Summary
אנו לפרט שיטה פשוטה כדי לייצר ברזולוציה גבוהה זמן לפקיעה סרטים של פסאודומונס aeruginosa נחילים כי להגיב בקטיויוג'ה (phage) ומתח אנטיביוטי באמצעות סורק מסמך מסורק. הליך זה הוא שיטה מהירה ופשוטה לניטור שורצים הדינמיקה יכול להיות מותאם ללמוד תנועתיות וצמיחה של מינים חיידקיים אחרים.
Abstract
שורצים היא צורה של תנועתיות פני השטח שנצפו במינים בקטריאליים רבים, כולל הפסאודומונס aeruginosa ואסאנכיה קולי. כאן, אוכלוסיות צפופות של חיידקים לנוע מעל מרחקים גדולים בקהילות בצורת tendril אופייני במהלך השעות. שורצים רגישים למספר גורמים, כולל לחות בינונית, לחות ותוכן תזונתי. בנוסף, תגובת הלחץ הקולקטיבי, אשר נצפתה ב P. aeruginosa , כי הם הדגיש על ידי אנטיביוטיקה או בקטביאג (phage), דוחה נחילים מתקרבים לאזור המכיל את הלחץ. השיטות המתוארות כאן כתובות כיצד לשלוט על הגורמים הקריטיים המשפיעים על שורצים. אנו מציגים שיטה פשוטה לפקח על שורצים הדינמיקה ואת תגובת הלחץ הקולקטיבי עם ברזולוציה גבוהה בזמן באמצעות סורק מסמך מסורק, ולתאר כיצד לקמפל ולבצע ניתוח כמותי של נחילים. שיטה פשוטה וחסכונית זו מספקת כימות מדויקת ומבוקרת היטב של שורצים ועשויים להיות מורחבים לסוגים אחרים של הצלחת הצמיחה המבוססת על לוח ומינים חיידקי.
Introduction
שורצים היא צורה קולקטיבית של תנועתיות בקטריאלי מתואמת המגביר עמידות לאנטיביוטיקה והפקת גורמי התקפה אלימה במחשב המארח1,2,3. התנהגות זו רב-תאיים מתרחשת על משטחים חצי מוצקים הדומים לאלה של שכבות ריריות המכסים ממברנות אפיתל בריאות4,5. ביוסוררים מיוצרים בדרך כלל על ידי אוכלוסיות שורצים כדי להתגבר על מתח פני השטח על משטחים ועל הייצור של אלה מוסדר על ידי תא התא מורכב איתות מערכות, הידוע גם כ-quorum חישה6,7,8. מינים רבים של חיידקים מסוגלים שורצים, כולל הפסאודומונס aeruginosa, סטייהולוקוקוס האוראוס, ואסאנכיה קולי9,10,11,12. דפוסי השמון שנוצרו על ידי חיידקים הם מגוונים ומושפעים התכונות הפיזיות והכימיות של שכבת פני השטח כולל הרכב מזינים, פורמים, ולחות13,14. בנוסף למאפייני פני השטח, טמפרטורת הצמיחה ולחות הסביבה משפיעים על מספר היבטים של שורצים, כולל שיעור שורצים ודפוסים12,13,14,15. משתני הצמיחה המשפיעים על שורצים ליצור אתגרים המשפיעים על התוכסות ניסיוני ואת היכולת לפרש את התוצאות. כאן, אנו מתארים שיטה סטנדרטית פשוטה כדי לפקח על הדינמיקה של נחילי בקטריאלי דרך הדמיה זמן לשגות. השיטה מתארת כיצד לשלוט בתנאי גדילה קריטיים המשפיעים באופן משמעותי על ההתקדמות של שורצים. בהשוואה לשיטות מסורתיות של ניתוח נחיל, זו שיטת הדמיה הזמן מאפשר לעקוב אחר תנועתיות של נחילים מרובים במקביל במהלך פרקי זמן ארוכים עם רזולוציה גבוהה. היבטים אלה משפרים את עומק הנתונים שניתן להשיג מהנחילים לניטור ולהקל על זיהוי גורמים המשפיעים על שורצים.
שורצים P. aerginosa הוא הקלה דרך הייצור ושחרורו של הרחמנויפידים ו-3-(3-הידרוקסילואנוק) חומצות אלקאנומית לאזור שמסביב6,16. המבוא של לחץ מתוך ריכוזי תת קטלני של אנטיביוטיקה או זיהום על ידי וירוס phage משפיע על הארגון של נחילים. במיוחד, הלחצים האלה לגרום P. aeruginosa לשחרר את מולקולה חישה 2-הפלטיל-3-הידרוxy-4-quinolone, הידוע גם בשם האות הפסאודומונס quinolone (pqs)17,18. בתוך הנחיל אומר כי מכילים שתי אוכלוסיות של נחילים, PQS המיוצר על ידי האוכלוסייה הנגרמת לחץ דוחה נחילים מטופל מלהיכנס לאזור המכיל את הלחץ (איור 1). תגובת הדחק הקולקטיבית מהווה מערכת מסוכנת לתקשורת איתות המזהירה את P. aeruginosa על איומים סמוכים18,19. השפעת הלחץ על P. aeruginosa, הפעלת תגובת הלחץ הקולקטיבי, ואת הדחייה של נחילים ניתן לדמיין באמצעות שיטת הדמיה בזמן שתוארה כאן. הפרוטוקול המתואר כאן מסביר כיצד: (1) להכין צלחות אגר עבור שורצים, (2) תרבות P. aeruginosa עבור שני סוגים של בחני (שורצים מסורתיים או תגובת הלחץ קולקטיבית התגובה) (איור 1), (3) לרכוש תמונות זמן, ו (4) להשתמש imagej לקמפל ולנתח את התמונות
בקצרה, P. aerginosa מן התרבות לילה הוא הבחין באמצע הלוח שורצים בזמן P. aeruginosa כי הם נגועים phage או מטופלים עם אנטיביוטיקה מאותרת בעמדות לווין. ההתקדמות של P. aeruginosa שורצים מנוטרים על מסמך הצרכן סורק שנמצא ממוקם בתוך לחות מוסדר 37 ° c אינקובטור. הסורק נשלט על ידי תוכנה שסורקת באופן אוטומטי את הצלחות במרווחי זמן קבועים על תקופת הצמיחה נחיל, בדרך כלל 16 – 20 h. שיטה זו מפיקה במקביל סרטוני וידאו של עד 6 10 ס"מ לוחות שורצים. התמונות מצולמות בסרטים והדחייה של הנחילים על ידי אוכלוסיות מוחלשות מקוונזת באמצעות תוכנת ImageJ זמינה באופן חופשי. שיקול מיוחד ניתן כדי להבטיח עקביות והתמדה בין ניסויים שורצים שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת לוחות שורצים במשך P. aeruginosa שורצים זמן הדמיה
- להכין 1 L של 5x M8 מינימום מדיה בבקבוק זכוכית על ידי הוספת 64 g של Na2hpo4• 7h2O, 15 גרם של KH2פו4, ו 2.5 g של הנאל ב 500 mL כפול מים מזוקקים (ddh2O). כוונן את אמצעי האחסון הסופי ל-1 ל' עם תוספת ddH2O. אוטוקלב כדי לעקר ולאחסן מדיה נוזלית בטמפרטורת החדר.
- הכינו 100 mL של 1 M MgSO4 (מגנזיום גופרתי) בבקבוק זכוכית על ידי הוספת 24.6 g של mgso4• 7h2o ב 50 ml Ddh2o. להתאים את הנפח הסופי 100 Ml עם תוספת ddh2o. אוטוקלב לחטא. . חנות בטמפרטורת החדר
- הכינו 100 mL של 20% חומצות קאמינית בבקבוק זכוכית על ידי הוספת 20 גרם של חומצות קאמינית ב 50 mL ddH2o. כוונן את הנפח הסופי ל 100 mL עם תוספת ddh2o. אוטוקלב לחטא. . חנות בטמפרטורת החדר
- להכין 100 mL של 20% גלוקוז בבקבוק זכוכית על ידי הוספת 20 גרם של גלוקוז ב 50 ml ddh2o. להתאים את הנפח הסופי ל 100 ml עם תוספת ddh2o. לעקר על ידי סינון עם מסנן 0.22 יקרומטר. . חנות בטמפרטורת החדר
- כדי להפוך 10 לוחות שורצים, להוסיף 1 גרם של אגר ב 100 mL של ddH2o ולהתאים את הנפח הסופי ל 160 ml עם תוספת ddh2o ב a 250 mL erlenmeyer בקבוקון. . לחטא על ידי אוטוקלינג
- מיד לאחר האוטוקלינג, מניחים את הפתרון אגר באמבט מים 55 ° c עבור 15 דקות.
- להסיר את הפתרון אגר מאמבט מים ולהוסיף 40 mL של מדיה 5x M8 מינימלי, 200 μL של 1 M MgSO4, 2 מ ל של 20% גלוקוז, ו 5 מ ל של 20% חומצות קאמידיות15. המשך לשלב 1.6 מיד לאחר ערבוב.
הערה: הריכוזים הסופיים הם 0.5% אגר, 1 מ"מ MgSO4, 0.2% גלוקוז, ו 0.5% חומצות אמינו.
- שימוש בפיפטה 25 מ ל לנפח אחיד, להוסיף 20 מ ל של הפתרון שורצים באגר 10 ס"מ צלחת פטרי.
הערה: נפח קבוע של פתרון אגר חשוב, כמו אמצעי האחסון משפיע על זמן ייבוש תוכן הלחות של אגר. להימנע בועות בעת ביצוע צלחות שורצים אגר. - לאפשר אגר לגבש ידי הצבת צלחות שורצים בערימה אחת עם מכסים על 1 h על הספסל בטמפרטורת החדר. הפעל את מכשיר האדים כדי להקטין את הלחות היחסית של החדר ל-40-50% 1 h לפני השלב הבא.
- נגב את הצלחות שורצים במשך 30 דקות נוספות עם העפעפיים בתוך כיפה זרם למינארי ב 300 ft3/min עם 40-50% לחות יחסית בטמפרטורת החדר. מייבשים את פנים העפעפיים על-ידי הצבת הפנים למעלה במכסה הזרימה הבינארי. חנות לוחיות שורצים ב -4 ° c עד 24 שעות.
- הכינו שחור 10 ס מ עפעפיים צלחת פטרי להדמיה על ידי החלקת החלק הפנימי של המכסה עם נייר זכוכית. הניחו את העפעפיים בתוך קופסת האריזה והניחו את תיבת האריזה תחת כיסוי כימי. רסס בתוך העפעפיים באמצעות ספריי צבע שחור. . הניחו לעפעפיים להתייבש
הערה: ניתן להשתמש מחדש בעפעפיים שחורים לניסויים נוספים. חשוב שעפעפיו נצבעים כך שלא ישקפו אור במהלך הסריקה.
2. צמיחה של P. aerginosa ותנאי ציפוי
- הכינו 400 מ ל של ציר ליבסואז (LB) על ידי הוספת 10 גרם של מיקס אבקת LB-מילר לתוך 400 mL ddH2O. עבור 2% LB-אגר מנות פטרי, להוסיף 8 גרם נוסף של אגר. אוטוקלב לחטא.
- יוצקים 20 מ ל מדיום LB-אגר מותכת לתוך 10 ס מ בקוטר מנות פטרי ולאפשר להם לגבש בטמפרטורת החדר לילה. אחסן מדיה נוזלית בטמפרטורת החדר וצלחות אגר ב -4 ° c.
- רצף P. aeruginosa על צלחת ליברות-אגר פטרי ממניה קפואה מאוחסן ב-80 ° c באמצעות לולאות סטרילי או מקלות עץ. הפוך את צלחת פטרי הפוכה ללילה ב 37 ° c. חנות ליברות-אגר הצלחת ב 4 ° צ' עד שבוע אחד.
- בחר מושבה אחת מצלחת פטרי עם לולאה סטרילית או מקל עץ, האיחסן אותו לתוך 2 מ"ל ליברות בינונית, ו דגירה את התרבות לרוויה בן לילה (16 – 18 h) ב 37 ° c בתוף רולר להגדיר ב 100 rpm.
- Pipet 5 μL של תרבות לילה משלב 2.4 באמצעות P20 pipet ובמקום במרכז צלחת אגר שורצים על ידי מתקרב טיפ pipet בזווית (10-45 °) 2.5 ס מ מעל אזור האיתור, ליטוף למטה אל התחנה הראשונה, ולגעת אגר עם רק טיפה נוזל (איור 1B).
- להימנע מלגעת אגר עם טיפ pipet כפי שהוא פוגע אגר. השתמש בתבנית כדי למקם את הספוט בעקביות בלוחות שונים של שורצים (איור משלים S1).
- עבור שורצים מסורתיים, השתמש רק במקום המרכזי ולדלג לשלב 2.8. עבור תגובת הלחץ הקולקטיבי אומר להמשיך שלב 2.6 (עבור זיהום phage) או צעד 2.7 (עבור לחץ אנטיביוטי).
- עבור זיהום phage, מערבבים 30 μL של תרבות לילה של P. aeruginosa משלב 2.4 עם 6 μl של 1 x 1012 pfu/mL phage DMS3vir20. . המשך מיד לשלב הבא
- Pipet 6 μL של P. aeruginosa-phage התערובת משלב 2.6 באמצעות P20 pipet וספוט ב 6 עמדות לווין מרחוק ברדיוס 2.8 ס מ מעגל קונצנטריים זה ממורכז בצלחת פטרי על ידי מתקרב את הטיפ pipet בזווית (10 כדי 45 °) 2.5 ס מ מעל אזור האיתור, מלטף עד התחנה הראשונה, ונוגע באגר רק עם טיפת נוזל (איור 1ג).
- להימנע מלגעת אגר עם טיפ pipet כפי שהוא פוגע אגר. השתמש בתבנית ציפוי לצורך עקביות (איור משלים S1). . המשך לשלב 2.8
- עבור טיפולים אנטיביוטיים, מערבבים 30 μL תרבות לילה P. aeruginosa משלב 2.4 עם 6 μl של 3 מ"ג/ml בג, 10 μl של 100 Mg/ml, או 7.5 μl של 100 Mg/ml fosfomycin. . המשך מיד לשלב הבא
- Pipet 6 μL של אנטיביוטיקה שטופלו P. aeruginosa משלב 2.7 באמצעות מP20 ובמקום 6 עמדות לווין ברדיוס 2.8 ס מ במעגל מעגלי על מרכז המנה על ידי מתקרב את הטיפ pipet בזווית (10 כדי 45 °) 2.5 ס מ מעל אזור האיתור, מלטף עד התחנה הראשונה, ונוגע באגר רק עם טיפת נוזל (איור 1ד).
- להימנע מלגעת אגר עם טיפ pipet כפי שהוא פוגע אגר. השתמש בתבנית ציפוי לצורך עקביות (איור משלים S1). . המשך לשלב 2.8
- החליפו את עפעפיו הצלולים בעפעפיים שחורים שנעשו בשלב 1.9 (איור 2א).
- מניחים את לוחיות המים על הסורק בחממה שנקבעה ב 37 ° c עם אמבטיה של 10 מטרים כדי לשמור על לחות ב 75% (איור 1E, איור 2ב).
התראה: לא להפריע בתאי הבחין על צלחות שורצים באגר. . לשמור על הצלחות מופנות כל הזמן
3. רכישת תמונה באמצעות סורק
- הפחת את תאורת הסביבה של מנות פטרי על-ידי הצמדת בד מאט שחור לארון תקשורת 40-60 ס מ מעל סורק המסמך. אבטח אותו באמצעות מיקוד (איור 2ב').
- הסורק יהיה נשלט באמצעות תוכנת סריקה ותוכנת scripting אוטומטית.
- בתוכנת הסריקה, בחר את מצב הבית (איור 3א). לכידת תמונות בצבע על-ידי בחירת צבע תחת סוג תמונה. כדי להגדיר את איכות התמונה, בחר באפשרות אחרת תחת יעד והתאם את הרזולוציה ל-300 dpi. שמור את גודל התקן עבור התמונות על-ידי בחירה במקור עבור גודל היעד. השאר את כל האפשרויות תחת התאמות תמונה לא מסומנת עבור איכות תמונה סטנדרטית.
הערה: גודל היעד מוגדר כמקורי כברירת מחדל. כדי לבחור אפשרויות אחרות עבור ' גודל יעד ', לחץ על התצוגה המקדימה הראשונה.
- בתוכנת הסריקה, בחר את מצב הבית (איור 3א). לכידת תמונות בצבע על-ידי בחירת צבע תחת סוג תמונה. כדי להגדיר את איכות התמונה, בחר באפשרות אחרת תחת יעד והתאם את הרזולוציה ל-300 dpi. שמור את גודל התקן עבור התמונות על-ידי בחירה במקור עבור גודל היעד. השאר את כל האפשרויות תחת התאמות תמונה לא מסומנת עבור איכות תמונה סטנדרטית.
- הגדר את נתיב השמירה של תמונות על-ידי לחיצה על סמל התיקייה מימין לסריקה כדי לפתוח את ' הגדרות שמירת קובץ ' (איור 3A).
- בחר את יעד התיקיה לשמירת תמונות על-ידי בחירה באפשרות אחרת תחת מיקום ולחץ על עיון. בחרו תיקייה לשמירת התמונות.
- נקוב בשמות התמונות בתיבת המלל ' קידומת '. הגדר את התחל מספר 001 כדי להתחיל רצף שמות עבור התמונות. הגדר את תבנית הקובץ ל-JPEG על-ידי בחירה ב-JPEG (*. jpg) עבור סוג תחת תבנית תמונה ולחץ על אפשרויות כדי להתאים לפרטים. הגדר את איכות תבנית התמונה על-ידי התאמת רמת הדחיסה ל-16, קידוד ל-Standard ובדוק את פרופיל ICC. לחץ על אישור כדי לסגור את החלון (איור 3ב).
- השאר את האפשרות הראשונה שאינה מסומנת ("החלף קבצים באותו שם") ובדוק את 3 האפשרויות הבאות ("הצג תיבת דו-שיח זו לפני הסריקה הבאה", "פתיחת תיקיית תמונה לאחר הסריקה", ו-"הצג את תיבת הדו הוספת דף לאחר הסריקה"). לחץ על אישור כדי לסגור את החלון
- בדוק את איכות התמונה על-ידי לחיצה על תצוגה מקדימה. חלון התצוגה המקדימה מופיע וסמל הסריקה הופך לפונקציונלי (איור 3ג).
- השתמש בתוכנת ה-scripting כדי להפוך את רכישת התמונה לאוטומטית. הסקריפט שסופק לוחץ על סריקה בחלון סריקה ובסדר בחלון הגדרות שמירת הקבצים במרווחי זמן של 30 דקות.
- יבא את קובץ ה-script על-ידי לחיצה על פעילות | יבא ובחר הן את Single_scan. צק וIdle_scanning. צק (קבצים שסופקו כקבצים משלימים 1 ו-2). ראה איור 3ד.
הערה: Single_scan. צק לוחץ על לחצן הסריקה בחלון הסריקה ואישור בחלון הגדרות שמירת הקובץ. . Idle_scanning מפעיל Single_scan כל 30 דקות אפשר לשנות את תדר הסריקה על ידי שינוי ההפעלה של Idle_scanning. צק - אפשר סריקה אוטומטית במרווחי זמן של 30 דקות על-ידי בחירה הן בסריקת סרק (מיובאות) והן בסריקה אחת (מיובאות), לחיצה ימנית על סריקת סרק (מיובאת), ולחיצה שמאלית על זמינה (איור 3ד, איור משלים S2).
הערה: סריקה אוטומטית מופעלת עד שהמשתמש מפסיק ידנית את קובץ ה-script. כדי לעצור את קובץ ה-script, בחר בסריקת סרק (מיובאת), לחץ לחיצה ימנית על סריקת סרק (מיובא)ולחץ על הלחצן השמאלי זמין. סימן הביקורת יוסר.
- יבא את קובץ ה-script על-ידי לחיצה על פעילות | יבא ובחר הן את Single_scan. צק וIdle_scanning. צק (קבצים שסופקו כקבצים משלימים 1 ו-2). ראה איור 3ד.
4. הידור זמן-תמונות לשגות ומדידת הדחייה נחיל
- בצע עריכת סרטים וניתוח תמונות באמצעות ImageJ.
- יבא את כל התמונות הסרוקות ל-ImageJ על-ידי לחיצה על קובץ | יבא | רצף תמונות ובחר את התמונות. בחלון אפשרויות רצף , בדוק את ההמרה ל-RGB כדי לשמור את התמונות בצבע. ספר התמונות מציין את מספר התמונות שנבחרו.
- שמור על התמונה ב-1 כדי להתחיל מהתמונה הראשונה בתיקיה ושנה את גודל התמונות ב-100% כדי לשמר את הגודל המקורי של התמונות. השאר את השימוש במחסנית וירטואלית לא מסומנת. לחץ על אישור והמתן לטעינת תמונות (איור 4א).
- להגדיר את רמת דחיסת הווידאו כדי 100 על ידי לחיצה על עריכה | אפשרויות מסוימות | קלט/פלט. .. ולהתאים את איכות JPEG ל 100.
- שמור את הקובץ כ. avi על ידי לחיצה על הקובץ | שמירה בשם | אבי. התאם דחיסה ל-JPEG ולקצב מסגרות ל-5 fps (איור 4ב). שמור את שעון ה-. avi בתיקייה הרצויה.
- כדי לכמת מרחקים דחייה, פתח תמונה לקראת סוף התקופה השורצים ב-ImageJ. לחץ על הקובץ | פתח ובחר את התמונה. להתאים את הסולם על ידי לחיצה על לנתח | קביעת קנה מידה והגדרת מרחק בפיקסלים ל-118, מרחק ידוע ל-1, יחס רוחב-גובה של פיקסל ל-1.0, ויחידת אורך ל-cm (איור 4ג). השאר את הכלל לא מסומן. לחץ על אישור כדי לסגור את החלון.
- לחץ על הסמל ישר ולמדוד ממרכז המושבה בעמדת לווין לקצה של האוכלוסייה שורצים. בחר באפשרות ' נתח ' | מידה כדי להפוך חלון חדש להופיע עם המידות (אורך) (איור 4D).
הערה: השתמש ב-"+" כדי להגדיל את התצוגה הקרובה ו-"-" כדי להתרחק.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השלבים לצמוח P. aeruginosa, להדגיש את התאים, ואת התמונה לוחות שורצים מיוצגים באיור 1. חיסלנו מושבה אחת של מסוג פראי P. aeruginosa ucbpp-PA14 המתח מצלחת lb-אגר ב 2 מ ל המרק lb לילה ב 37 ° c ו הבחין 5 μl במרכז הצלחת שורצים. הדמיה של הצלחת הזמן מגלה את הצמיחה הראשונית בצורה של מושבה במרכז ולאחר מכן מתפשטת של קנוקנות רדיאלי מן המושבה (וידאו 1). עבור תגובת הלחץ הקולקטיבי אומר, בנוסף לאיתור P. aeruginosa במרכז, 30 μl של תרבות לילה זהה מעורבב עם 6 μl של 1 x 1012 Pfu/Ml DMS3vir או 6 μl של 3 מ"ג/ml ג ' ו/מ"ל ביחס של 5:1 ו-6 μl מזוהה בעמדות הלווין. נחילים לנוע ממרכז לוחות שורצים לפריפריה והוא דחה על ידי אות הלחץ הנפלט על ידי החיידק כי היו נגועים phages (וידאו 2, למעלה לוחית שמאל) או מטופלים עם גנאמיצין (וידאו 2, הלוח הימני העליון). Phages (וידאו 2, לוחית השמאלית התחתונה) או הגנאמיצין (וידאו 2, הלוח הימני התחתון) הבחין לבד בעמדות לווין לא לגרום לאוכלוסיות שורצים להימנע אזורים אלה.
איור 1: סכימטי של P. aeruginosa שורצים ותגובת הלחץ הקולקטיבי. (א) התאים מגודלים לילה (16 – 18 h עד OD600 של כ 1.5) בציר LB ב 37 ° צ' ו (ב) הבחין באמצע לוחית של שורצים אגר. בתרבויות לילה מעורבבים עם (ג) phages או (ד) אנטיביוטיקה והבחין בעמדות לווין לתגובה קולקטיבית מצוקה. (ה) עד 6 צלחות מועלות על סורק בגודל 30 דקות במשך 16 – 18 h ב 37 ° c. לאחר 18 h, P. aeruginosa אוכלוסיות שורצים להימנע (F) תאים נגועים Phage או (G) תאים המטופלת עם אנטיביוטיקה (ג' ולאייאמיסינ). (ח) פ. אירויוגיסק מנחיל את לוחית השורצים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הגדרת הסורק בתוך החממה. (א) מכסיםשחורים בצלחת פטרי שנבנו בסעיף 1. עפעפיים אלה משמשים במהלך סריקה להפחתת השתקפויות אור ולהחליף מכסים ברורים של צלחת פטרי. (ב) סורק מסמך הסורק ממוקם בחממה שנקבעה ב-37 ° c. שישה צלחות עם עפעפיים שחורים ממוקמות על הסורק (תמונה שמאלית). בד המאט השחור מוצמד לארון התקשורת 60 ס מ מעל הסורק כדי להקטין עוד יותר את ההשתקפויות ואת האור התועה (התמונה הימנית). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: רכישת תמונה אוטומטית מסורק המסמכים המסורק באמצעות תוכנת הסריקה והסקריפט האוטומטי. (A) צילום מסך של חלון הסריקה הראשית. בחירת סוג תמונה (צבע) ורזולוציה (300 dpi). הריבוע האדום מציין את סמל התיקייה לפתיחת חלון ' הגדרות שמירת קובץ '. שים לב ללחצן התצוגה המקדימה ניתן ללחוץ אך הלחצן סריקה אינו זמין. (ב) צילום מסך של חלון הגדרות שמירת קובץ כדי להגדיר יעד התיקייה לשמירת תמונות, מתן שם לתמונות, ובחירת הפורמט של התמונות (משמאל). חלון הגדרות התוסף משמש להגדרת איכות תבנית התמונה (מימין). (ג) צילום מסך של חלון סריקה לאחר לחיצה על תצוגה מקדימה. לחצן הסריקה לחיץ לאחר הרכישה של תצוגה מקדימה. התוכנית יכולה כעת להיות אוטומטית באמצעות תוכנת ה-scripting (חומרים). (ד) צילום מסך של חלונות תוכנת ה-scripting המציין את לחצן ייבוא המשמש לייבוא סקריפטים אוטומציה (משמאל). ברגע Single_scan... וIdle_scanning מיובאים, אלה מופיעים כמשימות בחלון הראשי (מימין). לאחר בחירת שתי הפעילויות והלחיצה הימנית, הלחצן Enabled מופיע. לחיצה שמאלית אפשר להפעיל את קבצי ה-script כדי לסרוק באופן אוטומטי במרווחי זמן של 30 דקות (מימין). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ניתוח תמונה של הימנעות שורצים באמצעות ImageJ. (א) צעדים לייבוא רצף תמונות מתמונות הסורק בזמן הקפיצה. לחיצה על הקובץ | יבא | רצף תמונות בחלון ImageJ הראשי (משמאל) מעלה את חלון אפשרויות הרצף (מימין) ופותח את כל התמונות הסרוקות. הריבוע האדום מציין את האפשרות שנבדקה לטעינת תמונות בתבנית RGB. כל שאר האפשרויות משמאל כברירת מחדל. (ב) צעדים לשמירת וידאו הפקיעה בזמן בפורמט AVI. בחירת קובץ | שמירה בשם | AVI מעלה את חלון ' שמור כ-AVI '. דחיסה מוגדרת ל-JPEG ולקצב מסגרות ל-5 fps. (ג) הגדרת יחידות קנה המידה עבור תמונות. בחירה באפשרות ' נתח ' | קביעת קנה מידה הגדל את החלון ' קבע קנה מידה '. עבור תמונות 300 dpi, קנה המידה המתאים הוא 118 פיקסלים/cm. (D) מדידת הימנעות מאוכלוסיות שורצים. קו צהוב מצויר ממרכז המושבות ההדגיש עד לקצה הטדרילס. בחירה באפשרות ' נתח ' | מדידה מדווחת על אורך השורה בחלון חדש המסומן ' תוצאות '. Ctrl + M הוא קיצור מקשים המבצע את המדידה מבלי לבחור את פריטי התפריט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: נחילי הנציגים של פ. אירויוסק. פ. aeruginosa שורצים אוכלוסיות על לוחות שורצים באגר כי הם (א) יבש, (ב) רגיל, (ג) לח, ו (ד) נוסף לח. לוחות שורצים יבשים מעכבים את שיעור הנחיל של P. aeruginosa ומפחיתים את מספר הטדרילס. לחות לוחות שורצים לחים לגרום היווצרות tendrils גדול. תחת תנאים לחים במיוחד, הטופס קנוקנות באופן שווה לאורך לוחיות שורצים באגר. זמני ייבוש במכסה זרם למינארי ולחות הסביבה יש השפעות משמעותיות על תוכן לחות שורצים לוחית. המנות מוגשות בגובה 10 ס מ של מנות פטרי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
וידאו 1: סרט בזמן פקיעה של שורצים. בר מסוג P. aeruginosa נצפו במרכז לוחית שורצים והוא התמונה על הסורק במהלך 22 שעות. לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).
וידאו 2: סרט הזמן פקיעה של תגובת הלחץ הקולקטיבי. . הבחינו P. aeruginosa במרכז לוחית השורצים עמדות לווין זוהו עם P. aeruginosa כי הם מעורבים בנוסף עם (השמאלית העליונה) phage או (הימנית העליונה) בג, או הבחין אך ורק עם (השמאלית התחתונה) phage או (הימנית התחתונה) בג. נקודות לבנות מציינות. את מרכז הנקודות לוחיות הרישוי הגיעו לאורך המסלול במשך 16 שעות. לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).
איור משלים S1: תבנית ציפוי לאיתור תאים מסוימים. P. aeruginosa הנקודה השחורה האמצעית מייצגת את אזור האיתור של התרבות היחידה של 5 μl. הרדיוס של המעגל הפנימי הוא 2.8 ס מ ממרכז הצלחת. הצומת בין המעגל הפנימי לבין קווים ישרים על פני המעגל החיצוני מציין את אזור האיתור של 6 μL של P. aeruginosaהדגיש, phage הנגועים או אנטיביוטיקה תאים שטופלו. המעגל החיצוני מייצג את ההיקף של 10 ס מ צלחת פטרי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים S2: פקודות מאקרו להתחיל לסרוק באופן תקופתי באמצעות תוכנת scripting. (א) פקודות המאקרו בSingle_scan. הזזת הסמן לסריקה בחלון סריקה, לחיצה על סריקה, עוברת לאישור בחלון הגדרות שמירת קבצים ולוחץ על אישור. (ב) פקודות לסריקה במרווחי זמן של 30 דקות. המשימה Idle_scanning. אני מתחיל Single_scan והוא מוגדר להפעלה בתוך 30 דקות מרווחי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מתמקד בצמצום השונות בלוחות שורצים באגר ומספק שיטה פשוטה ובעלות נמוכה לרכישת תמונות בזמן של P. aeruginosa שורצים ומגיבים ללחץ. הליך זה ניתן להרחיב את התמונה מערכות בקטריאלי אחרות על ידי התאמת הרכב התקשורת ותנאי גדילה. עבור P. aeruginosa, למרות M9 או בינוני מינימלי FAB יכול לשמש כדי לגרום שורצים16,21, הפרוטוקול המוצג כאן משתמש M8 medium עם חומצות קמינו, גלוקוז, ו מגנזיום סולפט6. P. aeruginosa שורצים רגיש לקומפוזיציה בינונית כגון זמינות ברזל ומקורות מזינים כולל חומצות אמינו22,23,24. לכן, הבחירה של התקשורת לוחות שורצים באגר ממחיש היבט חשוב של האמירה שורצים.
שליטה על הלחות והטמפרטורה באזור מעבדה פתוחה מייצג את אחד האתגרים הגדולים ביותר עבור עקביות של נחיל. שינויים עונתיים תורמים לשונות של לחות לוחות שורצים, אשר יכול להשפיע באופן משמעותי דפוסי שורצים. לכן, השליטה המתמדת על הלחות היחסית נדרשת כדי להבטיח איכות אופטימלית לצלחת. הפעלת מכשיר האדים 1 h לפני ייבוש לוחות שורצים מתחת למכסה המנוע הלמינארי ישלוט על הלחות היחסית לקבוע 45%, שמירה על ייבוש זמן 30 דקות. אם לא ניתן לשלוט בלחות מקיף, הגדלת זמן הייבוש היא פתרון פשוט ופוטנציאלי לפיצוי על סביבות לחות. במהלך שורצים, לחות יחסית צריך להישאר ב 70% בחממה 37 ° c כדי למנוע את לוחיות אגר מתייבש. תא מים בחממה יכול לשמש כמאגר מים. יבש לוחות שורצים להאט את ההתקדמות של אוכלוסיות שורצים ולהקטין את מספר קנוקנות בעוד צלחות לח לגרום מבנה טאנקנת רחב (איור 5A – C). לוחות לחות שורצים במיוחד למנוע היווצרות קנוקנת ברור ולגרום קנוקנות להתפשט דפוס אחיד (איור 5d). ניתן להשתמש בשיטה המתוארת כאן כדי לשמור על סביבה מתמדת של לח שתבטיח עקביות של שורצים לוחות (איור 5B, וידאו 1). בנוסף, גודל צלחת ועובי אגר לשחק תפקיד בשמירת לחות בצלחת. השתמשנו בקוטר 10 ס מ מנות פטרי והוספנו 20 מ ל של פתרון שורצים באגר לכל צלחת כדי להבטיח עקביות. לא מומלץ למזוג צלחות ללא מדידת אמצעי אחסון. בשל המשתנים הרבים המשפיעים על השאיפה הגדולה, אנו ממליצים למטב את התמדה בתנאי מעבדה מקומיים ולהדגיש את החשיבות של ביצוע מספר משכפל ביולוגי על גבי חבילות נפרדות של לוחות כדי להתבונן בדפוסי שורצים עקביים ודומים.
היתרון של שיטת ההדמיה הזמן להקליט שורצים היא היכולת להתבונן בהתקדמות התנועתיות ללא צורך להפריע לנחילים. השיטה שלנו יוצרת בנוחות זמן כשלים של 6 צלחות במקביל באותם תנאים, המספקת גם סביבה מבוקרת עבור הערכה בו של זנים מרובים, מספר רב של מצבים ניסיוניים, או משכפל ביולוגי. השימוש בשישה עמדות לווין על כל צלחת בנוסף מקל על ניתוח סטטיסטי והשימוש ב-ImageJ מאפשר כימות של דחייה שורצים.
ההליך המתואר כאן הוא שיטה פשוטה לחקר האינטראקציה בין אוכלוסיות תת של P. aeruginosa: אוכלוסיית שורצים בריאים ותאים הדגיש. מעבר DMS3vir והגנאמיצין, סוגים נוספים של phages, אנטיביוטיקה, חיידקים מתחרים או פטריות ניתן להשתמש כדי ללמוד איתות מתח. למרות ששיטה זו מתמקדת ב -P. aeruginosa שורצים, זנים חיידקיים אחרים כגון S. האוראואוס ו -E. coli גם מציגים דפוסי שורצים, אבל הם דורשים מדיה המותאמים כדי נחיל10,11. על ידי אופטימיזציה של קומפוזיציות מדיה ומצבי הצלחת, שיטה זו יכולה להיות מיושמת כדי לנתח שורצים, אינטראקציות שורצים בין זנים חיידקיים, ותגובות הלחץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
י.-ל ג'ונסון, א. י., ו. מ. ק. ה. כתב ושינו את כתב היד. כל המחברים תכננו את הניסויים. ג.-ל ג'ונסון ביצעו את הניסויים והניתוח. עבודה זו נתמכת על ידי K22AI112816 בפרס NIH ו-R21AI139968 מענק ל-ס. י. ובאוניברסיטת קליפורניה. נ. מ. ח-ק בתמיכת מלגות לונלבק R220-2016-860 וR251-2017-1070. לתורמים לא היה כל תפקיד בהחלטה להגיש את העבודה לפרסום. . אין לנו אינטרסים מתחרים להכריז
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Bacto agar, dehydrated | BD Difco | 214010 | For LB-agar plate and swarming agar plate |
| Casamino acids | BD Difco | 223050 | For swarming media |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16500 | Dextrose. For swarming media |
| Fosfomycin disodium salt | Tokyo Chemical Industry | F0889 | Stock concentration: 200 mg/mL. Dissolved in ddH2O |
| Gentamycin sulfate | Sigma-Aldrich | G1914 | Stock concentration: 3 mg/mL. Dissolved in ddH2O |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | Stock concentration: 100 mg/mL. Dissolved in ddH2O |
| LB-Miller | BD Difco | 244620 | For LB broth and LB-agar plates |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | For swarming media |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | For 5x M8 media |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | For 5x M8 media |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Chemical | S373 | For 5x M8 media |
| Strains | |||
| Pseudomonas aeruginosa | Siryaporn lab | AFS27E.118 | PA14 strain |
| DMS3vir | O'Toole lab | DMS3vir20 | Bacteriophage |
| Supplies | |||
| Aluminium oxide sandpaper | 3M | 150 Fine | For black lids |
| Black fabric | Joann | PRD7089 | Black fabric |
| Black spray paint | Krylon | 5592 Matte Black | For black lids |
| Erlenmeyer flask | Kimax | 26500 | 250 mL |
| Glass storage bottles | Pyrex | 13951L | 250 mL, 500 mL, 1,000 mL |
| 8 inches zip ties | Gardner Bender | E173770 | For attaching black matte fabric |
| Petri dishes (100 mm x 15 mm) | Fisher | FB0875712 | 100 mm x 15 mm polystyrene plates |
| Wooden sticks | Fisher | 23-400-102 | For streaking and inoculating bacteria |
| Equipment | |||
| Autoclave | Market Forge Industries | STM-E | For sterilizing reagents |
| 25 mL pipette | USA Scientific, Inc. | 1072-5410 | To pipet 20 mL for swarming agar plates |
| Dehumidifier | Frigidaire | FAD704DWD 70-pint | For maintaing room relative humidity at about 45% |
| ImageJ | NIH | v1.52a | Software for image analysis |
| Incubator | VWR | 89032-092 | For growth of bacteria at 37 °C |
| Isotemp waterbath | Fisher | 15-462-21Q | For cooling media to 55 °C |
| Laminar flow hood | The Baker Company | SG603A | For drying plates |
| P-20 pipet | Gilson | F123601 | Spotting on swarming agar plates |
| Pipette Controller | BrandTech | accu-jet | To pipet 20 mL for swarming agar plates |
| Roller Drum | New Brunswick | TC-7 | For growth of bacteria at 100 rpm |
| Scanner | Epson | Epson Perfection V370 Photo | Scanner for imaging plates |
| Scanner automation software | RoboTask Lite | v7.0.1.932 | For 30 min internals imaging |
| Scanner image acquisition software | Epson | v9.9.2.5US | Software for imaging plates |
References
- Butler, M. T., Wang, Q., Harshey, R. M. Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3776-3781 (2010).
- Lai, S., Tremblay, J., Déziel, E. Swarming motility: a multicellular behaviour conferring antimicrobial resistance. Environmental Microbiology. 11 (1), 126-136 (2009).
- Overhage, J., Bains, M., Brazas, M. D., Hancock, R. E. W. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is a complex adaptation leading to increased production of virulence factors and antibiotic resistance. Journal of Bacteriology. 190 (8), 2671-2679 (2008).
- Yeung, A. T. Y., et al. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR. Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).
- Girod, S., Zahm, J. M., Plotkowski, C., Beck, G., Puchelle, E. Role of the physiochemical properties of mucus in the protection of the respiratory epithelium. The European Respiratory Journal. 5 (4), 477-487 (1992).
- Caiazza, N. C., Shanks, R. M. Q., O'Toole, G. A. Rhamnolipids modulate swarming motility patterns of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 187 (21), 7351-7361 (2005).
- Déziel, E., Lépine, F., Milot, S., Villemur, R. rhlA is required for the production of a novel biosurfactant promoting swarming motility in Pseudomonas aeruginosa: 3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic acids (HAAs), the precursors of rhamnolipids. Microbiology. 149, Reading, England. Pt 8 2005-2013 (2003).
- Dusane, D. H., Zinjarde, S. S., Venugopalan, V. P., McLean, R. J. C., Weber, M. M., Rahman, P. K. S. M. Quorum sensing: implications on rhamnolipid biosurfactant production. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 27, 159-184 (2010).
- Köhler, T., Curty, L. K., Barja, F., van Delden, C., Pechère, J. C. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is dependent on cell-to-cell signaling and requires flagella and pili. Journal of Bacteriology. 182 (21), 5990-5996 (2000).
- Pollitt, E. J. G., Crusz, S. A., Diggle, S. P. Staphylococcus aureus forms spreading dendrites that have characteristics of active motility. Scientific Reports. 5, 17698 (2015).
- Burkart, M., Toguchi, A., Harshey, R. M. The chemotaxis system, but not chemotaxis, is essential for swarming motility in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2568-2573 (1998).
- Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
- Tremblay, J., Déziel, E. Improving the reproducibility of Pseudomonas aeruginosa swarming motility assays. Journal of Basic Microbiology. 48 (6), 509-515 (2008).
- Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338 (2015).
- Ha, D. -G., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A. Plate-based assay for swarming motility in Pseudomonas aeruginosa. Methods in Molecular Biology. 1149, Clifton, N.J. 67-72 (2014).
- Tremblay, J., Richardson, A. -P., Lépine, F., Déziel, E. Self-produced extracellular stimuli modulate the Pseudomonas aeruginosa swarming motility behaviour. Environmental Microbiology. 9 (10), 2622-2630 (2007).
- Morales-Soto, N., et al. Spatially dependent alkyl quinolone signaling responses to antibiotics in Pseudomonas aeruginosa swarms. The Journal of Biological Chemistry. 293 (24), 9544-9552 (2018).
- Bru, J. -L., et al. PQS produced by the Pseudomonas aeruginosa stress response repels swarms away from bacteriophage and antibiotics. Journal of Bacteriology. , (2019).
- van Kessel, J. C. PQS signaling for more than a quorum: the collective stress response protects healthy Pseudomonas aeruginosa populations. Journal of Bacteriology. , (2019).
- Zegans, M. E., et al. Interaction between bacteriophage DMS3 and host CRISPR region inhibits group behaviors of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 191 (1), 210-219 (2009).
- Kamatkar, N. G., Shrout, J. D. Surface hardness impairment of quorum sensing and swarming for Pseudomonas aeruginosa. PloS One. 6 (6), 20888 (2011).
- Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. Multiple Environmental Factors Influence the Importance of the Phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa Swarming. Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), (2018).
- Boyle, K. E., Monaco, H., van Ditmarsch, D., Deforet, M., Xavier, J. B. Integration of Metabolic and Quorum Sensing Signals Governing the Decision to Cooperate in a Bacterial Social Trait. PLoS computational biology. 11 (5), 10004279 (2015).
- Bernier, S. P., Ha, D. -G., Khan, W., Merritt, J. H., O'Toole, G. A. Modulation of Pseudomonas aeruginosa surface-associated group behaviors by individual amino acids through c-di-GMP signaling. Research in Microbiology. 162 (7), 680-688 (2011).
