Summary
Dans cette expérience, une souris est injectée dans sa veine de queue avec rhodamine B isothiocyanate-dextran qui peut tacher les vaisseaux sanguins. Une fois que le foie est exposé et fixé, une partie spécifique du foie peut être sélectionnée pour observer le tissu profond dans le corps vivant à l’aide de microscopie multiphoton.
Abstract
L’observation de la dynamique intravasculaire du tissu hépatique de souris nous permet d’effectuer d’autres observations et études approfondies sur les maladies tissulaires du foie de souris. Une souris est injectée avec un colorant qui peut tacher les vaisseaux sanguins. Pour observer le foie de souris in vivo, il est exposé et fixé dans un cadre. Des images bidimensionnelles et tridimensionnelles des vaisseaux sanguins dans le tissu hépatique sont obtenues à l’aide d’un microscope multiphoton. Les images des tissus aux sites sélectionnés sont continuellement acquises pour observer les changements à long terme; les changements dynamiques des vaisseaux sanguins dans les tissus hépatiques sont également observés. La microscopie multiphoton est une méthode d’observation de la fonction cellulaire et cellulaire dans les sections ou organes des tissus profonds. La microscopie multiphoton est sensible à la microstructure tissulaire et permet l’imagerie des tissus biologiques à haute résolution spatiale in vivo, ce qui permet de capturer l’information biochimique de l’organisation. La microscopie multiphoton est utilisée pour observer une partie du foie, mais la fixation du foie pour rendre l’image plus stable est problématique. Dans cette expérience, une ventouse sous vide spéciale est utilisée pour fixer le foie et obtenir une image plus stable du foie au microscope. En outre, cette méthode peut être utilisée pour observer les changements dynamiques de substances spécifiques dans le foie en marquant ces substances avec des técédants.
Introduction
Les vaisseaux sanguins peuvent fournir des nutriments pour divers tissus organiques du corps humain, et échanger des substances. Dans le même temps, de nombreuses cytokines, hormones, médicaments et cellules fonctionnent également par le transport vasculaire à des endroits spécifiques. L’observation des changements vasculaires dans le tissu hépatique peut aider à comprendre la distribution du flux sanguin dans le tissu hépatique et le transport des substances, et aider à l’analyse de certaines maladies vasculairesconnexes 1,2.
Il existe de nombreuses façons d’observer les vaisseaux sanguins du foie chez la souris. Parmi eux, la microscopie optique a de nombreuses limites dans l’observation des tissus vasculairesopaques 3. La microscopie multiphoton peut être utilisée pour imager les vaisseaux sanguins des foies vivants avec une haute résolution non invasive4. Non seulement des images tridimensionnelles des vaisseaux sanguins peuvent être obtenues, mais la technique peut également être utilisée pour aider à organiser le tissu pour y observer les effets biologiques; en outre, le tissu entier peut être photographié plutôt que seulement les microvételles comme dans la tomographie calculée et l’imagerie par résonance magnétique5.
La microscopie multiphoton peut être utilisée pour détecter efficacement les signaux fluorescents dispersés dans les tissus vivants profonds, avec moins de phototoxicité6. Par conséquent, l’activité des tissus vivants peut être assurée, et la quantité de dommages peut être réduite. La microscopie multiphoton a une meilleure puissance pénétrante que la microscopie confocale, permettant d’observer des couchesplus profondes 7,offrant une imagerie 3D unique. La microscopie multiphoton est maintenant souvent utilisée dans l’imagerie des nerfs crâniens8 et a été étendue à l’étude de la dynamique neuronale chez les sourisvivantes 9,10,11.
Dans cette expérience, après l’étiquetage fluorescent des vaisseaux sanguins de souris, le foie est fixé dans un cadre, et la dynamique des vaisseaux sanguins dans le tissu hépatique vivant peut être vu en utilisant la microscopie multiphoton. Cette expérience montre comment marquer des substances spécifiques, utiliser la microscopie multiphoton pour aider à observer un emplacement dans le tissu, observer les événements cellulaires dans le tissu intercellulaire, faire des mesures photochimiques12,13,14, et observer la dynamique matérielle à l’intérieur du tissu vivant15. Par exemple, le marqueur endothélial de tumeur 1 (TEM1) a été identifié comme marqueur de surface nouveau upregulated sur les vaisseaux sanguins et le stroma dans beaucoup de tumeurs pleines, marquant le fragment variable d’une chaîne simple (scFv) 78 contre TEM1, et puis la microscopie de multiphoton peut être employée pour l’emplacement et l’évaluation de hemangioma de souris des tumeurs16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tous les soins et procédures des animaux étaient conformes aux politiques de l’Hôpital China Nanfang pour la santé et le bien-être (application No: NFYY-2019-73).
1. Préparation de souris
- Anesthésier la souris.
- Préparer le pentobarbital de sodium (50 mg/kg) dans une seringue.
- Prenez la souris (8 semaines mâle C57BL/6) avec la main gauche de sorte que son ventre est orienté vers le haut et sa tête est plus basse que sa queue. Désinfecter la peau abdominale avec 75% d’alcool.
- Tenant la seringue dans la main droite, percer la ligne blanche de l’abdomen avec l’aiguille légèrement sur le côté droit de la peau de 3-5 mm. Assurez-vous que l’aiguille de seringue et la peau sont à un angle de 45°, injectez le pentobarbital lentement dans la cavité abdominale. Après le rasage, désinfecte autour du site d’incision de la souris 3 fois alternativement avec 75% d’alcool et de chlorhexidine solution.
- Vérifiez si l’anesthésie a été réussie par l’absence d’un réflexe de droitage.
- Injecter rhodamine B isothiocyanate-dextran dans la veine caudale.
- Préparer 100 μL de 10 mg/mL rhodamine B isothiocyanate-dextran dans une seringue.
- Essuyez la queue de la souris avec 75% d’alcool.
- Tenez la queue avec la main gauche, tenez la seringue dans la main droite avec l’aiguille parallèle à la veine, et injectez le colorant de 100 μL.
- Arrêter le saignement avec un coton-tige après l’injection.
- Faire tremper la fourrure abdominale de la souris avec de la gaze mouillée avec de l’eau stérile, et raser l’abdomen de la souris à l’aide d’un rasoir, faire des coups dans le sens de la fourrure. Après le rasage, désinfecte autour du site d’incision de la souris 3 fois alternativement avec 75% d’alcool et de chlorhexidine solution.
- Après avoir essuyé un coussin chauffant avec 75% d’alcool, ouvrez le coussin chauffant et placez la souris sur le dos dans le coussin chauffant pour maintenir sa température corporelle à 37 °C.
2. Fixation du foie de souris avec le cadre d’imagerie d’organe de corps
REMARQUE : Le cadre d’imagerie des organes commerciaux n’a pas encore été libéré.
- Placez une ventouse propre en position fixe.
- Installez un appareil d’imagerie pour organes(figure supplémentaire 1)et essuyez le coussin chauffant et la ventouse avec 75 % d’alcool.
- Connectez la ventouse (5 mm de diamètre) au tuyau de la pompe à vide et allumez la pompe à vide.
- Sur une table stérile stérilisée à 75% d’alcool, désinfecte autour du site d’incision de la souris 3 fois alternativement avec 75% d’alcool et de solution chlorhexidine, puis désinfecte autour du site d’incision de la souris 3 fois alternativement avec 75% d’alcool et de solution chlorhexidine, puis utiliser des ciseaux chirurgicaux pour couper 2 cm de peau de la bordure sternale inférieure de la souris et exposer le foie.
- Placez la souris avec le coussin chauffant sur la base du support.
- Ajustez le appareil d’imagerie d’organe de sorte que la ventouse tienne le foie. Ensuite, utilisez une pression négative de 30-35 kPa pour l’aspiration de sorte que le foie se fixe à la ventouse (Figure supplémentaire 2).
3. Réglage du microscope à balayage laser multiphoton
- Allumez le microscope multiphoton et sélectionnez l’objectif 60x/1.00 W.
- Fixez le cadre et la souris sous l’objectif objectif.
- Ajouter une goutte de solution saline normale qui peut couvrir l’objectif entier, qui est le centre de la ventouse, et ajuster la lentille objective pour juste toucher la solution saline normale.
- Double-cliquez sur l’icône de l’ordinateur pour activer le logiciel laser et allumer l’interrupteur. Appuyez ensuite et maintenez le bouton d’alimentation et l’obturateur pendant 3 s.
- Réglez la longueur d’onde à 800 nm.
- Démarrez le logiciel d’exploitation au microscope à l’aide de l’ordinateur.
- Pour le réglage d’acquisition, définir Laser 800.
4. Observation à l’aide d’un microscope à balayage laser multiphoton
- Pour le contrôle d’acquisitiond’image, cliquez sur le commutateur fluorescent.
- Assurez-vous que les lumières de la pièce et de l’équipement sont éteintes. Pour réduire les niveaux de bruit, utilisez le microscope dans un environnement sombre.
- Ouvrez l’obturateur de chemin lumineux sur le microscope.
- Faites pivoter le filtre de fluorescence vers la quatrième vitesse et tirez sur les deux leviers de l’interrupteur optique.
- En regardant à travers l’oculaire, utilisez les quasispirals de focalisation grossiers et fins pour ajuster la longueur focale, et utilisez les axes X/Y pour ajuster le champ de vision pour trouver la zone cible.
5. Micrographie de balayage laser multiphoton
- Éteignez l’interrupteur fluorescent du logiciel, passez le filtre fluorescent à la deuxième vitesse (la deuxième vitesse est RXD1) et poussez les deux leviers de l’interrupteur optique.
- Cliquez sur Focus ×2 pour prévisualiser la zone cible et ajuster le paramètre d’acquisition et les paramètres de contrôle d’acquisition d’images (résolution d’image : 1024).
- Contrôle de presse + C et ajuster la haute tension, le gain et le décalage (pour réduire les niveaux de bruit).
- Cliquez sur Arrêter pour arrêter l’aperçu, cliquez sur le bouton XY pour numériser en deux dimensions, et économisez après l’achèvement (Figure 1).
- Sélectionnez une région, cliquez sur Profondeur,puis Prévisualisez pour sélectionner l’ensemble d’extrémité et de démarrage (voir la partie complète requise du vaisseau sanguin) dans le réglage microscope. Numérisez des images 3D et économisez aprèsl’achèvement ( Figure 2).
- Sélectionnez une région, cliquez sur Temps et ajustezd’autres paramètres de réglage d’acquisition et de contrôle de l’acquisition d’images (Taille de l’étape : 1 μm; Tranches: 10; Numéro de numérisation du temps: 40). Numérisez différentes tranches et économisez après l’achèvement pour obtenir des images mobiles( Vidéo 1).
REMARQUE : Que quelqu’un s’occupe des souris pendant l’analyse et ajoute l’anesthésie en conséquence. - Sacrifiez la souris par dissection du cou.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La distribution des vaisseaux sanguins dans le foie peut être observée dans la figure 1,obtenue à l’aide de microscopie multiphoton. Le vaisseau sanguin est divisé en une pluralité de branches émanant d’un tronc et distribuées à l’espace environnant. La circonférence extérieure du vaisseau sanguin est rouge, la cavité intérieure est sombre, et il ya beaucoup de choses à l’intérieur. Plus l’image est claire, plus elle est proche du plan d’observation. Il ya aussi quelques taches rouges autour, probablement parce que le colorant pénètre dans le tissu environnant pour tacher d’autres substances. Dans la vidéo 1, il ya des choses non rouges qui pourraient être des cellules se déplaçant dans les vaisseaux sanguins rouges. À la fin de la vidéo, certaines de ces choses sont assombries. C’est probablement parce que le foie fixe n’a pas été fixé bien au fil du temps. Cette méthode permettra l’imagerie pendant 2 heures.
Figure 1 : Les vaisseaux sanguins du tissu hépatique sous microscopie multiphoton. Les vaisseaux sanguins sont rouges. Une image bidimensionnelle du vaisseau sanguin avec une résolution de 2048 et un VH de 512, peut clairement image des vaisseaux sanguins rouges après coloration. Il ya aussi quelques taches rouges autour, et le colorant peut également pénétrer dans le tissu environnant pour teindre d’autres substances. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Image tridimensionnelle du tissu hépatique vivant dans la même position. L’épaisseur est de 9 μm, la morphologie des vaisseaux sanguins est observée sous différents angles, et des images dynamiques sont collectées. Après synthèse, les cellules des vaisseaux sanguins (sombres) s’écoulent. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure supplémentaire 1 : Cadre d’imagerie des organes corporels. (a) Coussin chauffant : Il maintient la température corporelle de la souris. (b) Support: Il peut fournir une base pour placer la souris et la position réglable ventouse avec des boutons. (c)Ventouse: Il est fixé par le support. La pression négative fournie par la pompe à pression négative provoque le foie à adsorb à la lentille transparente au centre de la ventouse. d) Tuyau flexible : Il relie la ventouse à la pompe à pression. La pompe à pression fournit une pression négative à la ventouse. e)Tube centrifugeuse : Le tube de centrifugeuse au milieu du tuyau flexible peut contenir le liquide, pour empêcher ces liquides d’être aspirés dans la pompe à vide. f)Pompe à pression négative : Elle est reliée à la ventouse par le tuyau flexible. La pompe à pression négative peut fournir une pression négative à la ventouse pour rendre le foie s’accrocher à la lentille. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.
Figure supplémentaire 2 : Image en gros plan du foie attaché à une lentille transparente. L’objectif transparent est au centre de la ventouse. La pompe fournit une pression négative à la ventouse pour lui faire sucer le foie et le foie est attaché à la lentille transparente. Parce que le foie ventouse est un peu loin de la souris, l’effet de la respiration et le rythme cardiaque sur les artefacts est réduit. La lentille transparente peut fournir une vue stable pour le microscope multiphoton. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
L’observation d’un tissu vivant spécifique est un moyen efficace de comprendre les changements, la localisation et les effets biologiques du matériau à l’intérieur du tissu17. Dans cette expérience, les étapes importantes sont la fixation du foie avec un appareil d’imagerie des organes, qui peut résoudre le problème des artefacts de mouvement en raison de la respiration et des battements cardiaques, et l’utilisation d’un microscope multiphoton pour l’observation. En utilisant cette méthode, les tissus internes du foie in vivo sont observés au microscope multiphoton, et les vaisseaux sanguins sont étiquetés fluorescentement pour observer clairement leur position et leur structure tridimensionnelle. Cette méthode peut être utilisée pour observer des effets spécifiques en étiquetant une substance de façon fluorescente et en suivant dynamiquement la substance dans le tissu vivant pour fournir d’autres visualisations.
La microscopie multiphoton est passée d’une nouvelle technique à un outil indispensable pour recueillir des informations à partir d’événements cellulaires dans un environnement tissulaire organisé. Cependant, l’organe doit être fixé en place pour produire une image stable afin que la méthode puisse être efficace dans l’observation de certains tissus et organes. Les artefacts de mouvement de la respiration et le rythme cardiaque peuvent empêcher le foie d’être directement imaged, ainsi un montage d’organe de corps est employé, qui emploie le principe de l’adsorption de vide pour fixer l’organe et empêcher le tremblement d’image. Le mandrin sous vide peut également fixer une variété d’organes du corps. Cependant, il y a un risque de rupture tissulaire si la pression négative appropriée n’est pas utilisée ou si le temps d’imagerie s’étend au-delà de 2 h.
Bien que la résolution de la microscopie multiphoton soit légèrement inférieure à celle de la microscopie confoccale, la profondeur de pénétration est portée à 9-10 μm, permettant la fourniture d’images pour l’observation plus profonde des tissus, les événements cellulaires et les effets matériels.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ces travaux ont été soutenus par la National Natural Science Foundation of China (81772133, 81902444), le Guangdong Natural Science Fund (2020A1515010269, 2020A1515011367), le Guangzhou Citizen Health Science and Technology Research Project (201803010034, 201903010072) et le Military Medical Innovation Project (17CXZ008).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe x 2 | Hunan Pinan Medical Devices Technology | YA0551 | |
| 5 W heating pad | BiolinkOptics Technology | BL336 | |
| 75% absolute ethanol | Guangdong Guanghua Sci-Tech | 1.17113.023 | |
| Absorbent cotton ball | Healthy Sanitation Kingdom | ||
| Mouse surgical instrument | RWD Life Science | SP0001-G | Including scissors and tweezers |
| Multiphoton microscopy | Olympus | FV1200MPE | |
| Organ imaging fixture | BiolinkOptics Technology | BL336 | Including suction cup, hose, negative pressure pump and bracket |
| Rhodamine B isothiocyanate–Dextran | Sigma | R9379 | |
| Shaving machine | Lei Wa | RE-3201 | |
| Sodium pentobarbital | Sigma | P3761-25G |
References
- Wu, Z., et al. Multi-photon microscopy in cardiovascular research. Methods. 130, 79-89 (2017).
- Zhou, M., Ling, W., Luo, Y. Intrahepatic mass-forming cholangiocarcinoma growing in a giant hepatic hemangioma: A case report. Medicine (Baltimore). 98 (27), 16410 (2019).
- Werkmeister, E., et al. Multiphoton microscopy for blood vessel imaging: new non-invasive tools (Spectral SHG, FLIM). Clinical Hemorheology and Microcirculation. 37 (1-2), 77 (2007).
- Wang, H., et al. Does optical microangiography provide accurate imaging of capillary vessels?: validation using multiphoton microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (10), 1-5 (2014).
- Upputuri, P. K., Sivasubramanian, K., Mark, C. S., Pramanik, M. Recent developments in vascular imaging techniques in tissue engineering and regenerative medicine. Biomed Research International. 2015, 783983 (2015).
- Ustione, A., Piston, D. W. A simple introduction to multiphoton microscopy. Journal of Microscopy. 243 (3), 221-226 (2011).
- Centonze, V. E., White, J. G. Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging. Biophys Journal. 75 (4), 2015-2024 (1998).
- Vogt, N. Chromatic multiphoton imaging of the whole brain. Nature Methods. 16 (6), 459 (2019).
- Bacskai, B. J., et al. Imaging of amyloid-β deposits in brains of living mice permits direct observation of clearance of plaques with immunotherapy. Nature Medicine. 7 (3), 369-372 (2001).
- Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo. Nature. 404 (6780), 876-881 (2000).
- Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons. Nature. 385 (6612), 161-165 (1997).
- Liu, H., et al. In vivo Deep-Brain Structural and Hemodynamic Multiphoton Microscopy Enabled by Quantum Dots. Nano Letters. , (2019).
- Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Intravital multiphoton microscopy as a tool for studying renal physiology and pathophysiology. Methods. 128, 20-32 (2017).
- Shear, J. B. Peer Reviewed: Multiphoton-Excited Fluorescence in Bioanalytical Chemistry. Analytical Chemistry. 71 (17), 598-605 (1999).
- Heymann, F., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
- Yuan, X., et al. Characterization of the first fully human anti-TEM1 scFv in models of solid tumor imaging and immunotoxin-based therapy. Cancer Immunology & Immunotherapy. 66 (3), 367-378 (2017).
- Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. Multiphoton microscopy in biological research. Current Opinion in Chemical Biology. 5 (5), 603-608 (2001).
