Summary
Nous détaillons une méthode simple pour produire des films à time-lapse haute résolution d’essaims pseudomonas aeruginosa qui répondent à la bactériophage (phage) et au stress antibiotique à l’aide d’un scanner de documents à plat. Cette procédure est une méthode rapide et simple pour surveiller la dynamique des essaims et peut être adaptée pour étudier la motilité et la croissance d’autres espèces bactériennes.
Abstract
L’essaimage est une forme de motilité de surface observée chez de nombreuses espèces bactériennes, y compris Pseudomonas aeruginosa et Escherichia coli. Ici, des populations denses de bactéries se déplacent sur de grandes distances dans les communautés caractéristiques en forme de tendril au cours des heures. L’essaimage est sensible à plusieurs facteurs, y compris l’humidité moyenne, l’humidité et la teneur en éléments nutritifs. En outre, la réponse collective au stress, qui est observée dans P. aeruginosa qui sont stressés par les antibiotiques ou le bactériophage (phage), repousse les essaims de s’approcher de la zone contenant le stress. Les méthodes décrites ici traitent de la façon de contrôler les facteurs critiques qui affectent l’essaimage. Nous introduisons une méthode simple pour surveiller la dynamique des essaims et la réponse collective au stress à haute résolution temporelle à l’aide d’un scanner de documents à plat, et décrivons comment compiler et effectuer une analyse quantitative des essaims. Cette méthode simple et rentable fournit une quantification précise et bien contrôlée des essaimages et peut être étendue à d’autres types d’essais de croissance à base de plaques et d’espèces bactériennes.
Introduction
L’essaimage est une forme collective de motilité bactérienne coordonnée qui augmente la résistance aux antibiotiques et la production de facteurs de virulence dans l’hôte1,2,3. Ce comportement multicellulaire se produit sur les surfaces semi-solides qui ressemblent à celles des couches muqueuses couvrant les membranes épithéliales dans les poumons4,5. Les biosurfacteurs sont généralement produits par des populations grouillantes pour surmonter la tension de surface sur les surfaces et la production de ceux-ci est réglementée par des systèmes complexes de signalisation cellulaire, également connu sous le nom de détection du quorum6,7,8. De nombreuses espèces de bactéries sont capables d’essaimer, y compris Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, et Escherichia coli9,10,11,12. Les modèles d’essaimage créés par les bactéries sont divers et sont affectés par les propriétés physiques et chimiques de la couche de surface, y compris la composition des nutriments, la porosité et l’humidité13,14. En plus des propriétés de surface, la température de croissance et l’humidité ambiante affectent plusieurs aspects de la dynamique des essaimages, y compris le taux d’essaimage et les modèles12,13,14,15. Les variables de croissance qui affectent les essaimages créent des défis qui ont un impact sur la reproductibilité expérimentale et la capacité d’interpréter les résultats. Ici, nous décrivons une méthode standardisée simple pour surveiller la dynamique des essaims bactériens grâce à l’imagerie en time-lapse. La méthode décrit comment contrôler les conditions de croissance critiques qui affectent considérablement la progression de l’essaimage. Par rapport aux méthodes traditionnelles d’analyse des essaims, cette méthode d’imagerie en time-lapse permet de suivre simultanément la motilité de plusieurs essaims pendant de longues périodes et à haute résolution. Ces aspects améliorent la profondeur des données qui peuvent être obtenues en surveillant les essaims et facilitent l’identification des facteurs qui affectent l’essaimage.
L’essaimage dans P. aeruginosa est facilité par la production et la libération de rhamnolipids et 3-(3-hydroxyalkanoyloxy)acides alplacés dans la zone environnante6,16. L’introduction du stress dû aux concentrations subtaltalgiques d’antibiotiques ou d’infection par le virus du phage a une incidence sur l’organisation d’essaims. En particulier, ces contraintes incitent P. aeruginosa à libérer la molécule de détection du quorum 2-heptyl-3-hydroxy-4-quinolone, également connu sous le nom pseudomonas quinolone signal (PQS)17,18. Dans les essais d’essaim qui contiennent deux populations d’essaims, le PQS produit par la population induite par le stress repousse les essaims non traités d’entrer dans la région contenant le stress(figure 1). Cette réponse collective au stress constitue un système de signalisation de communication de danger qui avertit P. aeruginosa au sujet des menaces à proximité18,19. Les effets du stress sur P. aeruginosa, l’activation de la réponse collective au stress, et la répulsion des essaims peuvent être visualisés à l’aide de la méthode d’imagerie time-lapse décrite ici. Le protocole décrit ici explique comment : (1) préparer des plaques d’agar pour essaimage, (2) la culture P. aeruginosa pour deux types d’essais (des essais grouillants traditionnels ou des essais collectifs de réponse au stress)(figure 1), (3) acquérir des images en time-lapse, et (4) utiliser ImageJ pour compiler et analyser les images.
En bref, P. aeruginosa d’une culture de nuit est repéré au milieu d’une plaque d’agar grouillant tandis que P. aeruginosa qui sont infectés par le phage ou traités avec des antibiotiques sont repérés aux positions satellites. La progression de l’essaimage de P. aeruginosa est surveillée sur un scanner à plat de documents de consommation qui est placé dans un incubateur de 37 oC régi par l’humidité. Le scanner est contrôlé par un logiciel qui scanne automatiquement les plaques à intervalles réguliers au cours de la période de croissance de l’essaim, généralement 16-20 h. Cette méthode donne des vidéos simultanées en time-lapse de jusqu’à six plaques grouillantes de 10 cm. Les images sont compilées dans des films et la répulsion des essaims par des populations induites par le stress est quantifiée en utilisant un logiciel ImageJ librement disponible. Une attention particulière est accordée pour assurer la cohérence et la reproductibilité entre les différentes expériences d’essaimage.
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Protocol
1. Préparation des plaques d’agar grouillantes pour p. aeruginosa Swarming Time-lapse Imaging
- Préparer 1 L de 5x M8 média minimum dans une bouteille en verre en ajoutant 64 g de Na2HPO47H2O, 15 g de KH2PO4, et 2,5 g de NaCl dans 500 mL d’eau double distillée (ddH2O). Ajuster le volume final à 1 L avec ddH2O. Autoclave supplémentaire pour stériliser et stocker les supports liquides à température ambiante.
- Préparer 100 ml de MgSO4 mgSO 4 (sulfate de magnésium) dans une bouteille en verre en ajoutant 24,6 g de MgSO4à 7H2O dans 50 mL ddH2O. Ajuster le volume final à 100 ml avec ddH2O. Autoclave supplémentaire à stériliser. Conserver à température ambiante.
- Préparer 100 ml d’acides casamino de 20 % dans une bouteille en verre en ajoutant 20 g d’acides casaminos dans 50 mL ddH2O. Ajuster le volume final à 100 ml avec ddH2O. Autoclave supplémentaire pour stériliser. Conserver à température ambiante.
- Préparer 100 ml de glucose de 20 % dans une bouteille en verre en ajoutant 20 g de glucose en ddH2O. Ajuster le volume final à 100 ml avec ddH2O. Stériliser par filtration avec filtre de 0,22 m. Conserver à température ambiante.
- Pour faire 10 plaques d’agar grouillant, ajouter 1 g d’agar dans 100 ml de ddH2O et ajuster le volume final à 160 ml avec ddH2O supplémentaire dans un flacon Erlenmeyer de 250 ml. Stériliser par autoclaving.
- Immédiatement après l’autoclaving, placez la solution d’agar dans un bain d’eau de 55 oC pendant 15 min.
- Retirez la solution d’agar du bain d’eau et ajoutez 40 ml de support minimum de 5x M8, 200 L de 1 M MgSO4,2 ml de glucose de 20 % et 5 ml d’acides casamino de 20 %15. Procédez à l’étape 1.6 immédiatement après le mélange.
REMARQUE : Les concentrations finales sont de 0,5 % d’agar, de 1 mM MgSO4,de 0,2 % de glucose et de 0,5 % d’acides casamino.
- À l’aide d’une pipette de 25 ml pour un volume constant, ajouter 20 ml de la solution d’agar grouillante par plat Petri de 10 cm de diamètre.
REMARQUE : Un volume fixe de solution d’agar est important, car le volume affecte le temps de séchage et la teneur en humidité de l’agar. Évitez les bulles lors de la fabrication des plaques d’agar grouillantes. - Laisser l’agar se solidifier en plaçant les plaques d’agar grouillantes dans une seule pile avec couvercles allumés pendant 1 h sur le banc à température ambiante. Allumez le déshumidificateur pour diminuer l’humidité relative de la pièce à 40-50% 1 h avant l’étape suivante.
- Séchez les plaques d’agar grouillantes pendant 30 minutes supplémentaires avec les couvercles éteints dans un capot de flux laminaire à 300 pi3/minavec 40 à 50 % d’humidité relative à température ambiante. Séchez l’intérieur des couvercles en les plaçant face vers le haut dans le capot de flux lamineur. Conserver les plaques d’agar grouillantes à 4 oC jusqu’à 24 h.
- Préparer les couvercles noirs de 10 cm de perpétre pour l’imagerie en lissant l’intérieur du couvercle avec du papier de verre. Placez les couvercles à l’intérieur d’une boîte d’emballage et placez la boîte d’emballage sous une hotte chimique. Vaporiser à l’intérieur des couvercles à l’aide de peinture noire. Laisser sécher les couvercles.
REMARQUE : Les couvercles noirs peuvent être réutilaux pour d’autres expériences. Il est important que les couvercles soient peints afin qu’ils ne reflètent pas la lumière pendant la numérisation.
2. Croissance des conditions de P. aeruginosa et de plating
- Préparer 400 ml de bouillon de lysogeny (LB) en ajoutant 10 g de mélange de poudre LB-Miller en 400 ml ddH2O. Pour 2% de plats LB-agar Petri, ajouter 8 g d’agar supplémentaire. Autoclave pour stériliser.
- Verser 20 ml de milieu LB-agar fondu dans des plats Petri de 10 cm de diamètre et leur permettre de se solidifier à température ambiante pendant la nuit. Conservez les supports liquides à température ambiante et les plaques d’agar à 4 oC.
- Streak P. aeruginosa sur un plat LB-agar Petri à partir d’un stock congelé stocké à -80 oC à l’aide de boucles stériles ou de bâtons en bois. Incuber le plat Petri à l’envers pendant la nuit à 37 oC. Conservez la plaque LB-agar à 4 oC jusqu’à 1 semaine.
- Choisissez une seule colonie du plat Petri avec une boucle stérile ou un bâton en bois, inoculez-le en milieu de 2 ml LB et incuber la culture à saturation pendant la nuit (16-18 h) à 37 oC dans un jeu à roulettes à 100 tr/min.
- Pipet 5 'L de la culture de nuit de l’étape 2.4 à l’aide d’un tuyau P20 et tache au centre de la plaque d’agar grouillante en s’approchant de la pointe de tuyauterie à un angle (10-45 ') 2.5 cm au-dessus de la zone de repérage, pipetting vers le bas au premier arrêt, et touchant l’agar avec seulement la goutte de liquide(figure 1B).
- Évitez de toucher l’agar avec la pointe de la pipe car elle endommage l’agar. Utilisez un modèle afin de positionner l’endroit uniformément à travers différentes plaques d’agar grouillantes (Figure supplémentaire S1).
- Pour les essais grouillants traditionnels, n’utilisez que l’endroit central et sautez à l’étape 2.8. Pour les essais collectifs de réponse au stress continuent d’étape 2.6 (pour l’infection à phage) ou l’étape 2.7 (pour le stress antibiotique).
- Pour l’infection par le phage, mélanger 30 l de culture de nuit de P. aeruginosa de l’étape 2.4 avec 6 'L de 1 x 1012 pfu/mL phage DMS3vir20. Passez immédiatement à l’étape suivante.
- Pipet 6 'L du mélange P. aeruginosa-phagede l’étape 2.6 à l’aide d’un tuyauterie P20 et tache à 6 positions satellites équidistantes sur un cercle concentrique de rayon de 2,8 cm centré sur le plat Petri en approchant la pointe de la pipet à un angle (10 à 45 degrés) 2,5 cm au-dessus de la zone de repérage, tuyauter vers le bas pour le premier arrêt, et toucher l’agar avec seulement la goutte de liquide(figure 1C).
- Évitez de toucher l’agar avec la pointe de la pipe car elle endommage l’agar. Utilisez un modèle de placage pour la cohérence(figure supplémentaire S1). Procédez à l’étape 2.8.
- Pour les traitements antibiotiques, mélanger 30 L de culture du jour au lendemain P. aeruginosa de l’étape 2.4 avec 6 'L de 3 mg/mL gentamycine, 10 'L de 100 mg/mL kanamycin, ou 7.5 'L de 100 mg/mL fosfomycin. Passez immédiatement à l’étape suivante.
- Pipet 6 'L d’antibiotique traité P. aeruginosa de l’étape 2.7 à l’aide d’une pipette P20 et placez-le à 6 positions satellites équidistantes sur un cercle concentrique de rayon de 2,8 cm au centre du plat en s’approchant de la pointe de la pipet à un angle (10 à 45 degrés) 2,5 cm au-dessus de la zone de repérage, en passant au premier arrêt, et en touchant l’agar avec seulement la baisse liquide(figure 1D).
- Évitez de toucher l’agar avec la pointe de la pipe car elle endommage l’agar. Utilisez un modèle de placage pour la cohérence(figure supplémentaire S1). Procédez à l’étape 2.8.
- Remplacer les couvercles à vaisselle Petri transparents par des couvercles noirs fabriqués à l’étape 1.9(figure 2A).
- Placez les plaques d’agar grouillantes sur un scanner dans un incubateur fixé à 37 oC avec un bain d’eau de 10 L pour maintenir l’humidité à 75 %(figure 1E, figure 2B).
CAUTION : Ne perturbez pas les cellules tachetées sur les plaques d’agar grouillantes. Gardez les assiettes face à face en tout temps.
3. Acquisition d’images avec Scanner
- Diminuez l’éclairage ambiant des plats Petri en attachant du tissu mat noir à une grille de 40 à 60 cm au-dessus du scanner de documents à plat. Sécurisez-le à l’aide de tyroliennes(figure 2B).
- Le scanner sera contrôlé à l’aide d’un logiciel de numérisation et d’un logiciel de script automatique.
- Dans le logiciel de numérisation, sélectionnez mode Accueil (figure 3A). Capturez des images en couleur en sélectionnant la couleur sous type d’image. Pour définir la qualité de l’image, sélectionnez Autres sous Destination et ajustez la résolution à 300 dpi. Conservez la taille standard des images en sélectionnant Original pour la taille cible. Laissez toutes les options sous les ajustements d’image non contrôlées pour la qualité standard de l’image.
REMARQUE : La taille de la cible est définie à Original par défaut. Pour sélectionner d’autres options pour la taille cible, cliquez sur Aperçu en premier.
- Dans le logiciel de numérisation, sélectionnez mode Accueil (figure 3A). Capturez des images en couleur en sélectionnant la couleur sous type d’image. Pour définir la qualité de l’image, sélectionnez Autres sous Destination et ajustez la résolution à 300 dpi. Conservez la taille standard des images en sélectionnant Original pour la taille cible. Laissez toutes les options sous les ajustements d’image non contrôlées pour la qualité standard de l’image.
- Définissez le chemin d’enregistrement des images en cliquant sur l’icône du dossier à droite de Scan pour ouvrir les paramètres d’enregistrement des fichiers(figure 3A).
- Sélectionnez la destination de dossier pour enregistrer des images en sélectionnant d’autres sous l’emplacement et cliquez sur Parcourir. Choisissez un dossier pour enregistrer les images.
- Nommez les images dans la boîte à texte Prefix. Définissez le numéro de démarrage 001 pour commencer la séquence de nommage des images. Définissez le format de fichier à JPEG en choisissant JPEG (jpg) pour type sous format d’image et cliquez sur Options pour ajuster les détails. Définissez la qualité du format d’image en ajustant le niveau de compression à 16, encodez à la norme, et vérifiez le profil d’ICC d’Embed. Cliquez sur OK pour fermer la fenêtre ( figure3B).
- Laissez la première option non contrôlée ("Overwrite tous les fichiers du même nom") et vérifiez les 3 options suivantes ("Afficher cette boîte de dialogue avant la prochaine analyse", "Dossier d’image ouvert après numérisation", et "Afficher le dialogue Ajouter page après la numérisation"). Cliquez sur OK pour fermer la fenêtre
- Vérifiez la qualité de l’image en cliquant sur Preview. La fenêtre de prévisualisation apparaît, et l’icône Scan devient fonctionnelle(figure 3C).
- Utilisez le logiciel de script pour automatiser l’acquisition d’images. Le script fourni clique sur Scan dans la fenêtre Scan et OK dans la fenêtre De l’enregistrement des fichiers à intervalles de 30 minutes.
- Importer le script en cliquant sur La tâche ( Importer et sélectionner les fichiers Single_scan.tsk et Idle_scanning.tsk (fichiers TSK fournis sous forme de fichiers supplémentaires 1 et 2). Voir la figure 3D.
REMARQUE : Single_scan.tsk clique sur le bouton Scan dans la fenêtre Scan et OK dans la fenêtre De l’enregistrement des fichiers. Idle_scanning.tsk active Single_scan.tsk toutes les 30 minutes. On peut modifier la fréquence d’analyse en modifiant l’activation de Idle_scanning.tsk. - Activez la numérisation automatique à intervalles de 30 min en sélectionnant à la fois la numérisation au ralenti (importée) et l’analyse unique (importée),en cliquant à droite sur la numérisation au ralenti (importée), et en cliquant à gauche sur Enabled (figure 3D, figure supplémentaire S2).
REMARQUE : La numérisation automatique s’exécute jusqu’à ce que l’utilisateur arrête manuellement le script. Pour arrêter le script, sélectionnez la numérisation Idle (importée),cliquez à droite Sur la numérisation Idle (importée)et cliquez à gauche sur Enabled. La marque de contrôle sera supprimée.
- Importer le script en cliquant sur La tâche ( Importer et sélectionner les fichiers Single_scan.tsk et Idle_scanning.tsk (fichiers TSK fournis sous forme de fichiers supplémentaires 1 et 2). Voir la figure 3D.
4. Compilation d’images Time-lapse et mesure de la répulsion des essaims
- Effectuez le montage de films et l’analyse d’images à l’aide d’ImageJ.
- Importer toutes les images numérisées sur ImageJ en cliquant sur Le fichier ( Importations Séquence d’image et sélectionnez les images. Dans la fenêtre Séquence Options, vérifiez Convertir en RGB pour garder les images en couleur. Nombre d’images indique le nombre d’images sélectionnées.
- Gardez l’image de départ à 1 pour commencer à partir de la première image dans le dossier et les images d’échelle à 100% pour conserver la taille originale des images. Laissez utiliser la pile virtuelle non contrôlée. Cliquez sur OK et attendez que les images se chargent ( figure4A).
- Définissez le niveau de compression vidéo à 100 en cliquant sur Edit ( Options de vente Entrée/sortie... et ajuster la qualité JPEG à 100.
- Enregistrer le fichier comme un .avi en cliquant sur le fichier ( Enregistrer comme '' ' ' ' ' ' ' ' AVI. Ajuster la compression au JPEG et au taux de cadre à 5 fps(figure 4B). Enregistrez le time-lapse .avi dans le dossier désiré.
- Pour quantifier les distances de répulsion des essaims, ouvrez une image vers la fin de la période d’essaimage dans ImageJ. Cliquez sur le fichier (en anglais) Ouvrez et sélectionnez l’image. Ajuster l’échelle en cliquant sur Analyze . Échelle de réglage et réglage Distance en pixels à 118, distance connue à 1, rapport d’aspect Pixel à 1,0, et unité de longueur à cm(figure 4C). Laissez Global sans contrôle. Cliquez sur OK pour fermer la fenêtre.
- Cliquez sur l’icône droite et mesurez du centre de la colonie à la position satellite jusqu’au bord de la population grouillante. Sélectionnez Analyse Mesure pour faire apparaître une nouvelle fenêtre avec les mesures (Longueur) (Figure 4D).
REMARQUE : Utilisez « » pour zoomer plus près et « » pour effectuer un zoom arrière.
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Representative Results
Les étapes pour cultiver P. aeruginosa,stressent les cellules, et imagent les plaques d’agar grouillantes sont représentées dans la figure 1. Nous avons inoculé une seule colonie de souche P. aeruginosa UCBPP-PA14 de type sauvage à partir d’une plaque de LB-agar dans 2 ml de bouillon LB pendant la nuit à 37 oC et repérée à 5 ll au centre de la plaque d’agar qui grouille. L’imagerie en time-lapse de cette plaque révèle la croissance initiale sous la forme d’une colonie au centre, puis la propagation des vrils radialement de la colonie (Vidéo 1). Pour les essais de réponse collective au stress, en plus de repérer P. aeruginosa au centre, 30 L de la même culture de nuit est mélangé avec 6 'L de 1 x10 12 pfu/mL DMS3vir ou 6 'L de 3 mg/mL gentamycine à un rapport de 5:1 et 6 'L est repéré aux positions du satellite. Les essaims se déplacent du centre des plaques d’agar grouillantes à la périphérie et sont repoussés par un signal de stress émis par les bactéries qui ont été infectées par des phages(Vidéo 2, plaque supérieure gauche) ou traités avec de la gentamycine(Vidéo 2, plaque supérieure droite). Les phages(vidéo 2, plaque inférieure gauche) ou la gentamycine(vidéo 2, plaque inférieure droite) repérées seules aux positions satellites ne font pas éviter ces zones aux populations grouillantes.
Figure 1 : Schéma de l’essai grouillant de P. aeruginosa et réponse collective au stress. (A) les cellules P. aeruginosa sont cultivées du jour au lendemain (16-18 h àOD 600 d’environ 1,5) dans le bouillon LB à 37 oC et (B) repéré au milieu de la plaque d’agar essaimage. Les cultures de nuit sont mélangées avec (C) phages ou (D) antibiotiques et repérés aux positions satellites pour les essais collectifs de réponse au stress. (E) Jusqu’à 6 plaques sont illustrées sur un scanner à intervalles de 30 min pour 16-18 h à 37 oC. Après 18 h, les populations grouillantes de P. aeruginosa évitent (F) les cellules infectées par le phage ou (G) cellules traitées avec des antibiotiques (gentamycine). (H) P. aeruginosa populations essaim à travers la plaque d’agar grouillant. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Configuration du scanner à l’intérieur de l’incubateur. (A) Couvercles à vaisselle Petri noir construits à la section 1. Ces couvercles sont utilisés lors de la numérisation pour réduire les reflets de lumière et remplacer les couvercles transparents de la vaisselle Petri. (B) Le scanner de documents à plat est placé dans un incubateur fixé à 37 oC. Six plaques avec couvercles noirs sont placées sur le scanner (image gauche). Le tissu mat noir est fixé à la grille 60 cm au-dessus du scanner pour réduire davantage les reflets et la lumière errante (image droite). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Acquisition automatisée d’images du scanner de documents à plat à l’aide du logiciel de numérisation et de script automatique. (A) Capture d’écran de la fenêtre scan principale. Sélection de type Image (Couleur) et Résolution (300 dpi). Le carré rouge indique l’icône du dossier pour ouvrir la fenêtre De fichiers Enregistrer paramètres. Notez que le bouton Preview peut être appuyé, mais le bouton Scan est désactivé. (B) Capture d’écran de la fenêtre De fichiers Enregistrer paramètres pour définir la destination du dossier pour enregistrer des images, nommer les images et choisir le format des images (à gauche). La fenêtre Plug-In Paramètres est utilisée pour définir la qualité du format d’image (à droite). (C) Capture d’écran de la fenêtre Scan après avoir cliqué sur Aperçu. Le bouton Scan est cliquable après l’acquisition d’un aperçu. Le programme peut maintenant être automatisé à l’aide du logiciel de script (Matériaux). (D) Capture d’écran des fenêtres logicielles de script indiquant le bouton Import utilisé pour importer les scripts d’automatisation (à gauche). Une fois que Single_scan.tsk et Idle_scanning.tsk sont importés, ceux-ci apparaissent comme des tâches dans la fenêtre principale (à droite). Après avoir sélectionné les deux tâches et à droite en cliquant sur elles, le bouton Activé apparaît. Clic gauche Enable démarre les scripts pour numériser automatiquement à intervalles de 30 minutes (à droite). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Analyse d’images de l’évitement grouillant à l’aide d’ImageJ. (A) Étapes pour importer une séquence d’image à partir des images du scanner time-lapse. Cliquer sur le fichier (fr) Importations Séquence d’image dans la fenêtre ImageJ principale (à gauche) évoque la fenêtre Séquence Options (à droite) et ouvre toutes les images numérisées. Le carré rouge indique l’option vérifiée pour charger des images en format RGB. Toutes les autres options sont laissées par défaut. (B) Étapes pour enregistrer la vidéo time-lapse en format AVI. Sélection du fichier (en anglais) Enregistrer comme '' ' ' ' ' ' ' ' AVI évoque la fenêtre Save as AVI. La compression est réglée à JPEG et Frame Rate à 5 fps. (C) Réglage des unités d’échelle pour les images. Sélection d’analyses L’échelle de configuration apporte la fenêtre d’échelle de configuration. Pour 300 images dpi, l’échelle appropriée est de 118 pixels/cm. (D) Mesure de l’évitement des populations grouillantes. Une ligne jaune est tracée du centre des colonies stressées jusqu’au bord des vrils. Sélection d’analyses Mesure indique la longueur de la ligne dans une nouvelle fenêtre étiquetée Résultats. Ctrl et M est un raccourci clavier qui effectue la mesure sans sélectionner les éléments du menu. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Essaims représentatifs de P. aeruginosa. P. aeruginosa grouillant les populations sur les plaques d’agar grouillantes qui sont (A) sèche, (B) normale, (C) humide, et (D) extra humide. Les plaques d’agar grouillantes sèches inhibent le taux d’essaim de P. aeruginosa et réduisent le nombre de vrils. Les plaques d’agar humides causent la formation de grandes vrils. Dans des conditions supplémentaires humides, les vrils se forment inégalement dans les plaques d’agar grouillantes. Les temps de séchage dans le capot d’écoulement lamineur et l’humidité ambiante ont des effets significatifs sur la teneur en humidité des plaques grouillante. Les plats sont des plats Petri de 10 cm. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Vidéo 1: Film time-lapse de grouillage. Wild-type P. aeruginosa ont été repérés au centre de la plaque d’essaimage et ont été photographiés sur le scanner au cours de 22 h. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit à télécharger.)
Vidéo 2: Film Time-lapse de la réponse collective au stress. Des P. aeruginosa de type sauvage ont été repérés au centre de la plaque d’essaimage. Des positions satellites ont été repérées avec P. aeruginosa qui sont mélangées en plus avec le phage (en haut à gauche) ou la gentamycine (en haut à droite), ou repérées uniquement avec le phage (en bas-gauche) ou la gentamycine (en bas-droite). Les points blancs indiquent le centre des taches. Les plaques ont été illustrées au cours de 16 h. Veuillez cliquer ici pour visionner cette vidéo. (Clic droit à télécharger.)
Figure supplémentaire S1 : Modèle de platage pour repérer les cellules de P. aeruginosa. Le point noir moyen représente la zone de repérage de la culture P. aeruginosa de 5 L pendant la nuit. Le rayon du cercle intérieur est à 2,8 cm du centre de la plaque. L’intersection entre le cercle intérieur et les lignes droites à travers le cercle extérieur indique la zone de repérage de 6 'L de P. aeruginosastressé, phage infecté ou antibiotiques cellules traitées. Le cercle extérieur représente la circonférence du plat Petri de 10 cm. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure supplémentaire S2: Macro commande de commencer périodiquement à numériser à l’aide d’un logiciel de script. (A) Les commandes macro dans Single_scan.tsk déplace le curseur à numériser dans la fenêtre Scan, clique sur Scan, se déplace vers OK dans file Enregistrer Paramètres fenêtre, et clique sur OK. (B) Commande de numériser en intervalles de 30 minutes. La tâche Idle_scanning.tsk commence Single_scan.tsk et est configuré pour activer dans 30 minutes d’intervalle. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Ce protocole met l’accent sur la réduction de la variabilité des plaques d’agar grouillantes et la fourniture d’une méthode simple et peu coûteuse pour acquérir des images en time-lapse de P. aeruginosa grouillant et répondant au stress. Cette procédure peut être étendue à l’image d’autres systèmes bactériens en adaptant la composition des médias et les conditions de croissance. Pour P. aeruginosa, bien que M9 ou FAB milieu minimal peut être utilisé pour induire essaimage16,21, le protocole présenté ici utilise M8 milieu avec des acides casamino, glucose, et le sulfate de magnésium6. P. aeruginosa essaimage est sensible à la composition moyenne telle que la disponibilité du fer et les sources d’éléments nutritifs, y compris les acides aminés22,23,24. Par conséquent, la sélection des médias pour les plaques d’agar grouillant illustre un aspect important de l’essai de motilité grouillante.
Le contrôle de l’humidité et de la température dans une zone de laboratoire ouverte représente l’un des plus grands défis pour la cohérence des essais d’essaims. Les changements saisonniers contribuent à la variabilité de l’humidité des plaques d’agar qui grouille, ce qui peut avoir un impact significatif sur les modèles d’essaimage. Par conséquent, un contrôle constant de l’humidité relative est nécessaire pour assurer une qualité optimale de la plaque. Commencer le déshumidificateur 1 h avant de sécher les plaques d’agar grouillantes sous le capot de flux laminaire contrôlera l’humidité relative à une constante 45%, en gardant le temps de séchage à 30 min. Si l’humidité ambiante ne peut pas être contrôlée, l’augmentation du temps de séchage est une solution simple potentielle pour compenser les environnements humides. Pendant l’essaimage, l’humidité relative devrait rester à 70 % dans l’incubateur de 37 oC pour empêcher les plaques d’agar de se dessécher. Un bac d’eau non plafonné dans l’incubateur peut servir de réservoir d’eau. Les plaques d’agar grouillantes sèches ralentissent la progression des populations grouillantes et réduisent le nombre de vrils tandis que les plaques humides causent une structure de vrombie large(figure 5A-C). Les plaques d’agars supplémentaires humides empêchent la formation claire de vrille et font que les vrilles se propagent dans un modèle inégal (Fig 5D). La méthode décrite ici peut être utilisée pour maintenir un environnement humide constant qui assurera la consistance des essaimages sur les plaques(figure 5B, Vidéo 1). De plus, la taille des plaques et l’épaisseur de l’agar jouent un rôle dans le maintien de l’humidité dans l’assiette. Nous avons utilisé des plats Petri de 10 cm de diamètre et ajouté 20 ml de solution d’agar grouillant par plaque pour assurer la consistance. Il n’est pas recommandé de verser des plaques sans mesurer les volumes. En raison des nombreuses variables qui affectent l’essai essaimage, nous recommandons d’optimiser l’essai aux conditions locales de laboratoire et nous soulignons l’importance d’effectuer plusieurs répliques biologiques sur des lots distincts de plaques pour observer des modèles constants et comparables d’essaimage.
L’avantage de la méthode d’imagerie en time-lapse pour enregistrer la motilité grouillante est la capacité d’observer la progression de la motilité sans avoir besoin de déranger les essaims. Notre méthode crée commodément des time-lapses de 6 plaques simultanément dans les mêmes conditions, ce qui fournit à la fois un environnement contrôlé pour l’évaluation simultanée de souches multiples, de multiples conditions expérimentales ou de reproductions biologiques. L’utilisation de six positions satellitaires sur chaque plaque facilite en outre l’analyse statistique et l’utilisation d’ImageJ permet la quantification de la répulsion grouillante.
La procédure décrite ici est une méthode simple pour étudier l’interaction entre les sous-populations de P. aeruginosa: une population grouillante saine et des cellules stressées. Au-delà du DMS3vir et de la gentamycine, d’autres types de phages, d’antibiotiques et de bactéries ou de champignons concurrents peuvent être utilisés pour étudier la signalisation du stress. Bien que cette méthode se concentre sur la motilité grouillantE P. aeruginosa, d’autres espèces bactériennes telles que S. aureus et E. coli présentent également des modèles d’essaimage, mais ils nécessitent des supports adaptés pour essaimer10,11. En optimisant les compositions des médias et les conditions des plaques, cette méthode peut être appliquée pour analyser les interactions grouillantes et grouillantes entre les souches bactériennes et les réponses au stress.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
J.-L.B., A.S., et N.M.H-K. écrit et révisé le manuscrit. Tous les auteurs ont conçu les expériences. J.-L.B. a effectué les expériences et l’analyse. Ce travail a été soutenu par le prix des NIH K22AI112816 et la subvention R21AI139968 aux A.S. et à l’Université de Californie. N.M.H-K. a reçu l’appui des bourses Lundbeck R220-2016-860 et R251-2017-1070. Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la décision de soumettre l’œuvre à la publication. Nous n’avons pas d’intérêts contradictoires à déclarer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Bacto agar, dehydrated | BD Difco | 214010 | For LB-agar plate and swarming agar plate |
| Casamino acids | BD Difco | 223050 | For swarming media |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16500 | Dextrose. For swarming media |
| Fosfomycin disodium salt | Tokyo Chemical Industry | F0889 | Stock concentration: 200 mg/mL. Dissolved in ddH2O |
| Gentamycin sulfate | Sigma-Aldrich | G1914 | Stock concentration: 3 mg/mL. Dissolved in ddH2O |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | Stock concentration: 100 mg/mL. Dissolved in ddH2O |
| LB-Miller | BD Difco | 244620 | For LB broth and LB-agar plates |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | For swarming media |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | For 5x M8 media |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | For 5x M8 media |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Chemical | S373 | For 5x M8 media |
| Strains | |||
| Pseudomonas aeruginosa | Siryaporn lab | AFS27E.118 | PA14 strain |
| DMS3vir | O'Toole lab | DMS3vir20 | Bacteriophage |
| Supplies | |||
| Aluminium oxide sandpaper | 3M | 150 Fine | For black lids |
| Black fabric | Joann | PRD7089 | Black fabric |
| Black spray paint | Krylon | 5592 Matte Black | For black lids |
| Erlenmeyer flask | Kimax | 26500 | 250 mL |
| Glass storage bottles | Pyrex | 13951L | 250 mL, 500 mL, 1,000 mL |
| 8 inches zip ties | Gardner Bender | E173770 | For attaching black matte fabric |
| Petri dishes (100 mm x 15 mm) | Fisher | FB0875712 | 100 mm x 15 mm polystyrene plates |
| Wooden sticks | Fisher | 23-400-102 | For streaking and inoculating bacteria |
| Equipment | |||
| Autoclave | Market Forge Industries | STM-E | For sterilizing reagents |
| 25 mL pipette | USA Scientific, Inc. | 1072-5410 | To pipet 20 mL for swarming agar plates |
| Dehumidifier | Frigidaire | FAD704DWD 70-pint | For maintaing room relative humidity at about 45% |
| ImageJ | NIH | v1.52a | Software for image analysis |
| Incubator | VWR | 89032-092 | For growth of bacteria at 37 °C |
| Isotemp waterbath | Fisher | 15-462-21Q | For cooling media to 55 °C |
| Laminar flow hood | The Baker Company | SG603A | For drying plates |
| P-20 pipet | Gilson | F123601 | Spotting on swarming agar plates |
| Pipette Controller | BrandTech | accu-jet | To pipet 20 mL for swarming agar plates |
| Roller Drum | New Brunswick | TC-7 | For growth of bacteria at 100 rpm |
| Scanner | Epson | Epson Perfection V370 Photo | Scanner for imaging plates |
| Scanner automation software | RoboTask Lite | v7.0.1.932 | For 30 min internals imaging |
| Scanner image acquisition software | Epson | v9.9.2.5US | Software for imaging plates |
References
- Butler, M. T., Wang, Q., Harshey, R. M. Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3776-3781 (2010).
- Lai, S., Tremblay, J., Déziel, E. Swarming motility: a multicellular behaviour conferring antimicrobial resistance. Environmental Microbiology. 11 (1), 126-136 (2009).
- Overhage, J., Bains, M., Brazas, M. D., Hancock, R. E. W. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is a complex adaptation leading to increased production of virulence factors and antibiotic resistance. Journal of Bacteriology. 190 (8), 2671-2679 (2008).
- Yeung, A. T. Y., et al. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR. Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).
- Girod, S., Zahm, J. M., Plotkowski, C., Beck, G., Puchelle, E. Role of the physiochemical properties of mucus in the protection of the respiratory epithelium. The European Respiratory Journal. 5 (4), 477-487 (1992).
- Caiazza, N. C., Shanks, R. M. Q., O'Toole, G. A. Rhamnolipids modulate swarming motility patterns of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 187 (21), 7351-7361 (2005).
- Déziel, E., Lépine, F., Milot, S., Villemur, R. rhlA is required for the production of a novel biosurfactant promoting swarming motility in Pseudomonas aeruginosa: 3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic acids (HAAs), the precursors of rhamnolipids. Microbiology. 149, Reading, England. Pt 8 2005-2013 (2003).
- Dusane, D. H., Zinjarde, S. S., Venugopalan, V. P., McLean, R. J. C., Weber, M. M., Rahman, P. K. S. M. Quorum sensing: implications on rhamnolipid biosurfactant production. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 27, 159-184 (2010).
- Köhler, T., Curty, L. K., Barja, F., van Delden, C., Pechère, J. C. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is dependent on cell-to-cell signaling and requires flagella and pili. Journal of Bacteriology. 182 (21), 5990-5996 (2000).
- Pollitt, E. J. G., Crusz, S. A., Diggle, S. P. Staphylococcus aureus forms spreading dendrites that have characteristics of active motility. Scientific Reports. 5, 17698 (2015).
- Burkart, M., Toguchi, A., Harshey, R. M. The chemotaxis system, but not chemotaxis, is essential for swarming motility in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2568-2573 (1998).
- Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
- Tremblay, J., Déziel, E. Improving the reproducibility of Pseudomonas aeruginosa swarming motility assays. Journal of Basic Microbiology. 48 (6), 509-515 (2008).
- Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338 (2015).
- Ha, D. -G., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A. Plate-based assay for swarming motility in Pseudomonas aeruginosa. Methods in Molecular Biology. 1149, Clifton, N.J. 67-72 (2014).
- Tremblay, J., Richardson, A. -P., Lépine, F., Déziel, E. Self-produced extracellular stimuli modulate the Pseudomonas aeruginosa swarming motility behaviour. Environmental Microbiology. 9 (10), 2622-2630 (2007).
- Morales-Soto, N., et al. Spatially dependent alkyl quinolone signaling responses to antibiotics in Pseudomonas aeruginosa swarms. The Journal of Biological Chemistry. 293 (24), 9544-9552 (2018).
- Bru, J. -L., et al. PQS produced by the Pseudomonas aeruginosa stress response repels swarms away from bacteriophage and antibiotics. Journal of Bacteriology. , (2019).
- van Kessel, J. C. PQS signaling for more than a quorum: the collective stress response protects healthy Pseudomonas aeruginosa populations. Journal of Bacteriology. , (2019).
- Zegans, M. E., et al. Interaction between bacteriophage DMS3 and host CRISPR region inhibits group behaviors of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 191 (1), 210-219 (2009).
- Kamatkar, N. G., Shrout, J. D. Surface hardness impairment of quorum sensing and swarming for Pseudomonas aeruginosa. PloS One. 6 (6), 20888 (2011).
- Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. Multiple Environmental Factors Influence the Importance of the Phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa Swarming. Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), (2018).
- Boyle, K. E., Monaco, H., van Ditmarsch, D., Deforet, M., Xavier, J. B. Integration of Metabolic and Quorum Sensing Signals Governing the Decision to Cooperate in a Bacterial Social Trait. PLoS computational biology. 11 (5), 10004279 (2015).
- Bernier, S. P., Ha, D. -G., Khan, W., Merritt, J. H., O'Toole, G. A. Modulation of Pseudomonas aeruginosa surface-associated group behaviors by individual amino acids through c-di-GMP signaling. Research in Microbiology. 162 (7), 680-688 (2011).
