هنا ، نحن نميز بنية البروتين ومواقع التفاعل في الخلايا الحية باستخدام تقنية بصمة البروتين التي يطلق عليها الأكسدة الضوئية الضوئية السريعة للبروتينات (IC-FPOP).
الأكسدة الضوئية السريعة للبروتينات (FPOP) هي طريقة بصمة البروتين الهيدروكسيل الراديكالية المستخدمة لتوصيف بنية البروتين والتفاعلات. FPOP يستخدم ليزر excimer 248 نانومتر لphotolyze بيروكسيد الهيدروجين إنتاج الجذور الهيدروكسيل. هذه الجذور تعديل المذيبات المؤكّد السلاسل الجانبية المكشوفة من 19 من الأحماض الأمينية 20. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام هذه الطريقة في الخلايا الحية (IC-FPOP) لدراسة تفاعلات البروتين في بيئتها الأصلية. دراسة البروتينات في الخلايا حسابات للازدحام بين الجزيئات والتفاعلات البروتين المختلفة التي تعطلت للدراسات المختبرية. تم تصميم نظام تدفق خلية واحدة مخصص للحد من تجميع الخلايا وانسداد خلال IC-FPOP. يركز نظام التدفق هذا الخلايا بعد الليزر excimer بشكل فردي ، وبالتالي ضمان التشعيع المستمر. من خلال مقارنة مدى الأكسدة المنتجة من FPOP لإمكانية وصول المذيبات للبروتين المحسوبة من بنية بلورية ، يمكن لـ IC-FPOP أن تحقق بدقة السلاسل الجانبية للمذيبات التي يمكن الوصول إليها من البروتينات.
البصمة البروتينية الجذرية الهيدروكسيل (HRPF) هي طريقة تحقق إمكانية وصول المذيبات من البروتين من خلال التعديلات الكوفالة المنتجة من جذور الهيدروكسيل. عندما يتغير هيكل البروتين أو تفاعلات البروتين ، فإنه سيغير تعرض المذيبات من الأحماض الأمينية ، وبالتالي تغيير مدى تعديل المخلفات. مع HRPF، تفاعلات البروتين1،,2،,3 والتغيرات التشكلية البروتين4،,5،,6 وقد تم استجوابه بنجاح في المختبر. هناك العديد من الطرق التي تولد الجذور الهيدروكسيل للتجارب HRPF، واحدة يجري الأكسدة الضوئية السريعة من البروتينات (FPOP). تم تطوير FPOP من قبل هامبلي وغروس في عام 2005 ويستخدم ليزر excimer 248 نانومتر لإنتاج الجذور الهيدروكسيل من خلال التحليل الضوئي لبيروكسيد الهيدروجين (H2O2)7.
في الآونة الأخيرة ، وسعت اسبينو وآخرون استخدام FPOP للتحقيق في بنية البروتين في الخلايا الحية ، وهي طريقة يطلق عليها في الخلية FPOP (IC-FPOP)8. على النقيض من الدراسات المختبرية، دراسة البروتينات في الخلايا حسابات للازدحام الجزيئي جنبا إلى جنب مع مختلف التفاعلات البروتين التي يمكن أن تؤثر على الهيكل. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يقدم ميزة توفير لقطة من البروتيوم الكامل يحتمل أن توفر معلومات هيكلية من العديد من النظم في وقت واحد لأداء البيولوجيا الهيكلية البروتيوم واسعة. وعلاوة على ذلك، هذه التقنية مثالية للبروتينات التي يصعب دراستها في المختبر، مثل بروتينات الغشاء.
بحثت الدراسات الأولية لـ IC-FPOP بنجاح 105 بروتينات تتراوح في وفرة البروتين وتوطين الخلايا. لتحسين طريقة IC-FPOP ، طور Rinas وآخرون نظام تدفق صغير لتدفق الخلية المفردة9. ويحد تعزيز نظام التدفق الأصلي من تجميع الخلايا ويزيد من المتاحة H2O2 المتاحة للتشعيع. في نظام التدفق الأولي ، أدت الخلايا التي تتجمع في أنابيب السيليكا إلى القباقيب والتشعيع غير المتكافئ. دمج اثنين من تيارات العازلة غمد هيدروديناميكيا يركز الخلايا، مما يسمح لهم بالتدفق بشكل فردي الماضي الليزر. يتيح دمج حقنة منفصلة لـ H2O2 وقت تعرض أكثر تحكمًا وقابلًا للتحسين مما يسمح بتركيزات H2O2 أعلى دون آثار ضارة. أيضا، الحد من الوقت حضانة يحد من انهيار H2O2 بواسطة الكاتالاز الذاتية. من خلال دمج نظام التدفق الجديد هذا ، زاد عدد البروتينات المكتشفة مع تعديل FPOP 13 مرة ، وبالتالي توسيع قدرات هذه الطريقة للتحقيق في العديد من البروتينات في الخلايا الحية. في هذا البروتوكول يتم وصف تجربة IC-FPOP عامة مع التركيز على تجميع نظام تدفق IC-FPOP.
وقد تم تطوير العديد من التقنيات القائمة على قياس الطيف الكتلي لدراسة بنية البروتين ومجمعات البروتين-ligand بطريقة على نطاق البروتيوم في الخلايا الكاملة أو الخلايا الغنية. وتشمل هذه التقنيات على سبيل المثال لا الحصر استقرار البروتينات من معدل الأكسدة (SPROX)، وتنميط البروتيوم الحراري (TPP)، والربط الكيميائي المتبادل (XL-MS)، وبصمة البروتين الجذري ة الهيدروكسيل (HRPF). كل تقنية لها قيود ومزايا فريدة بالمقارنة مع بعضها البعض ، والتي تم استعراضها على نطاق واسع12. وقد استخدمت كل من هذه الأساليب لبيولوجيا بروتيوم الهيكلية واسعة لتوضيح بنية البروتين وظيفة في نهاية المطاف داخل البيئة الخلوية المعقدة. IC-FPOP هو تقنية HRPF التي تستخدم الجذور الهيدروكسيل لتعديل المذيبات يتعرض السلاسل الجانبية للأكسدة من الأحماض الأمينية، وفحص بنية البروتين والتفاعلات البروتين ليغاند داخل الخلايا قابلة للحياة13. IC-FPOP هو تحسين لـ HRPF الأولي في الخلايا الحية التي استخدمت كيمياء فنتون لتوليد الجذور على مقياس الوقتدقيقة 14. في هذه الدراسة ، تميزت التغيرات الهيكلية في بروتين غشاء متكامل استجابة لخفض درجة الحموضة أو القوة الأيونية للعازل بنجاح بتغطية أكسدة جيدة عبر البروتين. بالمقارنة مع كيمياء فنتون ، فإن IC-FPOP أسرع بكثير ، حيث تعدل البروتينات على المقياس الزمني للثانية الدقيقة ، مما يتيح دراسة تركيبة البروتين الأصلية.
اختبار رئيسي لIC-FPOP هو تأكيد صلاحية الخلايا بعد التعرض لH2O2. باستخدام خط خلط 40 سم ، يتم احتضان الخلايا في H2O2 لمدة 3 s تقريبًا قبل التشعيع. ويمكن تعديل هذا الوقت عن طريق تغيير طول هذا الأنابيب السيليكا. ومن الجدير بالذكر أنه على الرغم من أن استخدام الأزرق trypan لاختبار صلاحية الخلية يظهر الحفاظ على سلامة الخلايا بعد H2O2 حضانة, الخلايا يمكن أن تكون تحت تأثير الإجهاد مسارات الإشارات التي تتفاعل مع H2O2. لحسن الحظ، وقت الحضانة القصير أسرع من تخليق البروتين مما يوفر الثقة لا يتم حث البروتينات الموجودة بواسطة H2O2.
الخطوة الهامة التالية هي تأكيد التجميع السليم لنظام التدفق. مرة واحدة تجميعها، تأكد من عدم وجود تسرب اتّسح بعد مسح النظام مع المخزن المؤقت المطلوب. إذا كانت التسريبات موجودة، تأكد من أن تم قطع أنابيب السيليكا بشكل صحيح وتدفق ضد الفمرة لجعل ختم السليم مرة واحدة تشديد أسفل. جميع أجزاء هي اليد تشديد، لذلك لا توجد أدوات ضرورية. خلال كل تجربة IC-FPOP، تأكد من أن التحريك المغناطيسي في حقنة الخلية لا تزال في الحركة. هذا الانفعالات الصغيرة يحد من عدد الخلايا التي تستقر في الجزء السفلي من الحقنة ولكن ليست قاسية بما يكفي لقص الخلايا. بعد تشغيل واحد، هناك ما يقرب من 50 ميكرولتر من الخلايا المتبقية في الحقنة. تأكد دائمًا من تخفيف هذا الأمر بخطوة الإنصافية للحد من عدد الخلايا التي تنقل إلى التجربة التالية. من المستحسن استخدام حقنة خلية جديدة إذا تم مقارنة علاجات الخلايا المتعددة. من المهم أيضًا تحديد مخزن مؤقت مناسب للخلايا التي يتم اختبارها. بعض المخازن المؤقتة إخماد الهيدروكسيل الجذريمما يؤدي إلى تعديلات أقل على البروتينات. وقد أظهرت شو وآخرون أن بعض المخازن المؤقتة شائعة الاستخدام تقلل من عمر الهيدروكسيل الراديكالي11. DPBS و HBSS هي المخازن المؤقتة المشتركة المستخدمة لتجارب IC-FPOP.
بعد IC-FPOP، وتحسين بروتوكول الهضم على أساس المعلمات اللازمة. نظرًا لأن FPOP تنتج تعديلات التكافؤ التي لا رجعة فيها ، فهناك وقت كاف متاح للهضم الشامل والتنظيف دون فقدان تغطية وضع العلامات. دائما اختبار وتطبيع تركيز البروتين حتى يتم تحميل تركيزات الببتيد موحدة لقياس الطيف الكتلي جنبا إلى جنب. وأخيراً، يجب أن تضع في اعتبارها أنه لا يمكن إجراء الهطول المناعي بالاقتران مع IC-FPOP. إذا كان تعديل FPOP يستهدف منطقة التفاعل سيتم خفض تقارب الجسم المضاد. للمساعدة في زيادة تحديد تعديلات FPOP ، أظهرت خطوات الفصل 2D-chromatographic إلى أكثر من ثلاثة أضعاف عدد الببتيدات المؤكسدة التي تم اكتشافها15.
ويتمثل أحد التحديات التي تواجه أي تجربة من تجارب FPOP في المستوى المعقد لتحليل البيانات بسبب منتجات الأكسدة المحتملة التي يمكن أن تنشأ. هذا صحيح لكل من في الخلية أو في المختبر ولكن يتم زيادة بشكل كبير مع تعقيد المضافة من تحليل تحلل الخلايا. مع مزيد من التحسين من IC-FPOP المزيد من البروتينات مع تغطية التعديل أعلى تنشأ، وبالتالي على وجه السرعة جعل التحليل أكثر صعوبة. إن كمية القص من البيانات التي تم إنشاؤها من تجربة IC-FPOP واحدة يحد من استخدام التحقق اليدوي مما يجعل الباحثين يعتمدون بشكل أكبر على البرامج. ونتيجة لذلك، وضعت ريناس وآخرون استراتيجية كمية لـ HRPF باستخدام بروتيوم ديسكفري (PD)16. يستخدم هذا الأسلوب سير عمل عقدة متعددة البحث على PD جنبا إلى جنب مع منصة كمية في جدول بيانات. ويجري إدخال مزيد من التحسينات على منصة IC-FPOP لزيادة عدد الببتيدات المحددة مع تعديلات FPOP إلى جانب زيادة قابلية الاستنساخ ودقة الكمية.
The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذا العمل من قبل جائزة NSF الوظيفية (MCB1701692) لLMJ.
15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | any brand is sufficient |
5 mL Gas Tight Syringe, Removable Luer Lock | SGE Analytical Science | 008760 | |
50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | any brand is sufficient |
500 µL SGE Gastight Syringes: Fixed Luer-Lok Models | Fisher Scientific | SG-00723 | |
Acetone, HPLC Grade | Fisher Scientific | A929-4 | 4 L quantity is not necessary |
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS120-500 | |
ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100 Å, 5 µm, 180 µm x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg | Waters | 186007496 | |
ACQUITY UPLC M-Class System | Waters | ACQUITY UPLC M-Class System | |
Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | any brand is sufficient |
Aqua 5 µm C18 125 Å packing material | Phenomenex | 04A-4299 | |
Centrifuge | Eppendorf | 022625501 | |
Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
Dithiothreiotol (DTT) | AmericanBio | AB00490-00005 | |
DMSO, Anhydrous | Invitrogen | D12345 | |
EX350 excimer laser | GAM Laser | EX350 excimer laser | |
FEP Tubing 1/16" OD x 0.020" ID | IDEX Health & Science | 1548L | |
Formic Acid, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A117-50 | |
HV3-2 VALVE | Hamilton | 86728 | |
Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
Iodoacetamide (IAA) | ACROS Organics | 122270050 | |
Legato 210 syringe pump | KD Scientific | 788212 | Any syringe pump that can hold 4, 5 mL syringes, withdraw and expel liquid, and have a way to stale the motor should work |
Luer Adapter Female Luer to 1/4-28 Male Polypropylene | IDEX Health & Science | P-618L | |
Methanol, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A454SK-4 | 4 L quantity is not necessary |
Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002436 | |
N,N'-Dimethylthiourea (DMTU) | ACROS Organics | 116891000 | |
NanoTight Sleeve Green 1/16" ID x .0155" ID x 1.6" | IDEX Health & Science | F-242X | |
NanoTight Sleeve Yellow 1/16" OD x 0.027" ID x 1.6" | IDEX Health & Science | F-246 | |
N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN) | ACROS Organics | 177350250 | |
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used |
PE50-C pyroelectric energy meter | Ophir Optronics | 7Z02936 | |
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | 23275 | |
Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | A53225 | |
Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 90058 | |
Pierce Universal Nuclease for Cell Lysis | Fisher Scientific | 88702 | |
Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32" | Molex | 1068680064 | any capillary tubing cutter is sufficient |
Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 150 µm, Outer Diameter 360 µm, TSP150350 | Polymicro Technologies | 1068150024 | |
Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 450 µm, Outer Diameter 670 µm, TSP450670 | Polymicro Technologies | 1068150025 | |
Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 75 µm, Outer Diameter 360 µm, TSP075375 | Polymicro Technologies | 1068150019 | |
Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P382-500 | |
Proteome Discover 2.2 (bottom-up proteomics software) | Thermo Scientific | OPTON-30799 | |
Rotary Magnetic Tumble Stirrer | V&P Scientific, Inc. | VP 710D3 | |
Rotary Magnetic Tumble Stirrer, accessory kit for use with Syringe Pumps | V&P Scientific, Inc. | VP 710D3-4 | |
Super Flangeless Ferrule w/SST Ring, Tefzel™ (ETFE), 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" OD | IDEX Health & Science | P-259X | |
Super Flangeless Nut PEEK 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" & 1/32" OD | IDEX Health & Science | P-255X | |
Super Tumble Stir Discs, 3.35 mm diameter, 0.61 mm thick | V&P Scientific, Inc. | VP 722F | |
Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer | Fisher Scientific | PI89900 | |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
Upchurch Scientific Low-Pressure Crosses: PEEK | Fisher Scientific | 05-700-182 | |
Upchurch Scientific Low-Pressure Tees: PEEK | Fisher Scientific | 05-700-178 | |
UV Fused Silica Plano-Convex Spherical Lenses | THORLABS | LA4052 | |
V&P Scientific IncSupplier Diversity Partner TUMBL STIR DISC PARYLENE 1000 | V&P Scientific, Inc. | VP724F | |
VHP MicroTight Union for 360µm OD | IDEX Health & Science | UH-436 | |
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS118-500 | |
Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 |