Method Article

זמן הדמיה של נחילים חיידקיים ואת תגובת הלחץ הקולקטיבי

DOI:

10.3791/60915

⸱

May 23rd, 2020

 ,  , 
1Department of Molecular Biology & Biochemistry, University of California, Irvine, 2Department of Physics & Astronomy, University of California, Irvine, 3Department of Veterinary and Animal Sciences, University of Copenhagen

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו לפרט שיטה פשוטה כדי לייצר ברזולוציה גבוהה זמן לפקיעה סרטים של פסאודומונס aeruginosa נחילים כי להגיב בקטיויוג'ה (phage) ומתח אנטיביוטי באמצעות סורק מסמך מסורק. הליך זה הוא שיטה מהירה ופשוטה לניטור שורצים הדינמיקה יכול להיות מותאם ללמוד תנועתיות וצמיחה של מינים חיידקיים אחרים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שורצים היא צורה של תנועתיות פני השטח שנצפו במינים בקטריאליים רבים, כולל הפסאודומונס aeruginosa ואסאנכיה קולי. כאן, אוכלוסיות צפופות של חיידקים לנוע מעל מרחקים גדולים בקהילות בצורת tendril אופייני במהלך השעות. שורצים רגישים למספר גורמים, כולל לחות בינונית, לחות ותוכן תזונתי. בנוסף, תגובת הלחץ הקולקטיבי, אשר נצפתה ב P. aeruginosa , כי הם הדגיש על ידי אנטיביוטיקה או בקטביאג (phage), דוחה נחילים מתקרבים לאזור המכיל את הלחץ. השיטות המתוארות כאן כתובות כיצד לשלוט על הגורמים הקריטיים המשפיעים על שורצים. אנו מציגים שיטה פשוטה לפקח על שורצים הדינמיקה ואת תגובת הלחץ הקולקטיבי עם ברזולוציה גבוהה בזמן באמצעות סורק מסמך מסורק, ולתאר כיצד לקמפל ולבצע ניתוח כמותי של נחילים. שיטה פשוטה וחסכונית זו מספקת כימות מדויקת ומבוקרת היטב של שורצים ועשויים להיות מורחבים לסוגים אחרים של הצלחת הצמיחה המבוססת על לוח ומינים חיידקי.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שורצים היא צורה קולקטיבית של תנועתיות בקטריאלי מתואמת המגביר עמידות לאנטיביוטיקה והפקת גורמי התקפה אלימה במחשב המארח1,2,3. התנהגות זו רב-תאיים מתרחשת על משטחים חצי מוצקים הדומים לאלה של שכבות ריריות המכסים ממברנות אפיתל בריאות4,5. ביוסוררים מיוצרים בדרך כלל על ידי אוכלוסיות שורצים כדי להתגבר על מתח פני השטח על משטחים ועל הייצור של אלה מוסדר על ידי תא התא מורכב איתות מערכות, הידוע גם כ-quorum חישה6,7,8. מינים רבים של חיידקים מ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת לוחות שורצים במשך P. aeruginosa שורצים זמן הדמיה

  1. להכין 1 L של 5x M8 מינימום מדיה בבקבוק זכוכית על ידי הוספת 64 g של Na2hpo4• 7h2O, 15 גרם של KH2פו4, ו 2.5 g של הנאל ב 500 mL כפול מים מזוקקים (ddh2O). כוונן את אמצעי האחסון הסופי ל-1 ל' עם תוספת ddH2O. אוטוקלב כדי לעקר ולאחסן מדיה נוזלית בטמפרטורת החדר.
  2. הכינו 100 mL של 1 M MgSO4 (מגנזיום גופרתי) בבקבוק זכוכית על ידי הוספת 24.6 g של mgso4• 7h2o ב 50 ml Ddh2o. להתאים את הנפח הסופי 100 Ml עם תוספת ddh2o. אוטוקלב לחטא. . חנות בטמפרטורת החדר
  3. הכינו 1....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השלבים לצמוח P. aeruginosa, להדגיש את התאים, ואת התמונה לוחות שורצים מיוצגים באיור 1. חיסלנו מושבה אחת של מסוג פראי P. aeruginosa ucbpp-PA14 המתח מצלחת lb-אגר ב 2 מ ל המרק lb לילה ב 37 ° c ו הבחין 5 μl במרכז הצלחת שורצים. הדמיה של הצלחת הזמן מגלה את הצמיחה הראשונית בצורה של מושבה במרכז ולאחר מכן מתפשטת של קנוקנות רדיאלי מן המושבה (וידאו 1). עבור תגובת הלחץ הקולקטיבי אומר, בנוסף לאיתור P. aeruginosa במרכז, 30 μl של תרבות לילה זהה מעורבב עם 6 μl של 1 x 1012<.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתמקד בצמצום השונות בלוחות שורצים באגר ומספק שיטה פשוטה ובעלות נמוכה לרכישת תמונות בזמן של P. aeruginosa שורצים ומגיבים ללחץ. הליך זה ניתן להרחיב את התמונה מערכות בקטריאלי אחרות על ידי התאמת הרכב התקשורת ותנאי גדילה. עבור P. aeruginosa, למרות M9 או בינוני מינימלי FAB יכול לשמש כדי לגרום שורצים16,21, הפרוטוקול המוצג כאן משתמש M8 medium עם חומצות קמינו, גלוקוז, ו מגנזיום סולפט6. P. aeruginosa שורצים רגי.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

י.-ל ג'ונסון, א. י., ו. מ. ק. ה. כתב ושינו את כתב היד. כל המחברים תכננו את הניסויים. ג.-ל ג'ונסון ביצעו את הניסויים והניתוח. עבודה זו נתמכת על ידי K22AI112816 בפרס NIH ו-R21AI139968 מענק ל-ס. י. ובאוניברסיטת קליפורניה. נ. מ. ח-ק בתמיכת מלגות לונלבק R220-2016-860 וR251-2017-1070. לתורמים לא היה כל תפקיד בהחלטה להגיש את העבודה לפרסום. . אין לנו אינטרסים מתחרים להכריז

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<חזק>ריאגנטים
אגר בקטו, מיובשBD Difco214010לצלחת LB-אגר וצלחת אגר נחיל
חומצות קסמינוBD Difco223050למדיה נחילה
D-גלוקוזפישר כימיקלD16500דקסטרוז. למצעי נחילים
מלח דיסודיום FosfomycinTokyo Chemical IndustryF0889ריכוז מלאי: 200 מ"ג/מ"ל. מומס ב-ddH2O
Gentamycin sulfateSigma-AldrichG1914ריכוז מלאי: 3 מ"ג/מ"ל. מומס ב-ddH2O
Kanamycin sulfateSigma-Aldrich60615ריכוז מלאי: 100 מ"ג/מ"ל. מומס ב ddH2O
LB-MillerBD Difco244620עבור מרק LB וצלחות LB-agar
מגנזיום סולפט heptahydrateSigma-Aldrich230391עבור נחילים מדיה
אשלגן פוספט מונו-בסיסיSigma-AldrichP0662עבור 5x M8 מדיה
נתרן כלוריסיגמא-אולדריץ'S9888עבור 5x M8 מדיה
נתרן פוספט דו-בסיסי heptahydrateפישר כימיקלS373עבור 5x M8 media
זנים
Pseudomonas aeruginosaSiryaporn labAFS27E.118PA14
זן DMS3virO'Toole labDMS3vir20בקטריופאג'
< חזק>אספקה
אלומיניום תחמוצת נייר זכוכית3M150 עדיןעבור מכסים שחורים
בד שחורJoannPRD7089בד שחור
שחור ספריי צבעקרילון5592 שחור מטעבור מכסים שחורים
בקבוק Erlenmeyer Kimax26500250 מ"ל
בקבוקי אחסון זכוכיתפיירקס13951L250 מ"ל, 500 מ"ל, 1,000 מ"ל
8 אינץ' קשרי רוכסןגרדנר בנדרE173770מבד מט שחור
(100 מ"מ x 15 מ"מ)פישרFB0875712100 מ"מ x 15 מ"מ לוחות פוליסטירן
עץפישר23-400-102לפסים וחיסון חיידקים
<חזק>ציוד
שוק החיטויForge IndustriesSTM-Eלעיקור ריאגנטים
25 מ"ל פיפטהארה"ב Scientific, Inc.1072-5410לפיפט 20 מ"ל לנחיל צלחות אגר
לחותFrigidaireFAD704DWD 70 ליטרלשמירה על לחות יחסית בחדר בכ-45%
ImageJNIHv1.52aתוכנה לניתוח תמונות
חממהVWR89032-092לגידול חיידקים ב-37 מעלות; C
אמבט מים איזוטמפפישר15-462-21Qלקירור מדיה עד 55 מעלות; C
קולט אדים זרימה למינאריחברת בייקרSG603Aלייבוש צלחות
P-20 פיפטגילסוןF123601תצפית על צלחות אגר נחיל
בקר פיפטהBrandTechaccu-jetלפיפט 20 מ"ל לנחיל צלחות אגר
תוף רולרניו ברונסוויקTC-7לגידול חיידקים ב 100 סל"
ד סורקEpsonסורק תמונות Epson Perfection V370ללוחות הדמיה
תוכנת אוטומציה של הסורקRoboTask Litev7.0.1.932להדמיה פנימית של 30 דקות
תוכנה לרכישת תמונות סורקEpsonv9.9.2.5USתוכנה ללוחות הדמיה
לחיבור כלי פטרי מקלות מסיר

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Butler, M. T., Wang, Q., Harshey, R. M. Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3776-3781 (2010).
  2. Lai, S., Tremblay, J., Déziel, E.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Bacterial SwarmingTime lapse ImagingSwarming Agar PlatesPseudomonas aeruginosaBacteriophage ResponseAntibiotic StressDocument ScannerImageJ AnalysisAVI Time lapseBrightfield Microscopy

Related Articles