Summary
I dette eksperiment injiceres en mus i halen med Rhodamin B isothiocyanat-dextran, der kan plette blodkar. Efter leveren er eksponeret og fast, en bestemt del af leveren kan vælges til at observere det dybe væv i den levende krop ved hjælp af multiphoton mikroskopi.
Abstract
Overholdelse af den intravaskulære dynamik i muselevervæv giver os mulighed for at foretage yderligere dybdegående observationer og undersøgelser af vævsrelaterede sygdomme i museleveren. En mus injiceres med et farvestof, der kan plette blodkar. For at observere museleveren in vivo udsættes den og fastgøres i en ramme. To og tre-dimensionelle billeder af blodkarrene i levervævet er opnået ved hjælp af et multiphoton mikroskop. Billeder af vævene på de udvalgte steder erhverves løbende for at observere langsigtede ændringer; de dynamiske ændringer af blodkarrene i levervævet observeres også. Multiphoton mikroskopi er en metode til at observere celle- og cellefunktion i dybe vævssektioner eller organer. Multiphoton mikroskopi har følsomhed over for væv mikrostruktur og muliggør billeddannelse af biologiske væv ved høj rumlig opløsning in vivo, hvilket giver mulighed for at fange de biokemiske oplysninger i organisationen. Multiphoton mikroskopi bruges til at observere en del af leveren, men fastsættelse af leveren for at gøre billedet mere stabilt er problematisk. I dette eksperiment bruges en speciel vakuumsugkop til at fikse leveren og opnå et mere stabilt billede af leveren under mikroskopet. Desuden kan denne metode bruges til at observere dynamiske ændringer af specifikke stoffer i leveren ved at markere sådanne stoffer med farvestoffer.
Introduction
Blodkar kan give næringsstoffer til forskellige organvæv i den menneskelige krop, og udveksle stoffer. Samtidig fungerer mange cytokiner, hormoner, lægemidler og celler også gennem vaskulær transport til bestemte steder. Observation vaskulære ændringer i levervæv kan hjælpe med at forstå fordelingen af blodgennemstrømningen i levervæv og transport af stoffer og hjælpe med analysen af visse vaskulære-relaterede sygdomme1,2.
Der er mange måder at observere leverens blodkar på hos mus. Blandt dem har optisk mikroskopi mange begrænsninger i at observere uigennemsigtig vaskulært væv3. Multiphoton mikroskopi kan bruges til at afbilde blodkarrene i levende lever med noninvasive høj opløsning4. Ikke alene kan tre-dimensionelle billeder af blodkar opnås, men teknikken kan også bruges til at hjælpe med at organisere vævet til at observere biologiske virkninger deri; Desuden kan hele vævet afbildes i stedet for kun mikrovesselerne som i computertomografi og magnetisk resonansbilleddannelse5.
Multiphoton mikroskopi kan bruges til effektivt at opdage spredte lysstofrør i dybt levende væv, med mindre fototoksicitet6. Derfor kan aktiviteten af levende væv sikres, og mængden af skader kan reduceres. Multiphoton mikroskopi har bedre gennemtrængende effekt end konfokal mikroskopi, så dybere lag, der skal overholdes7, giver unikke 3D-billedbehandling. Multiphoton mikroskopi bruges nu ofte i billeddiagnostik kranienerver8 og er blevet udvidet til studiet af neuronal dynamik i levende mus9,10,11.
I dette eksperiment, efter fluorescerende mærkning af museblodkar, er leveren fastgjort i en ramme, og dynamikken i blodkarrene i levende levervæv kan ses ved hjælp af multifotonmikroskopi. Dette eksperiment demonstrerer, hvordan man markerer specifikke stoffer, bruger multifotonmikroskopi til at hjælpe med at observere et sted i vævet, observere cellulære begivenheder i det intercellulære væv, foretage fotokemiske målinger12,13,14og observere materialedynamikken inde i det levende væv15. For eksempel, tumor endotel markør 1 (TEM1) er blevet identificeret som en ny overflade markør upreguleret på blodkarrene og stroma i mange faste tumorer, mærkning enkelt-kæde variabel fragment (scFv) 78 mod TEM1, og derefter multiphoton mikroskopi kan bruges til mus hemangioma placering og evaluering af tumorer16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyrepleje og procedurer var i overensstemmelse med Kinas Nanfang Hospital politikker for hede og velvære (ansøgning Nr.: NFYY-2019-73).
1. Museforberedelse
- Bedøve musen.
- Forbered natrium pentobarbital (50 mg/kg) i en sprøjte.
- Grib musen (8 uger gammel mand C57BL/6) med venstre hånd, så dens mave vender op og hovedet er lavere end halen. Desinficer mavehuden med 75% alkohol.
- Hold sprøjten i højre hånd, gennembore maven hvide linje med nålen lidt til højre side af huden med 3-5 mm. Sørg for, at sprøjtenålen og huden er i en vinkel på 45°, og indsprøjt pentobarbitalen langsomt i bughulen. Efter barbering desinficeres omkring musens snitsted 3 gange skiftevis med 75% alkohol og Chlorhexidin-opløsning.
- Kontroller, om bedøvelsen var vellykket på grund af manglen på en højrerefleks.
- Injicere Rhodamin B isothiocyanat-dextran i kaudale vene.
- Der fremstilles 100 μL på 10 mg/mL Rhodamin B isothiocyanat-dextran i en sprøjte.
- Tør musens hale med 75% alkohol.
- Hold halen med venstre hånd, hold sprøjten i højre hånd med nålen parallelt med venen, og injicere 100 μL farvestof.
- Stop blødningen med en vatpind efter injektionen.
- Blød musens abdominal pels med gaze fugtet med sterilt vand, og barber musens underliv ved hjælp af en barbermaskine, hvilket gør slagtilfælde i retning af pelsen. Efter barbering desinficeres omkring musens snitsted 3 gange skiftevis med 75% alkohol og Chlorhexidin-opløsning.
- Efter at have tørret en varmepude med 75% alkohol, skal du åbne varmepuden og placere musen på ryggen i varmepuden for at opretholde kropstemperaturen ved 37 °C.
2. Fastsættelse af museleveren med kroppen organ billeddannelse ramme
BEMÆRK: Den kommercielle organbilledramme er endnu ikke blevet frigivet.
- Placer en ren sugekop i en fast position.
- Der skal installeres et organbilledarmature (supplerende figur 1) og varmepuden og sugekoppen tørres af med 75 % alkohol.
- Tilslut sugekoppen (5 mm diameter) til vakuumpumpeslangen, og tænd vakuumpumpen.
- På et sterilt bord steriliseret med 75% alkohol desinficeres omkring musens snitsted 3 gange skiftevis med 75% alkohol og Chlorhexidin-opløsning, og desinficerer derefter omkring musens snitsted 3 gange skiftevis med 75% alkohol og Chlorhexidin-opløsning, og brug derefter kirurgisk saks til at skære 2 cm hud af musens nederste brystkant og udsætte leveren.
- Placer musen sammen med varmepuden på holderbunden.
- Juster organ billeddiagnostik armaturet, så sugekoppen holder leveren. Brug derefter et undertryk på 30-35 kPa til sugning, så leveren fastgøres til sugekoppen(supplerende figur 2).
3. Justering af multifoton laserscanning mikroskop
- Tænd multifotonmikroskopet, og vælg 60x/1.00 W-målet.
- Fastgør rammen og musen under den objektive linse.
- Tilføj en dråbe normal saltvand, der kan dække hele linsen, som er centrum for sugekoppen, og juster den objektive linse for bare at røre ved den normale saltvand.
- Dobbeltklik på computerikonet for at tænde for lasersoftwaren og tænde for kontakten. Tryk derefter på tænd/sluk-knappen og lukkeren i 3 s.
- Sæt bølgelængden til 800 nm.
- Start mikroskopets driftssoftware ved hjælp af computeren.
- Angiv Laser 800for anskaffelsesindstillingen.
4. Observation ved hjælp af multiphoton laserscanning mikroskop
- Klik på fluorescerende switchen under Billedanskaffelseskontrol.
- Sørg for, at rum- og udstyrslamperne er slukket. For at reducere støjniveauet skal du bruge mikroskopet i et mørkt miljø.
- Åbn lyskurven på mikroskopet.
- Drej fluorescensfilteret til det fjerde gear, og træk i de to håndtag på den optiske kontakt.
- Ser man gennem okularet, skal du bruge grove og fine fokus quasispirals at justere brændvidden, og bruge X/Y akser til at justere synsfeltet for at finde målområdet.
5. Multiphoton laserscanning mikrografi
- Sluk for lysstofrøret på softwaren, skift lysstofrøret til det andet gear (andet gear er RXD1), og tryk på de to håndtag i den optiske switch.
- Klik på Fokus ×2 for at få vist målområdet og justere anskaffelsesindstillingen og parametrene for billedopsamlingskontrol (billedopløsning: 1024).
- Tryk på Ctrl + C og juster højspændingen, forstærkningen og forskydningen (for at reducere støjniveauet).
- Klik på Stop for at stoppe vis udskrift, klik på knappen XY for at scanne i to dimensioner, og gem efter afslutning (Figur 1).
- Vælg et område, klik på Dybde, og klik derefter på Eksempel for at vælge slutsættet og startsættet (se den komplette påkrævede del af blodkarret) i mikroskopindstillingen. Scan 3D-billeder, og gem efter afslutning (Figur 2).
- Vælg en region, klik på Tid, og juster andre anskaffelsesindstillings- og billedopsamlingskontrolparametre (Trinstørrelse: 1 μm; Udsnit: 10; Tidsscanningsnummer: 40). Scan forskellige udsnit, og gem efter afslutning for at hente levende billeder (Video 1).
BEMÆRK: Få nogen til at passe musene under scanningen og tilsæt anæstesi i overensstemmelse hermed. - Ofre musen ved hals dissektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fordelingen af blodkar i leveren kan ses i figur 1, opnået ved hjælp af multiphoton mikroskopi. Blodkarret er opdelt i en mangfoldighed af grene, der stammer fra en kuffert og distribueres til det omgivende rum. Blodkarrets ydre omkreds er rød, det indre hulrum er mørkt, og der er mange ting indeni. Jo klarere billedet er, jo tættere på observationsplanet er det. Der er også nogle røde pletter rundt, sandsynligvis fordi farvestoffet trænger ind i det omgivende væv til at plette andre stoffer. I Video 1, der er ikke-røde ting, der kunne være celler bevæger sig i de røde blodkar. I slutningen af videoen er nogle af disse ting formørket. Dette skyldes sandsynligvis, at den faste lever ikke er blevet rettet godt over tid. Denne metode tillader billeddannelse i 2 timer.
Figur 1: Blodkarrene i levervævet under multifotonmikroskopi. Blodkarrene er røde. Et todimensionelt billede af blodkarret med en opløsning på 2048 og en HV på 512 kan tydeligt forestille sig de røde blodkar efter farvning. Der er også nogle røde pletter rundt, og farvestoffet kan også trænge ind i det omgivende væv til at farve andre stoffer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Tredimensionelt billede af levende levervæv i samme position. Tykkelsen er 9 μm, blodkarrenes morfologi observeres fra forskellige vinkler, og dynamiske billeder indsamles. Efter syntese ses cellerne i blodkarrene (mørke) flyder. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1: Billedramme for karrosseriorganer. (a) Varmepude: Den opretholder musens kropstemperatur. (b) Beslag: Det kan give en base til at placere musen og den justerbare sugekop position med knopper. c)Sugekop: Den fastgøres af beslaget. Det undertryk, som undertrykspumpen giver, får leveren til at adsorbere til den gennemsigtige linse i midten af sugekoppen. d) Fleksibelt rør: Det forbinder sugekoppen med trykpumpen. Trykpumpen giver undertryk til sugekoppen. e)Centrifugerøret: Centrifugerøret i midten af det fleksible rør kan holde væsken for at forhindre, at disse væsker suges ind i vakuumpumpen. f)Undertrykspumpe: Den tilsluttes sugekoppen med det fleksible rør. Undertrykspumpen kan give undertryk til sugekoppen for at få leveren til at klamre sig til linsen. Klik her for at downloade dette tal.
Supplerende figur 2: Et nærbillede af leveren, der er fastgjort til gennemsigtig linse. Den gennemsigtige linse er i midten af sugekoppen. Pumpen giver undertryk til sugekoppen for at få den til at suge leveren, og leveren er fastgjort til den gennemsigtige linse. Fordi suge-faced leveren er en smule væk fra musen, effekten af vejrtrækning og hjerteslag på artefakter er reduceret. Den gennemsigtige linse kan give et stabilt udsyn til multiphoton mikroskop. Klik her for at downloade dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
At observere et bestemt levende væv er et effektivt middel til at forstå ændringer, lokalisering og biologiske virkninger af materialet inde i vævet17. I dette eksperiment, er de vigtige skridt fastsættelse af leveren med et organ imaging armatur, som kan løse problemet med bevægelse artefakter på grund af vejrtrækning og hjerteslag, og brugen af et multiphoton mikroskop til observation. Ved hjælp af denne metode observeres leverens indre væv in vivo gennem et multifotonmikroskop, og blodkarrene er fluorescerende mærket for tydeligt at observere deres position og tredimensionelle struktur. Denne metode kan bruges til at observere specifikke virkninger ved fluorescerende mærkning af et stof og dynamisk følge stoffet i det levende væv for at give yderligere visualiseringer.
Multiphoton mikroskopi har udviklet sig fra at være en ny teknik til at blive et uundværligt redskab til indsamling af oplysninger fra cellulære begivenheder i et organiseret vævsmiljø. Organet skal dog fastgøres for at producere et stabilt billede, så metoden kan være effektiv til at observere visse væv og organer. Bevægelse artefakter fra vejrtrækning og hjerteslag kan forhindre leveren i at blive direkte afbildet, så en krop organ stativ anvendes, som bruger princippet om vakuum adsorption at sikre organet og forhindre billedrystelser. Vakuumpatronen kan også rette en række kropsorganer. Der er dog risiko for brud på vævet, hvis der ikke anvendes passende undertryk, eller billedtiden strækker sig ud over 2 timer.
Selv om opløsningen af multifotonmikroskopi er lidt mindre end confocal mikroskopi, øges dybdeindtrængningsdybden til 9-10 μm, hvilket gør det muligt at levere billeder til dybere vævsobservation, cellulære begivenheder og materielle virkninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (81772133, 81902444), Guangdong Natural Science Fund (2020A1515010269, 2020A1515011367), Guangzhou Citizen Health Science and Technology Research Project (201803010034, 201903010072) og Military Medical Innovation Project (17CXZ008).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe x 2 | Hunan Pinan Medical Devices Technology | YA0551 | |
| 5 W heating pad | BiolinkOptics Technology | BL336 | |
| 75% absolute ethanol | Guangdong Guanghua Sci-Tech | 1.17113.023 | |
| Absorbent cotton ball | Healthy Sanitation Kingdom | ||
| Mouse surgical instrument | RWD Life Science | SP0001-G | Including scissors and tweezers |
| Multiphoton microscopy | Olympus | FV1200MPE | |
| Organ imaging fixture | BiolinkOptics Technology | BL336 | Including suction cup, hose, negative pressure pump and bracket |
| Rhodamine B isothiocyanate–Dextran | Sigma | R9379 | |
| Shaving machine | Lei Wa | RE-3201 | |
| Sodium pentobarbital | Sigma | P3761-25G |
References
- Wu, Z., et al.
- Zhou, M., Ling, W., Luo, Y. Intrahepatic mass-forming cholangiocarcinoma growing in a giant hepatic hemangioma: A case report. Medicine (Baltimore). 98 (27), 16410 (2019).
- Werkmeister, E., et al. Multiphoton microscopy for blood vessel imaging: new non-invasive tools (Spectral SHG, FLIM). Clinical Hemorheology and Microcirculation. 37 (1-2), 77 (2007).
- Wang, H., et al. Does optical microangiography provide accurate imaging of capillary vessels?: validation using multiphoton microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (10), 1-5 (2014).
- Upputuri, P. K., Sivasubramanian, K., Mark, C. S., Pramanik, M. Recent developments in vascular imaging techniques in tissue engineering and regenerative medicine. Biomed Research International. 2015, 783983 (2015).
- Ustione, A., Piston, D. W. A simple introduction to multiphoton microscopy. Journal of Microscopy. 243 (3), 221-226 (2011).
- Centonze, V. E., White, J. G. Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging. Biophys Journal. 75 (4), 2015-2024 (1998).
- Vogt, N. Chromatic multiphoton imaging of the whole brain. Nature Methods. 16 (6), 459 (2019).
- Bacskai, B. J., et al. Imaging of amyloid-β deposits in brains of living mice permits direct observation of clearance of plaques with immunotherapy. Nature Medicine. 7 (3), 369-372 (2001).
- Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo. Nature. 404 (6780), 876-881 (2000).
- Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons. Nature. 385 (6612), 161-165 (1997).
- Liu, H., et al. In vivo Deep-Brain Structural and Hemodynamic Multiphoton Microscopy Enabled by Quantum Dots. Nano Letters. , (2019).
- Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Intravital multiphoton microscopy as a tool for studying renal physiology and pathophysiology. Methods. 128, 20-32 (2017).
- Shear, J. B. Peer Reviewed: Multiphoton-Excited Fluorescence in Bioanalytical Chemistry. Analytical Chemistry. 71 (17), 598-605 (1999).
- Heymann, F., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
- Yuan, X., et al. Characterization of the first fully human anti-TEM1 scFv in models of solid tumor imaging and immunotoxin-based therapy. Cancer Immunology & Immunotherapy. 66 (3), 367-378 (2017).
- Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W.
