Summary
在这个实验中，一只老鼠的尾静脉中注射了可染色血管的罗达明B异氰酸酯。肝脏暴露和固定后，可以选择肝脏的特定部分使用多光子显微镜观察活体的深层组织。
Abstract
观察小鼠肝组织的血管内动力学，使我们能够对小鼠肝脏组织相关疾病进行进一步的深入观察和研究。老鼠被注射一种染料，可以染色血管。要观察小鼠肝脏的体内，它被暴露和固定在一个框架中。使用多光子显微镜获取肝脏组织中血管的二维和三维图像。不断获取选定地点的组织图像，以观察长期变化：还观察到肝组织血管的动态变化。多光显微镜是观察深层组织部分或器官细胞和细胞功能的一种方法。多光子显微镜对组织微观结构具有敏感性，能够在体内以高空间分辨率成像生物组织，从而能够捕获组织的生化信息。多光子显微镜用于观察肝脏的一部分，但修复肝脏，使图像更稳定是有问题的。在这个实验中，一种特殊的真空吸盘用于修复肝脏，并在显微镜下获得更稳定的肝脏图像。此外，该方法还可用于通过用染料标记此类物质来观察肝脏中特定物质的动态变化。
Introduction
血管可以为人体的各种器官组织提供营养，并交换物质。同时，许多细胞因子、激素、药物和细胞也通过血管输送到特定位置而发挥作用。观察肝组织血管变化有助于了解肝组织中血流的分布和物质的输送，有助于分析某些血管相关疾病1、2。
有许多方法可以观察小鼠肝脏的血管。其中，光学显微镜在观察不透明血管组织3方面有许多局限性。多光子显微镜可用于用非侵入性高分辨率4对活体肝脏的血管进行成像。不仅可以获得血管的三维图像，而且该技术还可用于组织组织观察其中的生物效应：此外，整个组织可以成像，而不仅仅是微维塞尔在计算断层扫描和磁共振成像5。
多光子显微镜可用于有效检测深层活组织中零散的荧光信号，光毒性6较小。因此，可以保证活组织的活动，减少损伤。多光子显微镜比共聚焦显微镜具有更好的穿透力，可观察到更深的层7，提供独特的3D成像。多光子显微镜现在常用于成像颅神经8，并已扩展到活小鼠9，10，11的神经元动力学研究。
在这个实验中，在老鼠血管的荧光标记后，肝脏固定在一个框架中，使用多光谱显微镜可以看到活体肝组织中血管的动力学。本实验演示了如何标记特定物质，使用多光子显微镜帮助观察组织内的位置，观察细胞间组织的细胞事件，进行光化学测量12，13，14，并观察活组织15内的物质动力学。例如，肿瘤内皮标记1（TEM1）已被确定为一种新的表面标记，在血管和频闪在许多实体肿瘤，标记单链变量片段（scFv）78对TEM1，然后多光子显微镜可用于小鼠血管瘤的位置和肿瘤16的评估。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所有动物护理和程序均符合中国南方医院健康福祉政策（申请号：NFYY-2019-73）。
1. 鼠标准备
- 麻醉鼠标。
- 在注射器中准备五巴比妥钠（50毫克/千克）。
- 用左手抓住鼠标（8周大的雄性C57BL/6），使其腹部朝上，头部低于尾巴。用75%的酒精消毒腹部皮肤。
- 右手拿着注射器，用针刺穿腹部白线，稍微刺穿皮肤右侧3-5毫米。确保注射针和皮肤处于 45° 角，将五巴比妥缓慢注射到腹腔中。 剃须后，用75%的酒精和氯西丁溶液在小鼠切口周围3次交替消毒。
- 检查麻醉是否成功，因为缺乏正确的反射。
- 将罗达明 B 异氰酸酯 - 脱硝酸盐注射到牛皮静脉中。
- 在注射器中准备100微升10毫克/mL的罗达明B异氰酸酯。
- 用75%的酒精擦拭老鼠的尾巴。
- 用左手握住尾巴，用与静脉平行的针头将注射器握在右手，并注射100微L染料。
- 注射后用棉签止血。
- 用纱布浸泡老鼠的腹部毛皮，用无菌水浸湿，用剃须刀剃掉老鼠的腹部，使毛皮方向中风。剃须后，用75%的酒精和氯西丁溶液在小鼠切口周围3次交替消毒。
- 用75%的酒精擦拭加热垫后，打开加热垫，将鼠标放在加热垫的背面，以保持其体温在37°C。
2. 用身体器官成像框架修复小鼠肝脏
注：商业器官成像框架尚未发布。
- 将干净的吸盘放在固定位置。
- 安装器官成像装置（补充图1），用75%的酒精擦拭加热垫和吸盘。
- 将吸盘（直径 5 毫米）连接到真空泵软管，然后打开真空泵。
- 在用75%酒精消毒的无菌表上，用75%的酒精和氯西丁溶液在小鼠切口周围3次交替消毒，然后用75%的酒精和氯西丁溶液在小鼠切口周围3次消毒，然后用手术剪刀将2厘米的皮肤从小鼠的下胸围上切下来，露出肝脏。
- 将鼠标与加热垫放在支架底座上。
- 调整器官成像夹具，使吸盘保持肝脏。然后使用30-35 kPa的负压进行吸气，使肝脏附着在吸盘上（补充图2）。
3. 调整多光子激光扫描显微镜
- 打开多光显微镜，选择 60x/1.00 W 目标。
- 在客观镜头下修复框架和鼠标。
- 加入一滴普通盐水，可以覆盖整个镜头，这是吸盘的中心，并调整目标透镜，只需触摸正常的盐水。
- 双击计算机图标打开激光软件并打开开关。然后按住电源按钮和快门3s。
- 将波长设置为 800 nm。
- 使用计算机启动显微镜操作软件。
- 对于收购设置，设置激光800。
4. 使用多光子激光扫描显微镜观察
- 有关 图像采集控制，请单击 荧光 开关。
- 确保房间和设备灯关闭。为了降低噪音水平，请在昏暗的环境中使用显微镜。
- 打开显微镜上的光路径快门。
- 将荧光滤光片旋转到第四档，并拉动光学开关的两个操纵杆。
- 透过目镜，使用粗细的聚焦准轴来调整焦距，并使用 X/Y 轴调整视场以查找目标区域。
5. 多光子激光扫描显微图
- 关闭软件上的荧光开关，将荧光滤光片切换到第二档（第二档为 RXD1），并推动光学开关的两个杠杆。
- 单击 Focus ×2 以预览目标区域并调整采集设置和图像采集控制参数（图像分辨率：1024）。
- 按 控 +C 并调整高压、增益和偏移（以降低噪音水平）。
- 单击 "停止" 停止预览，单击 XY 按钮以两个维度进行扫描，并在完成后保存（图 1）。
- 选择一个区域，单击 深度，然后 预览 以选择末端集并在 显微镜 设置中启动集（参见血管的完整要求部分）。扫描 3D 图像并在完成后保存 （图 2）。
- 选择区域，单击 时间，并调整其他采集设置和图像采集控制参数（步大小：1 μm;切片： 10：时间扫描号码：40）。扫描不同的切片并在完成后保存以获取移动图像 （视频 1）。
注意：请在扫描过程中有人照顾小鼠，并相应地添加麻醉。 - 用颈部解剖牺牲鼠标。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
肝脏血管的分布可以在 图1中看到，该图是利用多光子显微镜获得的。血管被分成多个分支，从树干中流出，并分布到周围的空间。血管的外周是红色的，内腔是暗的，里面有很多东西。图像越清晰，离观察平面越近。周围也有一些红点，可能是因为染料穿透周围的组织来染色其他物质。在 视频1中，有非红色的东西，可能是细胞在红血管中移动。在视频的结尾，其中一些东西变暗了。这可能是因为固定肝脏没有随着时间的推移得到很好的修复。此方法将允许成像 2 小时。
图1：多光显微镜下肝组织中的血管。血管是红色的。血管的二维图像分辨率为2048，HV为512，在染色后可以清楚地映像红血管。周围也有一些红点，染料也可能穿透周围的组织来染色其他物质。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：活肝组织的三维图像处于同一位置。厚度为 9 μm，从不同角度观察血管形态，并收集动态图像。合成后，血管中的细胞（黑暗）会流动。 请单击此处查看此图的较大版本。
补充图1：身体器官成像框架。 （a） 加热垫：它保持鼠标体温。（b） 支架：它可以提供一个底座，放置鼠标和可调吸盘位置与旋钮。（c） 吸盘：由支架固定。负压泵提供的负压使肝脏吸附到吸盘中心的透明透镜中。（d） 柔性管道：它连接吸盘与压力泵。压力泵为吸盘提供负压。离心管：柔性管中间的离心管可以容纳液体，防止这些液体被吸入真空泵。（f） 负压力泵：它通过柔性管道连接到吸盘。负压泵可以为吸盘提供负压，使肝脏粘附在镜头上。 请单击此处下载此图。
补充图2：附在透明镜片上的肝脏特写图像。 透明镜头位于吸盘的中心。泵为吸盘提供负压，使其吸吮肝脏，肝脏连接到透明透镜上。由于吸脸肝脏与小鼠稍远，呼吸和心跳对神器的影响降低。透明透镜可为多光子显微镜提供稳定的视图。 请单击此处下载此图。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
观察特定的活组织是了解组织内物质变化、定位和生物影响的有效手段。在这个实验中，重要的步骤是用器官成像固定装置固定肝脏，它可以解决呼吸和心跳导致的运动神器问题，并使用多光子显微镜进行观察。使用这种方法，通过多光子显微镜观察肝脏体内的内部组织，并荧光标记血管，以清楚地观察其位置和三维结构。这种方法可用于观察特定效果，通过荧光标记物质和动态跟踪物质在活组织提供进一步的可视化。
多光子显微镜已经从一种新技术发展成为在有组织的组织环境中收集细胞事件信息不可或缺的工具。然而，器官必须固定到位，以产生一个稳定的形象，使该方法可以有效地观察某些组织和器官。运动文物从呼吸和心跳可以防止肝脏被直接成像，所以使用身体器官夹具，它使用真空吸附原理，以确保器官和防止图像震动。真空夹头也可以修复各种身体器官。但是，如果不使用适当的负压或成像时间超过 2 h，则存在组织破裂的风险。
虽然多光子显微镜的分辨率略低于共聚焦显微镜，但渗透深度增加到 9-10 μm，从而能够提供图像，用于更深入的组织观察、细胞事件和物质效应。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了中国国家自然科学基金委员会（81772133） 的支持。 81902444）、广东省自然科学基金（2020A1515010269、2020A15150111367）、广州市公民健康科技研究项目（201803010034、201903010072）和军事医学创新项目（17CXZ008）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe x 2 | Hunan Pinan Medical Devices Technology | YA0551 | |
| 5 W heating pad | BiolinkOptics Technology | BL336 | |
| 75% absolute ethanol | Guangdong Guanghua Sci-Tech | 1.17113.023 | |
| Absorbent cotton ball | Healthy Sanitation Kingdom | ||
| Mouse surgical instrument | RWD Life Science | SP0001-G | Including scissors and tweezers |
| Multiphoton microscopy | Olympus | FV1200MPE | |
| Organ imaging fixture | BiolinkOptics Technology | BL336 | Including suction cup, hose, negative pressure pump and bracket |
| Rhodamine B isothiocyanate–Dextran | Sigma | R9379 | |
| Shaving machine | Lei Wa | RE-3201 | |
| Sodium pentobarbital | Sigma | P3761-25G |
References
- Wu, Z., et al.
- Zhou, M., Ling, W., Luo, Y. Intrahepatic mass-forming cholangiocarcinoma growing in a giant hepatic hemangioma: A case report. Medicine (Baltimore). 98 (27), 16410 (2019).
- Werkmeister, E., et al. Multiphoton microscopy for blood vessel imaging: new non-invasive tools (Spectral SHG, FLIM). Clinical Hemorheology and Microcirculation. 37 (1-2), 77 (2007).
- Wang, H., et al. Does optical microangiography provide accurate imaging of capillary vessels?: validation using multiphoton microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (10), 1-5 (2014).
- Upputuri, P. K., Sivasubramanian, K., Mark, C. S., Pramanik, M. Recent developments in vascular imaging techniques in tissue engineering and regenerative medicine. Biomed Research International. 2015, 783983 (2015).
- Ustione, A., Piston, D. W. A simple introduction to multiphoton microscopy. Journal of Microscopy. 243 (3), 221-226 (2011).
- Centonze, V. E., White, J. G. Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging. Biophys Journal. 75 (4), 2015-2024 (1998).
- Vogt, N. Chromatic multiphoton imaging of the whole brain. Nature Methods. 16 (6), 459 (2019).
- Bacskai, B. J., et al. Imaging of amyloid-β deposits in brains of living mice permits direct observation of clearance of plaques with immunotherapy. Nature Medicine. 7 (3), 369-372 (2001).
- Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo. Nature. 404 (6780), 876-881 (2000).
- Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons. Nature. 385 (6612), 161-165 (1997).
- Liu, H., et al. In vivo Deep-Brain Structural and Hemodynamic Multiphoton Microscopy Enabled by Quantum Dots. Nano Letters. , (2019).
- Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Intravital multiphoton microscopy as a tool for studying renal physiology and pathophysiology. Methods. 128, 20-32 (2017).
- Shear, J. B. Peer Reviewed: Multiphoton-Excited Fluorescence in Bioanalytical Chemistry. Analytical Chemistry. 71 (17), 598-605 (1999).
- Heymann, F., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
- Yuan, X., et al. Characterization of the first fully human anti-TEM1 scFv in models of solid tumor imaging and immunotoxin-based therapy. Cancer Immunology & Immunotherapy. 66 (3), 367-378 (2017).
- Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W.
