Summary
Denne protokol beskriver, hvordan man skive og kultur hjertevæv under fysiologiske forhold i 6 dage. Dette kultursystem kan bruges som en platform til at teste effekten af nye hjertesvigt terapeutiske samt pålidelig test af akut kardiotoksicitet i en 3D hjertemodel.
Abstract
Mange nye lægemidler mislykkes i kliniske undersøgelser på grund af kardiotoksiske bivirkninger som den aktuelt tilgængelige in vitro assays og in vivo dyremodeller dårligt forudsige menneskelige hjerteforpligtelser, udgør en multi-milliard-dollar byrde på den farmaceutiske industri. Derfor er der en verdensomspændende uopfyldte medicinske behov for bedre tilgange til at identificere narkotika kardiotoksicitet før virksomheden dyre og tidskrævende 'første i mennesket' forsøg. I øjeblikket er det kun umodne hjerteceller (humane inducerede pluripotente stamceller-afledte kardiomyocytter [hiPSC-CMs]) bruges til at teste terapeutisk effektivitet og lægemiddeltoksicitet, da de er de eneste menneskelige hjerteceller, der kan dyrkes i længere perioder for at teste lægemidlets effektivitet og toksicitet. En enkelt celletype kan dog ikke replikere fænotypen af det komplekse 3D-hjertevæv, som dannes af flere celletyper. Vigtigere er det, effekten af narkotika skal testes på voksne kardiomyocytter, som har forskellige egenskaber og toksicitet svar i forhold til umodne hiPSC-CMs. Dyrkning menneskelige hjerte skiver er en lovende model af intakt humanmyocardium. Denne teknologi giver adgang til et komplet flercellet system, der efterligner det menneskelige hjertevæv og afspejler de fysiologiske eller patologiske forhold i det menneskelige myokardi. For nylig, gennem optimering af kultur mediekomponenter og kultur betingelser til at omfatte kontinuerlig elektrisk stimulation på 1,2 Hz og intermitterende iltning af kulturmediet, udviklede vi en ny kultur system setup, der bevarer levedygtigheden og funktionalitet af menneskelige og svin hjerte skiver i 6 dage i kultur. I den nuværende protokol beskriver vi metoden til udskæring og dyrkning af grisehjerte som eksempel. Den samme protokol bruges til kultur skiver fra menneske, hund, får, eller kat hjerter. Dette kultursystem har potentiale til at blive en kraftfuld prædiktiv human in situ model for akut kardiotoksicitet test, der lukker kløften mellem prækliniske og kliniske testresultater.
Introduction
Lægemiddelinduceret kardiotoksicitet er en væsentlig årsag til tilbagetrækning på markedet1. I det sidste årti af det220.th Desuden kan flere anti-cancer behandlinger (mens i mange tilfælde effektiv) føre til flere kardiotoksiske virkninger, herunder kardiomyopati og arytmier. For eksempel kan både traditionelle (f.eks. antracykliner og stråling) og målrettede (f.eks. trastuzumab) brystkræftbehandlinger resultere i kardiovaskulære komplikationer hos en delmængde af patienter3. Et tæt samarbejde mellem kardiologer og onkologer (via det nye område "cardio-onkologi") har bidraget til at gøre disse komplikationer håndterbare sikre, at patienterne kan behandles effektivt2. Mindre klare er de kardiovaskulære virkninger af nyere midler, herunder Her2 og PI3K hæmmere, især når behandlinger anvendes i kombination. Derfor er der et stigende behov for pålidelige prækliniske screeningsstrategier for hjerte-kar-toksicitet i forbindelse med nye anticancerbehandlinger forud for kliniske forsøg hos mennesker. Den manglende tilgængelighed af kultursystemer til humant hjertevæv, der er funktionelt og strukturelt levedygtigt i mere end 24 timer, er en begrænsende faktor for pålidelig kardiotoksicitetstest. Derfor er der et presserende behov for at udvikle et pålideligt system til dyrkning af humant hjertevæv under fysiologiske betingelser for test ning af lægemiddeltoksicitet.
Den seneste skridt i retning af brugen af humane inducerede pluripotente stamceller-afledte kardiomyocytter (hiPSC-CMs) i kardiotoksicitet test har givet en delvis løsning til at løse dette problem; men hiPSC-CMs' umodne karakter og tabet af vævsintegritet sammenlignet med hjertevævets flercellede natur er væsentlige begrænsninger i denne teknologi4. En nylig undersøgelse har delvis overvundet denne begrænsning gennem fremstilling af hjertevæv fra hiPSC-CMs på hydrogels og udsætte dem for gradvis stigning i elektrisk stimulation over tid5. Men deres elektromekaniske egenskaber ikke nå modenhed ses i den voksne menneskelige myocardium. Desuden er hjertevævet strukturelt mere kompliceret, idet det består af forskellige celletyper, herunder endotelceller, neuroner og forskellige typer af stromale fibroblaster forbundet med en meget specifik blanding af ekstracellulære matrixproteiner6. Denne heterogenitet af ikke-kardiomyocyt cellepopulation7,8,,9 i det voksne pattedyr hjerte er en stor hindring i modellering hjertevæv ved hjælp af individuelle celletyper. Disse store begrænsninger understreger vigtigheden af at udvikle metoder til at muliggøre dyrkning af intakt hjertevæv til optimale undersøgelser, der involverer fysiologiske og patologiske tilstande i hjertet5.
Dyrkning menneskelige hjerte skiver er en lovende model af intakt humanmyocardium. Denne teknologi giver adgang til et komplet 3D multicellulært system, der svarer til det menneskelige hjertevæv, som pålideligt kunne afspejle de fysiologiske eller patologiske forhold i det menneskelige myokardi. Anvendelsen af den har imidlertid været stærkt begrænset af den korte periode med levedygtighed i kulturen, som ikke strækker sig ud over 24 timer ved hjælp af de mest robuste protokoller , der blev indberettet indtil 201810,11,12. Denne begrænsning skyldtes flere faktorer, herunder brugen af luft-væske interface til kultur skiverne, og brugen af en simpel kultur medium, der ikke understøtter de høje energiske krav i hjertevæv. Vi har for nylig udviklet et nedsænket kultursystem, som er i stand til at levere kontinuerlig elektrisk stimulation og optimeret kulturmediekomponenterne for at holde hjertevævsskiver levedygtige i op til 6 dage13. Dette kultursystem har potentiale til at blive en kraftfuld prædiktiv human in situ model for akut kardiotoksicitet test for at lukke kløften mellem prækliniske og kliniske testresultater. I den aktuelle artikel beskriver vi protokollen for udskæring og dyrkning af hjerteskiverne ved hjælp af et grisehjerte som eksempel. Den samme proces anvendes på mennesker, hund, får, eller kat hjerter. Med denne protokol håber vi at sprede teknologien til andre laboratorier i det videnskabelige samfund.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg var i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer fra University of Louisville og godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Forberedelse til udskæring (en dag før udskæring)
- Forberedelse af det vibrerende mikrotom
- Anbring den keramiske klinge i holderen ved at følge disse trin: Når klingen forsigtigt er udklaett, skal du først placere den skarpe kant i klingeværktøjets stikplads. Sæt derefter klingen ind i holderen ved at løsne de to skruer på holderens arme og skubbe klingen under hver skive og skubbe den fast tilbage mod bagstopperen. Stram skruerne for at fastgøre klingen.
BEMÆRK: Skruerne må ikke overspændes. - Kalibrer klingen ved hjælp af kalibreringsprotokollen og værktøjerne i henhold til producentens protokol.
BEMÆRK: For kort at lette føringens tilpasning til rejseaksen og for at minimere Z-aksens afbøjninger bruger det vibrerende mikrotom en demonterbar kalibreringsanordning. Når kalibreringsanordningen er tilsluttet instrumentet, registreres dets tilstedeværelse automatisk, og det vibrerende mikrotom vil tage kontrol over justeringen af bladets amplitude- og frekvensindstillinger til en størrelsesorden, der bedst gør det muligt at justere klingejusteringsfejlen.- Tryk på skiveknappen for at starte justeringsprocessen, som automatisk flytter klingen, så skærkanten er i optimal position i forhold til kalibreringsanordningen for at opnå den bedste justeringsevaluering. Følg vejledningen på skærmen for at foretage justeringer af klingen ved hjælp af den medfølgende skruetrækker for at sikre, at Z-justeringen er inden for 1 μm.
- Autoklave det indre bad og alle metaldele af den vibrerende mikrotom.
- Anbring den keramiske klinge i holderen ved at følge disse trin: Når klingen forsigtigt er udklaett, skal du først placere den skarpe kant i klingeværktøjets stikplads. Sæt derefter klingen ind i holderen ved at løsne de to skruer på holderens arme og skubbe klingen under hver skive og skubbe den fast tilbage mod bagstopperen. Stram skruerne for at fastgøre klingen.
- Autoklave de store metalbakker (til opsamling af skiverne og iblødsætning af de elektriske stimuleringspladedæksler), eventuelle glasbeholdere, almindelige rektangelblade, pincet, saks, printertandteringsbælte (skær dem i 6 mm brede stykker), metalskiver og 5 L dobbelt destilleret vand (ddH2O).
- Steriliser en 1 L krukke, en 500 ml krukke og en plastikbakke til hjertet in situ og in vitro perfusion med kardioplegiksopløsningen.
- 2 L af udskæringen af Tyrodes opløsning fremstilles i et 2 L bægerglas.
- For 1 L af udskæringen Af Tyrodeopløsning blandes 3 g/L 2,3-butanedionmonoxime (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D -glucose (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 ML 1 Mopløsning), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml 1 M opløsning), op til 1 L ddH2O. PH justeres til 7,40 ved hjælp af NaOH. Derefter filtreres opløsningen ved hjælp af et 1.000 ml, 0,22 μm, vakuumfilter/opbevaringssystem og opbevares ved 4 °C natten over.
- Forbered 4 L af kardioplegiksopløsningen.
- For 1 L af kardioplegikisk opløsning blandes 110 mM NaCl (6,43 g), 1,2 mM CaCl2 (1,2 ml 1 ML 1 M opløsning), 16 mM KCl (1,19 g), 16 mM MgCl2 (3,25 g), 10 mM NaHCO3 (0,84 g), 1 U/ml heparin, op til 1 L ddH2O. Juster pH'en til 7,40 ved hjælp af NaOH. Derefter filtreres opløsningen ved hjælp af et 1.000 ml, 0,22 μm, vakuumfilter/opbevaringssystem og opbevares ved 4 °C natten over.
BEMÆRK: Der tilsættes 1.000 U/L heparin i kardioplegiaopløsning på skæringsdagen (se trin 2.1).
- For 1 L af kardioplegikisk opløsning blandes 110 mM NaCl (6,43 g), 1,2 mM CaCl2 (1,2 ml 1 ML 1 M opløsning), 16 mM KCl (1,19 g), 16 mM MgCl2 (3,25 g), 10 mM NaHCO3 (0,84 g), 1 U/ml heparin, op til 1 L ddH2O. Juster pH'en til 7,40 ved hjælp af NaOH. Derefter filtreres opløsningen ved hjælp af et 1.000 ml, 0,22 μm, vakuumfilter/opbevaringssystem og opbevares ved 4 °C natten over.
- Friskfremstille 500 ml kultur medium i den oprindelige flaske i en biosikkerhed kabinet: mix medium 199, 1x insulin-transferrin-selen (ITS) supplement, 10% føtal kvæg serum (FBS), 5 NG/ml vaskulære endotel vækstfaktor (VEGF), 10 NG/mL FGF-basic, og 2x antibiotika-antimycotic. Steriliser gennem 0,22 μm, vakuumfilter/opbevaringssystem og opbevares ved 4 °C natten over.
BEMÆRK: Du må ikke justere pH, tilsæt VEGF og FGF frisk før brug. - Forbered 4% agar gel plader.
- Der tilsættes 200 ml steriliseret ddH2O i en 500 ml steriliseret kolbe. Der vejes 8 g agarose, og hældes forsigtigt i kolben. Kog i 2 minutter i en mikrobølgeovn, derefter afkøles i 5 min ved stuetemperatur.
- Hæld 25 ml i hver 100 mm petriskål i et biosikkerhedsskab (forbered 6 retter) og vent i 1 time for at størkne. Derefter forsegles pladerne med paraffinfilm, wrap med ren wrap, og opbevares ved 4 °C.
- Der fremstilles 4 L 70% ethanol ved at fortynde den 200-sikre absolutte ethanol i autoclaved ddH2O.
- Forbered 2x antimykotisk antimykotisk i steriliseret ddH2O: bland 980 ml steriliseret ddH2O med 20 ml antimyskotisk under biosikkerhedskabinettet.
2. Gris Heart Perfusion
- Der tilsættes 1 ml 1.000 U/ml heparin til hver 1 L kardioplegikisk opløsning. Hold opløsningen på is.
BEMÆRK: Mindst 3 L er nødvendige for perfusion og bevarelse af hjertet under overførslen til vævkulturrummet. - Tag følgende elementer til grisen kirurgi værelse: en stor isspand fuld af is, en steriliseret metal bakke (holde på isspand for hjerte perfusion), en steriliseret 500 ml krukke, en 1 L krukke (for at overføre hjertet i kardioplegia løsning tilbage til vævkultur værelse på is) og en steriliseret plastikbakke fuld af is (for at holde kardioplegikopløsning på is).
- Forbered en in-situ hjerte perfusion system, der indeholder en 3-vejs stophane, en 60 ml sprøjte, en 18 G sommerfugl nål kateter, og forlængerrør til kardioplegikiske opløsning reservoir.
- Bedøve Yorkshire hangris (2−3 måneder gammel, 20−25 kg) først med en intramuskulær injektion af et ketamin (20 mg/kg)/xylazine (2 mg/kg) cocktail. Bekræft korrekt anæstesi ved tab af kæbespændinger. Derefter overføre grisen til kirurgi værelse, intubate og mekanisk ventilere lungerne som tidligere beskrevet14.
- Bevar anæstesi med (1,5-2%) isofluran.
- Placer dyret på højre sidestilling og barber pelsen fra brystområdet. Rengør huden med sprit, derefter sterilisere det kirurgiske sted med 10% (w / v) povidon-jod opløsning.
- Åbn brystet ved venstre thoracotomy snit ved hjælp af en skalpel på 4th interkostale rum, og bruge en bryst retractor mellem ribbenene til at holde brystet åbent og udsætte hjertet.
BEMÆRK: Brug alle steriliserede instrumenter til denne procedure. - Sæt sommerfuglenålkateteret ind i venstre atrium, og fastgør nålen med en lukning af en snurpesnor. Efter intravenøs injektion af en bolusdosis heparin (100 U/kg) begynder du at gennemtrænge hjertet in situ med 500 ml iskold kardioplegikopløsning (for at bremse pulsen) via venstre atriekateter.
- Dybt bedøve grisen med 5% isofluran. Hurtigt punktafgifter hjertet ud af brystet med kirurgisk saks. Kannure aorta med en aorta kanyle og gennemsyre hjertet in vitro med en anden 1 L af iskold kardioplegikiske opløsning (100 ml / min) at skylle ud vaskulatur blod.
- Efter hjerteperfusion, holde hjertet i en 1 L krukke fyldt med iskold kardioplegia løsning og holde på is under overførslen til vævkultur værelse.
3. Svinehjertevæv Udskæring
- Opsæt vævsbadet på vibratome, tilsæt is til vævsbadet kølejakke, tilsæt derefter Tyrodes opløsning i vævsbadet. Opsæt 1 L plast krukke til at indsamle bortskaffelse af smeltet is fra vævbadet kølejakke.
- Under biosikkerhedsskabet overføres svinehjertet til en bakke med 1 L frisk kold kardioplegikopløsning.
- Dissekere hjertet for at isolere venstre hjertekammer ved hjælp af optrækkelige sterile skalpeller. Skær derefter venstre hjertekammer i blokke på 1−2 cm3 hver ved hjælp af barbermaskinerektangelblade. Brug et stykke til udskæring og opbevar de resterende stykker i et 50 ml rør i kold Tyrodes opløsning på is til skæring senere, hvis det er nødvendigt.
BEMÆRK: Massér vævet før udskæring med hænder, især hvis dette er den anden blok. Masserer hjælper med at genoprette den korrekte muskel fiber konfiguration og forhindrer enhver stivhed i hjerteblokken. - Der tilsættes 1−2 dråbervævslim( Materialebord ) til metalprøveholderen, og der sættes et stykke af den 4% agarblok med et overfladeareal på ca. 1 cm2.
- Tilsæt 1−2 dråber vævslim på agaren.
- Stick hjerteblokken til agar med hjerte epicardium side vender ned på væv lim og sørg for at det er så fladt som muligt. Derefter overføres vævsholderen med hjerteblokken til sin position i vibratomens udskæringsbad.
- Fastgør iltrøret til skærebadet og metalbakken fyldt med Tyrodes opløsning til opsamling af skiverne (iltet Tyrodes bad). Derefter tilsættes 40 μm celle sier i metalbakken for at samle skiverne efter skæring.
- Justering af udskæringspositionen
- Brug vibratome-driftssoftwaren og instrumentbrættet til at justere klingens/prøvens højde. Vælg højdeknappen, og følg vejledningen på skærmen for at justere højden. Ideelt set har bladet tæt på toppen af vævet, men under papillære muskler og sørg for der er væske, der dækker væv og bladet før udskæring.
- Juster, hvor vævet skal begynde, ved at vælge forskudsknappen. Tryk på skiveknappen, og øg hastigheden ved hjælp af knappen for at flytte klingen mod kanten af vævet. Tryk derefter på udsnit igen for at stoppe, og tryk på knappen Forskud for at deaktivere processen.
- Opjuster skæreparametrene: fordrejningshastighed = 0,03 mm/s, vibrationsfrekvens = 80 Hz og vandret vibrationsamplitude = 2 mm. Start derefter udskæringen ved at vælge udsnitsknappen.
- Lad vibratome skiven, indtil den når enden af vævet, men før den rammer bagsiden ende af prøveholderen. Tryk på udsnitigen på dette tidspunkt for at stoppe. Tryk på knappen Retur for at gå tilbage til startpositionen.
- Vælg automatisk gentagelse (klik på den to gange), hvilket vil gøre det muligt for det vibrerende mikrotomat automatisk at gentage udskæringsprocessen i op til 99 gange.
- Indsamling af udsnit
- Vent, indtil skiverne er fulde længde og synes godt (efter at komme forbi papillær muskel lag), derefter begynde at indsamle skiver.
- Saml skiverne ved hjælp af en plastik Pasteur pipette fyldt med kolde Tyrode opløsning til forsigtigt at få fat i vævet fra badet. Hvis det er nødvendigt, bruge pincet og foråret saks til at adskille skiven fra hjerteblokken, hvis vævet stadig er fastgjort.
- Overfør skiven til en cellesi i det iltede Tyrodes bad (se trin 3.7), og brug væsken i plastpasteurpipetter til at få vævet til at ligge fladt på en af cellesierne, og tilsæt derefter en metalskive på toppen for at holde vævet nede.
BEMÆRK: Skiverne skal inkuberes mindst 1 time i Tyrodeopløsningen før behandlingen (dette er op til BDM at slappe af i vævet).
4. Culturing Heart Skiver
-
Forberedelse af skiver til kultur
- Trim udsnittet fra kanterne for at undgå ujævne kanter. Derefter lim det fra begge ender til steriliseret polyurethan 6 mm bred printer timing bælte med metaltråde indlejret ved hjælp af væv lim.
- Overfør de understøttede hjerteskiver til 6 brøndplader, der indeholder 6 ml kulturmedium i hver brønd.
- Placer stimuleringpladedækslet (Materialebord) oven på 6 brøndpladen og tilslut dækslet til cellekulturens elektriske stimulator (Materialetabel). Juster stimulatoren til elektrisk stimulere hjertet skiver ved 10 V, 1,2 Hz kontinuerligt hele tiden.
BEMÆRK: Når stimuleringen er tilsluttet, begynder hjerteskiverne at slå, og denne bevægelse vil være visuelt tydelig. - Pladerne overføres til en rugemaskine, og der holdes ved 37 °C med befugtet luft og 5 % CO2.
- Skift kultur medium 3x per dag og tilføje 6 ml kultur medium per godt under hver medieændring.
BEMÆRK: Kulturmediet iltes i 5 minutter før hver medieændring. Mediet skal ændres mindst 1 x pr. dag. dette er okay i weekenden, hvis det er nødvendigt. To dage med kun 1 medieændring om dagen er det maksimale, der testes. -
Skift stimuleringspladedækslet hver dag for at forhindre frigivelse af giftige grafitpartikler i kulturmediet (normalt i medieskiftet midt på dagen).
- Fjern stimuleringspladedækslet fra dyrkningsskålen, og sæt det hvide skumstik i, hvor dækslet sluttes til kablet til cellekulturens elektriske stimulator for at forhindre vandskader på det elektriske kredsløb.
- Placer pladen dække i et bad af autoclaved vand med 2x antibiotika-antimykotiske. Opbevar det i dette bad (dvs. skylning bad) natten over.
- Den næste dag, flytte pladedækslet i en 70% ethanol bad i 5−15 min at dekontaminere. Ryst så meget væske af enheden, før badene skiftes.
- Derefter overføres pladedækslet til det tredje og sidste bad (dvs. rent bad), som består af autoclaved vand og 2x antibakteriel-antimykotisk, for at skylle eventuelle resterende ethanolspor.
- Efter skylning af pladedækslet i det rene bad skal du bruge en ren fnugfri aftørring (sprøjtet ned med ethanol) til at tørre eventuelt resterende vand af på plastdelene, fjern derefter det hvide skumstykke og placer forsigtigt pladedækslet tilbage på kulturpladen.
BEMÆRK: Rør ikke ved de sorte grafitelektroder, der går ind i brønden, da enheden ikke længere vil være steril. - Brug sterile pincet, sørg for vævet er i midten af brønden, så pladen dækslet ikke rører vævet. Sørg for, at den buede side af pladedækslet stemmer overens med den vinklede side af pladen, og at de firkantede hjørner er på linje.
BEMÆRK: For at minimere kontaminering af stimuleringspladedækslerne skal de opbevares i rene og tomme 6 brøndplader efter forsøgets afslutning.
- Udfør en MTT-analyse, calciummålinger og kontraktile funktionsvurderinger på friske svinehjerteskiver (dag 0) og efter 6 dage i kultur ifølge Ou et al.13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af en kommercielt tilgængelig cellekultur elektrisk stimulator, der kan rumme otte 6 godt plader på én gang, vi efterlignede den voksne hjertemiljø ved at inducere elektrisk stimulation på den fysiologiske frekvens (1,2 Hz), og screenet for de grundlæggende medium komponenter til at forlænge varigheden af funktionelle svin hjerte skiver i kultur13. Da svin og menneskelige hjerter er ens i størrelse og anatomi15,vi udviklet en biomimetisk hjerte skive kultur system ved hjælp af svin hjerter og efterfølgende valideret det i menneskelige hjerte skiver. Her har vi detaljeret protokollen for svin hjerte skiver, som er den samme procedure for menneskelige hjerte udskæring og dyrkning. Den nye biomimetiske kultur setup beskrevet her, fastholdt levedygtigheden af svin hjerte skiver i 6 dage som vurderet af MTT assay (Figur 1A). Vi bekræftede den funktionelle levedygtighed af disse skiver over 6 dage ved at vurdere deres calcium homøostase og kontraktile kraft. I de første 6 dage er der ingen spontane calciumtransienter i kardiomyocytter, og kardiomyocytterne reagerede på ekstern elektrisk stimulation samt β-adrenerge stimulation svarende til friske hjerteskiver (Figur 1B). Desuden opretholdes kontraktilekraften og reaktionerne på isoproterenol i kultiverede hjerteskiver i op til 6 dage svarende til friske hjerteskiver (Figur 1C,D).
Figur 1: Validering af levedygtigheden og funktionaliteten af svinehjerteskivekultur. (A)Kvantificering af hjerteskivernes levedygtighed over tid ved hjælp af MTT-analysen i enten stimuleret eller ustimuleret dyrkningssystem i optimeret medium (n = 5 svinehjerter hver i tre eksemplarer, SEM er repræsenteret som fejlstænger; tovejs ANOVA-test blev udført for at sammenligne mellem grupper, *p < 0,05). (B) Repræsentativt calciumsignalspor fra en frisk hjerteskive (dag 0) og efter 6 dage i kultur (dag 6) med og uden 1 μM isoproterenol (Iso) stimulation. Transienter blev registreret efter lastning hjertet skiver med Fluo-4 calcium farvestof og ved hjælp af 1 Hz/20 V elektrisk stimulation på tidspunktet for optagelsen. Kvantificering af calciumsignalamplitude med og uden stimulering med isoproterenol viser et lignende mønster af calciumtransienter på dag 0 og dag 6 i kulturen (n = 4 svinehjerter 10−15 celler analyseret i hver, SEM er repræsenteret som fejllinjer; tovejs ANOVA-test blev udført for at sammenligne mellem grupper, *p < 0,05 sammenligne baseline til Iso-stimulering på samme tidspunkt, p-værdiD0 vs D6 = 0,95 og p-værdiD0 Iso vs D6 Iso = 0,93). cC) Opsætning af kontraktkraftstyrkevurdering (venstre panel) hjerteskiven (HS) hænges mellem en krafttransducer (FT) og en stabil stolpe (P) mellem to elektriske elektroder (EE) til elektrisk stimulation. Ved stimulering registreres skivekontrakterne og sammentrækningerne ved hjælp af den udpegede software (højre panel). (D) Søjlegrafen viser kvantificeringen af kontraktilekraften ved tilstedeværelse eller fravær af isoproterenol (Iso) fra friske svinehjerteskiver (dag 0) og efter 6 dage i biomimetisk kultur (n = 4 svinehjerter hver i treeksemplarer SEM er repræsenteret som fejllinjer; tovejs ANOVA-test blev udført for at sammenligne grupper, *p < 0,05 sammenligne baseline til Iso-stimulering på samme tidspunkt, spjætkraft: p-værdiD0 vs D6 = 0,96, p-værdiD0 Iso vs D6 Iso = 0,81; tid til 50% afslapning: p-værdi D0 vs D6 = 0,47, p-værdiD0 Iso vs D6 Iso = 0,43). Dette tal er blevet ændret fra Ou et al.13. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Betingelse | Fischer et al.16 | Ou et al.13 |
| Arter | Menneskelige | Svin og mennesker |
| Sygdom | Svigtende hjerter | Normale sunde hjerter |
| Bevarelse | Konserveret væv | Frisk væv |
| Udsnitstykkelse | 300 μm | 300 μm |
| Medium iltning | Nej | Intermitterende iltning |
| Kultur Medium | M199/ITS | M199/ITS/FBS/VEGF/FGF |
| Agitation | Ja | Nej |
| Tempohastighed | 0,2 Hz | 1,2 Hz |
| Kulturens varighed | 4 måneder med kompromis | 6 dage uden kompromis |
| Cuture Temperatur | 37 | 37 |
| Mekanisk belastning | auxotoniske belastning | ingen indlæsning |
| Testede tidspunkter uden ændring i genekspression sammenlignet med frisk hjerteskive | Nielsen | 2 og 6 dage |
| Første testede tidspunkt for at vise ændring i genekspression | Dag 8 | Dag 10 |
Tabel 1: Sammenligning mellem de skærings- og dyrkningsbetingelser, der anvendes i Fischer et al.16 og Ou et al.13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi den detaljerede video protokol for vores nyligt offentliggjorte metode til forenklet medium gennemløb (processer op til 48 skiver / enhed) metode, der gør det muligt kultur af svin hjerte skiver i en periode tilstrækkelig lang til at teste akut kardiotoksicitet13. De foreslåede betingelser efterligner miljøet i hjertet, herunder hyppigheden af elektrisk stimulation, næringsstof tilgængelighed, og intermitterende iltning. Vi tilskriver den langvarige levedygtighed af hjerteskiver i vores biomimetiske stimulerede kultur til vores fokus på at genskabe de fysiologiske forhold, som det intakte hjerte oplever. Dette koncept understøttes af vores data, der viser, at elektrisk stimulation alene, uden at give essentielle næringsstoffer, er ikke tilstrækkelig til at opretholde hjerte skive levedygtighed13. Derfor er de nye komponenter i kulturmediet den vigtigste drivkraft bag at forlænge hjerteskivens levedygtighed og funktionalitet i kulturen. Vi fandt, at det er vigtigt at medtage FBS i mediet for at opretholde levedygtigheden, hvilket sandsynligvis skyldes kravet om en række fedtsyrer, sporstoffer, enzymer, proteiner, makromolekyler, kemiske komponenter og hormoner, som normalt er til stede i serum og leveres til hjertevæv in vivo17. Endvidere fandt vi, at tilføjelsen af FGF og VEGF til kulturmediet er nødvendig for at forbedre vævets levedygtighed. FGF og VEGF er kendte angiogene faktorer, som er afgørende for vedligeholdelse af dyrkede endotelceller18. Derfor er det sandsynligt, at FGF og VEGF er nødvendige for at opretholde endotelceller og bindevæv i kultur for at støtte væv levedygtighed. Vores arbejde er den første til at ændre det forenklede kulturmedium, der tidligere blev rapporteret for dyrkningshjerteskiver, og det åbner mulighed for yderligere optimering af mediekomponenterne i efterfølgende undersøgelser.
I tide med vores nye metode, var der tre andre undersøgelser, der har vist betydningen af kontinuerlig elektromekanisk stimulation i at opretholde skiver i kultur i bioengineered systemer16,19,20. Men, disse undersøgelser brugte de basale M199/ITS medium, som ikke er tilstrækkelig til at opretholde de metaboliske behov i hjertet skiver. Dette førte til flere kompromiser i skiven kontraktilitet og calcium homøostase tidligt under kultur16,19,20. Qiao et al.19 udviklede en meget sofistikeret biomanipuleret chips, som kan opretholde de elektrofysiologiske egenskaber af hjertet skiver i 4 dage, men ingen vurdering af kontraktile funktion blev givet. Watson et al.20 har bioengineered en lav gennemløb kultur system (processer op til 4 skiver / enhed) for at påvise betydningen af diastolisk sarcomere længde for vedligeholdelse af hjertemusklen egenskaber for 24 timer. Endelig har Fischer et al.16 vist, at svigtende menneskelige hjerteskiver kan opretholdes in vitro i op til 4 måneder, når de dyrkes under 0,2 Hz stimulation, auxotonisk belastning og medieagitation i en bioengineering enhed. Disse forhold induceret en række ændringer i hjertet skiver, som afspejles i deres RNAseq data, som viste over 10 fold downregulation af hjertegenekspression så tidligt som første gang vurderingssted (dag 8)16. Men i vores optimerede kultursystem blev kun 2 og 5 udskrifter signifikant udtrykt efter henholdsvis 2 og 6 dage i kultur sammenlignet med frisk hjertevæv. Men efter 10 dage i kultur, var der betydelige ændringer i udtrykket af over 500 udskrifter. De downregulated gener efter 10 dage i kultur var for det meste relateret til hjertemusklen, mens de upregulated gener er relateret til fibroblaster, ekstracellulære matrix, og betændelse13. Tabel 1 indeholder en fuldstændig sammenligning af udskærings- og kulturprotokoller mellem Fischer et al.16 og Ou et al.13. Derfor emulerer vores biomimetiske stimulerede kultursystem de kontrollerbare tilstande, som hjertet oplever in situ, og bør derfor give en pålidelig udlæsning af de funktionelle og strukturelle resultater af narkotikabehandling med hensyn til akut kardiotoksicitet eller effekt sammenlignet med kompromitterede kultursystemer.
En af de største begrænsninger ved dette kultursystem er, at selv om vores kultursystem kan efterligne flere fysiologiske forhold, kan det ikke efterligne ændringer i mekanisk belastning og forskydningsstress under hjertekontraktilecyklussen. Yderligere optimering af fysiologiske og metaboliske faktorer kan hjælpe forlænge hjerte skive levedygtighed og funktion. Derudover bemærkede vi en tidlig tilpasning, som fører til formindskelse af oxidativ fosforylering, som kan anspore til forringelse af hjerteskivens levedygtighed13. Desværre har vi indtil videre ikke været i stand til at identificere en optimal metode til at opretholde oxidativ fosforylering. Det er sandsynligt, at øge fedtsyre metabolisme i hjerte skiver er ikke så simpelt som at tilføje fedtsyrer til vækstmediet, og vil kræve yderligere optimering, som kunne behandles i fremtidige undersøgelser. Desuden er en generel svaghed ved denne tilgang den manglende måling af handlingspotentialer på enkeltkardiomyocytter i hjerteskiven, hvilket er afgørende for at påvise forstyrrelser i elektrokardiogram og ventrikulær arytmi. Derfor er der behov for at optimere protokoller til at isolere enkelt kardiomyocytter fra hjertet skiver efter behandling med kardiotoksiner, der inducerer forstyrrelser i elektrokardiogram og vurdere deres virkning på handling potentiale på de isolerede kardiomyocytter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
TMAM ejer aktier i Tenaya Therapeutics. De øvrige forfattere rapporterer ingen konflikter.
Acknowledgments
TMAM er støttet af NIH tilskud P30GM127607 og American Heart Association tilskud 16SDG29950012. RB understøttes af P01HL78825 og UM1HL113530.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,000 mL, 0.22 µm, Vacuum Filter/Storage Systems | VWR | 28199-812 | |
| 2,3-Butanedione monoxime (BDM) | Fisher | AC150375000 | |
| 500 mL, 0.22 µm, Vacuum Filter/Storage Systems | VWR | 28199-788 | |
| 6-well C-Dish Cover (electrical-stimulation-plate-cover) | Ion Optix | CLD6WFC | |
| 6-well plates | Fisher | 08-772-1B | |
| Agarose | Bioline USA | BIO-41025 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo | 15-240-062 | |
| C-Pace EM (cell-culture-electrical-stimulator) | Ion Optix | CEP100 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Fisher | C79-500 | |
| Ceramic Blades for Vibrating Microtome | Campden Instruments | 7550-1-C | |
| Cooley Chest Retractor | Millennium Surgical | 63-G5623 | |
| D-Glucose | Fisher | D16-1 | |
| Disposable Scalpel #20 | Biologyproducts.com | DS20X | |
| Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning | VWR | 21008-952 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo | A3160502 | |
| Graefe Forceps | Fisher | NC9475675 | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Histoacryl BLUE Tissue glue | Amazon | https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/ | |
| Iris Spring scissors | Fisher | NC9019530 | |
| Iris Straight Scissors | Fisher | 731210 | |
| Isoflurane, USP | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma-Aldrich | I3146-5ML | |
| Ketamine HCl (500 mg/10 mL) | West-Ward | NDC 0143-9508 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher | M33-500 | |
| Mayo SuperCut Surgical Scissors | AROSurgical Instruments Corporation | AROSuperCut™ 07.164.17 | |
| Medium 199, Earle's Salts | Thermo | 11-150-059 | |
| Oxygen regulator | Praxair | ||
| Oxygen tanks - | Praxair | ||
| Plastic Pasteur pipettes | Fisher | 13-711-48 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher | AC193780010 | |
| Printer Timing Belt | Amazon | https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/ | |
| Razor rectangle blades | Fisher | 12-640 | |
| Recombinant Human FGF basic | R&D Systems | 233-FB-025/CF | |
| Recombinant Human VEGF | R&D Systems | 293-VE-010/CF | |
| Retractable scalpels | Fisher | 22-079-716 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher | AC217125000 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | AC327300010 | |
| Vibrating Microtome | Campden Instruments | 7000 SMZ-2 | |
| Xylazine HCl (100 mg/mL) | Heartland Veterinary Supply | NADA 139-236 |
References
- Onakpoya, I. J., Heneghan, C. J., Aronson, J. K. Post-marketing withdrawal of 462 medicinal products because of adverse drug reactions: a systematic review of the world literature. BMC Medicine. 14, 10 (2016).
- Fermini, B., Fossa, A. A. The impact of drug-induced QT interval prolongation on drug discovery and development. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (6), 439-447 (2003).
- Moslehi, J. J. Cardiovascular Toxic Effects of Targeted Cancer Therapies. The New England Journal of Medicine. 375 (15), 1457-1467 (2016).
- Robertson, C., Tran, D. D., George, S. C. Concise review: maturation phases of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells. 31 (5), 829-837 (2013).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
- Pinto, A. R., et al. Revisiting Cardiac Cellular Composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).
- Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
- Fu, X., et al. Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart. Journal of Clinical Investigations. 128 (5), 2127-2143 (2018).
- Kretzschmar, K., et al. Profiling proliferative cells and their progeny in damaged murine hearts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (52), E12245-E12254 (2018).
- Perbellini, F., et al. Investigation of cardiac fibroblasts using myocardial slices. Cardiovascular Research. 114 (1), 77-89 (2018).
- Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).
- Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 28798 (2016).
- Ou, Q., et al. Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices. Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).
- Jones, S. P., et al. The NHLBI-sponsored Consortium for preclinicAl assESsment of cARdioprotective therapies (CAESAR): a new paradigm for rigorous, accurate, and reproducible evaluation of putative infarct-sparing interventions in mice, rabbits, and pigs. Circulation Research. 116 (4), 572-586 (2015).
- Crick, S. J., Sheppard, M. N., Ho, S. Y., Gebstein, L., Anderson, R. H. Anatomy of the pig heart: comparisons with normal human cardiac structure. Journal of Anatomy. 193 (Pt 1), 105-119 (1998).
- Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10 (1), 117 (2019).
- Franke, J., Abs, V., Zizzadoro, C., Abraham, G. Comparative study of the effects of fetal bovine serum versus horse serum on growth and differentiation of primary equine bronchial fibroblasts. BMC Veterinary Research. 10, 119 (2014).
- Vuorenpaa, H., et al. Novel in vitro cardiovascular constructs composed of vascular-like networks and cardiomyocytes. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 50 (4), 275-286 (2014).
- Qiao, Y., et al. Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 144, 139-150 (2018).
- Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10 (1), 2168 (2019).
