Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

مرفق التكافؤ من جزيئات واحدة للتنظير الطيفي للقوة المستندة إلى AFM

Published: March 16, 2020 doi: 10.3791/60934
Automatic Translation
1, 1, 1,3, 2, 1,3
1Institute of Physical Chemistry, Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, 2Chair in Polymer Chemistry, Saarland University, 3Cluster of Excellence livMatS at FIT - Freiburg Center for Interactive Materials and Bioinspired Technologies, University of Freiburg

Summary

التعلق التكافؤ من جزيئات التحقيق إلى المجهر القوة الذرية (AFM) نصائح cantilever هو تقنية أساسية للتحقيق في خصائصها الفيزيائية. وهذا يسمح لنا لتحديد قوة التمدد، وقوة الامتزاز وطول البوليمرات عن طريق مطياف قوة جزيء واحد المستندة إلى AFM مع استنساخ عالية.

Abstract

الفحص المجهري للقوة الذرية (AFM) القائم على الجزيء الواحد هو أداة مثالية للتحقيق في التفاعلات بين البوليمر الواحد والأسطح. لتجربة جزيء واحد صحيح، التعلق التكافؤ من جزيء التحقيق أمر ضروري لأنه فقط عندها يمكن الحصول على مئات من آثار قوة التمديد مع واحد ونفس جزيء واحد. العديد من الآثار هي بدورها ضرورية لإثبات أن يتم التحقيق جزيء واحد وحده. بالإضافة إلى ذلك، يعد التخميل أمرًا حاسمًا لمنع التفاعلات غير المرغوب فيها بين جزيء المسبار الواحد وطرف الكانتيليفر AFM وكذلك بين طرف AFM cantilever والسطح الأساسي. بروتوكول وظيفية المعروضة هنا موثوق بها ويمكن تطبيقها بسهولة على مجموعة متنوعة من البوليمرات. يتم الكشف عن أحداث جزيء واحد مميزة (أي امتدادات والهضاب) في آثار قوة التمديد. من هذه الأحداث ، يمكن الحصول على المعلمات المادية مثل قوة التمدد وقوة الامتزاز وطول الامتزاز. وهذا مهم بشكل خاص للاستقصاء الدقيق للأنظمة المستجيبة للمحفزات على مستوى جزيء واحد. كما النظم المثالية بولي (جلايكول الإيثيلين) (PEG)، بوليx (N-isopropylacrylamide) (PNiPAM) والبوليسترين (PS) وتمتد من SiO x (لPEG و PNiPAM) ومن الأسطح أحادية الطبقات الذاتية التي يتم تجميعها (لPS) في البيئة المائية.N

Introduction

منذ اختراعه في 1980s1، أصبح مجهر القوة الذرية (AFM) واحدة من أهم تقنيات التصوير في العلوم الطبيعية تتميز بدقة النانو المكانية الفرعية ، ودقة قوة sub piconewton وإمكانية القياس في مختلف ظروف المذيبات ودرجة الحرارة2،3،4،5،66.

وبصرف النظر عن التصوير8،9، يستخدم AFM لأداء مطياف قوة جزيء واحد (SMFS) إعطاء نظرة ثاقبة في التفاعلات لاصقة بين البوليمر واحد والأسطح، والخصائص الفيزيائية للبوليمرات واحدة وآليات تتكشف من البروتينات7،,10،11،,,12،,13،,14،,15،,16. في تجربة SMFS العادية ، يتم إحضارها إلى طرف cantilever وظيفية في اتصال مع سطح بحيث البوليمر في AFM تلميح cantilever physisorbs إلى هذا السطح. من خلال سحب تلميح AFM cantilever من السطح ، يتم تحويل تغيير في انحراف Cantilever AFM إلى قوة تؤدي إلى منحنى تمديد القوة4. يمكن تحديد المعلمات الفيزيائية مثل قوة التمدد وقوة الامتزاز وطول الامتزاز على أنها تعتمد على معلمات مختلفة مثل سرعة السحب ، ووقت السُبل على السطح ، وعمق المسافة البادئة في السطح ، ودرجة الحرارة ، والمذيبات17،و 18 والأسطحالمختلفة مثل الركائز الصلبة ، وأفلام البوليمر أو ثنائيات الدهون المدعومة19،20،21،22. وعلاوة على ذلك، يمكن فحص البوليمر في اتجاهات مكانية مختلفة، وبالتالي التحقيق في خصائص الاحتكاك من البوليمر23،,24،,25،,26.

ملحق التكافؤ من البوليمر التحقيق إلى طرف AFM cantilever ضروري لمثل هذه الدراسات. وهكذا ، فإن العائد العالي من أحداث جزيء واحد مع واحد والبوليمر نفسه ملزمة لتلميح AFM cantilever يمنع أي تحيز للنتائج بسبب معايرة ثابت الربيع من cantilever AFM27،28، نقاط التعلق متفاوتة29 أو البوليمرات متفاوتة (مع أطوال كفاف مختلفة) كما هو الحال في تجارب nanofishing30،31،32. أيضا، يمكن منع التفاعلات مع البوليمرات الأخرى، فضلا عن الآثار في المتوسط على نطاق واسع18،,28. للتعلق التكافؤ من البوليمر إلى تلميح AFM cantilever، يمكن تطبيق أنواع مختلفة من التعديلات الكيميائية، وكثير منها يلخص في الكتاب من قبل هيرمانسون33. أمين وthiol القائم على ربط ردود الفعل وكذلك فوق الكيمياء تمثل الأساليب الأكثر استخداما في AFM cantilever تلميح الوظيفية34،35،36،37،38،39،40،41،42. بيك وآخرون40 تظهر كيفية استخدام 1-إيثيل-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC)/NHS الكيمياء لإرفاق بروتين إلى تلميح AFM cantilever. ومع ذلك ، فإن المجموعات الوظيفية المذكورة تميل إلى الربط المتبادل ، مما يؤدي إلى فقدان الوظائف43،44. أيضا، كاربوديميدس تظهر ميلا إلى التحلل المائي السريع في الحل43. مايليميد ومجموعات ثيول عموما أكثر استقرارا ولا تظهر ردود الفعل crosslinking. البروتوكول المقدم هو الأمثل للبروتوكولات المنشورة سابقا الواردة في المراجع35،39.

هنا ، يتم تقديم بروتوكول وظيفيموثوق به يمكن تعديله بسهولة إلى عدد كبير من البوليمرات المختلفة ، بغض النظر عن خصائص مثل طول الكفاف أو hydrophobicity. تم اختيار ثلاثة بوليمرات مختلفة على سبيل المثال: البولي إيثيلين السكري جليكولN(PEG) وبولي (N-isopropylacrylamide) (PNiPAM) وكذلك ارتفاع كتلة المولان البوليستيرين الكاره للماء (PS). من أجل توفير قدرة ملزمة التكافؤ مع جزيء رابط مناسب، تم اختيار البوليمرات الثلاثة ليضم مويتي تيل تيل تيتشيليك كمجموعة نهاية وظيفية. جزيء الرابط نفسه هو عادة البوليمر PEG قصيرة مع اثنين من المواقع النشطة، ومجموعة سيلان في نهاية واحدة ومجموعة maleimide في الطرف الآخر. الأول يتيح المرفق التكافؤ إلى طرف AFM cantilever والأخير رد فعل ملزم مع مجموعة ثيول من البوليمر الكتلة المولية عالية وظيفية. وعلاوة على ذلك، فإن جزيئات رابط PEG غير النشطة بمثابة طبقة تخميل لمنع التفاعلات غير المرغوب فيها بين البوليمر التحقيق وطرف AFM cantilever وكذلك بين طرف AFM cantilever والسطح الأساسي.

Protocol

ملاحظة: راجع الشكل 1 للحصول على نظرة عامة تخطيطية.

1. إعداد الكاشف

ملاحظة: البوليمرات المستخدمة لهذا البروتوكول هي: ماليميد-البولي إيثيلين جليكول-تريثوكسيسيلين (سيلان-PEG-مال، 5 كيلو دا), ثيول-البولي إيثيلين جليكول-ثيول (HS-PEG-SH, 35Nكيلو دا), thiol إنهاء بولي (N-isopropylacrylamide) (PNiPAM-SH, 637 كيلو دا) وthiol إنهاء البوليسترين (PS-SH, 1.3 mDa).

  1. إعداد الكتلة المولية عالية المعالم PNiPAM-SH عبر البلمرة الجذرية لنقل الذرة ، يليها تحويل وتقليل مجموعة النهاية الوظيفية لإدخال الثيول مويتي ، كما هو موضح في الأدب18. يرجى الاطلاع على الشكل 1 للاطلاع على الهياكل التفصيلية.
  2. لتخزين المواد الكيميائية، وإعداد aliquots أصغر داخل نظام القفازات الجافة مع الغلاف الجوي النيتروجين لتجنب التعرض للأكسجين والرطوبة في الغلاف الجوي. PEG وPNiPAM هي hygroscopic45،46 ومجموعات نهاية وظيفية من PEG ، PNiPAM وPS ومن المعروف أن تصبح تتأكسد بسهولة عند تخزينها في الظروف المحيطة33،47،48. يجب تخزين جميع المواد الكيميائية عند -20 درجة مئوية.
  3. استخدام المذيبات الصف التحليلي أو أعلى. وعلاوة على ذلك، استخدم المياه فائقة النقاء لشطف رقائق AFM cantilevers والأواني الزجاجية لأن تجارب جزيء واحد حساسة جدا لجميع التلوث.

2. إعداد المعدات

ملاحظة: استخدام الملاقط والأكواب المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ أو الزجاج. استخدام ملاقط مقلوبة لقبضة آمنة (على سبيل المثال، نموذج R3 SA وجود ثابت ربيع منخفض).

  1. إعداد RCA (المياه فائقة النقاء، بيروكسيد الهيدروجين والأمونيا (5:1:1)) حل لتنظيف الأواني الزجاجية وملاقط.
  2. وضع السفن في كوب وملئه اركا حتى يتم تغطية الأواني الزجاجية أو ملاقط بالكامل.
  3. سخني الكأس من الخطوة 2.2 لساعة واحدة عند درجة حرارة 80 درجة مئوية.
  4. شطف الأوعية في وقت لاحق مع الماء النقي جدا حتى لا رائحة لاذع هو قابل للتحقق بعد الآن (على الأقل ثلاث مرات).
  5. الأواني الزجاجية الجافة وملاقط في الفرن (120 درجة مئوية).

3. تلميح الوظيفية

ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الخطوات في غطاء الدخان لتجنب استنشاق الأبخرة العضوية. بالإضافة إلى ذلك، هناك حاجة إلى قفازات ومعطف المختبر وحماية العين. استخدم قفازات النتريل أو اللاتكس لكل خطوة لتجنب التلوث. ارتداء قفازات مقاومة للمذيبات عند استخدام التولوين. تتم جميع الخطوات، ما لم ينص على خلاف ذلك، في RT. استخدام معدات وقفازات جديدة لكل خطوة لتجنب التلوث المتبادل المحتمل.

  1. قم بإجراء تنشيط السطح عن طريق تطبيق بلازما الأكسجين على رقاقة AFM CANTilever MLCT-Bio-DC.
    ملاحظة: كفاءة معالجة البلازما لمزيد من خطوات وظيفية جداول مع محتوى الأكسجين في غرفة البلازما.
    1. استخدم ملاقط نظيفة حديثًا لوضع رقائق AFM cantilever في غرفة البلازما (40 كيلو هرتز، 600 واط).
    2. استخدام برنامج التنشيط المعدل حسب الطلب: الإخلاء (0.1 ملبار) - الفيضانات بالأكسجين إلى ضغط: 0.2 ملبار (4 دقيقة) - عملية البلازما (الطاقة: 40٪، المدة: 2 دقيقة، ضغط العملية: 0.2 مبار).
    3. غرفة التهوية والاستمرار مع الخطوة 3.2.2 على الفور من أجل منع أي امتصاص الملوثات لرقائق AFM cantilever من الهواء.
  2. السيلانة والبجيلة
    ملاحظة: التوقيت هو معلمة هامة بين الخطوات. إعداد الحلول طازجة قدر الإمكان خلال أوقات الانتظار. تخضع مجموعات Maleimide للتحلل المائي في الوسائط المائية وتصبح ثيولس بسهولة مؤكسدة إلى ثنائي كبريتيدات في الحل33،47 مما يعوق ردود فعل AFM تلميح وظيفية.
    1. إعداد محلول سيلان-PEG-mal في التولوين (1.25 ملغم/مل) في أنابيب بلاستيكية أو زجاجية مقاومة للمذيبات وصب 6 مل من المحلول في أطباق بيتري مسطحة، 3 مل لكل منهما.
      ملاحظة: إذا لوحظ ربط البوليمرات التحقيق متعددة في تجربة SMFS، خلط سيلان-PEG-المال مع سيلان-PEG غير وظيفية يمكن أن تقلل من عدد نقاط الرسو. لتعديل طبقة التخميل PEG مع كتل مختلفة (أي، أطوال كفاف) يمكن استخدامها27.
    2. احتضان رقائق AFM cantilever مباشرة بعد الخطوة 3.1.3 في حل سيلان-PEG-mal (ما يصل إلى 10 رقائق لكل طبق بيتري) لمدة 3 ساعة عند 60 درجةمئوية 35.
    3. أخرج أطباق بيتري من الفرن واترك المحلول يبرد لمدة 10 دقيقة على الأقل.
    4. شطف كل رقاقة AFM cantilever بعناية. قلل من تأثير القوى الشعرية على الكانتيليفر AFM عند تمرير واجهة المذيبات الهوائية ، على سبيل المثال عن طريق إمالة هذه الرقائق قليلاً عند الغمر في الحل.
      1. لالبوليمرات PEG وPS، شطف ثلاث مرات مع التولوين.
      2. لبوليمر PNiPAM، شطف مرة واحدة مع التولوين ومرتين مع الإيثانول.
    5. اختيار ما لا يقل عن اثنين من رقائق AFM cantilever كسيطرة رقائق AFM cantilever، تخطي الخطوة 3.3 وشطف لهم على النحو التالي لزيادة قطبية المذيبات:
      1. لالبوليمرات PEG وPS، شطف مرتين مع الإيثانول ومرة واحدة مع الماء فائق النقاء.
      2. لبوليمر PNiPAM، شطف مرتين مع الماء فائق النقاء.
        ملاحظة: لقد مرت رقائق الكانتيليفر التحكم AFM من خلال جميع خطوات وظيفية باستثناء مرفق البوليمر (الخطوة 3.3). وهي تعمل على إثبات نظافة عملية التشغيل ، ونظام حامل رقاقة AFM ، والأسطح والمذيبات المستخدمة لتجربة SMFS.
  3. مرفق البوليمر الالتكافؤ
    ملاحظة: على الرغم من أن من المتوقع أن يكون تلميح AFM cantilever مغطى بالكامل مع مجموعات maleimide ، هناك عدد قليل من المواقع الملزمة لبوليمر التحقيق واحد ، لأن maleimide يخضع التحلل المائي في الماء مما يؤدي إلى PEGs غير نشط47. تعمل هذه PEGs غير النشطة كطبقة تخميل، كما هو موضح أعلاه.
    1. احتضان رقائق AFM cantilever مباشرة بعد الخطوة 3.2.5 في واحدة من حلول البوليمر التالية في 3 أطباق بيتري مل. إذا لم يتم حل البوليمر المعني بشكل صحيح، استخدم حمام الماء 40 درجة مئوية وحرك الحل بشكل جيد.
      ملاحظة: كما استخدام البوليميرات المنتهية ثيول قد يؤدي إلى تشكيل السندات ديسولدفيد عرقلة رد الفعل مع مجموعات maleimide من سيلان-PEG-mal، ينصح عامل تخفيض، لا سيما إذا تم تطبيق الخطوة 3.3 في المخازن المؤقتة المائية للبوليمرات القابلة للذوبان في الماء33.
      1. بالنسبة لبوليمرات PEG و PS، استخدم تركيزًا قدره 1.25 ملغم/مل في التولوين لمدة ساعة واحدة عند 60 درجة مئوية.
      2. بالنسبة لبوليمرات PNiPAM ، استخدم تركيزًا قدره 1.25 ملغم / مل في الإيثانول لمدة 3 ساعة في RT.
        ملاحظة: إذا لوحظ ربط البوليمرات التحقيق متعددة في تجربة SMFS، يجب تقليل تركيز البوليمر.
    2. شطف بعناية كل رقاقة AFM cantilever.
      1. لالبوليمرات PEG وPS، شطف مرتين مع التولوين، مرتين مع الإيثانول ومرة واحدة مع الماء فائق النقاء بعد 10 دقيقة بارد.
      2. بالنسبة لبوليمرات PNiPAM، شطف مرتين مع الإيثانول ومرتين مع الماء فائق النقاء.
    3. قم بتخزين كل شريحة AFM cantilever بشكل منفصل في طبق بيتري صغير (1 مل) مليء بالماء فائق النقاء عند درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى يتم استخدامه في التجربة.

4. إعداد السطح

  1. رقاقة أكسيد السيليكون
    ملاحظة: تم استخدام هذا السطح لSMFS مع PEG و PNiPAM.
    1. قطع رقاقة أكسيد السيليكون في قطع صغيرة باستخدام سكين الماس.
    2. وضع قطع أكسيد السيليكون بشكل منفصل في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة وملء هذه الأنابيب مع الإيثانول.
    3. سونيكات قطع أكسيد السيليكون لمدة 10 دقيقة.
    4. شطف قطع أكسيد السيليكون مع الإيثانول مرتين وتجفيفها تحت تدفق النيتروجين بعناية. استخدام قطع أكسيد السيليكون على الفور.
  2. طبقة أحادية ذاتية التجميع من الكان الكحول الكاره للماء على الذهب (SAM)
    ملاحظة: تم استخدام هذا السطح لSMFS مع PS. انظر الأدب39،49 لمزيد من المعلومات حول SAMs.
    1. استخدام رقاقة السيليكون المغلفة بالذهب (A [100]، 5 نانومتر التيتانيوم، 100 نانومتر الذهب) لتنفيذ الخطوات 4.1.1 - 4.1.4.
    2. احتضان القطع السطحية في محلول 1-dodecanthiol (2 mM) لمدة 18 ساعة.
    3. شطف SAMs الطازجة المعدة في الإيثانول مرتين.
    4. SAMs الجافة مع تدفق النيتروجين للاستخدام المباشر أو تخزينها في الإيثانول لمدة تصل إلى 4 أيام لاستخدامها في وقت لاحق.

5 - الحصول على البيانات

ملاحظة: تم إجراء جميع القياسات المعروضة هنا في مياه فائقة النقاء باستخدام Cypher ES AFM باستخدام مرحلة عينة التدفئة والتبريد للاختلاف في درجة الحرارة. وبوجه عام، يمكن استخدام جميع الآليات الإنتاجية التي توفر القدرة على القياس بالسوائل.

  1. أدخل رقاقة AFM cantilever الوظيفية في AFM.
  2. الغراء السطح المعدة في حامل عينة التي هي مناسبة لقياس في السوائل (على سبيل المثال، عالية الدقة تكرار مركب 101RF أو لاصقة قابلة للشفاء الأشعة فوق البنفسجية).
    ملاحظة: هذه العوامل الترابط خاملة للغاية ومقاومة لعدد كبير من المذيبات القطبية. وينبغي التحقق من مقاومة المادة اللاصقة للمذيبات غير القطبية (مثل التولوين أو الهكسان) أو درجات الحرارة المرتفعة قبل الاستخدام.
  3. تزج رقاقة AFM cantilever وعينة التحقيق في السائل، وهنا: المياه فائقة النقاء.
    ملاحظة: يمكن إيداع قطرة مذيبة (حوالي 100 ميكرولتر) على حامل رقاقة AFM cantilever. تغطية رقاقة AFM cantilever مع المذيبات يقلل من القوى الشعرية، والتي من شأنها أن تعمل على خلاف ذلك على cantilever AFM عند الاقتراب من سطح العينة التي تمر عبر واجهة الهواء المذيبات.
  4. إذا لزم الأمر، ضبط درجة الحرارة والسماح للنظام equilibrate.
    ملاحظة: قد تؤدي التغيرات في درجة الحرارة إلى انحراف الكانتيليفر AFM بسبب تأثير ثنائي الفلزات لـ AFM cantilevers مع طلاء عاكس مثل الألومنيوم أو الذهب. وينبغي إجراء التوازن بعيداً عن السطح (عدة ميكرومتر) إلى أن لا يلاحظ أي تغيير آخر في إشارة الانحراف (حتى 15 دقيقة لـ MLCT-Bio-DC).
  5. تختلف درجة الحرارة عشوائيا لاستبعاد أي آثار الشيخوخة من الوظيفية. تأكد من أن درجات الحرارة المطبقة لا تؤدي إلى الانحناء لا رجعة فيه من cantilever AFM.
    ملاحظة: قد تعيق أي تأثيرات في درجة الحرارة على خصائص المذيبات (مثل التبخر أو التغيرات في اللزوجة) تجاربك. في الأمثلة المعروضة، تباينت درجة الحرارة على مدى يصل إلى 40 ك في خطوات من 10 K أخذ الماء كمذيب (على سبيل المثال، من 278 K إلى 318 K).
  6. اقترب من السطح لتحديد InvOLS (حساسية الرافعة البصرية العكسية) عن طريق أخذ منحنيات تمديد القوة على سطح صلب (مثل أكسيد السيليكون). لهذا، خذ إشارة انحراف كاشف الصور (في الخامس) مقابل المسافة بيزو وتحديد المنحدر من الجزء الذي يمثل المسافة البادئة من تلميح AFM cantilever في السطح الأساسي (نظام مثير للاشمئزاز) باستخدام دالة خطية. لتقليل الأخطاء، خذ متوسط خمس قيم على الأقل للحصول على قيمة InvOLS النهائية. لمزيد من التفاصيل، راجع الأدب4،39.
    ملاحظة: يمكن تحديد InvOLS فقط بشكل موثوق على الأسطح الصلبة. في حالة التجارب على الأسطح الناعمة أو الواجهات تأكد من وضع سطح صلب بالقرب من الأسطح الناعمة. بعد ذلك، يمكن إجراء معايرة InvOLS قبل أو بعد تجارب السطح الناعم دون الحاجة إلى تفكيك إعداد AFM.
  7. لتحديد الربيع المستمر، نقل cantilever AFM إلى ارتفاع مع التفاعلات لا جذابة ولا مثيرة للاشمئزاز بين AFM تلميح cantilever والسطح (عدة ميكرومتر). ثم قم بتسجيل طيف الضوضاء الحرارية حيث يتم رسم الكثافة الطيفية للقدرة (PSD) مقابل التردد. وعادة ما يتم تنفيذ الخطوات التالية من خلال الوظائف المدمجة الآلي في برنامج AFM التجاري: أولاً، يتم تحليل طيف الضوضاء الحرارية المكتسبة من خلال تركيب وظيفة لPSD، على سبيل المثال، مذبذب متناغم بسيط (SHO). ويتم احتواء تصل إلى الحد الأدنى بين الرنين الأول والثاني. ثانياً، يتم تحديد المنطقة الواقعة تحت الجزء المجهز من قطعة الترددات PSD مقابل التردد التي تمثل متوسط الإزاحة المربعة لـ AFM في الاتجاه الرأسي. وأخيرا، يتم استخدام نظرية equipartition للحصول على قوة AFM cantilever ثابت28،,50.
    ملاحظة: ينبغي استخدام نطاق تردد مناسب يشمل ذروة الرنين الأولى لـ AFM cantilever. للحصول على نسبة إشارة إلى ضوضاء مرضية، يجب تجميع ما لا يقل عن 10 PSDs بأعلى دقة تردد ممكنة.
  8. بدء التجربة. تسجيل خرائط القوة عن طريق أخذ منحنيات تمديد القوة بطريقة تشبه الشبكة (على سبيل المثال، 10 × 10 نقاط لمساحة 20 × 20 ميكرومتر2)لتجنب أي تأثيرات سطحية محلية (مثل الشوائب والخلع) ومتوسط مناطق سطح مختلفة.
    ملاحظة: المعلمات النموذجية هي سرعة سحب 1 ميكرومتر/سنة ومعدل أخذ العينات 5 كيلو هرتز لضمان دقة كافية. وينبغي تكييف معدل أخذ العينات عندما تتنوع سرعة السحب. وينبغي تكييف مسافة التراجع مع طول كفاف أو الامتزاز من البوليمر المقاس (حوالي ضعف الطول المتوقع).
  9. استخدام وتختلف في الوقت يسكن نحو السطح للسماح للبوليمر واحد إلى التمسك السطح (عادة 0 - 5 s).
  10. كرر تحديد InvOLS وثابت الربيع في نهاية التجربة للتحقق من اتساق واستقرار النظام.
    ملاحظة: للالتصاق القوي بين البوليمر والسطح، يمكن إجراء المعايرة بعد التجربة الفعلية للحفاظ على الأداء الوظيفي.

6 - تقييم البيانات

ملاحظة: لتقييم البيانات، تم استخدام برنامج مكتوب حسب الطلب يستند إلى إيغور برو لتنفيذ الخطوات التالية.

  1. تحويل إشارة انحراف الخام (في فولت) إلى قيم القوة (في نيوتن) عن طريق الضرب مع InvOLS المسجلة وثابت الربيع المحدد.
  2. طرح انحراف من cantilever AFM (بعد مضاعفة إشارة انحراف الخام مع InvOLS) من المسافة التي تحركها عناصر بيزو في الاتجاه الرأسي من أجل الحصول على التمديد الحقيقي (تلميح سطح المسافة)4.
  3. تصحيح منحنيات تمديد القوة التي تم الحصول عليها للانجراف عن طريق تركيب دالة خطية لخط الأساس بعد الحدث الأخير وطرح نفسه من منحنى تمديد القوة. وينبغي أن يمثل الجزء المجهز امتداداً كافياً من السطح حيث لا تلاحظ تفاعلات جذابة أو مثيرة للاشمئزاز بين طرف AFM cantilever والسطح الأساسي. ثم يتم تعيين الأساس إلى المحور صفر.
    ملاحظة: في حالة القياسات على الأسطح العاكسة للغاية مثل الذهب، قد تظهر التداخلات. هذه نتيجة للانعكاس الجزئي لشعاع الليزر من السطح ومن المؤخر للcantilever AFM. لذلك، قد تظهر منحنيات تمديد القوة التي تم الحصول عليها قطعة أثرية إشارة قوة جيبية على طول الامتداد الرأسي. هذه قطعة أثرية تعيق قيم القوة النهائية. من أجل أن تأخذ هذه المنحنيات تمديد القوة في الاعتبار ، من الممكن تصحيح(الشكل 2).
  4. إذا ظهرت التداخلات في منحنيات تمديد القوة، فحدد منحنى توسيع القوة التمثيلي (منحنى التراجع) الذي لا يظهر أي أحداث أخرى غير ذروة الالتصاق غير المحدد ونفس القطعة الأثرية الجيبية (أي السعة والمرحلة)(الشكل 2A).
    ملاحظة: تنعيم منحنى تمديد القوة التمثيلي من أجل الحصول على نمط التردد المنخفض للتداخل.
  5. حدد منحنى تمديد القوة الذي سيتم تصحيحه(الشكل 2B).
  6. تراكب كل من منحنيات تمديد القوة من الخطوات 6.4. و 6.5. للتأكد من أن كلا من تظهر نفس القطعة الأثرية الجيوب الأنفية (أي السعة والمرحلة)(الشكل 2C).
  7. طرح منحنى توسيع القوة التمثيلي (الممهد) من منحنى تمديد القوة ليتم تصحيحه مما يؤدي إلى خط أساس مستقيم بدلاً من خط أساس جيبي(الشكل 2D).
    ملاحظة: الحرص على أن ذروة الالتصاق غير محددة من منحنى ممثل متميزة عن أي أحداث جزيء واحد تظهر في المنحنيات التي سيتم تصحيحها. في الواقع ، واختيار منحنى تمثيلي أمر حاسم لتصحيح السليم.

Representative Results

تظهر الأمثلة التالية نتائج تمتد جزيء واحد والامتزاز من البوليمرات PEG، PNiPAM وPS. تم استخدام جميع نصائح AFM cantilever مع البروتوكول المذكور أعلاه. تم قياس PEG و PNiPAM على SiOx مع اختلاف في درجة الحرارة. للحصول على مناقشة مفصلة للمنحنيات الممتدة المعتمدة على درجة الحرارة الناتجة لـ PEG و PNiPAM ، انظر Kolberg et al.18 هو شعار قوة تمديد مختلف هو هضبة من القوة الثابتة (على سبيل المثال ، عندما desorbing PS من monolayers ذاتية التجميع من الميثيل إنهاء الكان ثيولز على الذهب (SAM) في الماء4،27،39،51).

مثال 1: تمتد من PEG وPNiPAM في الماء
تم قياس سلوك التمدد المعتمد على درجة الحرارة في الماء باستخدام PNiPAM واحد والبوليمرات PEG ملزمة بشكل كامل إلى طرف AFM cantilever في نهاية واحدة وفيزيسورعلى سطحSiO x في الطرف الآخر. بعد تجارب المعايرة والتحكم النظيف (أقل من 2٪ من منحنيات تمديد القوة تظهر أحداث جزيء واحد) ، تم تسجيل خرائط قوة اثنين على الأقل لكل من Cantilever AFM. تم إجراء التجربة المعتمدة على درجة الحرارة عن طريق تسجيل خريطة قوة واحدة على الأقل في كل درجة حرارة. عندما ظهرت أحداث تمدد قليلة فقط ، تم التخلص من كانتيليفر AFM المعني ة وتم أخذ AFM المقبل من الشريحة (عادة في الترتيب C و B و D و E من MLCT-Bio-DC). بالنسبة للبيانات المثالية لـ PEG ، لوحظ حدث تمدد واحد في 95 من أصل 500 منحنيات تمديد القوة المقاسة (19٪). بالنسبة لـ PNiPAM ، أظهر 252 من أصل 600 منحنيات تمديد القوة نمطًا ممتدًا (42٪). ولإجراء مقارنة أفضل بين منحنيات تمديد القوة، تم إنشاء منحنى رئيسي واحد لكل درجة حرارة. لهذا الغرض، فقط تلك المنحنيات مع حدث تمتد إلى ما لا يقل عن 500 pN، حيث التقلبات التشكيلية والآثار المذيبات لا تذكر، تم اختيار52. وكان العدد النهائي للامتدادات التي أخذت في الاعتبار 3 في 278 ك، 7 في 298 ك و 4 في 318 K لPEG و 4 في 278 K، 3 في 298 K و 3 في 318 K لPNiPAM18.

يتم إعطاء الإجراء لإنشاء المنحنيات الرئيسية في الشكل 3. يتم إعادة تحجيم منحنيات تمديد القوة المختارة(الشكل 3A)إلى طول L0 (التمديد بقوة 500 pN)، انظر الشكل 3B. تظهر ذروة الالتصاق اختلافًا كبيرًا في الالتصاق غير المحدد بين السطح وطرف AFM cantilever ، ولكنها لا تؤثر على سلوك التمدد البوليمر. بعد دمج منحنيات تمديد القوة rescaled يتم متوسطها بواسطة تنعيم ثنائي الاسم كما هو موجود في الشكل 3C. لهذا، مرشح غاوسي convolves البيانات مع معاملات طبيعية المستمدة من مثلث باسكال على مستوى يساوي المعلمة التنعيم 2053. وأخيرا، يتم الحصول على منحنى رئيسي لكل درجة حرارة كما هو معطى في الشكل 3D. يُظهر التكبير النطاق الذي يكون فيه تأثير درجة الحرارة على سلوك تمديد القوة أكثر وضوحًا.

يمكن العثور على مقارنة بين سلوك درجة الحرارة من PEG(A)وPNiPAM(B)في الشكل 4. لPEG لوحظ انخفاض قوة التمدد مع زيادة درجة الحرارة. ولوحظت زيادة بنسبة 5 في المائة تقريباً من الامتداد المُعيد في 100 pN عند زيادة درجة الحرارة من 278 إلى 318 ك. بالنسبة لـ PNiPAM ، يمكن الكشف عن تحول معاكس يعتمد على درجة الحرارة. ولوحظ انخفاض بنسبة 1 في المائة تقريباً من الامتداد المُعيد التحجيم عند 100 pN عندما زادت درجة الحرارة من 278 إلى 328 ك. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن الحصول على الطاقة الحرة الممتدة من المنحنيات الرئيسية للقوة- التمديد عن طريق تحديد المنطقة الواقعة تحت المنحنى لأي قيمة قوة معينة. ويمكن استخدام هذا لاستخراج مساهمات حيوية وentropic من الطاقة الحرة تمتد مع مساعدة من ديناميات الجزيئية (MD) المحاكاة18.

مثال 2: امتلاك PS من سطح SAM في الماء
ويمكن استخدام الامتزاز PS من سطح سام في الماء لتحديد قوة الامتزاز والطول وبالتالي تحديد حجم التفاعل الكاره للماء. بعد المعايرة، تم تسجيل خريطتين للقوة على الأقل في موقعين مختلفين من السطح. عندما كان مرفق البوليمر ناجحا، أظهرت منحنيات قوة التمديد هضاب القوة الثابتة، كميزة مميزة، انظر الشكل 5A والشكل 5C. ويلاحظ امتصاص مثل الهضبة عندما ديناميات السندات التحقيق أسرع بكثير من معدل سحب تلميح AFM cantilever (شبه التوازن). توفر قوى الامتزاز من منحنيات تمديد القوة الشبيهة بالهضبة مباشرة ً طاقات حرة للالتصاق من خلال دمج تتبع القوة- التمديد54. وقد استخدمت لتحديد التفاعلات الكهروستاتيكية والتشتتية والكارهة للماء وكذلك خصائص الاحتكاك من البوليمرات واحدة على الأسطح في البيئة السائلة2،4،23،51،54،55.

تم تجهيز كل هضبة من القوة الثابتة مع منحنى السيني لتحديد قوة الامتزاز وطول الامتزاز، والتي تم رسمها بعد ذلك في الرسوم البيانية. تم تجهيز الرسوم البيانية مع غاوسية لاستخراج القيمة القصوى والانحراف المعياري. للحصول على نظرة عامة أفضل، تم عرض قوة الامتزاز وقيم الطول معًا في مخطط مبعثر، كما هو معطى في الشكل 5B والشكل 5D.

للحصول على البوليسترين على SAM في الماء، وقوى الامتزاز تحديد تتوافق مع القيم التي تم الحصول عليها سابقا19،,23. كما يرتبط طول الامتزاز مع طول كفاف البوليمر51، يمكن استخدام توزيع طول الامتزاز كدليل على الربط المنضدي للبوليمر المعني إلى طرف AFM cantilever عبر مجموعته النهائية الوظيفية. وبالتالي ، فإن طول الامتزاز بمثابة بصمة.

لأكثر من بوليمر واحد تعلق على طرف AFM cantilever، يمكن ملاحظة سلاسل من الهضاب (خطوات منفصلة) في منحنيات قوة التمديد56. كل هضبة تمثل الامتزاز من البوليمر في تمديد مختلفة. وأظهرت التجربة الواردة في الشكل 5جيم والشكل 5دال حالة نموذجية من بولمرات اثنين متصلين بطرف الكانتيليفر AFM في نفس الوقت. من خلال تركيب التمزق النهائي ، يمكن العثور على توزيع ثنائي الوسائط لطول الامتزاز ، في حين أظهرت قوة الامتزاز توزيعًا ضيقًا. في هذه الحالة ، يمكن العثور على طول الامتزاز الأصغر في 90٪ من منحنيات تمديد القوة ، إما كهضبة واحدة أو كهضبة إضافية على الهضبة الأطول ، كما هو معطى في الشكل 5C. تم العثور على ارتفاع طول الامتزاز في 37٪ من منحنيات القوة التمديد التي تم الحصول عليها. وهكذا، يمكن استخدام توزيع طول الامتزاز لتحديد عدد البوليمرات المختلفة المرفقة بطرف AFM cantilever. بشكل عام، توزيع ضيق لقيم طول الامتزاز هو مؤشر جيد على أن واحد واحد واحد تم فحص البوليمر واحد في منحنيات القوة التمديد التي تم الحصول عليها. وفي الوقت نفسه، يمكن استخدام الموضع الفائق للقوات ذات الصلة - التمديد لتقرير ما إذا كان قد تم قياس واحد واحد واحد من البوليمر.

بعد إثبات الربط المنضدي لبوليمر PS واحد ، يمكن إجراء مزيد من التجارب مع هذا البوليمر PS الركيزة متفاوتة (سطح صلب وكذلك أفلام البوليمر) ، وظروف المذيبات ، ودرجة الحرارة ، وسرعة السحب أو وقت السُكن.

Figure 1
الشكل 1: نظرة عامة تخطيطية لعملية وظيفية تلميح. يتضمن التعديل الكيميائي للتلميح AFM cantilever بعد(1)تنشيط البلازما(2)silanization / PEGylation و(3)مرفق البوليمر. بالإضافة إلى ذلك ، يتم عرض الهياكل الكيميائية التفصيلية للبوليمرات المستخدمة ، وهي PEG و PNiPAM و PS. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: القضاء على التداخلات في منحنيات تمديد القوة. (أ)العثور على منحنى قوة التمديد تظهر قطعة أثرية إشارة قوة الجيوب الأنفية على طول التمديد ولكن ليس هناك جزيء واحد تمتد الحدث. (ب)اختيار منحنى قوة التمديد مع حدث جزيء واحد، والتي يتم تصحيحها من قطعة أثرية الجيوب الأنفية. (C)فرض المنحنيات للسيطرة إذا كانت القطع الأثرية الجيوب الأنفية من المنحنيات مطابقة حقا. (D)عن طريق طرح منحنى تمديد القوة(A)من (B) يتم الحصول على منحنى تمديد القوة مع خط أساس مستقيم. على الرغم من أنه لا يمكن استخدام ذروة الالتصاق لمزيد من التحليل ، إلا أنه يتم الآن تصحيح منحنى تمديد القوة للقطعة الأثرية مما يؤدي إلى قيم قوة أكثر دقة في منطقة حدث الجزيء الواحد (هنا: أكثر من 0.2 ميكرومتر من التمديد). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تحديد المنحنيات الرئيسية من منحنيات تمديد القوة من PEG في 298 K. (أ)بيانات تجريبية عند 298 ك، باستخدام 7 منحنيات تمديد القوة. بعد إعادة التحجيم إلى طول L0 بقوة 500 pN(B)، يمكن دمج منحنيات تمديد القوة ومتوسطها عن طريق تنعيم ثنائي الاسم للحصول على منحنى رئيسي(C). يتم إعطاء المنحنيات التي تم إعادة تحجيمها كنقاط بينما يظهر المنحنى الرئيسي كخط صلب. وأخيرا، يمكن مقارنة المنحنيات الرئيسية التي تم الحصول عليها لدرجات حرارة مختلفة(D). يشير التكبير إلى النطاق الذي يكون فيه تأثير درجة الحرارة على سلوك تمديد القوة أكثر وضوحًا. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: مقارنة المنحنيات الرئيسية المعتمدة على درجة الحرارة من PNiPAM و PEG. لPEG يتم ملاحظة زيادة في تمديد rescaled في 100 pN (نطاق منتصف القوة) عند زيادة درجة الحرارة(A)، في حين أن PNiPAM يتم الكشف عن التحول المعاكس تعتمد على درجة الحرارة(B). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: تحليل منحنيات تمديد القوة من PS على SAM في الماء. (أ)منحنى مثالي للقوة التمديد (أزرق) مع نوبة سيغويدال ية للهضبة (أرجواني). بالإضافة إلى ذلك، علامة الأسهم القوة المحددة (الأحمر) وطول (الأخضر) من الهضبة. يتم عرض قوة الامتزاز وقيم طول الامتزاز التي تم الحصول عليها بواسطة نوبات سيغويدال في مؤامرة مبعثرة ويتم تجهيز المخططات البيانية الناتجة مع غاوسي. (ب)متوسط قوة الامتزاز المحدد وقيم طول الامتزاز هي (112 ± 6) pN و (659 ± 7) نانومتر ، حيث 93 ٪ من منحنيات تمديد القوة تظهر مثل هذه الأحداث الهضبة واحدة. (C)منحنى مثالي لتمديد القوة (أزرق) لاثنين من البوليمرات المرفقة بطرف AFM cantilever في نفس الوقت. هنا، تظهر قوة الامتزاز توزيع أحادي الواسطة مع متوسط قيمة القوة (117 ± 5) pN، في حين يمكن العثور على توزيع ثنائي الوسائط لطول الامتزاز مما يؤدي إلى متوسط قيم الطول (656 ± 9) نانومتر و (1050 ± 16) نانومتر. (D)90٪ من منحنيات قوة التمديد عينة تظهر أحداث الهضبة واحد فقط. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

SMFS المستندة إلى AFM هي واحدة من الأدوات الرئيسية للتحقيق في تفاعلات جزيء واحد في فيزياء البوليمر. لتجربة جزيء واحد صحيح، مرفق التكافؤ من البوليمر التحقيق إلى طرف AFM cantilever أمر ضروري.

وتستند العديد من الأعمال السابقة على تجارب الصيد النانوي، ولا سيما لPNiPAM، حيث يتم امتصاص البوليمرات على سطح ومن ثم امتدت عن طريق اختيار عشوائيا لهم من الركيزة باستخدام تلميح AFM cantilever30،31. وهذا قد يغير النتائج ويؤدي إلى سوء تفسير سلوك جزيء واحد. هناك، قد تهيمن الآثار التعاونية على النتائج لأنه لا يمكن استبعاد التفاعلات مع البوليمرات المجاورة. هذا له تأثير كبير على النتائج ، وخاصة بالنسبة للبوليمرات التي تظهر سلوكًا مختلفًا بشكل كبير بكميات كبيرة مقارنة بالجزيئات المعزولة الفردية57،58.

بروتوكول وظيفية المعروضة هنا موثوق بها ويمكن تطبيقها بسهولة على البوليمرات المختلفة، بغض النظر عن طول كفاف، hydrophobicity أو العائق ستريكامن المونومرات. بالإضافة إلى ذلك، يتم توفير التخميل لمنع التفاعلات غير المرغوب فيها بين البوليمر مسبار واحد وطرف AFM cantilever وكذلك بين طرف AFM cantilever والسطح الأساسي. وعلاوة على ذلك، يظهر تقييم منحنيات تمديد القوة التي تبين أحداث التمدد. وهناك، يُقترح إجراء لتحديد منحنيات تمديد القوة الرئيسية. وهذا يوفر وسيلة أفضل للكشف، على سبيل المثال، عن الآثار المتعلقة بدرجات الحرارة على سلوك تمديد القوة. وعلاوة على ذلك، يتم توفير تحليل أحداث الامتزاز جزيء واحد يضم هضاب القوة الثابتة. أيضا ، يتم إعطاء طريقة بسيطة لتصحيح التحف إشارة قوة الجيوب الأنفية في منحنيات تمديد القوة التي قد تضعف نتائج التجربة.

بالمقارنة مع Stetter وآخرون39، يتم تقليل إجراء التشغيل المقدم هنا إلى ثلاث خطوات بدلاً من أربع وتحسين متانة الإجراء. الفائدة الرئيسية لأداء PEGylation وsilanization في خطوة واحدة هو أن يكون رد فعل أفضل للرقابة وزيادة العائد. وعلاوة على ذلك، هناك حاجة إلى عدد أقل من الحلول اللازمة، كما أن هناك حاجة إلى اتخاذ خطوات أقل في الغسل. وهذا يقلل من الجهد والوقت للتحضير ويزيد من قابلية الاستنساخ. وعلاوة على ذلك ، فإن نقل AFM cantilevers هو دائمًا جزء ًا حاسمًا من عملية التشغيل. النقل من حل إلى آخر دائما ً يخاطر بالتأثير بقوة على جودة التشغيل بسبب عمليات النقل من خلال واجهة الهواء والماء أو فقدان أجهزة AFM عن طريق الاستخدام غير السليم لملاقط.

من أجل إثبات التعلق التكافؤ السليم من البوليمر واحد إلى تلميح AFM cantilever شروط مختلفة يجب أن تتحقق. أولاً، مراقبة AFM cantilevers ذات أهمية كبيرة وينبغي أن تكون مستعدة لكل وظيفية. ولا تعتبر عملية التشغيل والخلية السائلة لإجراء التجارب نظيفة إلا إذا أظهر عدد صغير من منحنيات تمديد القوة امتدادات أو هضاب في تجربة التحكم (في الأمثلة المقدمة أقل من 2 في المائة).

نمط واضح تمتد مع عدم وجود مزيد من قطرات أو ماكسيما ضروري للحصول على جزيء واحد المناسبة تمتد الأحداث. بالإضافة إلى ذلك ، يجب تحليل اعتماد قوة التمزق على معدل تحميل القوة عند التمزق أو الاستجابة المرنة الكاملة لمنحنى التمدد من أجل استبعاد الامتزاز المتزامن للبوليمرات المتعددة59،60. بالنسبة لـ PEG و PNiPAM ، أظهرت 19٪ و 42٪ من منحنيات تمديد القوة التي تم اتخاذها في مواقع مختلفة من السطح نمط ًا ممتدًا من هذا القبيل ، على التوالي. من أجل الحصول على أحداث التمدد ، يجب أن يكون فيزيوبتيون البوليمر إلى السطح الأساسي المعني قويًا. وإلا لوحظ حدث الامتزاز مثل الهضبة. هذا هو أكثر حسما للكشف عن أحداث تمتد في القوات العالية (ما يصل إلى 500 pN أو أكثر). وبما أن هذا الفيزيوبتيون القوي لا يُلبى لكل منحنى تمديد للقوة، فإن غلة مثل هذه الأحداث أقل من أحداث الامتزاز الشبيهة بالهضبة النقية. كبديل، يمكن استخدام مجموعات التمسك بقوة مثل الكاتيشول أو chemisorption بين البوليمر والسطح الأساسي. ومع ذلك ، وهذا يتطلب إدخال المزيد من المجموعات الوظيفية أو مواقع الاقتران في البوليمر61،62.

في الواقع ، فإن الكتلة (أي طول كفاف) من البوليمر يوفر بصمة قيمة. على الرغم من أنه لا يمكن ترجمة الكتلة مباشرة إلى طول كفاف يقاس للأسباب التالية، توزيع الطول قيمة جداً لتعريف الأحداث جزيء واحد. في حالة بوليمر PNiPAM مع تعدد التشتت المنخفض(= 1.28) ، وجدنا اختلافات كبيرة في قيم التمديد لأحداث التمدد التي تم الحصول عليها (وبالتالي في طول البوليمر) في التجارب. ويمكن أن يكون أحد أسباب ذلك هو تحديد طول البوليمر وتوزيعه. في اللونية استبعاد الحجم (SEC)، يتم تحديد الوزن النسبي للبوليمر المستهدف بالمقارنة مع معايير مثل PS أو بولي (ميثاكريلات الميثيل) (PMMA)63. ومن المتوقع أن ينحرف الوزن النسبي المفترض عن الوزن الجزيئي المطلق لأن نصف قطر الهيدرودينامي للبوليمر المستهدف والمعيار يمكن أن يختلف اختلافا كبيرا. بالإضافة إلى ذلك، قد تكون طبقة سيلان oligomerized بواسطة المياه زائفة في التولوين أثناء عملية وظيفية. يؤدي إرفاق مثل هذه القلة إلى طرف AFM cantilever إلى طبقة أكثر مرونة مع نقاط ارتساء أقل64. أيضا ، قد لا تكون نقطة التعلق من البوليمر إلى طبقة السيليكون بالضرورة في قمة مما يؤدي إلى تحول في قيم الطول المكتشفة29. في حين أن نموذج البوليمر مثل سلسلة wormlike (WLC) أو سلسلة مشتركة بحرية (FJC) نموذج لا يمكن استنساخ سلوك قوة التمديد المعنية لPEG أو PNiPAM بشكل صحيح على مدى كامل نطاق التمديد18،29،41،65،66، مثل هذا النموذج البوليمر قد تكون ذات قيمة لأنظمة البوليمر والبروتين الأخرى10،15،67،68.

يعتبر المرفق الالتكافؤي لبوليمر PS واحد (بطول كفاف يُعد أكثر من 1 ميكرومتر) ناجحًا فقط ، عندما يظهر عدد كبير من منحنيات تمديد القوة هضبة طويلة بما يكفي من القوة الثابتة(الشكل 5). يتم تعريف الهضبة الناتجة عن تحلية بوليمر واحد من خلال قطرة حادة واحدة من قوة ثابتة لخط الأساس في امتداد معين ، كما هو معطى في الشكل 5A. إذا تم إرفاق المزيد من البوليمرات إلى طرف AFM cantilever ، لوحظ تتالي من الهضاب56 (الشكل 5C). طول الهضبة (طول الامتزاز)، وربط مع طول كفاف البوليمر51،يجب أن يكون أطول بكثير من أي ذروة التصاق بسبب التصاق غير محدد من تلميح AFM cantilever إلى السطح الأساسي (هنا حول 200 نانومتر). لا ينبغي تفسير الميزات التي تظهر فقط في منحنى تمديد قوة واحدة. في التجارب المقدمة، أظهر ما لا يقل عن 80 من أصل 100 منحنى هضبة أطول من 200 نانومتر في خريطتين قوة على الأقل في بقعتين مختلفتين على السطح. وعلاوة على ذلك، فإن توزيع أطوال الامتزاز، وذلك باستخدام قطع البعثرة مثل الواردة في الشكل 5B و 5D،تكشف ما إذا كان عدد البوليمرات ملزمة إلى تلميح AFM cantilever. في حالة PS ، كان التوزيع الضيق لقوة الامتزاز والطول المأخوذ من هضاب منحنيات تمديد القوة بمثابة دليل على وجود ارتباط التكافؤ الناجح. وقد أثبت ذلك أخيرانجاح بروتوكول التشغيل. وبالتالي، فإننا نوصي بشدة بعرض هذه القوة والتوزيع اتّهامافيال في المنشورات.

تقييم منحنيات تمديد القوة باستخدام الخوارزميات المضمنة التي تشمل العديد من المعلمات المحددة مسبقًا يجب أن يتم بعناية. والأسباب هي على سبيل المثال أن معدل أخذ العينات الثابت غير مناسب لكل سرعة سحب مطبقة أو أن التنعيم الآلي لمنحنيات تمديد القوة قد يؤدي إلى متوسط التفاصيل الهامة. وعادة ما يمكن للفهم السليم لإجراءات التقييم المعنية أن يمنع الأخطاء في إجراء التقييم، والتي يمكن أن تؤثر بدورها بقوة على النتائج النهائية لتجربة SMFS المستندة إلى AFM.

باختصار ، نقدم بروتوكول وظيفي موثوق به ويمكن تطبيقه بسهولة على مجموعة متنوعة من البوليمرات. وعلاوة على ذلك، يتم تقديم التقييم السليم لمنحنيات قوة الجزيء الواحد، مما يسمح بتحديد المعلمات الفيزيائية مثل قوة التمدد، وقوة الامتزاز وطول الامتزاز. والبروتوكولات والإجراءات المقدمة ذات قيمة بالنسبة للتحقيق في النظم المستجيبة للمحفزات على مستوى الجزيء الواحد.

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لهما مصلحة مالية متنافسة.

Acknowledgments

B.N.B. و T.H. تعترف بتمويل من دويتشه فورشونججماينشافت (DFG، مؤسسة البحوث الألمانية) في إطار استراتيجية التميز في ألمانيا - EXC-2193/1 - 390951807، gefördert durch يموت دويتشه Forschungsgemeinschaft (DFG) ايم رحمن دير Exzellenzstrategie des Bundes und der Länder – EXC-2193/1 – 390951807, ومنح HU 997/1-13 (المشروع # 420798410). وتعترف وزارة التعليم العالي والبحث والفنون في ولاية هيسن بالدعم الجزئي في إطار مشروع لوي ووINAPO. نشكر الدكتور فولفغانغ برونر والدكتور أغني زوكاوسكايت من معهد فراونهوفر لفيزياء الحالة الصلبة التطبيقية IAF للتبرع برقائق السيليكون المغلفة بالذهب عالية الجودة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Dodecanethiol (≥98%) Sigma-Aldrich, USA 417364-500ML Used for SAM
Ammonia solution (30%) Roth, Germany CP17.2 Used for cleaning
Cypher ES Asylum Research, an Oxford Instruments company, USA - AFM
Ethanol (≥99.9%) Roth, Germany PO76.1 Solvent
Gold coated silicon wafer Fraunhofer Institute for Applied Solid State Physics IAF, Germany - Used for SAM
High Resolution Replicating Compound Microset Products Ltd, UK 101RF Bonding agent
Hydrogen peroxide solution Sigma-Aldrich, USA H1009 Used for cleaning
Igor Pro Wavemetrics, USA - Software environment
Tetra-30-LF-PC Diener Electronic, Germany - Plasma chamber
Maleimide-polyethylene glycol-triethoxysilane Creative PEG works, USA PHB-1923 Linker polymer
MLCT-Bio-DC Bruker, USA MLCT-Bio-DC AFM cantilever
Prime CZ-Si wafer, n-type (Phosphor) TTV < 10 µm MicroChemicals, Germany WSA40600250 P1314SNN1 Silicon wafer
Purelab Chorus 1, 18.2 MΩ cm Elga LabWater, Germany 10034-540 Ultrapure water source
R3 SA Vomm GmbH, Germany 5803 Blank Tweezers
Thiol terminated poly(N-isopropylacrylamide) Gallei Group, Saarland University, Germany - PNiPAM probe polymer
Thiol terminated polystyrene Polymer Source, Canada P40722-SSH PS probe polymer
Thiol-polyethylene glycol-thiol Creative PEGWorks, USA PSB-615 PEG probe polymer
Toluene (99.99%) Fisher Chemicals T324-500 Solvent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Physical Review Letters. 56 (9), 930-933 (1986).
  2. Hugel, T., Seitz, M. The Study of Molecular Interactions by AFM Force Spectroscopy. Macromolecular Rapid Communications. 22 (13), 989-1016 (2001).
  3. Butt, H. -J., Cappella, B., Kappl, M. Force measurements with the atomic force microscope: Technique, interpretation and applications. Surface Science Reports. 59 (1-6), 1 (2005).
  4. Balzer, B. N., Hugel, T. Single-Molecule Detection and Manipulation. Reference Module in Materials Science and Materials Engineering. Hashmi, S. , Elsevier. Amsterdam. (2016).
  5. Krieg, M., et al. Atomic force microscopy-based mechanobiology. Nature Reviews Physics. 1 (1), 41-57 (2019).
  6. Edwards, D. T., Faulk, J. K., LeBlanc, M. -A., Perkins, T. T. Force Spectroscopy with 9-μs Resolution and Sub-pN Stability by Tailoring AFM Cantilever Geometry. Biophysical journal. 113 (12), 2595-2600 (2017).
  7. Alsteens, D., et al. Nanomechanical mapping of first binding steps of a virus to animal cells. Nature Nanotechnology. 12 (2), 177-183 (2017).
  8. Kodera, N., Yamamoto, D., Ishikawa, R., Ando, T. Video imaging of walking myosin V by high-speed atomic force microscopy. Nature. 468, 72-76 (2010).
  9. Shibata, M., et al. Real-space and real-time dynamics of CRISPR-Cas9 visualized by high-speed atomic force microscopy. Nature Communications. 8 (1), 1-9 (2017).
  10. Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. Reversible unfolding of individual titin immunoglobulin domains by AFM. Science. 276 (5315), 1109-1112 (1997).
  11. Oesterhelt, F., Oesterhelt, D., Pfeiffer, M., Engel, A., Gaub, H. E., Müller, D. J. Unfolding pathways of individual bacteriorhodopsins. Science. 288 (5463), New York, N.Y. 143-146 (2000).
  12. Hugel, T., Holland, N. B., Cattani, A., Moroder, L., Seitz, M., Gaub, H. E. Single-molecule optomechanical cycle. Science. 296 (5570), New York, N.Y. 1103-1106 (2002).
  13. Yu, H., Siewny, M. G. W., Edwards, D. T., Sanders, A. W., Perkins, T. T. Hidden dynamics in the unfolding of individual bacteriorhodopsin proteins. Science. 355 (6328), New York, N.Y. 945-950 (2017).
  14. Erlich, K. R., Sedlak, S. M., Jobst, M. A., Milles, L. F., Gaub, H. E. DNA-free directed assembly in single-molecule cut-and-paste. Nanoscale. 11 (2), 407-411 (2019).
  15. Rico, F., Russek, A., González, L., Grubmüller, H., Scheuring, S. Heterogeneous and rate-dependent streptavidin-biotin unbinding revealed by high-speed force spectroscopy and atomistic simulations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (14), 6594-6601 (2019).
  16. Löf, A., et al. Multiplexed protein force spectroscopy reveals equilibrium protein folding dynamics and the low-force response of von Willebrand factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (38), 18798-18807 (2019).
  17. Kienle, S., Liese, S., Schwierz, N., Netz, R. R., Hugel, T. The effect of temperature on single-polypeptide adsorption. Chemphyschem : a European journal of chemical physics and physical chemistry. 13 (4), 982-989 (2012).
  18. Kolberg, A., et al. Opposing Temperature Dependence of the Stretching Response of Single PEG and PNiPAM Polymers. Journal of the American Chemical Society. 141 (29), 11603-11613 (2019).
  19. Balzer, B. N., et al. Cohesion Mechanisms of Polystyrene-Based Thin Polymer Films. Macromolecules. 46 (18), 7406-7414 (2013).
  20. Balzer, B. N., et al. Adhesion property profiles of supported thin polymer films. ACS Applied Materials & Interfaces. 5 (13), 6300-6306 (2013).
  21. Stetter, F. W. S., Cwiklik, L., Jungwirth, P., Hugel, T. Single Lipid Extraction: The Anchoring Strength of Cholesterol in Liquid-Ordered and Liquid-Disordered Phases. Biophysical journal. 107 (5), 1167-1175 (2014).
  22. Schwierz, N., Krysiak, S., Hugel, T., Zacharias, M. Mechanism of Reversible Peptide-Bilayer Attachment: Combined Simulation and Experimental Single-Molecule Study. Langmuir. 32 (3), 810-821 (2016).
  23. Balzer, B. N., et al. Nanoscale Friction Mechanisms at Solid-Liquid Interfaces. Angewandte Chemie International Edition. 52 (25), 6541-6544 (2013).
  24. Balzer, B. N., Kienle, S., Gallei, M., von Klitzing, R., Rehahn, M., Hugel, T. Stick-Slip Mechanisms at the Nanoscale. Soft Materials. 12, 106-114 (2014).
  25. Kühner, F., Erdmann, M., Sonnenberg, L., Serr, A., Morfill, J., Gaub, H. E. Friction of single polymers at surfaces. Langmuir. 22 (26), 11180-11186 (2006).
  26. Grebíková, L., Gojzewski, H., Kieviet, B. D., Klein Gunnewiek, M., Vancso, G. J. Pulling angle-dependent force microscopy. The Review of Scientific Instruments. 88 (3), 33705 (2017).
  27. Geisler, M., et al. Hydrophobic and Hofmeister effects on the adhesion of spider silk proteins onto solid substrates: an AFM-based single-molecule study. Langmuir. 24 (4), 1350-1355 (2008).
  28. Pirzer, T., Hugel, T. Atomic force microscopy spring constant determination in viscous liquids. Review of Scientific Instruments. 80 (3), 35110 (2009).
  29. Liese, S., et al. Hydration Effects Turn a Highly Stretched Polymer from an Entropic into an Energetic Spring. ACS Nano. 11 (1), 702-712 (2017).
  30. Cui, S., Pang, X., Zhang, S., Yu, Y., Ma, H., Zhang, X. Unexpected Temperature-Dependent Single Chain Mechanics of Poly(N-isopropyl-acrylamide) in Water. Langmuir. 28 (11), 5151-5157 (2012).
  31. Liang, X., Nakajima, K. Nanofishing of a Single Polymer Chain: Temperature-Induced Coil-Globule Transition of Poly(N -isopropylacrylamide) Chain in Water. Macromolecular Chemistry and Physics. 219 (3), 1700394 (2018).
  32. Zhang, W., Zou, S., Wang, C., Zhang, X. Single Polymer Chain Elongation of Poly(N -isopropylacrylamide) and Poly(acrylamide) by Atomic Force Microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 104 (44), 10258-10264 (2000).
  33. Hermanson, G. T. Bioconjugate techniques - 3rd Edition. , Academic Press. San Diego. (2013).
  34. Leitner, M., et al. Single-molecule AFM characterization of individual chemically tagged DNA tetrahedra. ACS Nano. 5 (9), 7048-7054 (2011).
  35. Walder, R., et al. Rapid Characterization of a Mechanically Labile α-Helical Protein Enabled by Efficient Site-Specific Bioconjugation. Journal of the American Chemical Society. 139 (29), 9867-9875 (2017).
  36. Tang, J., et al. High-affinity tags fused to s-layer proteins probed by atomic force microscopy. Langmuir. 24 (4), 1324-1329 (2008).
  37. Wildling, L., et al. Linking of sensor molecules with amino groups to amino-functionalized AFM tips. Bioconjugate Chemistry. 22 (6), 1239-1248 (2011).
  38. Maity, S., Viazovkina, E., Gall, A., Lyubchenko, Y. A. A Metal-free Click Chemistry Approach for the Assembly and Probing of Biomolecules. Journal of Nature and Science. 2 (4), 187 (2016).
  39. Stetter, F. W. S., Kienle, S., Krysiak, S., Hugel, T. Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (96), e52456 (2015).
  40. Becke, T. D., et al. Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (138), e58167 (2018).
  41. Ott, W., et al. Elastin-like Polypeptide Linkers for Single-Molecule Force Spectroscopy. ACS Nano. 11 (6), 6346-6354 (2017).
  42. Newton, R., et al. Combining confocal and atomic force microscopy to quantify single-virus binding to mammalian cell surfaces. Nature Protocols. 12 (11), 2275-2292 (2017).
  43. Staros, J. V., Wright, R. W., Swingle, D. M. Enhancement by N-hydroxysulfosuccinimide of water-soluble carbodiimide-mediated coupling reactions. Analytical Biochemistry. 156 (1), 220-222 (1986).
  44. Grabarek, Z., Gergely, J. Zero-length crosslinking procedure with the use of active esters. Analytical Biochemistry. 185 (1), 131-135 (1990).
  45. Baird, J. A., Olayo-Valles, R., Rinaldi, C., Taylor, L. S. Effect of Molecular Weight, Temperature, and Additives on the Moisture Sorption Properties of Polyethylene Glycol. Journal of Pharmaceutical Sciences. 99 (1), 154-168 (2010).
  46. Halperin, A., Kröger, M., Winnik, F. M. Poly(N-isopropylacrylamide) Phase Diagrams: Fifty Years of Research. Angewandte Chemie International Edition. 54 (51), 15342-15367 (2015).
  47. Barradas, R. G., Fletcher, S., Porter, J. D. The hydrolysis of maleimide in alkaline solution. Canadian Journal of Chemistry. 54 (9), 1400-1404 (1976).
  48. Kharasch, N., Tarbell, D. S. Chapter 10 - The Mechanism of Oxidation of Thiols to Disulfides. Organic Sulfur Compounds. , 97-102 (1961).
  49. Folkers, J. P., Laibinis, P. E., Whitesides, G. M. Self-assembled monolayers of alkanethiols on gold: comparisons of monolayers containing mixtures of short- and long-chain constituents with methyl and hydroxymethyl terminal groups. Langmuir. 8 (5), 1330-1341 (1992).
  50. Hutter, J. L., Bechhoefer, J. Calibration of atomic-force microscope tips. Review of Scientific Instruments. 64 (7), 1868-1873 (1998).
  51. Krysiak, S., Liese, S., Netz, R. R., Hugel, T. Peptide desorption kinetics from single molecule force spectroscopy studies. Journal of the American Chemical Society. 136 (2), 688-697 (2014).
  52. Hugel, T., Rief, M., Seitz, M., Gaub, H. E., Netz, R. R. Highly Stretched Single Polymers: Atomic-Force-Microscope Experiments Versus Ab-Initio Theory. Physical Review Letters. 94 (4), 48301 (2005).
  53. Marchand, P., Marmet, L. Binomial smoothing filter: A way to avoid some pitfalls of least-squares polynomial smoothing. Review of Scientific Instruments. 54 (8), 1034-1041 (1983).
  54. Horinek, D., et al. Peptide adsorption on a hydrophobic surface results from an interplay of solvation, surface, and intrapeptide forces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (8), 2842-2847 (2008).
  55. Friedsam, C., Gaub, H. E., Netz, R. R. Adsorption energies of single charged polymers. EPL (Europhysics Letters). 72 (5), 844-850 (2005).
  56. Scherer, A., Zhou, C., Michaelis, J., Brauchle, C., Zumbusch, A. Intermolecular Interactions of Polymer Molecules Determined by Single-Molecule Force Spectroscopy. Macromolecules. 38 (23), 9821-9825 (2005).
  57. Abbott, L. J., Tucker, A. K., Stevens, M. J. Single Chain Structure of a Poly(N-isopropylacrylamide) Surfactant in Water. The Journal of Physical Chemistry B. 119 (9), 3837-3845 (2015).
  58. Okano, T., Bae, Y. H., Jacobs, H., Kim, S. W. Thermally on-off switching polymers for drug permeation and release. Journal of Controlled Release. 11 (1), 255-265 (1990).
  59. Sulchek, T., Friddle, R. W., Noy, A. Strength of multiple parallel biological bonds. Biophysical journal. 90 (12), 4686-4691 (2006).
  60. Sulchek, T. A., et al. Dynamic force spectroscopy of parallel individual Mucin1-antibody bonds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (46), 16638-16643 (2005).
  61. Krysiak, S., Wei, Q., Rischka, K., Hartwig, A., Haag, R., Hugel, T. Adsorption mechanism and valency of catechol-functionalized hyperbranched polyglycerols. Beilstein Journal of Organic Chemistry. 11, 828-836 (2015).
  62. Jobst, M. A., Schoeler, C., Malinowska, K., Nash, M. A. Investigating receptor-ligand systems of the cellulosome with AFM-based single-molecule force spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (82), e50950 (2013).
  63. Trathnigg, B. Determination of MWD and chemical composition of polymers by chromatographic techniques. Progress in Polymer Science. 20 (4), 615-650 (1995).
  64. Blass, J., Albrecht, M., Wenz, G., Zang, Y. N., Bennewitz, R. Single-molecule force spectroscopy of fast reversible bonds. Physical Chemistry Chemical Physics. 19 (7), 5239-5245 (2017).
  65. Oesterhelt, F., Rief, M., Gaub, H. E. Single molecule force spectroscopy by AFM indicates helical structure of poly(ethylene-glycol) in water. New Journal of Physics. 1, 1-11 (1999).
  66. Xue, Y., Li, X., Li, H., Zhang, W. Quantifying thiol-gold interactions towards the efficient strength control. Nature Communications. 5, 4348 (2014).
  67. Lyu, X., Song, Y., Feng, W., Zhang, W. Direct Observation of Single-Molecule Stick-Slip Motion in Polyamide Single Crystals. ACS Macro Letters. 7 (6), 762-766 (2018).
  68. Hugel, T., et al. Elasticity of Single Polyelectrolyte Chains and Their Desorption from Solid Supports Studied by AFM Based Single Molecule Force Spectroscopy. Macromolecules. 34 (4), 1039-1047 (2001).

Tags

الكيمياء، العدد 157، جزيء واحد، مطياف القوة، مجهر القوة الذرية، الالتصاق، وظيفية، PEGylation
مرفق التكافؤ من جزيئات واحدة للتنظير الطيفي للقوة المستندة إلى AFM
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kolberg, A., Wenzel, C., Hugel, T.,… More

Kolberg, A., Wenzel, C., Hugel, T., Gallei, M., Balzer, B. N. Covalent Attachment of Single Molecules for AFM-based Force Spectroscopy. J. Vis. Exp. (157), e60934, doi:10.3791/60934 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter