Här kännetecknar vi proteinstruktur och interaktionsplatser i levande celler med hjälp av en proteinavtrycksteknik som kallas snabb fotokemisk oxidation av proteiner (IC-FPOP).
Snabb fotokemisk oxidation av proteiner (FPOP) är en hydroxyl radikal protein avtryckmetod som används för att karakterisera proteinstruktur och interaktioner. FPOP använder en 248 nm excimer laser för att photolyze väteperoxid producerar hydroxyl radikaler. Dessa radikaler modifierar oxidativt lösningsmedelexponerade sidokedjor av 19 av de 20 aminosyrorna. Nyligen har denna metod använts i levande celler (IC-FPOP) för att studera proteininteraktioner i sin inhemska miljö. Studien av proteiner i celler står för intermolekylär trängsel och olika proteininteraktioner som störs för in vitro-studier. Ett anpassat system med en cellflöde har utformats för att minska cellaggregering och igensättning under IC-FPOP. Detta flödessystem fokuserar cellerna förbi excimer laser individuellt, vilket säkerställer konsekvent bestrålning. Genom att jämföra omfattningen av oxidation som produceras från FPOP med proteinets lösningsmedelstillgänglighet beräknad från en kristallstruktur kan IC-FPOP noggrant sondera de lösningsmedelstillgängliga sidokedjorna av proteiner.
Hydroxyl radikala protein avtryck (HRPF) är en metod som sonderar lösningsmedeltillgängligheten av ett protein genom kovalenta modifieringar som framställs av hydroxylradikaler. När proteinstruktur eller proteininteraktioner förändras kommer det att förändra lösningsmedelsexponeringen av aminosyror, vilket förändrar omfattningen av modifieringen av rester. Med HRPF harproteininteraktionerna 1,,2,,3 och proteinkonformationella förändringar4,,5,6 framgångsrikt förhörts in vitro. Det finns flera metoder som genererar hydroxylradikaler för HRPF-experiment, varav en är snabb fotokemisk oxidation av proteiner (FPOP). FPOP utvecklades av Hambly och Gross under 2005 och använder en 248 nm excimer laser för att producera hydroxyl radikaler genom fotolys av väteperoxid (H2O2)7.
Nyligen förlängde Espino et al. användningen av FPOP för att sondera proteinstrukturen i levande celler, en metod som kallas i cell FPOP (IC-FPOP)8. I motsats till in vitro-studier, studera proteiner i celler står för molekylär trängsel tillsammans med olika protein interaktioner som potentiellt kan påverka strukturen. Dessutom utgör det fördelen med att ge en ögonblicksbild av den fullständiga proteom som potentiellt ger strukturell information om många system på en gång för att utföra proteom bred strukturbiologi. Dessutom är denna teknik idealisk för proteiner som är svåra att studera in vitro, som membranproteiner.
Inledande studier av IC-FPOP framgångsrikt sonderade 105 proteiner som sträcker sig i protein överflöd och cellulär lokalisering. För att förbättra IC-FPOP-metoden utvecklade Rinas et al. ett mikroflödessystem för encellflöde9. Förbättringen av det ursprungliga flödessystemet begränsar cellaggregering och ökar den tillgängliga H2O2 som är tillgänglig för bestrålning. I det ursprungliga flödessystemet resulterade celler som klumpar i kiselslangen i träskor och ojämn bestrålning. Införlivandet av två strömmar av en skida buffert hydrodynamiskt fokuserar cellerna, så att de kan flöda individuellt förbi lasern. Införlivandet av en separat spruta för H2O2 möjliggör mer kontrollerad och valsabel exponeringstid som möjliggör högre H2O2-koncentrationer utan negativa effekter. Också begränsa inkubationstiden begränsar fördelningen av H2O2 genom endogen katalas. Genom att införliva detta nya flödessystem ökade det upptäckta antalet proteiner med en FPOP-modifiering 13 gånger, vilket utökade kapaciteten hos denna metod för att undersöka en mängd proteiner i levande celler. I detta protokoll beskrivs ett allmänt IC-FPOP-experiment med fokus på sammansättningen av IC-FPOP-flödessystemet.
Flera masspektrometribaserade tekniker har utvecklats för att studera proteinstruktur och protein-ligand komplex på ett proteom-brett sätt i hela celler eller celllysmer. Dessa tekniker inkluderar men är inte begränsade till stabilitet av proteiner från oxidationshastighet (SPROX), termisk proteomprofilering (TPP), kemisk tvärbindning (XL-MS) och hydroxylradikalproteinavtryck (HRPF). Varje teknik har unika begränsningar och fördelar jämfört med varandra, som har genomgått omfattande översyn12. Var och en av dessa metoder har använts för proteom bred strukturbiologi för att belysa proteinstruktur och i slutändan fungera inom den komplexa cellulära miljön. IC-FPOP är en HRPF teknik som använder hydroxyl radikaler för att oxidativt modifiera lösningsmedel exponerade sidokedjor av aminosyror, sondering proteinstruktur och protein-ligand interaktioner inom livskraftiga celler13. IC-FPOP är en förbättring av den initiala HRPF i levande celler som använde Fenton kemi för att generera radikaler på minuter tidskala14. I denna studie, strukturella förändringar i ett integrerat membran protein som svar på att sänka pH eller jonisk styrka bufferten framgångsrikt kännetecknas med god oxidation täckning över proteinet. Jämfört med Fenton kemi, IC-FPOP är mycket snabbare, ändra proteiner på mikrosekunden tidsskalan, vilket gör det möjligt för den inhemska proteinkonformationen att studeras.
Ett viktigt test för IC-FPOP är att bekräfta cellernas livskraft efter exponering för H2O2. Med hjälp av en 40 cm blandningslinje ruvas cellerna i H2O2 för ungefär 3 s före bestrålning. Denna gång kan justeras genom att ändra längden på denna kiseldioxid slangar. Det är anmärkningsvärt att även om användningen av trypan blå för att testa cellenlivbarhet visar integriteten hos cellerna upprätthålls efter H2O2 inkubation, kan cellerna potential vara under stresssom påverkar signalering vägar som interagerar med H2O2. Lyckligtvis är den korta inkubationstiden snabbare än proteinsyntesen som ger förtroende de proteiner som finns inte induceras av H2O2.
Nästa viktiga steg är att bekräfta korrekt montering av flödessystemet. När den är monterad, se till att det inte finns några läckor närvarande efter att ha spolat systemet med önskad buffert. Om det finns läckor, se till att kiselslangen skars ordentligt och spolas mot glödregeln för att göra en ordentlig tätning en gång åtdragen. Alla delar är handdragna, så inga verktyg är nödvändiga. Under varje IC-FPOP-experiment ska du se till att de magnetiska omrörarna i cellsprutan förblir i rörelse. Denna lilla agitation begränsar antalet celler som bosätter sig längst ner i sprutan men är inte tillräckligt hård för att skjuva cellerna. Efter en körning finns det ungefär 50 μL celler kvar i sprutan. Se alltid till att späda ut detta med ett sköljsteg för att begränsa antalet celler som förs över till nästa experiment. Det rekommenderas att använda en färsk cellspruta om flera cellbehandlingar jämförs. Det är också viktigt att välja en lämplig buffert för de celler som testas. Vissa buffertar släcker hydroxylradikalen som leder till färre modifieringar på proteiner. Xu et al. har visat att vissa vanliga buffertar minskar hydroxyl radikal livstid11. DPBS och HBSS är vanliga buffertar som används för IC-FPOP-experiment.
Efter IC-FPOP optimerar du matsmältningsprotokollet baserat på de parametrar som behövs. Eftersom FPOP producerar irreversibla kovalenta ändringar, det finns gott om tid för en grundlig matsmältning och sanering utan att förlora märkning täckning. Testa och normalisera alltid proteinkoncentrationen så att enhetliga peptidkoncentrationer laddas för tandemmasspektrometri. Slutligen, tänk på att en immunoprecipitation inte kan utföras tillsammans med IC-FPOP. Om en FPOP-modifiering är inriktad på interaktionsområdet sänks antikroppens affinitet. För att öka identifieringen av FPOP-modifieringar har 2D-kromatografiska separationssteg visat sig mer än tredubbla antalet oxiderade peptider som upptäckts15.
En utmaning av alla FPOP experiment är den komplicerade nivån av dataanalys på grund av eventuella oxidationsprodukter som kan uppstå. Detta gäller både i cell eller in vitro men ökar drastiskt med den extra komplexiteten i att analysera celllysta. Med mer ytterligare optimization av IC-FPOP uppstår mer proteiner med högre ändringtäckningar, således snabbt danande analys mer mödosamt. Skjuvningmängden data som genereras från ett enda IC-FPOP-experiment begränsar användningen av manuell validering som gör att forskare förlitar sig mer på programvara. På grund av detta utvecklade Rinas et al. en kvanteringsstrategi för HRPF med Proteome Discoverer (PD)16. Den här metoden använder ett arbetsflöde för flera sökningar på PD i kombination med en kvantitativ plattform i ett kalkylblad. Ytterligare förbättringar på IC-FPOP-plattformen pågår för att öka antalet identifierade peptider med FPOP-modifieringar tillsammans med ökad reproducerbarhet och kvantierbarhet.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av NSF CAREER Award (MCB1701692) för LMJ.
15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | any brand is sufficient |
5 mL Gas Tight Syringe, Removable Luer Lock | SGE Analytical Science | 008760 | |
50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | any brand is sufficient |
500 µL SGE Gastight Syringes: Fixed Luer-Lok Models | Fisher Scientific | SG-00723 | |
Acetone, HPLC Grade | Fisher Scientific | A929-4 | 4 L quantity is not necessary |
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS120-500 | |
ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100 Å, 5 µm, 180 µm x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg | Waters | 186007496 | |
ACQUITY UPLC M-Class System | Waters | ACQUITY UPLC M-Class System | |
Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | any brand is sufficient |
Aqua 5 µm C18 125 Å packing material | Phenomenex | 04A-4299 | |
Centrifuge | Eppendorf | 022625501 | |
Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
Dithiothreiotol (DTT) | AmericanBio | AB00490-00005 | |
DMSO, Anhydrous | Invitrogen | D12345 | |
EX350 excimer laser | GAM Laser | EX350 excimer laser | |
FEP Tubing 1/16" OD x 0.020" ID | IDEX Health & Science | 1548L | |
Formic Acid, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A117-50 | |
HV3-2 VALVE | Hamilton | 86728 | |
Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
Iodoacetamide (IAA) | ACROS Organics | 122270050 | |
Legato 210 syringe pump | KD Scientific | 788212 | Any syringe pump that can hold 4, 5 mL syringes, withdraw and expel liquid, and have a way to stale the motor should work |
Luer Adapter Female Luer to 1/4-28 Male Polypropylene | IDEX Health & Science | P-618L | |
Methanol, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A454SK-4 | 4 L quantity is not necessary |
Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002436 | |
N,N'-Dimethylthiourea (DMTU) | ACROS Organics | 116891000 | |
NanoTight Sleeve Green 1/16" ID x .0155" ID x 1.6" | IDEX Health & Science | F-242X | |
NanoTight Sleeve Yellow 1/16" OD x 0.027" ID x 1.6" | IDEX Health & Science | F-246 | |
N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN) | ACROS Organics | 177350250 | |
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used |
PE50-C pyroelectric energy meter | Ophir Optronics | 7Z02936 | |
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | 23275 | |
Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | A53225 | |
Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 90058 | |
Pierce Universal Nuclease for Cell Lysis | Fisher Scientific | 88702 | |
Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32" | Molex | 1068680064 | any capillary tubing cutter is sufficient |
Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 150 µm, Outer Diameter 360 µm, TSP150350 | Polymicro Technologies | 1068150024 | |
Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 450 µm, Outer Diameter 670 µm, TSP450670 | Polymicro Technologies | 1068150025 | |
Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 75 µm, Outer Diameter 360 µm, TSP075375 | Polymicro Technologies | 1068150019 | |
Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P382-500 | |
Proteome Discover 2.2 (bottom-up proteomics software) | Thermo Scientific | OPTON-30799 | |
Rotary Magnetic Tumble Stirrer | V&P Scientific, Inc. | VP 710D3 | |
Rotary Magnetic Tumble Stirrer, accessory kit for use with Syringe Pumps | V&P Scientific, Inc. | VP 710D3-4 | |
Super Flangeless Ferrule w/SST Ring, Tefzel™ (ETFE), 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" OD | IDEX Health & Science | P-259X | |
Super Flangeless Nut PEEK 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" & 1/32" OD | IDEX Health & Science | P-255X | |
Super Tumble Stir Discs, 3.35 mm diameter, 0.61 mm thick | V&P Scientific, Inc. | VP 722F | |
Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer | Fisher Scientific | PI89900 | |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
Upchurch Scientific Low-Pressure Crosses: PEEK | Fisher Scientific | 05-700-182 | |
Upchurch Scientific Low-Pressure Tees: PEEK | Fisher Scientific | 05-700-178 | |
UV Fused Silica Plano-Convex Spherical Lenses | THORLABS | LA4052 | |
V&P Scientific IncSupplier Diversity Partner TUMBL STIR DISC PARYLENE 1000 | V&P Scientific, Inc. | VP724F | |
VHP MicroTight Union for 360µm OD | IDEX Health & Science | UH-436 | |
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS118-500 | |
Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 |