Summary
在这里，我们描述了核糖体和相关RNA的免疫沉淀从成年雄性小鼠生殖细胞的精选群体使用RiboTag系统。战略性育种和精心的免疫沉淀产生清洁、可重复的结果，为生殖细胞的翻译提供信息，并深入了解突变表型的机制。
Abstract
量化mRNA丰度差异是了解给定基因突变对细胞生理学影响的经典方法。然而，对翻译主题（整个翻译的mRNA）的差异进行特征化提供了一层额外的信息，在尝试理解RNA调节或结合蛋白的功能时特别有用。已经开发了许多方法来实现这一目标，包括核糖体分析和多体分析。然而，这两种方法都面临重大技术挑战，除非与额外的分拣方法相结合，否则不能应用于组织内的特定细胞群。相反，RiboTag 方法是一种基于基因、高效且技术简单的替代方法，它允许从特定细胞群中识别核糖体相关 RNA，而无需添加排序步骤，前提是可以使用适用的细胞特异性Cre驱动程序。该方法包括育种，以生成遗传模型、样本收集、免疫沉淀和下游RNA分析。在这里，我们概述了在成年雄性小鼠生殖细胞突变的这一过程，用于男性生育所需的RNA结合蛋白。特别注意育种的考虑，重点是有效的菌群管理和产生正确的遗传背景和免疫沉淀，以减少背景和优化产量。还讨论了故障排除选项、其他确认实验和潜在的下游应用。提出的遗传工具和分子协议是描述复杂组织或具有异常mRNA存储和翻译系统的特定细胞群的核糖体相关RNA的有力方法，目的是告知突变表型的分子驱动因素。
Introduction
通过微阵列或RNA测序对细胞或组织的RNA丰度进行分析，已被证明是了解突变表型分子驱动因素的有力工具。然而，这些相对不完整的分析工具可能无法告知细胞的生理或蛋白酶，特别是在许多mRNA在翻译前储存的系统，如神经和生殖细胞。在这些系统中，定义被主动转化为蛋白质的mRNA种群，或细胞的翻译，可能是细胞实际生理状态1，2的更好指标。例如，处于不同发育阶段的生殖细胞转录了RNA，这些RNA被储存在以后的翻译中，由发育3或信号线索4驱动。这个过程通过mRNA编码蛋白胺得到证明，其中mRNA转录本在蛋白质制造前数天可检测到，即1、2、5、6。同样，神经细胞在细胞核中转录RNA并将其输送到斧子下，就像β-actin7一样。除了这些专门的细胞系统外，稳态转录在RNA存储、核糖体生物发生或mRNA转化受到影响的模型中也不太可能具有信息性。多个其他因素也可能影响细胞的稳态RNA池，包括mRNA衰变和RNA结合蛋白的活性。在这些情况下，在主动转化下分析核糖体相关RNA或mRNA的可靠工具更有可能产生与生物学相关的结果。
为此，已经开发了几种方法来识别核糖体相关或主动翻译的消息。聚体分析，它提供了核糖体相关转录的快照，已经使用了几十年来分离与核糖体亚单位或单体、二核糖体和多核糖体复合物3相关的完整RNA。简单地说，收集的细胞裂解物被应用于线性蔗糖梯度，并高速离心，从而分离核糖体亚单位、完整的核糖体和多体体的大小。传统上，这种技术已经应用于研究一个或几个mRNA，但最近这种方法已经结合RNA-seq研究，以阐明潜在的转化调节器8，9虽然一种强大的方法来区分主动翻译和非翻译mRNA10，多部分分析确实需要耗时的方法（梯度分馏和超离心），并可能需要大量的样品分析稀有细胞人口具有挑战性的。
检查翻译体的另一种方法是核糖体分析，它识别与核糖体直接相关的转录部分。简而言之，核糖体相关RNA片段通过RNase保护测定产生，通过蔗糖梯度分离的单个核糖体复合物，以及分离并转化为RNA-seq标记的相关RNA片段，可适应深度测序11。核糖体分析的关键好处之一是能够确定核糖体在隔离时的具体位置，从而能够识别翻译起始点，计算核糖体占用和分布，以及识别核糖体失位12。然而，这种方法有几个固有的缺点，包括设备需求（梯度分数和超离心），一个相对复杂的协议，需要广泛的故障排除，和计算问题不容易由缺乏经验的用户11处理。重要的是，核糖体分析主要应用于培养中的分离细胞，需要大量的材料，这使得其应用于混合细胞型组织或体内分类细胞。
桑兹等人于2009年13月开发的哺乳动物RiboTag方法消除了多体体和核糖体分析所固有的许多问题。在这种方法中，核糖体相关RNA可以从特定的细胞类型中分离出来，允许研究复杂组织中细胞型特异性的翻译，而无需额外的隔离技术和专用设备，这是其他方法13、14中所必需的。RiboTag方法的基础是转基因小鼠模型（RiboTag），它携带一个经过修饰的60S核糖体亚单位蛋白基因Rpl22的位点。此位点 （Rpl22-HA） 包括一个浮点端外子，然后是一个附加的终端外子副本，经过修正后，在编码区域内包含一个 C 端血凝素 （HA） 标记。当交叉到鼠标表示细胞特定的Cre重组酶时，絮状的外子被移除，允许以细胞特定的方式表达HA标记的RPL22（图1）。然后，HA 标记可用于免疫沉淀 （IP） 核糖体及其从所选细胞类型相关的 RNA。
除了开发该技术的最初出版物外，其他几个实验室还利用了RiboTag模型。各种组织，如小鼠塞尔托利和莱迪格细胞15，微胶质16，神经元17，18，卵母细胞19，和培养细胞20已被分析和研究。虽然该协议显然能够成功地分离核糖体和不同组织类型的相关RNA，但仍有需要改进的领域，特别是当应用于突变系统时。特别是，对新鲜组织的共同依赖会导致技术变异增加，从而大大降低分析能力。其次，当高免疫沉淀背景发生在非Cre重组细胞类型中时，对差异转换目标的自信识别更具挑战性，如之前报道的13。虽然Sanz等人设计了该技术的基本前提，但斯奈德实验室在这份手稿中提出了协议优化，以减少这些顾虑，使该方法更加实用和高效。
本文的目的是解释繁殖小鼠表达细胞特异性HA标记核糖体、从闪冻样品中免疫沉淀这些核糖体以及纯化其相关RNA以进行进一步下游分析的步骤。由于哺乳动物雄性生殖细胞和不育突变的研究提供了独特的挑战，已努力阐明该技术可以适应其他细胞系统的方法。
Protocol
所有动物使用和处理做法均获得罗格斯大学内部动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准。
1. 小鼠繁殖
- 繁殖雌性小鼠同源为RNA结合蛋白突变，导致男性不育（手稿在准备，这里称为感兴趣的基因）在三重交配的雄性血吸虫为Stra8-iCre等位基因（B6）。FVB-Tg（Stra8-iCre）1Reb/LguJ（Cre+），因为将两只雌性与每只雄性配对，可提高繁殖效率。
注：感兴趣的突变基因（M）通过母体，因为女性同源性M有正常的生育能力。这有额外的好处，允许父体传播男性生殖细胞Cre（血吸血），建议21和优化与所需的等位基因组合的后代百分比。由于同源性Cres表现出生殖细胞毒性22，建议保持等位基因并处于异构或半血状态。重要的是，在实验总体之前，Cre表达式不得与Rpl22-HA等位基因共发生。未能在繁殖动物中从Cre分离出Rpl22-HA等位基因，将会导致由于生殖细胞Cre活性而在全球表达Rpl22-HA的后代。此问题特定于生殖细胞。此外，Stra8-iCre是特定于作者感兴趣的细胞群22，针对在梅氏菌病中过渡和非常早的细胞，包括前白细胞和白细胞。可以改为使用特定于其他感兴趣的单元格类型的不同Cre驱动程序。常见的实践规定男性生殖细胞表达的Cres在父方传播。然而，Stra8-iCre的母体传播可能导致雄性后代的类似转基因表达。无论选择何种育种方案，为了产生具有等效Cre表达的后代，所有实验样本都应通过来自同一父母方的Cre传输（无论是母体还是总是父体）生成。 - 如第2.4节所述，导致雄性小狗的基因型。选择那些携带M等位基因和正为Cre （+/M：Cre+） 进行下游育种。
- 繁殖雌性小鼠同源为M等位基因在三重交配与雄性同源为Rpl22-HA（B6J.129（Cg）-Rpl22tm1.1Psam/SjJ）。
注：Rpl22-HA背景高度混合，因此在评估应变特异性表型时应小心谨慎。 - 基因型导致雌性小狗识别那些携带M等位基因和阳性的Rpl22-HA（+/M：Rpl22-HA+）（见第2.3节）。 选择这些雌性进行下游育种。
- 交叉[/M：Cre]雄性与[/M：Rpl22]雌性在三重交配。基因型产生的小狗（见第2.3和2.4节），以识别雄性，同时是Cre+和Rpl22+，或者野生型或M/M。
注：由于这项工作侧重于导致完全雄性不育的突变，在育种方案中已考虑特殊因素，以最有效地获得所需的实验基因型。在其他实验模型中，这种考虑可能是不必要的。有关育种注意事项的更多讨论，请参阅图 2，了解完整的育种原理图和随附的图例。
2. 样本收集
- 在产后21天（dpp）从雄性小鼠身上收集睾度。
- 牺牲小鼠通过CO2吸入，然后是宫颈脱位。在每个动物的侧边做一个心室切口（3厘米），两个较短（每个2厘米），连接侧切口。拉回皮肤和围膜，露出睾号。
- 使用钳子，从体腔的一侧拉出表皮脂肪垫，以显示表皮和睾度。用端皮剪刀，切除睾丸，注意修剪去表皮，周围的脂肪，和任何外部血管。将完整的睾号放入干净的 1.7 mL 管中。
- 与另一侧重复，将第二个睾号添加到第一个试管中。盖住这个管子，立即将其浸入液氮中，以进行闪冻。
注：样品可在-80°C保存，直到使用。
- 为每个动物（2毫米）收集额外的尾尖样本，以进行基因分型确认。
- 要提取DNA，在1.7 mL管中加入100 μL的50mM NaOH的2毫米尾尖，在95°C下煮30分钟。 加入100 μL的50 mM HCl和20 μL的1M Tris-HCl pH 8.0，在10，000 x g时加入离心样品3分钟。保留上清液（包含基因组DNA），并将提取的DNA储存在4°C，直到用作以下基因分型反应的模板。
- 使用以下引注采用从 Sanz 等人13中改编的方法执行Rpl22-HA基因分型：前进： 5' GGGAGGCGCTGGATATATG 3';反向： 5' TTTCCAACACACTAGTACAC 3'。
- 制备反应混合物，包括步骤2.2.1中提取的2μLDNA，25 mM dNTP的0.08μL，10 mM正向底漆的0.1μL， 0.1 μL 的 10 mM 反向底漆，2 μL 的聚合酶链反应 （PCR） 缓冲液 （650 mM Tris pH = 8.8， 165 mM （NH4）2SO4， 30 mM MgCl2和 0.1% 补间）， 0.2 μL的塔克聚合酶， 和无核酸酶 H2O 的总体积为 20 μL。
- 使用以下热循环器条件：在 95°C 下进行 30 秒引水熔炼步骤，在 64°C 下执行 30 s 退火，在 72°C 下进行 30 秒伸长，在 72°C 下重复 37 次，最后 5 分钟伸长。
注：这产生了260 bp的野生型样品和292 bp的样品是Rpl22-HA*
- 使用以下引物执行Cre基因分型：前进：5' GTGCCAGCTAACAACAAGA 3';反向： 5' AGGGACACATGGGGGGTC 3'。准备 PCR 反应，如步骤 2.3.2 中所述，而是使用Cre引物。使用以下热循环器条件：在 95°C 下进行 30 秒引水熔炼步骤，在 60°C 下执行 30 s 退火，在 72°C 下进行 15 秒伸长，在 72°C 下重复 35 次，最后 5 分钟伸长。
- 执行感兴趣的基因基因分型，这是有关基因的标准。
注：作者的基因分型协议使用集中的自定义Taq，因此，其他用户可能不得不修改条件，以适应他们的酶要求。为了更好地了解这种兴趣基因的丢失对翻译的影响，选择野生型或同源基因的雄性，以及Cre®和Rpl22+作为实验样本。基因型选择在上节1中进一步讨论。
3. 准备解决方案
注：必须严格地在条件下准备解决方案和所有后续步骤。
- 要制备均质缓冲液（HB），在50m KCl中加入2.5 mL的1M Tris pH 7.4，1M KCl的5mL，1M MgCl2的600μL，以及500μL的NP-40到50 mL管中。将二乙基热碳酸二甲酯 （DEPC） H2O 中的体积 （50 mL） 调入并混合，直到所有组件都加入。
注：最终浓度如下：50 mM Tris pH 7.4、100 mM KCl、12 mM MgCl2和 1% NP-40。 - 要制备高盐洗涤缓冲液 （HSWB），在 50 mL 管中加入 2.5 mL 的 1 M Tris pH 7.4，15 mL 的 1 M KCl，600 μL 的 1 M MgCl2和 500 μL 的 NP-40 到 50 mL 管。在 DEPC H2O 中引入体积 （50 mL），然后混合，直到所有组件都入内。
注：最终浓度如下：50 mM Tris pH 7.4、300 mM KCl、12 mM MgCl2和 1% NP-40 协议可在此暂停，溶液可在室温下存储直至使用。
4. 组织制备
- 预称重所有样品管，记录重量，并在液氮中预冷却。
- 预冷却无菌砂浆，虫子，和在干冰上称重的铲子。
- 使用预冷却、无菌砂浆和干冰上的虫子将闪光冷冻组织样品研磨到细粉末中。
- 将闪光冷冻组织放入干冰上预冷却的砂浆中。轻轻地将组织切成大块，用虫子慢慢研磨，直到组织是细粉。
注：虽然使用新鲜组织也可以使用，但按照原始协议13，使用闪光冷冻组织在结果上没有显著差异。有关详细信息，请参阅代表性结果和讨论。 - 使用预冷铲从砂浆中刮取粉末，小心地将地面样品转移到预冷却收集管中。确保只收集组织，而不是沉积在冷砂浆上的任何水分。
- 用纸巾称量管子，尽可能保持干冰。计算组织的质量，从管的重量中减去管子的初始重量，并计算其中的样本。记录此值以用于以后计算莱沙缓冲卷。
注： 该协议可以在此处暂停，样品可以存储在 -80°C，直到使用。
- 将闪光冷冻组织放入干冰上预冷却的砂浆中。轻轻地将组织切成大块，用虫子慢慢研磨，直到组织是细粉。
5. 样品的同质化
- 通过加入10 μL的1M二硫乙醇（DTT）、1个蛋白酶抑制剂片剂、50μL的RNase抑制剂（40，000单位/mL）、200 μL的5mg/mL环氧乙酰甲酰胺和100μL的100mg/mL肝素至10mL的HB。混合，直到所有组件被合并，并保持在冰上，直到使用。
注：10 mL HB补充剂的最终浓度如下：1 mM DTT、200 U/mL RNase抑制剂、100微克/mL环乙酰胺和1mg/mL肝素。此溶液必须在添加补充剂后的 24 小时内使用，并可在 4°C 或冰上保存，直到使用。 - 对于每100毫克的样品，加入1mL的莱沙缓冲液。使用用于添加裂液缓冲液的相同移液器，小心地将生成的裂液上下移至碎片细胞并混合。继续移液，直到样品不再粘稠，一般为25-30冲程。
注：由于溶液最初非常粘稠，因此应使用大直径移液器来混合溶液。标准1000 μL通常足以用于100毫克的组织。 - 在冰上设置样品10分钟以进行分莱。然后，在预冷却的离心机（4°C）中旋转样品10分钟，在10，000 x g下。一个大的，松散的，多云的颗粒应形成在管的底部。
- 小心不要干扰颗粒，将分管收集到新的管中，并记录每个样品的体积。为了防止样品脱冰，请确保样品在整个剩余协议中保持凉爽，尽可能储存在冰上或4°C处。
6. 珠子的均衡
- 使用步骤 5.2 中的解物体积，计算与相应抗体结合蛋白（本例中为蛋白质 G）耦合的磁珠所需的体积。对于 1 mL 的莱沙，使用 375 μL 的蛋白质 G 珠子 （30 mg/mL）。
注：偶联珠的选择会随着使用的抗HA抗体而变化;例如，如果选择兔子生成的抗HA抗体，蛋白质A珠将更可取。 - 使用磁管机架，去除珠子溶剂，并在珠子中加入同等体积的新鲜溶解缓冲液。在4°C下旋转5分钟洗涤。使用设置为 20 rpm 的台式管旋转器执行所有旋转步骤。
- 将管子放在磁管机架上并拆下洗涤缓冲液。
- 重复步骤 6.1_6.3 两次。
- 在原始体积处将莱沙缓冲液添加到平衡的珠子中。储存在4°C或冰上，直到使用。
7. 预清理样品
- 每 1 mL 的莱沙片加入 50 μL 的均衡珠子，加入上清酸样品（莱沙）的上清，并在 4°C 下旋转 1 小时。
- 将管子放在磁铁架上，将乳化酶收集到新鲜的管中。丢弃用过的珠子。
- 在分瓶中，每1mL加入25μL的均衡珠子，在4°C下旋转1小时。
- 将管子放在磁铁架上，将乳化酶收集到新鲜的管中。丢弃用过的珠子。从清除的莱沙中，保留 50 μL 以用作样品输入控制。储存在-80°C。
注：输入样本作为表示样本总RNA总体的对照，包括与组织中其他细胞类型相关的RNA，在下游分析期间用于校正基因表达变化作为突变的函数。
8. 抗体的孵育
- 每清除1mL的解结物，加入5μg的抗HA抗体。为防止样品丢失，用实验室薄膜密封管盖。在 4°C 下旋转样品 16-18 小时。
注：抗体孵育时间和浓度尚未优化。作者发现，5μg的过夜孵育就足够了;然而，较短的孵育或较少的抗体可能就足够了，或者较长的孵育或更多的抗体将改善结合。
9. 珠子孵化
- 每1mL的清除莱沙，加入300μL的蛋白质G珠子。用实验室薄膜重新密封管盖，在 4°C 下旋转 2 小时。
10. 洗珠
- 将样品管放在磁架上，让珠子与 IPed 莱糖分离。移液关闭流通过的流液干和丢弃，保留珠子。
- 将 800 μL 的 HSWB 涂抹到珠子上，并在 4°C 下旋转 10 分钟。将样品管放在磁铁架上，让珠子与清洗分离。取出并丢弃洗涤。
- 在珠子上再涂抹800 μL的HSWB。关闭样品，并在 4°C 下旋转 5 分钟。将样品管放在磁铁架上，让珠子与清洗分离。取出并丢弃洗涤。
- 再次重复步骤 10.3。
11. RNA提取
- 将样品管放在磁铁架上，让珠子与清洗分离。移液和丢弃洗涤，保留珠子进行RNA提取。将3.5 μL的14.2Mβ-甲氧醇（bME）加入珠子中，并通过涡旋混合15s。
- 根据制造商的说明，使用商业RNA纯化试剂盒提取RNA。在 30 μL 的 RNase 释放 H2O 中洗取样品。
注：虽然10μL/样本DNase处理是可选的大多数试剂盒，它强烈鼓励。这种可选的清理步骤可显著减少背景，从而获得更准确的最终浓度。在赖沙缓冲液中使用含有β-甲二醇（bME）的试剂盒，需要大力重新组合。bME作为额外的RNase抑制剂，防止RNA分离过程中样品降解。 - 将样品储存在-80°C或立即分析。
12. 量化和样品分析
- 使用 UV-Vis 分光光度计，量化RNA浓度和初步质量。
- 分析通过生物分析仪从样品中提取的RNA的质量。
注：生成的RNA可用于RNA测序或其他下游分析，如北移印迹或定量逆转录PCR（qRT-PCR）。
Representative Results
以前的报告曾指出，缺乏Cre14的细胞具有非特异性免疫沉淀。为了确定在我们的修改协议中是否如此，IP效率是在从携带Cre和Rpl22-HA的动物和只携带一个但另一个动物的样本中确定的，期望如果没有Cre-driver和Rpl22-HA，免疫沉淀RNA应该最小。如图3所示，从缺乏Cre或Rpl22-HA的样品中分离出很少的RNA，证明该协议具有减少IP背景和分离真正的HA标记核糖体RNA的有效性。此外，仅Cre-和Rpl22-HA-仅样本均表示适当的阴性对照。
鉴于试剂源对IP效率有显著影响的潜力，在Cre和Rpl22-HA阳性样品中测试了一系列抗体和RNA分离方案（图4）。这些结果表明，试剂选择会对 IP 效率产生重大影响，因此，对试剂选择的任何更改都应谨慎进行。
为了在RNA结合蛋白突变的上下文中测试此协议，对野生型-Cre_Rpl22-HA_（野生型）和感兴趣的基因-/-Cre_Rpl22-HA+（感兴趣的基因-/-）测试物进行了检测，以确定核糖体相关RNA的有效性（图5）。将野生型输入和IP的RNA浓度与感兴趣的基因-/-输入和IP进行比较时，基因型之间没有显著差异。然而，对于两种基因型，输入浓度明显高于IP浓度，表明输入样本中的RNA较多（图5B）。这一结果是预料之中的，因为并不是细胞中存在的所有mRNA在任何特定时间都与核糖体相关，特别是在生殖细胞的情况下，RNA在翻译之前可能很久被转录。
为了确认送去测序的RNA样本的质量，样品在生物分析仪上运行。RNA完整性数（RIN），通常计算为28S和18S rRNA峰的比例，在样本中进行比较。在总RNA池中，RIN值预计接近10，RIN越高，推断样本完整性和质量越高。虽然 IP 样本的 RIN 低于输入值，但 RIN 仍在可接受的范围内，并且不依赖于样本基因型（图 5C）。由于分析RNA的平均核苷酸长度相对轻微，IPed样本的RIN值降低可能是RNA降解的结果，尽管非常轻微。鉴于协议的长度和免疫沉淀所需的温度，预计会出现一些降解。减少的RIN和RNA长度也可能对非rRNA物种（如mRNA）进行浓缩。
图 1：RiboTag 方法。该方法的前提是生物学上的简单。新的 Exon 4 插入到原始 Exon 4 下游的Rpl22位点的序列中。在Cre驱动器的存在下，原始 Exon 4 两侧的 loxP 站点被切割，从而切除浮花外显子。HA 标记的 Exon 4 现已合并到Rpl22 mRNA 中，在表达 CRE 的细胞中生成 HA 标记 RPL22。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：RiboTag小鼠的样本繁殖方案。展示了用于产生实验动物的育种方案。采用了双管齐下的计划。在第1代，建立了两组平行的饲养员三人组。一方将兴趣的等位基因（由于这种特异性突变导致男性不育）与雄性不育结合，另一方将兴趣的等位基因结合在一起，再次以母体方式携带，与Rpl22-HA。然后，在第2代，第一对携带兴趣等位基因和Cre的雄性被交叉到携带兴趣等位基因和第二配对的雌性后代。结果后代的基因型被确定，并选择与实验相关的动物（在这种情况下，携带Cre和Rpl22-HA等位基因的野生型或同源突变体）。需要注意的是，对于表达Cre-驱动器的生殖细胞，在实验产生之前，Cre和Rpl22-HA等位基因不应一起繁殖。在繁殖代中，Rpl22-HA等位基因与生殖细胞表达的Cre接触将推动生殖细胞Rpl22-HA切除。任何产生的后代将全局表达Rpl22-HA，从而防止细胞特异性核糖体分离。在本文描述的系统中，每个基因型的 n = 4 为下游分析提供了足够的统计能力。应为每个实验系统确定生物复制数。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3：确认负控制。Cre+和Rpl22-HA+的样本显示的 RNA 下拉比仅Cre+或Rpl22-HA+的样本高。Cre®和Rpl2-HA+样品 RNA 下拉功效之间没有显著差异，表明缺乏Cre或Rpl22-HA的样品是合适的阴性对照。"+"表示这些样本中存在相应的等位基因或转基因，而"-"表示不存在。IP/输入表示RNA免疫沉淀（IP）与总（输入）RNA的比例。根据纳克浓度计算的值。* 表示 p < 0025。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：试剂影响协议的成功。（A） 闪光冷冻组织产生与新鲜组织相似的免疫沉淀效率.（B） 确定两种商业抗体的IP效率，分别指定为抗体1和抗体2（材料表）。当测试时，抗体1比抗体2在拉下RNA方面更有效，抗体2似乎无法区分阴性（不表达Cre或Rpl22-HA+）和阳性对照（同时表达Cre和Rpl22-HA+）。指示单个生物复制的 IPed 与输入 RNA 比率的点。（C） 当RNA提取试剂盒（材料表）进行比较时，试剂盒2明显优于试剂盒1。虽然这两个试剂盒都通过阴性对照中掺入了同样数量的RNA，但Kit 2从阳性样本中显著提高了RNA产量。• 表示 p < 0.05， = p < 0.025， = p < 0.01。请点击此处查看此图的较大版本。
图5：该方法在突变模型中的应用。（A） 通过西方印迹确认感兴趣的基因型的样本基因，使用定制的内部抗体对抗感兴趣的蛋白质基因，证明感兴趣的基因-/- （M/M） 雄性未能产生相关的蛋白质。GAPDH 显示为装载控件。（B） 来自成对输入的图形生物分析仪输出和用于野生型和突变样本的 IPed 样本。（C） 按样本类型和基因型比较RNA完整性数（RIN）。（D） 由生物分析器按样本类型和基因型分析的RNA物种的平均核苷酸长度。• 表示 p < 0.05， = p < 0.025， = p < 0.01， N.S. 不显著。N = 每个基因型 4。请点击此处查看此图的较大版本。
图6：Cre驱动程序确认示例。在生殖细胞发育的早期翻译的基因（Stra8）和在生殖细胞发育后期翻译的两个基因（Tnp1和Prm1）的定量化，由由两个不同的生殖细胞Cres（Stra8-iCre（在生殖细胞发育早期表达）和Hspa2-Cre（在生殖细胞发育中后期表达，特别是在Stra8翻译后，从RPL22-HA中分离出的RNA免疫分泌）进行分析。 在这里，Stra8的HA-IP是使用早期生殖细胞Cre驱动器实现的，而不是用后来的生殖细胞Cre驱动器来证明免疫沉淀的细胞特异性。相比之下，在晚期生殖细胞中翻译的转录本的HA-IP由Stra8-iCre和Hspa2-Cre实现。这被预期为表达Stra8-iCre的细胞将在整个开发过程中生成HA标记的RPL22，而那些表达Hspa2-Cre的细胞将只在其发育的后期产生。请点击此处查看此图的较大版本。
Discussion
了解特定细胞类型的翻译体对于更准确地理解正常或突变状态的细胞的生理是无价的。特殊益处在翻译与转录分离的系统中可见，例如在神经组织中，翻译发生在离转录很远的地方，或者在转录发生很久之前发生转录的生殖细胞中。与其他翻译体分析方法相比，RiboTag系统的最大优势来自于使用Cre重组酶系统。这允许自由定位具有相关Cre驱动程序的任何单元格群。其次，本文所述的 RiboTag IP 是有效的，在技术上比多体或核糖体分析少得多，而且更不费时。最后，RiboTag IP 可在台面轻松执行。
此协议中有许多关键步骤。其中最主要的是建立RiboTag小鼠线和产生实验动物进行研究。至于所有基因模型，应仔细跟踪小鼠群落内的个体，以及仔细的基因分型方案。PCR基因分型，根据Sanz等人应包括针对野生型外生4的loxP位点5'的引物，以区分野生型等位基因（260 bp）和突变体（290bp）13。对于生殖细胞模型中的RiboTag分析，应遵循非常具体的育种要求。首先，在导致不育的突变体的情况下，深思熟虑的育种策略应包括优化中间代和实验代中具有所需基因型的后代数量的方法。其次，对于生殖细胞特异性克雷斯，鉴于生殖细胞对Cre毒性的敏感性，应注意Cre-zygosity。 在生殖细胞中，高浓度的Cre蛋白会产生有害影响22，禁止在繁殖方案中使用Cre/Cre动物。最后，当使用生殖细胞Cres时，重要的是从Cre分离出RiboTag等位基因，直到最后一代作为中间代生殖细胞中的Cre表达，导致后代在全球范围内表达Rpl22-HA。
无论细胞系统如何，可以进行一些推荐的控制，以验证Cre表达和特异性的鲁棒性。使用多种方法可以确定您的 Cre的正确表达和Rpl22-HA的预期切除。首先，从实验动物中分离出来的组织可以使用免疫组织化学或免疫荧光15染色，用于HA。此方法是最佳方法，因为它不需要先验地了解目标细胞类型中的已翻译 mRNA。第二种方法（图 6中演示的一个示例）需要了解目标单元类型中的转换调控消息。在这种方法中，可以使用IPed与输入RNA的定量PCR从选定的Cre-驱动程序中确认已知翻译调节的mRNA的富集。同样，通过将Cre_/Rpl22+样本（阳性对照）与Cre-/Rpl22+或Cre_/Rpl22-样本进行比较，可以确认强大的Rpl22-HA表达式，这些样本可作为有效的阴性对照（参见图 3）。这些比较可以通过对总IPed RNA进行，也可以对由qRT-PCR或其他一些定量方法评估的已知翻译调节的mRNA进行浓缩。
协议执行中的常见问题往往只有在RNA产量出乎意料地低或高时才变得明显。这些失败的最常见原因是个人基因分型不正确。我们建议从采集的样本中保留额外的组织，以确认所有样品的基因型，以防出现意外的RNA。一旦得到确认，应考虑其他可能性，包括RNase污染或样品降解的可能性。在实验室内仔细存储、处理和维护无RNase区域，可以大大减少或消除这些问题。虽然RNA分离问题是该协议中的另一个潜在问题，但商业试剂盒的使用大大减少了这个问题，但应注意确保它们保持为无RNA酶，并且不包含过期的解决方案。最后，与所有基于抗体的程序一样，批次、储存条件、浓度甚至装运的变化都有可能对抗体的质量以及随后的下拉成功产生负面影响。因此，经过仔细和反复的测试，我们选择了最一致和最有效的抗体。
该协议包含相对于其他已发布的 RiboTag 协议的两个主要修改，可显著提高成功的可能性。一种是使用闪光冷冻组织的能力，从而缓解涉及批次、技术人员或技术运行变化的任何问题。可以收集和存储样品，以便一次从所有样品中分离 HA-核糖体，从而降低可能是主要变异源。其次，预清除步骤的加入大大减少了 RiboTag 系统其他用户报告的背景类型。最近，Sanz等人的一份协议报告显示，由于非克细胞14的核糖体相关记录量丰富，存在高背景。我们的协议通过包括预清除步骤来解决此问题，从而有效地消除Cre阴性 IP 样品中是否存在 RNA。
与所有系统一样，应牢记 RiboTag 系统固有的局限性。当使用未描述的Cre驱动器时，应在实验样品生产之前对表达进行分析。从翻译的角度来看，应该注意这种方法的几个细微差别。首先，RiboTag 不允许区分准备翻译的 mRNA 和那些积极翻译的 mRNA。因此，目前基于RiboTag的方法不允许将翻译效率量化为单个mRNA的函数。如果对翻译效率感兴趣，如果 RiboTag 方法与其他翻译体分析工具（如多体分析）结合使用，则可以根据具体单元格进行测量。其次，考虑个体或基因型依赖性差异引起的总RNA丰度变化至关重要。正因如此，在免疫沉淀过程中仔细分离输入RNA，从每个样本中提取的样本在任何下游分析过程中保持配对。最后，关于基于RiboTag的分析，应该记住，与核糖体的关联并不一定证明翻译正在发生。应执行次要分析方法，以确认目标中的平移调节。
该协议使用RiboTag模型描述了核糖体相关RNA与雄性小鼠生殖细胞的分离。不考虑小鼠的繁殖和样本采集，协议需要两天，第一天三个小时，最好在下午完成，一个通宵孵化，然后五个小时的工作，第二天早上。强烈建议提前准备库存溶液（HB和HSWB）和组织研磨。该协议的整体成功取决于正确的基因分型和严格的无RNase条件。能够检查特定细胞类型的翻译体将允许未来的研究更好地了解转录、翻译和无数细胞类型和突变背景中的蛋白酶之间的关系。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作由NIH资助NICHD R00HD083521给EMS，以及罗格斯大学向EMS提供内部支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| 1,4-Dithio-DL-threitol (8% | Alfa Aesar | A15797 | |
| 1.7 mL or 2mL tubes | Preference of researcher | ||
| 10 mL conical tubes | Preference of researcher | ||
| 10 mL serological pippettes | Preference of researcher | ||
| 10 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| 20 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| 200 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| 5 mL serological pipettes | Preference of researcher | ||
| 50 mL conical tubes | Preference of researcher | ||
| Anti-HA tag antibody | Abcam | ab18181 | Antibody 1 |
| Anti-HA tag antibody | Antibodies.com | A85278 | Antibody 2 |
| B6.FVB-Tg(Stra8-icre)1Reb/LguJ Mice | The Jackson Laboratory | 17490 | Or mice carrying Cre driver of choice |
| B6N.129-Rpl22tm1.1Psam/J Mice | The Jackson Laboratory | 11029 | |
| Benchtop centrifuge | Preference of researcher | ||
| C1000 Touch thermal cycler | BioRad | 184-1100 | Or equivalent thermal cycler |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000537 | Or equivalent refrigerated centrifuge |
| Cyclohexamide | Sigma Aldrich | C7698-1g | |
| Dissection scissors | Preference of researcher | ||
| Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Invitrogen by ThermoFisher Scientific | 10009D | |
| DynaMag-2 Magnet rack | Invitrogen by ThermoFisher Scientific | 12321D | |
| E.Z.N.A. Total RNA Kit 1 | OMEGA | 6834-01 | Kit 1 |
| Heat block | Preference of researcher | ||
| Heparin | Sigma Aldrich | 84020 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma Aldrich | M9272-500g | |
| Microdissection forceps | Preference of researcher | ||
| Microdissection scissors | Preference of researcher | ||
| MiRNeasy kit | Qiagen | 217004 | Kit 2 |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | ThermoFisher Scientific | ND-ONE-W | Or equivalent spectrophotometer |
| NP-40 Alternative - CAS 9016-45-9 - Calbiochem | Millipore Sigma | 492016 | |
| Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-free | ThermoFisher Scientific | A32965 | |
| Potassium (KCl) | Sigma Aldrich | P3911-2.5kg | |
| RNase Inhibitor, Murine | New England BioLabs Inc. | M0314 | |
| SI vortex-genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | Or equivalent benchtop vortex |
| Tips for 1 mL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| Tips for 10 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| Tips for 20 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| Tips for 200 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | ThermoFisher Scientific | BP152-500 | |
| Tube Revolver / Rotator | ThermoFisher Scientific | 88881001 | Or equivalent rotator |
| VWR Powerpette Plus pipet controller | VWR | 75856-450 | Or equivalent pipette controller |
References
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