 3 experiment utfördes självständigt (*p < 0,05 enligt vad som beräknats med hjälp av tvåvägs ANOVA med Tukeys flera jämförelsetest). (A) och (B) är anpassade från Saraswati et al.10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Funktionell karakterisering av fibroblaster isolerade från oskadade och skadade mushjärtan. Representativ figur av kollagen gel kontraktion i närvaro av oskadade och skadade aktiveras αSMA+ fibroblaster (P3-P5). Diagrammet representerar den procentuella förändringen i det ursprungliga gelområdet efter 24 h och 48 h kontraktion när inkuberas med oskadd och skadad aktiverad αSMA+ fibroblaster, n = 2 experiment utfördes självständigt. Denna siffra är anpassad från Saraswati et al.10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Antikropp | Cellmål | Utspädning |
7AAD (7AAD) | Döda celler | 1:1000 |
Ghost färgämne violett 510 | Döda celler | 1:1000 |
APC-CD45 | Hematopoetiska celler | 1:200 |
PE-CD31 | Endotelceller | 1:200 |
anti-AN2/NG2 | Pericyter | 1:11 |
Åsna anti-råtta alexa fluor 405 | Sekundär antikropp | 1:100 |
Anti-feeder celler-APC (MEFSK4) | Fibroblaster | 1:100 |
Råtta IgG-APC | Isotyp kontroll | 1:100 |
Tabell 1: FACS-färgämnen och antikroppar.
Primär antikropp | Utspädning | |
α-glatt muskelaktin (αSMA) | 1:1000 | |
Fibroblast specifikt protein 1 (FSP1)1:250 | 1:100 | |
KOL 1α1 | 1:1000 | |
Periostin (på plats) | 1:100 | |
Vimentin (vimentin) | 1:200 | |
CD31 (cd31) | 1:250 | |
CD45 (på 85) | 1:250 | |
Sekundär antikropp | Utspädning | |
Get anti-mus Alexa Fluor 488 | 1:200 | |
Get anti-kanin-FITC | 1:200 | |
Get anti-kanin-Cy3 | 1:200 | |
Get anti-råtta Alexa Fluor 488 | 1:200 | |
Get anti-råtta Alexa Fluor 647 | 1:200 |
Tabell 2: Immunofluorescens primära och sekundära antikroppar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fibroblaster är en heterogen grupp av celler, identifieras av olika uppsättning markörer. De proteinmarkörer som har använts för att identifiera fibroblaster är discoidin domänreceptor 2 (DDR2), fibronectin, vimentin, kollagen I och III, och Thy115,16,17,18,19,20.18 Medan vimentin har använts för att identifiera oskadade quiescent hjärt fibroblaster, fibroblast specifika protein 1, αSMA och periostin har visat sig identifiera skada-inducerad aktiverad fibroblaster, med αSMA är den vanligaste markören för att upptäcka aktiverade fibroblaster6,12,21. Dessutom, Tcf21 och MEFSK4 proteiner har fått nyligen erkännande i att erkänna både quiescent fibroblaster finns i oskadd hjärtvävnad samt aktiverade fibroblaster inklusive myofibroblaster finns i skadade mus hjärtan21,22.
Detta protokoll använder tre olika metoder för att isolera och berika fibroblaster och aktiverade fibroblaster inklusive myofibroblaster. Fibroblast förmåga att företrädesvis följa plast används i den första metoden för isolering. Efter enzymatisk matsmältning med liberase, är encellfjädringen av celler sådd på en plastskål för att företrädesvis följa. Oförmågan hos många icke-fibroblast celler att följa polystyren ytan av Petri rätter tillåter oss att ta bort alla medier från skålen och förbli med en relativt ren population av fibroblaster. En varning att använda denna teknik är även fibroblaster företrädesvis kommer att följa polystyren skålen, vissa förorenande icke-fibroblast celler kan också fästa, lämnar en icke-homogen population av celler.
Den andra isoleringstekniken använder FACS för att separera αSMA som uttrycker myofibroblaster från andra celler. I den transgena musmodellen som används här uttrycks GFP uteslutande tillsammans med αSMA, så myofibroblaster som innehåller αSMA kan detekteras av en FACS-maskin genom GFP:s fluorescerande kapacitet. Denna isoleringsprocedur gör det möjligt för oss att få en population av celler som är cirka 99% myofibroblast. Renhetsanalyserna av dessa celler har beskrivits utförligt av Saraswati et al.10.
Den tredje isoleringstekniken är ett effektivt sätt att isolera både oskadda och aktiverade fibroblaster genom magnetisk pärlbaserad separation av MEFSK4 som uttrycker cell. Genom att tillåta en encellfjädring att binda till anti-CD45 och anti-CD31 magnetiska pärlor och bli immobiliserade i en matris på grund av magnetiska fälteffekter, detta tillät separation av någon hematopoietic samt endotelceller som kan ha förorenat fibroblast isolering. Som MEFSK4 har nyligen använts som en pålitlig markör för att identifiera fibroblaster, en antikropp som kommer att binda till MEFSK4 uttrycksceller kan tillämpas. Efter att ha binder en magnetisk strålande till antikroppen, skapa ett komplex som tillåter isolering av fibroblaster, den magnetiska bead-cell komplex passerar genom en matris i ett magnetfält, och en mycket berikad fibroblast befolkningen erhålls. Renheten hos den isolerade fibroblast populationen bör bedömas genom immunostaining, RTPCR, och flöde cytometri analyser.
Som med alla andra tekniker finns det begränsningar med de tekniker som beskrivs i detta manuskript. Begränsningen av det selektiva vidhäftningsprotokollet och magnetisk pärmbaserad isolering är att dessa metoder inte skiljer mellan quiescent och aktiverade fibroblaster. För att berika aktiverade fibroblaster bör isoleringen utföras 8–10 dagar efter hjärtinfarkt. Dessutom är det viktigt att kontrollera renheten i isoleringen med andra fibroblast markörer. MEFSK4-positiv fibroblast renhet har visats endast av RTPCR, rekommenderas att testa (genom immunfärgning och flöde cytometri analys) med andra fibroblast markörer och markörer som erkänner förorenande celltyper inklusive hematopoietic (CD45), (CD31) och pericyter (AN2). Om möjligt kan andra fibroblast specifika markörer användas för att ytterligare sortera eller magnetiskt isolera fibroblast befolkningen.
Att använda αSMA-GFP-möss för att isolera och sortera myofibroblaster är en tillförlitlig teknik för att få en aktiverad fibroblastpopulation. Emellertid, en försumbar andel av hematopoietic och endotelceller har observerats i flödesanalysen. För att förbättra den här tekniken bör CD45+ve/CD31+ve- och AN2+ve-celler uteslutas från GFP+ve/αSMA+ve cellsortering. Eftersom αSMA är en allmänt accepterad markör för myofibroblaster, är αSMA-GFP reporter mus modellen ett värdefullt verktyg som bör utnyttjas för att studera myofibroblaster i samband med hjärtinfarkt skador.
Det finns flera viktiga felsökningsåtgärder som måste beaktas. Matsmältningstiden kan minskas om cellens bärkraft och avkastning påverkas. En rörstång bör inte användas för att röra upp matsmältningsblandningen, eftersom detta påverkar cellens livskraft. Röret bör säkras på en vippa eller i en skakning inkubator att agitera matsmältningen blandningen försiktigt. Återupphängning av den smälta vävnaden 10x med en 5 ml eller 10 ml pipett är avgörande för korrekt dissociation av celler.
Korrekt röda blodkroppar lysis av encelliga suspension måste utnyttjas om celler kommer att sorteras eller analyseras genom flöde cytometri. För magnetisk pärpisolering är avgasning av bufferten nödvändig för att förhindra införandet av luftbubblor i kolonnen. Kolonnen som används för magnetisk pärjcellsisolering bör inte återanvändas mellan olika magnetiska pärpkonjugerade celler. Till exempel bör en ny kolumn användas för att separera CD45+ celler, som bör kasseras efter elution av CD45+ celler, sedan en annan ny för CD31+ cellisolering. I våra händer har vi inte sett kontaminering av pericyter i isolerade/sorterade fibroblaster. MEFSK4 har dock visat sig känna igen pericyter22. Det rekommenderas därför att använda ytterligare ett steg för att sortera ut/magnetiskt utarma pericyter (AN2) från de enskilda cellerna. Även om detta protokoll valideras hos 12 veckor gamla möss kan tekniken användas för yngre eller äldre möss.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Dr Ivo Kalajzic för αSMA-GFP möss. Forskning som rapporterats i denna publikation stöddes av National Institute of General Medical Sciences vid National Institutes of Health (NIH) under Award Number R01GM118300 (S.S.), National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering of the NIH under Award Number R21EB019509 (P.P.Y.) och Scientist Development Grant of the American Heart Association under Award Number 17SDG33630187 (S.S.). Flödecytometri analyser utfördes vid VUMC Flow Cytometri Delad resurs som stöds av Vanderbilt Ingram Cancer Center (P30 CA68485) och Vanderbilt Digestive Disease Research Center (DK058404).
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | |||
Acetone | |||
Anti-fungal (Amphotericin B-solubilized; Fungizone) | Sigma Aldrich | A9528 | |
Bovine Serium Albumin (BSA) | Sigma | 9048-46-8 | |
Calcium chloride | |||
Citrate Buffer | |||
Collagenase blend (Liberase Blendzyme 3 TH) | Roche Applied Science | ||
DAPI | |||
DDI water | |||
DI water | |||
DMEM-F12 with L-Glutamine and HEPES | Life technologies | 11330057 | |
Dnase I(20U/mL) | BioRad | 7326828 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (dPBS) without Ca2+ and Mg2+ | Gibco | 13190-144 | |
70% Ethanol | |||
FC Blocker (Purified anti-mouse CD16/CD32) | Tonbo Biosciences | 70-0161 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 16000044 | |
10% goat serum | |||
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 21-023-CV | |
1M HEPES | Corning | 25-060-Ci | |
Krebs-Henseleit Buffer powder | Sigma | K3753 | |
Mycoplasma prophylactic (Plasmocin) | Invivogen | ant-mpp | |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
1x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | |||
10x Red Blood Cell Lysis Buffer | Miltenyi | 130-094-183 | |
Slow-fade Mounting Media | |||
Sodium azide | |||
Sodium bicarbonate | |||
TGFβ | |||
Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
Type 1 Rat Collagen | |||
Antibodies | |||
7AAD (stock: 1 mg/mL solution in DMSO) | Molecular Probes | A1310 | dilution = 1:1000; RRID = |
CD45-APC | BD Bioscience | 559864 | dilution = 1:200; RRID = AB_398672 |
CD31-PE | BD Bioscience | 553373 | dilution = 1:200; RRID = AB_394819 |
CD31 | BD Biosciences | 553370 | dilution = 1:250; RRID = AB_394816 |
CD45 | BD Biosciences | 553076 | dilution = 1:250; RRID = AB_394606 |
COL 1α1 | MD Bioproducts | 203002 | dilution = 1:1000; RRID = |
Ghost dye violet 510 (Formulation: 1 uL/test in DMSO) | Tonbo Biosciences | 13-0870 | dilution = 1:1000; RRID = |
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11029 | dilution = 1:200; RRID = AB_138404 |
Goat anti-rabbit-Cy3 | Southern Biotech | 4050-02 | dilution = 1:200; RRID = AB_2795952 |
Goat anti-rabbit-FITC | Jackson Immunoresearch Laboratories | 711-165-152 | dilution = 1:200; RRID = AB_2307443 |
Goat anti-rat Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11006 | dilution = 1:200; RRID = AB_2534074 |
Goat anti-rat Alexa Fluor 647 | Thermo-Fisher | A21247 | dilution = 1:200; RRID = AB_141778 |
Periostin | Santa Cruz | SC67233 | dilution = 1:100; RRID = AB_2166650 |
Vimentin | Sigma Aldrich | V2258 | dilution = 1:200; RRID = AB_261856 |
α-smooth muscle actin (αSMA) | Sigma Aldrich | A2547 | dilution = 1:1000; RRID = AB_476701 |
Fibroblast specific protein 1 (FSP1) | Millipore 07-2274 | 07-2274 | dilution = 1:100; RRID = AB_10807552 |
CD45 Magnetic Beads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
CD31 Magnetic Beads | Miltenyi Biotec | 130-087-418 | |
Anti-feeder cells-APC (MEFSK4) | Miltenyi Biotec | 130-102-900 | dilution = 1:100; RRID = AB_2660619 |
anti-APC Beads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
Rat IgG-APC | Miltenyi Biotec | 130-103-034 | dilution = 1:100; RRID = AB_2661598 |
Donkey anti-rat Alexa Fluor405 | Abcam | ab175670 | dilution = 1:100 |
anti-AN2/NG2 | Miltenyi Biotec | 130-097-455 | dilution = 1:11; RRID = AB_2651235 |
Other Materials | |||
0.22 µm Filter | Thermo Scientific | 723-2520 | |
10 cm2 Cell Culture Dish | Corning | 430167 | |
10 mL Pipet | Fisherbrand | 13-678-11E | |
40 µm Cell Strainer | Fisherbrand | 22363547 | |
5 mL Pipet | Fisherbrand | 13-678-11D | |
50 mL Conical Tube | Falcon | 352070 | |
6-well Plate | Corning | 3506 | |
Flow Cytometry Tubes | Falcon | 352058 | |
Forceps | |||
Rocker | |||
Single Edge Blade | PAL | 62-0177 | |
Surgical Scissors | |||
GFP-αSMA Reporter Mice | |||
MACS Separator Magnetic Field | |||
MACS Separation Column | |||
Coverslips | |||
Qaigen Rneasy Mini Kit | Qaigen | 74104 | |
Ambion RNAqueous Micro Total Isolation Kit | Ambion | AM1931 | |
BioRad iScript cDNA Syntehsis Kit | BioRad | 1708891 | |
48-well Plate | |||
30G Needle | |||
3 Laser Flow Cytometry Machine (BD LSRFortessa) | BD Biosciences | ||
4 Laser Flow Cytometry Machine (BD FACSAria III) | BD Biosciences | ||
Flow Data Acquiring Software (BD FACSDiva Software v8.0a) | BD Biosciences | ||
Flow Data Analysis Software (FlowJo Software) | BD Biosciences |
References
- Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the Cardiac Fibroblast. Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).
- Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction: From Inflammation to Fibrosis. Circulatory Research. 119 (1), 91-112 (2016).
- Duan, J., et al. Wnt1/betacatenin injury response activates the epicardium and cardiac fibroblasts to promote cardiac repair. EMBO Journal. 31 (2), 429-442 (2012).
- Shinde, A. V., Frangogiannis, N. G. Fibroblasts in myocardial infarction: a role in inflammation and repair. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 70, 74-82 (2014).
- Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing. Nature Communications. 10 (1), 3027 (2019).
- Kong, P., Christia, P., Saxena, A., Su, Y., Frangogiannis, N. G. Lack of specificity of fibroblast-specific protein 1 in cardiac remodeling and fibrosis. American Journal of Physiology -Heart and Circulatory Physiology. 305 (9), 1363-1372 (2013).
- Furtado, M. B., Nim, H. T., Boyd, S. E., Rosenthal, N. A. View from the heart: cardiac fibroblasts in development, scarring and regeneration. Development. 143 (3), 387-397 (2016).
- Stellato, M., Czepiel, M., Distler, O., Blyszczuk, P., Kania, G. Identification and Isolation of Cardiac Fibroblasts From the Adult Mouse Heart Using Two-Color Flow Cytometry. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 105 (2019).
- Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulatory Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing. Nature Communications. 10 (1), 3027 (2019).
- Kalajzic, Z., et al. Use of an alpha-smooth muscle actin GFP reporter to identify an osteoprogenitor population. Bone. 43 (3), 501-510 (2008).
- Travers, J. G., Kamal, F. A., Robbins, J., Yutzey, K. E., Blaxall, B. C. Cardiac Fibrosis: The Fibroblast Awakens. Circulatory Research. 118 (6), 1021-1040 (2016).
- Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (3), 1274-1278 (1979).
- Montesano, R., Orci, L. Transforming growth factor beta stimulates collagen-matrix contraction by fibroblasts: implications for wound healing. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 85 (13), 4894-4897 (1988).
- Goldsmith, E. C., et al. Organization of fibroblasts in the heart. Developmental Dynamics. 230 (4), 787-794 (2004).
- Bagchi, R. A., Lin, J., Wang, R., Czubryt, M. P. Regulation of fibronectin gene expression in cardiac fibroblasts by scleraxis. Cell Tissue Research. 366 (2), 381-391 (2016).
- Goodpaster, T., et al. An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 347-358 (2008).
- Chapman, D., Weber, K. T., Eghbali, M. Regulation of fibrillar collagen types I and III and basement membrane type IV collagen gene expression in pressure overloaded rat myocardium. Circulatory Research. 67 (4), 787-794 (1990).
- Vasquez, C., Benamer, N., Morley, G. E. The cardiac fibroblast: functional and electrophysiological considerations in healthy and diseased hearts. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 380-388 (2011).
- Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 42 (5), 991-1000 (2007).
- Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
- Pinto, A. R., et al. Revisiting Cardiac Cellular Composition. Circulatory Research. 118 (3), 400-409 (2016).