Summary
该协议描述了如何在生理条件下切片和培养心脏组织6天。该培养系统可用作测试新型心力衰竭治疗效果的平台，以及3D心脏模型中急性心毒性的可靠检测平台。
Abstract
许多新药在临床研究中失败，由于心毒副作用，因为目前可用的体外测定和体内动物模型对人体心脏负债的预测不佳，给制药业带来了数十亿美元的负担。因此，全世界在进行昂贵且耗时的"人类第一"试验之前，需要更好的方法来识别药物心毒性， 在全球范围内未得到满足。目前，只有未成熟的心脏细胞（人类诱导多能干细胞衍生心肌细胞[hiPSC-CMs]）用于测试治疗效率和药物毒性，因为它们是唯一可以长期培养的人类心脏细胞需要测试药物疗效和毒性。然而，单个细胞类型不能复制由多种细胞类型组成的复杂3D心脏组织表型。重要的是，药物对成人心肌细胞的影响需要测试，与不成熟的hiPSC-CMs相比，其特征和毒性反应不同。 培养人类心脏切片是完整人体心肌的一种有前途的模式。该技术提供一个完整的多细胞系统，模拟人类心脏组织，反映人类心肌的生理或病理状况。最近，通过优化培养介质组件和培养条件，包括1.2 Hz的连续电刺激和培养介质的间歇性氧合，我们开发了一种新的培养系统设置，以保持生存能力和功能的人和猪心脏切片6天的培养。在目前的协议中，我们以研究猪心切片和培养的方法为例。同样的协议用于培养来自人类、狗、绵羊或猫心的切片。该培养系统有可能成为急性心毒性检测的强有力的预测性人类原位模型，从而缩小临床前和临床检测结果之间的差距。
Introduction
药物诱发的心肌毒性是市场退出的主要原因1.在20世纪的最后十年里，有8种非心血管药物因心室心律失常导致突然死亡而退出市场。此外，几种抗癌疗法（在许多情况下有效）可导致多种心毒性作用，包括心肌病和心律失常。例如，传统（如安曲霉素和辐射）和靶向（如曲图祖马布）乳腺癌疗法都可能导致患者的一部分3的心血管并发症。心脏病学家和肿瘤学家之间的密切合作（通过新兴的"心肿瘤"领域）帮助使这些并发症易于管理，确保患者得到有效治疗。较新的药物，包括Her2和PI3K抑制剂的心血管效应不太清楚，尤其是当疗法被结合使用时。因此，在人体临床试验之前，人们越来越需要可靠的心血管毒性临床前筛查策略， 与新兴的抗癌疗法有关。人体心脏组织缺乏在功能上和结构上可存活超过24小时的培养系统，是可靠的心毒性测试的一个限制因素。因此，迫切需要开发一个可靠的系统，在生理条件下培养人类心脏组织，以测试药物毒性。
最近，人类诱导多能干细胞衍生心肌细胞（hiPSC-CMs）在心毒性测试中的使用，为解决这一问题提供了部分解决办法;然而，与心脏组织的多细胞性质相比，hiPSC-CM的不成熟性质和组织完整性的丧失是该技术的主要局限性4。最近的一项研究通过从水凝胶上制造hiPSC-CM的心脏组织，并使它们随着时间的推移逐渐增加电刺激，从而部分克服了这种限制。然而，它们的机电性能并没有达到成人心肌的成熟度。此外，心脏组织在结构上更为复杂，由各种细胞类型组成，包括内皮细胞、神经元和各种类型的基质纤维细胞，与细胞外基质蛋白6的非常特殊的混合物连接在一起。这种非心肌细胞群的异质性在成年哺乳动物,8,心脏中为使用单个细胞类型对心脏组织进行建模的主要障碍。这些主要限制强调开发方法的重要性，使完整的心脏组织培养，以最佳研究涉及心脏的生理和病理条件5。
培养人类心脏切片是一种完整的人类心肌的有前途的模型。该技术提供了获得一个完整的3D多细胞系统，类似于人类心脏组织，可以可靠地反映人类心肌的生理或病理状况。然而，它的使用受到文化生存时间短的严格限制，在2018年10、11、12,11,12之前，使用报告的最可靠的协议不会超过24小时。这一限制是由于多种因素造成的，包括使用空气-液体接口来培养切片，以及使用一种不支持心脏组织高能量需求的简单培养介质。我们最近开发了一个水下培养系统，能够提供连续的电刺激和优化培养培养培养成分，以保持心脏组织切片的活性长达6天13。该培养系统有可能成为急性心毒性检测的强有力的预测性人类原位模型，以缩小临床前和临床检测结果之间的差距。在本文中，我们将详细介绍使用猪心切片来切片和培养的规程。同样的过程也适用于人类、狗、绵羊或猫的心脏。有了这个协议，我们希望将这项技术推广到科学界的其他实验室。
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Protocol
所有动物程序都符合路易斯维尔大学的体制准则，并经机构动物护理和使用委员会批准。
1. 切片准备（切片前一天）
- 振动微托姆的准备
- 按照以下步骤将陶瓷刀片放入其支架中：仔细展开刀片后，先将锋利边缘放入刀片工具的插槽中。然后，松开支架臂上的两个螺钉，将刀片滑到每个套牢器下方，并将其牢固地向后推到后止动器上，将刀片安装到支架中。拧紧螺钉以固定刀片。
注：螺钉不应过度拧紧。 - 根据制造商的协议，使用校准协议和工具校准刀片。
注：简而言之，为了便于刀片与行驶轴对齐并尽量减少 Z 轴偏转，振动微透器使用可拆卸的校准装置。当校准装置插入仪器时，其存在将自动被检测到，振动微向仪将控制将刀片的振幅和频率设置调整到最大程度，从而最好地调整刀片对准误差。- 按下"切片"按钮可启动自动移动刀片的校准过程，以便切削刃相对于校准设备处于最佳位置，从而进行最佳校准评估。按照屏幕上的说明使用提供的螺丝刀对刀片进行调整，以确保 Z 对齐在 1 μm 以内。
- 高压内浴和振动微体的所有金属部件。
- 按照以下步骤将陶瓷刀片放入其支架中：仔细展开刀片后，先将锋利边缘放入刀片工具的插槽中。然后，松开支架臂上的两个螺钉，将刀片滑到每个套牢器下方，并将其牢固地向后推到后止动器上，将刀片安装到支架中。拧紧螺钉以固定刀片。
- 高压灭菌大金属托盘（用于收集切片和浸泡电刺激板盖）、任何玻璃容器、常规矩形刀片、钳子、剪刀、打印机正时皮带（将其切成 6 mm 宽件）、金属垫圈和 5 L 的双蒸馏水（ddH2O）。
- 用心肺溶液对心脏进行原位和体外灌注，对一个 1 L 罐、一个 500 mL 罐和一个塑料托盘进行消毒。
- 在 2 L 杯中准备 2 L 切片 Tyrode 溶液。
- 对于切片 Tyrode 溶液的 1 L，混合 3 g/L 2，3-丁二酮单溪 （BDM），140 mM NaCl （8.18 g），6 mM KCl （0.447 g），10 mM D-葡萄糖（1.86 g）、10 mM HEPES（2.38 g）、1 mM MgCl2（1 mL 1 M 溶液）、1.8 mM CaCl2（1 M 溶液的 1.8 mL）、ddH2O 的 1 L。 使用 NaOH 将 pH 调整为 7.40。然后，使用 1，000 mL、0.22 μm 真空过滤器/存储系统过滤溶液，并在 4°C 过夜处存储。
- 准备4升心电图溶液。
- 对于心电图溶液的 1 L，混合 110 mM NaCl （6.43 g）、1.2 mM CaCl2 （1.2 mL 1 M 溶液）、16 mM KCl （1.19 g）、16 mM MgCl2 （3.25 g）、10 mM NaHCO23 （0.84 g）、1 U/mL 肝素、 使用 NaOH 将 pH 调整到 7.40。然后，使用 1，000 mL、0.22 μm 真空过滤器/存储系统过滤溶液，并在 4°C 过夜处存储。
注：在切片当天在心绞痛溶液中加入 1，000 U/L 肝素（参见步骤 2.1）。
- 对于心电图溶液的 1 L，混合 110 mM NaCl （6.43 g）、1.2 mM CaCl2 （1.2 mL 1 M 溶液）、16 mM KCl （1.19 g）、16 mM MgCl2 （3.25 g）、10 mM NaHCO23 （0.84 g）、1 U/mL 肝素、 使用 NaOH 将 pH 调整到 7.40。然后，使用 1，000 mL、0.22 μm 真空过滤器/存储系统过滤溶液，并在 4°C 过夜处存储。
- 在生物安全柜中原瓶中新鲜制备500 mL培养介质：混合中199，1倍胰岛素转移-硒（ITS）补充剂，10%胎儿牛血清（FBS），5纳克/mL血管内皮生长因子（VEGF），10纳克/mL FGF基本，和2倍抗生素抗真菌。过滤器通过0.22μm真空过滤器/储存系统进行消毒，并在4°C下储存过夜。
注：请勿调整 pH，在使用前新鲜添加 VEGF 和 FGF。 - 准备4%的加胶凝胶板。
- 在 500 mL 消毒烧瓶中加入 200 mL 消毒 ddH2O。重8克的阿根松，轻轻倒入烧瓶中。在微波炉中煮2分钟，然后在室温下冷却5分钟。
- 将每 100 mm 培养皿倒入 25 mL（准备 6 道菜），等待 1 小时固化。然后，用石蜡薄膜密封板，用干净的包装包裹，储存在4°C。
- 通过在自灭 ddH2O 中稀释 200 防护的绝对乙醇，制备 4 L 的 70% 乙醇。
- 在灭菌 ddH2O 中制备 2 倍抗生素抗异化剂：将 980 mL 的灭菌 ddH2O 与生物安全柜下的 20 mL 抗生素抗病菌混合。
2. 猪心灌注
- 将 1 mL 的 1，000 U/mL 肝素添加到每个 1 L 的心电图溶液中。把溶液放在冰上。
注：在转移到组织培养室期间，心脏的灌注和保存至少需要3升。 - 将以下物品带到猪手术室：一个装满冰的大冰桶，一个消毒金属托盘（保存在冰桶上，用于心脏灌注），一个消毒的500 mL罐，一个1 L罐（将心肺功能室的心脏转移到组织培养室，在冰上），和一个消毒塑料托盘充满冰（以保持心脏增生溶液在冰上）。
- 准备一个原位心脏灌注系统，包括3路止流器、60 mL注射器、18 G蝴蝶针导管以及向心肺结水溶液储液库延伸管。
- 首先麻醉约克郡雄狮（2~3个月大，20~25公斤），首先注射氯胺酮（20毫克/千克）/xylazine（2毫克/千克）鸡尾酒。确认适当的麻醉与失去下颌张力。然后，将猪转移到手术室，像先前描述的14样，插管和机械地呼吸肺部。
- 保持麻醉（1.5~2%）异 氟 醚。
- 将动物放在右侧的横向位置，然后从胸部区域将毛皮进行扫描。用酒精磨砂清洁皮肤，然后用10%（w/v）povidone碘溶液对手术部位进行消毒。
- 在第4节间空间使用手术刀切除胸部，用肋骨之间的胸部伸缩器保持胸部打开并暴露心脏。
注：使用所有消毒仪器进行此过程。 - 将蝴蝶针导管插入左侧中庭，用钱包串合起来固定针头。静脉注射一剂肝素（100 U/kg）后，开始通过左心房导管将500 mL的冰冷心性肺结塞溶液（以减缓心率）原地注入心脏。
- 用5%的二恶二苯对猪进行深度麻醉。用手术剪刀迅速将心脏从胸部中切除。用主动脉管对主动脉进行装饰，并在体外注入另外1升冰冷心肺结水溶液（100 mL/min），以排出血管血。
- 心脏灌注后，将心脏放在充满冰冷心胸痛溶液的1升罐子中，并在转移到组织培养室时保持冰。
3. 猪心组织切片
- 在振动器上设置组织浴，将冰添加到组织浴冷却套中，然后将Tyrode的溶液添加到组织浴中。设置 1 L 塑料罐，收集组织浴冷却套中熔化冰的处理情况。
- 在生物安全柜下，将猪的心脏转移到含有1升新鲜冷心肺溶液的托盘上。
- 用可伸缩的无菌手术刀分离心脏以隔离左心室。然后，使用剃须刀矩形刀片将左心室切成 1⁄2 厘米3的块。使用一块切片，并将剩余的部分保存在 50 mL 管中，放在冰冷的 Tyrode 的冰上溶液中，以便以后根据需要进行切割。
注：用双手切片前按摩组织，特别是如果这是第二块。按摩有助于恢复正确的肌肉纤维配置，并防止心脏块内的任何刚度。 - 在金属样品架上加入1⁄2滴组织胶（材料表），并粘上一块4%的agar块，表面积约为1厘米2。
- 在阿加上加入1⁄2滴组织胶。
- 将心脏块粘在阿加上，心脏表片侧朝下放在组织胶水上，并确保其尽可能平。然后，将带心脏块的组织支架转移到其在颤音切片浴中的位置。
- 将氧气管连接到切片浴和金属托盘，里面装满了Tyrode的收集切片的溶液（含氧的Tyrode浴缸）。然后，在金属托盘中加入 40 μm 细胞滤网，在切割后收集切片。
- 调整切片位置
- 使用振动操作软件和仪表板，调整刀片/样品的高度。选择高度按钮，然后按照屏幕说明调整高度。理想情况下，让刀片靠近组织顶部，但低于毛细管肌肉，并确保在切片前有液体覆盖组织和刀片。
- 通过选择前进按钮，调整开始切片组织的位置。按下切片按钮，使用旋钮提高速度，将刀片移向组织边缘。然后，再次按切片停止，然后按前进按钮以停用进程。
- 调整切割参数：前进速度 = 0.03 mm/s，振动频率 = 80 Hz，水平振动振幅 = 2 mm。然后，通过选择切片按钮开始切片。
- 让振动片切片，直到它到达组织末端，但在它击中标本支架的后端之前。此时，再次按切片停止。点击"返回"按钮返回起始位置。
- 选择自动重复（单击两次），使振动微音自动重复切片过程长达 99 次。
- 收集切片
- 等待切片全长，并看起来不错（经过毛细血管肌肉层后），然后开始收集切片。
- 使用装满冷Tyrode溶液的塑料巴斯德移液器收集切片，轻轻从浴缸中抓取纸巾。如有必要，使用钳子和弹簧剪刀将切片与心脏块分离，如果组织仍附着。
- 将切片转移到含氧Tyrode浴缸中的一个细胞滤网（参见步骤3.7），并使用塑料巴斯德移液器中的液体使组织平放在细胞过滤器之一上，然后在顶部加入金属洗浴器以按住组织。
注：在加工前，Tyrode 溶液中需要孵育至少 1 小时（这是 BDM 放松组织）。
4. 培养心片
-
准备区域性切片
- 从边缘修剪切片以避免任何不均匀的边缘。然后，从两端粘附到用纸巾胶水嵌入金属丝的6毫米宽打印机正时带消毒。
- 将支撑的心脏切片转移到每个井中含有6 mL培养介质的6个孔板。
- 将刺激板盖（材料表）放在6个井板的顶部，并将盖连接到细胞培养电刺激器（材料表）。始终调整刺激器以 10 V、1.2 Hz 持续持续地刺激心脏切片。
注：插入刺激后，心脏切片将开始跳动，这种运动在视觉上会很明显。 - 将板转移到培养箱，并保持在37°C与加湿空气和5%CO2。
- 在每次介质更换期间，每天更改培养介质 3x，每口井添加 6 mL 的文化介质。
注：培养介质每次更换前用氧5分钟。介质必须每天至少更换 1x;如有必要，周末可以这样做。每天仅更改 1 个介质的两天是测试的最大值。 -
每天更换刺激板盖，以防止培养介质中有毒石墨颗粒释放（通常在中间介质变化期间）。
- 从培养皿中取出刺激板盖，插入白色泡沫塞，盖连接到电池培养电刺激器的电缆，以防止电路水损坏。
- 将板盖放入 2 倍抗生素抗霉素的自杀水浴中。放在这个浴缸里（即洗浴）过夜。
- 第二天，将板盖移到70%乙醇浴中5~15分钟进行脱污。在切换浴池之前，从设备中甩掉尽可能多的液体。
- 然后，将板盖转移到第三个也是最后一个浴池（即干净的浴），包括自封水和2x抗菌-抗霉菌，以冲洗任何剩余的乙醇痕迹。
- 在干净的浴缸中磨碎板盖后，使用干净的无绒抹布（用乙醇喷洒下来）擦干塑料部件上的任何残留水，然后取出白色泡沫片，并小心地将板盖放回培养板上。
注：请勿触摸进入井内的黑色石墨电极，因为设备将不再无菌。 - 使用无菌钳子，确保组织位于井的中心，以便板盖不会接触组织。确保板盖的弯曲侧与板的倾斜侧相匹配，并确保方形角排列。
注：为了尽量减少刺激板盖的污染，在完成实验后，将它们保持清洁和空 6 孔板。
- 根据Ou等人13日介绍，对新鲜猪心片（第0天）进行MTT测定、钙测量和收缩功能评估，并在培养6天后进行。
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Representative Results
我们使用一种商用细胞培养电刺激器，可以同时容纳8个6个井板，通过诱导生理频率（1.2 Hz）的电刺激来模拟成人心脏环境，并筛选基本介质成分，以延长培养13中功能性猪心片的持续时间。由于猪和人类心脏的大小和解剖量相似，我们利用猪心开发了一种生物化心脏切片培养系统，随后在人类心脏切片中验证了它。在这里，我们详细介绍了猪心切片的规程，这是人类心脏切片和培养的相同程序。这里描述的新的生物仿生培养装置，根据MTT测定评估，将猪心切片的生存能力维持了6天（图1A）。通过评估这些切片的钙平衡和收缩力，我们确认了这些切片在6天内的功能可行性。在前6天，心肌细胞中没有自发性钙瞬变，心肌细胞对外部电刺激的反应，以及类似于新鲜心脏切片的β-肾上腺素刺激（图1B）。此外，对异丙烯醇的收缩力和反应在培养的心脏切片中保持长达6天，类似于新鲜心脏切片（图1C，D）。
图1：猪心片培养的可行性和功能验证。（A） 在优化介质中使用 MTT 测定法对心脏切片的可行性进行量化（n = 三联中每只猪心 5 个，SEM 表示为误差条;进行双向 ANOVA 测试以比较各组之间，\p < 0.05）。（B） 代表钙信号从新鲜的心脏切片（第0天）和6天后培养（第6天）与和没有1μM异丙烯醇（iso）刺激。在使用Fluo-4钙染料加载心脏切片并使用 1 Hz/20 V 电刺激进行记录后，将记录瞬变。用异丙烯醇进行和无刺激的钙信号振幅的定量在培养中表现出第0天和第6天钙瞬变的类似模式（n = 4 猪心， 每个分析的10×15个细胞，SEM表示为误差条;进行双向ANOVA测试以比较各组，\p < 0.05 比较基线与同一时间点的 Iso 刺激，p 值D0 vs D6 = 0.95，p 值D0 Iso vs D6 Iso = 0.93）。（C） 收缩力评估设置（左面板）;心脏片 （HS） 挂在力传感器 （FT） 和两个电电极 （EE） 之间的稳定柱 （P） 之间，用于电刺激。刺激后，使用指定的软件（右面板）记录切片收缩和收缩。（D） 条形图显示了新鲜猪心切片（第 0 天）和 6 天后生物仿生培养（n = 4 个猪心在三联中）产生的异丙烯醇 （Iso） 的存在或不存在的收缩力的定量， SEM表示为误差条;进行双向ANOVA测试以比较各组之间，\p < 0.05 比较基线与同一时间点的 Iso 刺激，抽搐力：p 值D0 vs D6 = 0.96，p 值D0 Iso vs D6 Iso = 0.81;时间到 50% 放松：p 值D0 vs D6 = 0.47，p 值D0 Iso vs D6 Iso = 0.43。这个数字是从Ou等人13中修改的。请点击此处查看此图形的较大版本。
| 条件 | 菲舍尔等人16 | 欧等人13 |
| 物种 | 人类 | 猪和人类 |
| 疾病 | 失败的心 | 正常健康心脏 |
| 保存 | 保存组织 | 新鲜组织 |
| 切片厚度 | 300 μm | 300 μm |
| 中氧 | 不 | 内颤氧 |
| 文化媒介 | M199/ITS | M199/ITS/FBS/VEGF/FGF |
| 搅拌 | 是的 | 不 |
| 起搏率 | 0.2 Hz | 1.2 Hz |
| 文化持续时间 | 4个月妥协 | 6天，无妥协 |
| 切口温度 | 37 | 37 |
| 机械装载 | 辅助加载 | 无加载 |
| 与新鲜心脏切片相比，基因表达没有变化的测试时间点 | 不适用 | 2 天和 6 天 |
| 首次测试时间点显示基因表达的变化 | 第8天 | 第10天 |
表1：费舍尔等人16和欧等人13中使用的切片和培养条件的比较。
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Discussion
在这里，我们描述了我们最近发布的简化中等通量方法的详细视频协议（过程多达48片/设备），使猪心切片的培养时间足够长，以测试急性心毒性13。建议的条件模仿心脏的环境，包括电刺激的频率、营养供应和间歇性氧合。我们将生物仿生刺激培养中心片的长期生存能力归因于我们专注于重建完整心脏所经历的生理状况。这一概念得到我们的数据的支持，表明仅靠电刺激而不提供必需的营养，不足以维持心脏切片的可行性。因此，培养介质的新组成部分是延长文化中心片生存能力和功能的主要驱动力。我们发现，有必要将FBS纳入介质以保持生存能力，这可能是由于对各种脂肪酸、微量元素、酶、蛋白质、大分子、化学成分和激素的需求，这些脂肪酸通常存在于血清中，并在体内传递到心脏组织。此外，我们发现，需要向培养介质中添加FGF和VEGF，以提高组织生存能力。FGF和VEGF是已知的血管生成因子，对维持培养的内皮细胞18至关重要。因此，可能需要FGF和VEGF来维持培养中的内皮细胞和结缔组织，以支持组织生存能力。我们的工作是首次修改先前报道的用于培养心片的简化培养介质，为在随后的研究中进一步优化媒体成分提供了可能性。
以我们的新方法，有另外三项研究，证明连续机电刺激在维持生物工程系统16、19、2019,20中培养切片的重要性。16然而，这些研究使用基础M199/ITS介质，这不足以维持心脏切片的代谢需求。这导致在16、19、20,19,20年早期在切片收缩和钙平衡方面达成若干妥协。乔等人19日研制出一种高度精密的生物工程芯片，能维持心脏切片4天的电生理特性，但没有对收缩功能进行评估。Watson 等人20人生物工程了一个低通量培养系统（处理多达 4 切片/设备），以证明舒张沙康长度对于维持 24 小时心肌性能的重要性。最后，Fischer等人16日已经表明，在生物工程装置中，在0.2 Hz刺激、辅助载荷和介质搅拌下培养时，在体外可以维持衰竭的人类心脏切片长达4个月。然而，这些条件诱发了心脏切片的各种变化，这反映在他们的RNAseq数据，这表明心脏基因表达早在第一次评估点（第8天）16。然而，在我们优化的培养系统中，与新鲜心脏组织相比，在培养2天和6天后，只有2个和5个笔录的表达差异显著。然而，经过10天的文化，500多份成绩单的表达发生了重大变化。培养10天后的放松基因大多与心肌有关，而高调控基因则与成纤维细胞、细胞外基质和炎症13有关。表1包括费舍尔等人16和Ou等人13对切片和文化协议的完整比较。因此，我们的生物仿效刺激培养系统模拟心脏就地经历的可控条件，因此，与受损的培养系统相比，应可靠地读取药物治疗的功能和结构结果，从而与受损的培养系统相比。
这种培养系统的主要局限性之一是，虽然我们的培养系统可以模拟多种生理条件，但它不能模仿心脏收缩周期中机械负荷和剪切应力的变化。生理和代谢因子的进一步优化有助于延长心脏切片的生存能力和功能。此外，我们注意到早期适应，导致氧化磷酸化的减少，这可能导致心脏切片生存能力的恶化13。不幸的是，到目前为止，我们未能找到维持氧化磷酸化的最佳方法。可能增强心脏切片中的脂肪酸代谢不如在生长介质中加入脂肪酸那么简单，需要进一步优化，这一点可以在未来的研究中得到解决。此外，这种方法的一个普遍弱点是缺少心脏片内单心肌细胞作用潜能值的测量，这对于证明心电图和心室心律失常的中断至关重要。因此，需要优化治疗方案，在使用心毒素治疗后，将单心肌细胞与心脏切片分离，从而引起心电图紊乱，并评估它们对分离性心肌细胞的作用潜力。
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Disclosures
TMAM持有泰纳亚治疗公司的股权。其他作者报告没有冲突。
Acknowledgments
TMAM 得到 NIH 授予 P30GM127607 和美国心脏协会授予 16SDG29950012 的支持。RB 支持 P01HL78825 和 UM1HL113530。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,000 mL, 0.22 µm, Vacuum Filter/Storage Systems | VWR | 28199-812 | |
| 2,3-Butanedione monoxime (BDM) | Fisher | AC150375000 | |
| 500 mL, 0.22 µm, Vacuum Filter/Storage Systems | VWR | 28199-788 | |
| 6-well C-Dish Cover (electrical-stimulation-plate-cover) | Ion Optix | CLD6WFC | |
| 6-well plates | Fisher | 08-772-1B | |
| Agarose | Bioline USA | BIO-41025 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo | 15-240-062 | |
| C-Pace EM (cell-culture-electrical-stimulator) | Ion Optix | CEP100 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Fisher | C79-500 | |
| Ceramic Blades for Vibrating Microtome | Campden Instruments | 7550-1-C | |
| Cooley Chest Retractor | Millennium Surgical | 63-G5623 | |
| D-Glucose | Fisher | D16-1 | |
| Disposable Scalpel #20 | Biologyproducts.com | DS20X | |
| Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning | VWR | 21008-952 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo | A3160502 | |
| Graefe Forceps | Fisher | NC9475675 | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Histoacryl BLUE Tissue glue | Amazon | https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/ | |
| Iris Spring scissors | Fisher | NC9019530 | |
| Iris Straight Scissors | Fisher | 731210 | |
| Isoflurane, USP | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma-Aldrich | I3146-5ML | |
| Ketamine HCl (500 mg/10 mL) | West-Ward | NDC 0143-9508 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher | M33-500 | |
| Mayo SuperCut Surgical Scissors | AROSurgical Instruments Corporation | AROSuperCut™ 07.164.17 | |
| Medium 199, Earle's Salts | Thermo | 11-150-059 | |
| Oxygen regulator | Praxair | ||
| Oxygen tanks - | Praxair | ||
| Plastic Pasteur pipettes | Fisher | 13-711-48 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher | AC193780010 | |
| Printer Timing Belt | Amazon | https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/ | |
| Razor rectangle blades | Fisher | 12-640 | |
| Recombinant Human FGF basic | R&D Systems | 233-FB-025/CF | |
| Recombinant Human VEGF | R&D Systems | 293-VE-010/CF | |
| Retractable scalpels | Fisher | 22-079-716 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher | AC217125000 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | AC327300010 | |
| Vibrating Microtome | Campden Instruments | 7000 SMZ-2 | |
| Xylazine HCl (100 mg/mL) | Heartland Veterinary Supply | NADA 139-236 |
References
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