Summary
I detta experiment injiceras en mus i svansen med Rhodamine B isothiocyanate-dextran som kan färga blodkärl. När levern har exponerats och fixerats kan en specifik del av levern väljas för att observera den djupa vävnaden i den levande kroppen med hjälp av multifotonmikroskopi.
Abstract
Genom att observera den intravaskulära dynamiken i muslevervävnad kan vi genomföra ytterligare djupgående observationer och studier på vävnadsrelaterade sjukdomar i muslever. En mus injiceras med ett färgämne som kan färga blodkärlen. För att observera muslever in vivo exponeras den och fixeras i en ram. Två- och tredimensionella bilder av blodkärlen i levervävnaden erhålls med hjälp av ett multifotonmikroskop. Bilder av vävnaderna på de valda platserna förvärvas kontinuerligt för att observera långsiktiga förändringar; de dynamiska förändringarna av blodkärlen i levervävnaderna observeras också. Multifotonmikroskopi är en metod för att observera cell- och cellfunktion i djupa vävnadssektioner eller organ. Multifotonmikroskopi har känslighet för vävnadsmikrostruktur och möjliggör avbildning av biologiska vävnader med hög rumslig upplösning in vivo, vilket ger möjlighet att fånga organisationens biokemiska information. Multifotonmikroskopi används för att observera en del av levern men att fixa levern för att göra bilden stabilare är problematiskt. I detta experiment används en speciell vakuumsugkopp för att fixa levern och få en stabilare bild av levern under mikroskopet. Dessutom kan denna metod användas för att observera dynamiska förändringar av specifika ämnen i levern genom att märka sådana ämnen med färgämnen.
Introduction
Blodkärl kan ge näringsämnen för olika organvävnader i människokroppen och utbyta ämnen. Samtidigt fungerar många cytokiner, hormoner, droger och celler också genom vaskulär transport till specifika platser. Observera vaskulär förändringar i levervävnad kan hjälpa till att förstå fördelningen av blodflödet i levervävnad och transport av ämnen, och hjälpa till vid analys av vissa kärlrelaterade sjukdomar1,2.
Det finns många sätt att observera leverns blodkärl hos möss. Bland dem har optisk mikroskopi många begränsningar för att observera ogenomskinlig vaskulärvävnad 3. Multifotonmikroskopi kan användas för att avbilda blodkärlen i levande lever med icke-invasiv hög upplösning4. Tredimensionella bilder av blodkärl kan inte bara erhållas, utan tekniken kan också användas för att hjälpa till att organisera vävnaden för att observera biologiska effekter däri; Dessutom kan hela vävnaden avbildas snarare än bara mikrovesselerna som i datortomografi och magnetisk resonanstomografi5.
Multifotonmikroskopi kan användas för att effektivt upptäcka spridda fluorescerande signaler i djup levande vävnad, med mindre fototoxicitet6. Därför kan levande vävnads aktivitet säkerställas, och mängden skador kan minskas. Multifotonmikroskopi har bättre genomträngande kraft än konfokal mikroskopi, vilket gör att djupare lager kanobserveras 7, vilket ger unik 3D-avbildning. Multiphotonmikroskopi används nu ofta i bildande hjärnskålen nerver8 och har utvidgats till att studera neuronal dynamik i levande möss9,10,11.
I detta experiment, efter fluorescerande märkning av mus blodkärl, levern är fixerad i en ram, och dynamiken i blodkärl i levande levervävnad kan ses med hjälp av multiphoton mikroskopi. Detta experiment visar hur man markerar specifika ämnen, använder multifotonmikroskopi för att observera en plats i vävnaden, observera cellulära händelser i den intercellulära vävnaden, göra fotokemiskamätningar 12,13,14, och observera materialdynamiken inuti den levandevävnaden 15. Till exempel har tumör endotel markör 1 (TEM1) identifierats som en ny ytmarkör uppreglerad på blodkärlen och stroma i många fasta tumörer, markera en-kedja variabel fragment (scFv) 78 mot TEM1, och sedan multiphoton mikroskopi kan användas för mus hemangioma plats och utvärdering av tumörer16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
All djurvård och alla ingrepp var i enlighet med Kinas Nanfang-sjukhuspolicy för hed och välbefinnande (tillämpning nr: NFYY-2019-73).
1. Musberedning
- Bedöva musen.
- Förbered natriumpentobarbital (50 mg/kg) i en spruta.
- Ta tag i musen (8 veckor gammal manlig C57BL/6) med vänster hand så att magen är vänd uppåt och huvudet är lägre än svansen. Desinficera bukhuden med 75% alkohol.
- Håll sprutan i höger hand, genomborra bukens vita linje med nålen något till höger sida av huden med 3-5 mm. Se till att sprutnålen och huden är i 45° vinkel, injicera pentobarbital långsamt i bukhålan. Efter rakning desinficerar du runt musens snittplats 3 gånger växelvis med 75% alkohol och klorhexidinlösning.
- Kontrollera om anestesin lyckades med bristen på en högerreflex.
- Injicera Rhodamine B isothiocyanate–dextran i kaudal venen.
- Bered 100 μL 10 mg/ml rhodamin B isothiocyanate–dextran i en spruta.
- Torka musens svans med 75% alkohol.
- Håll svansen med vänster hand, håll sprutan i höger hand med nålen parallellt med venen och injicera 100 μL-färgämnet.
- Stoppa blödningen med en bomullspinne efter injektionen.
- Blötlägg musens bukpäls med gasväv våt med sterilt vatten och raka musens buk med en rakhyvel, vilket gör slag i pälsens riktning. Efter rakning desinficerar du runt musens snittplats 3 gånger växelvis med 75% alkohol och klorhexidinlösning.
- Efter att ha torkat en värmeplatta med 75% alkohol, öppna värmedynan och placera musen på ryggen i värmedynan för att bibehålla kroppstemperaturen vid 37 °C.
2. Fixering av muslever med kroppsorgansbildramen
OBS: Den kommersiella organavbildningsramen har ännu inte släppts.
- Placera en ren sugkopp i fast läge.
- Installera en organavbildningsfixtur (Kompletterande figur 1) och torka av värmedynan och sugkoppen med 75 % alkohol.
- Anslut sugkoppen (5 mm diameter) till vakuumpumpsslangen och slå på vakuumpumpen.
- På ett sterilt bord steriliserat med 75% alkohol desinficerar du runt musens snittplats 3 gånger växelvis med 75% alkohol- och klorhexidinlösning, desinficerar sedan runt musens snittplats 3 gånger växelvis med 75% alkohol- och klorhexidinlösning, använd sedan kirurgisk sax för att skära 2 cm hud från musens nedre sternala gräns och exponera levern.
- Placera musen tillsammans med värmedynan på hållarens bas.
- Justera organavbildningsfixturen så att sugkoppen håller levern. Använd sedan ett undertryck på 30-35 kPa för sug så att levern fästs på sugkoppen (kompletterande figur 2).
3. Justera multifotonlaserskanningsmikroskopet
- Slå på multifotonmikroskopet och välj målet 60x/1,00 W.
- Fixera ramen och musen under objektivet.
- Tillsätt en droppe normal saltlösning som kan täcka hela linsen, som är mitten av sugkoppen, och justera objektivet för att bara röra vid den normala saltlösningen.
- Dubbelklicka på datorikonen för att slå på laserprogramvaran och slå på strömbrytaren. Tryck sedan och håll strömbrytaren intryckt och slutaren i 3 s.
- Ställ våglängden på 800 nm.
- Starta operativsystemet mikroskop med hjälp av datorn.
- För förvärvsinställningenställer du in Laser 800.
4. Observation med multifoton laser scanning mikroskop
- Klicka på fluorescerande växel för bildförvärvskontroll.
- Se till att rummet och utrustningens lampor är avstängda. För att minska ljudnivåerna, använd mikroskopet i en mörkare miljö.
- Öppna ljusvägens slutare på mikroskopet.
- Vrid fluorescensfiltret till den fjärde växeln och dra i de två spakarna på den optiska strömbrytaren.
- När du tittar genom okularet använder du de grov- och finfokuserande kvasvaspiralerna för att justera brännviddenoch använder X /Y-axlarna för att justera synfältet för att hitta målområdet.
5. Multiphoton laser scanning mikrografi
- Stäng av lysrörsbrytaren på programvaran, byt lysrörsfiltret till den andra växeln (andra växeln är RXD1) och tryck på de två spakarna på den optiska strömbrytaren.
- Klicka på Fokus ×2 för att förhandsgranska målområdet och justera parametrarna för förvärvsinställning och bildförvärvskontroll (bildupplösning: 1024).
- Tryck på Ctrl + C och justera högspänning, förstärkning och förskjutning (för att minska ljudnivåerna).
- Klicka på Stoppa om du vill stoppa förhandsgranskningen, klicka på XY-knappen för att skanna i två dimensioner och spara efter slutförande ( bild1).
- Välj en region, klicka på Djupoch förhandsgranska sedan för att välja slutuppsättningen och startuppsättningen (se den fullständiga nödvändiga delen av blodkärlet) i mikroskopinställningen. Skanna 3D-bilder och spara efter slutförande (bild 2).
- Välj en region, klicka på Tid ochjustera andra anskaffningsinställnings- och bildförvärvskontrollparametrar (Stegstorlek: 1 μm; Skivor: 10; Tidsskanningsnummer: 40). Skanna olika segment och spara efter slutförande för att få rörliga bilder (Video 1).
OBS: Ha någon som bryr sig om mössen under skanningen och tillsätt anestesi i enlighet därmed. - Offra musen efter hals dissekering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fördelningen av blodkärl i levern kan ses i figur 1, erhållen med multifotonmikroskopi. Blodkärlet är uppdelat i en mångfald av grenar som härrör från en bagagelucka och distribueras till det omgivande utrymmet. Blodkärlets yttre omkrets är röd, den inre håligheten är mörk och det finns många saker inuti. Ju tydligare bilden är, desto närmare observationsplanet är det. Det finns också några röda fläckar runt, förmodligen för att färgämnet tränger in i den omgivande vävnaden för att färga andra ämnen. I video 1finns det icke-röda saker som kan vara celler som rör sig i de röda blodkärlen. I slutet av videon är några av dessa saker mörkare. Detta beror förmodligen på att den fasta levern inte har fixats väl över tiden. Denna metod tillåter avbildning i 2 timmar.
Figur 1: Blodkärlen i levervävnaden under multifotonmikroskopi. Blodkärlen är röda. En tvådimensionell bild av blodkärlet med upplösningen 2048 och ett HV på 512, kan tydligt avbilda de röda blodkärlen efter färgning. Det finns också några röda fläckar runt, och färgämnet kan också tränga in i den omgivande vävnaden för att färga andra ämnen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Tredimensionell bild av levande levervävnad i samma position. Tjockleken är 9 μm, blodkärlens morfologi observeras från olika vinklar och dynamiska bilder samlas in. Efter syntesen ses cellerna i blodkärlen (mörka) flöda. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Kompletterande figur 1: Bildram för kroppsorgan. a)Värmedyna: Den bibehåller muskroppens temperatur. b) Fäste: Det kan ge en bas för att placera musen och det justerbara sugkoppsläget med knoppar. c)Sugkopp: Den är fastsatt av fästet. Det negativa trycket från undertryckspumpen gör att levern adsorberar till den genomskinliga linsen i mitten av sugkoppen. (d) Flexibelt rör: Den förbinder sugkoppen med tryckpumpen. Tryckpumpen ger ett undertryck till sugkoppen. e)Centrifugrör: Centrifugröret i mitten av det flexibla röret kan hålla vätskan för att förhindra att dessa vätskor sugs in i vakuumpumpen. f)Tryckpump: Den ansluts till sugkoppen med det flexibla röret. Undertryckspumpen kan ge negativt tryck till sugkoppen för att få levern att klamra sig fast vid linsen. Klicka här för att ladda ner den här siffran.
Kompletterande figur 2: En närbild av levern fäst vid genomskinlig lins. Den genomskinliga linsen är i mitten av sugkoppen. Pumpen ger negativt tryck till sugkoppen för att få den att suga levern och levern är fäst vid den genomskinliga linsen. Eftersom den sugansikte levern är lite borta från musen, minskar effekten av andning och hjärtslag på artefakter. Den genomskinliga linsen kan ge en stabil vy för multifotonmikroskopet. Klicka här för att ladda ner den här siffran.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Att observera en specifik levande vävnad är ett effektivt sätt att förstå förändringar, lokalisering och biologiska effekter av materialet inutivävnaden 17. I detta experiment är de viktiga stegen att fixa levern med en organavbildningsfixtur, vilket kan lösa problemet med rörelseartefakter på grund av andning och hjärtslag och användningen av ett multifotonmikroskop för observation. Med denna metod observeras leverns inre vävnader in vivo genom ett multifotonmikroskop, och blodkärlen är fluorescerande märkta för att tydligt observera deras position och tredimensionella struktur. Denna metod kan användas för att observera specifika effekter genom att fluorescerande märka ett ämne och dynamiskt följa ämnet i levande vävnad för att ge ytterligare visualiseringar.
Multifotonmikroskopi har utvecklats från att vara en ny teknik till att bli ett oumbärligt verktyg för att samla in information från cellulära händelser i en organiserad vävnadsmiljö. Organet måste dock fixeras för att ge en stabil bild så att metoden kan vara effektiv vid observation av vissa vävnader och organ. Rörelseartefakter från andning och hjärtslagen kan förhindra att levern avbildas direkt, så en kroppsorganfixtur används, som använder principen om vakuum adsorption för att säkra organet och förhindra bildskakning. Vakuumchucken kan också fixa en mängd olika kroppsorgan. Det finns dock risk för vävnadsbrott om lämpligt undertryck inte används eller avbildningstiden sträcker sig över 2 timmar.
Även om upplösningen av multifotonmikroskopi är något mindre än för konfokal mikroskopi, ökas penetrationsdjupet till 9-10 μm, vilket möjliggör tillhandahållande av bilder för djupare vävnadsobservation, cellulära händelser och materialeffekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (81772133, 81902444), Guangdong Natural Science Fund (2020A1515010269, 2020A1515011367), Guangzhou Citizen Health Science and Technology Research Project (201803010034, 201903010072) och Military Medical Innovation Project (17CXZ008).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe x 2 | Hunan Pinan Medical Devices Technology | YA0551 | |
| 5 W heating pad | BiolinkOptics Technology | BL336 | |
| 75% absolute ethanol | Guangdong Guanghua Sci-Tech | 1.17113.023 | |
| Absorbent cotton ball | Healthy Sanitation Kingdom | ||
| Mouse surgical instrument | RWD Life Science | SP0001-G | Including scissors and tweezers |
| Multiphoton microscopy | Olympus | FV1200MPE | |
| Organ imaging fixture | BiolinkOptics Technology | BL336 | Including suction cup, hose, negative pressure pump and bracket |
| Rhodamine B isothiocyanate–Dextran | Sigma | R9379 | |
| Shaving machine | Lei Wa | RE-3201 | |
| Sodium pentobarbital | Sigma | P3761-25G |
References
- Wu, Z., et al. Multi-photon microscopy in cardiovascular research. Methods. 130, 79-89 (2017).
- Zhou, M., Ling, W., Luo, Y. Intrahepatic mass-forming cholangiocarcinoma growing in a giant hepatic hemangioma: A case report. Medicine (Baltimore). 98 (27), 16410 (2019).
- Werkmeister, E., et al. Multiphoton microscopy for blood vessel imaging: new non-invasive tools (Spectral SHG, FLIM). Clinical Hemorheology and Microcirculation. 37 (1-2), 77 (2007).
- Wang, H., et al. Does optical microangiography provide accurate imaging of capillary vessels?: validation using multiphoton microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (10), 1-5 (2014).
- Upputuri, P. K., Sivasubramanian, K., Mark, C. S., Pramanik, M. Recent developments in vascular imaging techniques in tissue engineering and regenerative medicine. Biomed Research International. 2015, 783983 (2015).
- Ustione, A., Piston, D. W. A simple introduction to multiphoton microscopy. Journal of Microscopy. 243 (3), 221-226 (2011).
- Centonze, V. E., White, J. G. Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging. Biophys Journal. 75 (4), 2015-2024 (1998).
- Vogt, N. Chromatic multiphoton imaging of the whole brain. Nature Methods. 16 (6), 459 (2019).
- Bacskai, B. J., et al. Imaging of amyloid-β deposits in brains of living mice permits direct observation of clearance of plaques with immunotherapy. Nature Medicine. 7 (3), 369-372 (2001).
- Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo. Nature. 404 (6780), 876-881 (2000).
- Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons. Nature. 385 (6612), 161-165 (1997).
- Liu, H., et al. In vivo Deep-Brain Structural and Hemodynamic Multiphoton Microscopy Enabled by Quantum Dots. Nano Letters. , (2019).
- Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Intravital multiphoton microscopy as a tool for studying renal physiology and pathophysiology. Methods. 128, 20-32 (2017).
- Shear, J. B. Peer Reviewed: Multiphoton-Excited Fluorescence in Bioanalytical Chemistry. Analytical Chemistry. 71 (17), 598-605 (1999).
- Heymann, F., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
- Yuan, X., et al. Characterization of the first fully human anti-TEM1 scFv in models of solid tumor imaging and immunotoxin-based therapy. Cancer Immunology & Immunotherapy. 66 (3), 367-378 (2017).
- Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. Multiphoton microscopy in biological research. Current Opinion in Chemical Biology. 5 (5), 603-608 (2001).
