Kovalent fastgørelse af sondemolekyler til atomkraftmikroskopi (AFM) cantilever tips er en vigtig teknik til undersøgelse af deres fysiske egenskaber. Dette giver os mulighed for at bestemme stretching kraft, desorption kraft og længden af polymerer via AFM-baserede enkelt molekyle kraft spektroskopi med høj reproducerbarhed.
Atomic force mikroskopi (AFM)-baserede enkelt molekyle kraft spektroskopi er et ideelt værktøj til at undersøge samspillet mellem en enkelt polymer og overflader. For et ægte enkelt molekyle eksperiment, kovalent fastgørelse af sonden molekyle er afgørende, fordi først da kan hundredvis af kraft-forlængelse spor med en og samme enkelt molekyle opnås. Mange spor er igen nødvendige for at bevise, at et enkelt molekyle alene er undersøgt. Derudover, passivitet er afgørende for at forhindre uønskede interaktioner mellem enkelt sonde molekyle og AFM cantilever spids samt mellem AFM cantilever spidsen og den underliggende overflade. Funktionaliseringsprotokollen præsenteres her, er pålidelig og kan nemt anvendes på en række polymerer. Karakteristiske enkeltmolekylehændelser (dvs. strækninger og plateauer) påvises i kraftforlængelsessporene. Fra disse hændelser kan fysiske parametre såsom strækkraft, desorptionskraft og desorptionslængde opnås. Dette er især vigtigt for den præcise undersøgelse af stimuli-responsive systemer på enkelt molekyleniveau. Som eksemplariske systemer poly (ethylenglycol) (PEG), poly( N-isopropylacrylamid) (PNiPAM) og polystyren (PS) er strakt og desorbed fra SiOx (for PEG og PNiPAM) og fra hydrofobisk selvsamlede monolagoverflader (for PS) i vandige omgivelser.N
Siden sin opfindelse i 1980’erne1, atomkraftmikroskopet (AFM) er blevet en af de vigtigste billeddannelsesteknikker i naturvidenskaben med rumlig opløsning under nanometer , subpiconewton kraftopløsning og muligheden for at måle i forskellige opløsningsmiddel- og temperaturforhold2,3,4,5,6,7.,
Bortset fra billeddannelse8,9, AFM bruges til at udføre enkelt molekyle kraft spektroskopi (SMFS) giver indsigt i klæbende interaktioner mellem en enkelt polymer og overflader, fysiske egenskaber af enkelte polymerer og udfoldelse mekanismer proteiner7,10,11,12,13,14,15,16. I et almindeligt SMFS-eksperiment kommer den funktionaliserede cantilever spids i kontakt med en overflade, så polymeren ved AFM cantilever spidsen sorber til denne overflade. Ved at trække AFM cantilever spidsen fra overfladen, en ændring i afbøjning af AFM cantilever omdannes til en kraft, der fører til en kraft-udvidelse kurve4. Fysiske parametre såsom strækkraft, desorptionskraft og desorptionslængde kan bestemmes som afhængige af forskellige parametre såsom trækkraft, dvæletid på overfladen, indrykningsdybde ind i overfladen, temperaturen, opløsningsmiddel17,,18 og forskellige overflader som faste substrater, polymerfilm eller understøttede lipidbilag19,20,21,22. Desuden kan en polymer undersøges i forskellige rumlige retninger, og dermed undersøge friktionsegenskaberne af polymeren23,24,25,26.
En kovalent fastgørelse af den undersøgte polymer til en AFM cantilever tip er afgørende for sådanne undersøgelser. Således forhindrer et højt udbytte af enkeltmolekylehændelser med en og samme polymer, der er bundet til en AFM cantilever-spids, enhver skævhed i resultaterne på grund af kalibrering af afårskonstanten af AFM-kantilever27,28, varierende fastgørelsespunkter29 eller varierende polymerer (med forskellige konturlængder), som i tilfælde af nanofisk3030,31,32. Interaktioner med andre polymerer samt gennemsnitseffekter kan også i vid udstrækning forebygges18,28. For den kovalente fastgørelse af en polymer til AFM cantilever spidsen, kan forskellige typer af kemiske ændringer anvendes, hvoraf mange er sammenfattet i bogen af Hermanson33. Amin og thiol-baserede sammenkædningsreaktioner samt klikkemi repræsenterer de mest anvendte metoder i AFM cantilever tip funktionalisering34,35,36,37,38,39,40,41,42. Becke et al.40 viser, hvordan man bruger 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC)/NHS kemi til at knytte et protein til en AFM cantilever tip. Men de nævnte funktionelle grupper har tendens til at krydslinke, hvilket fører til et tab af funktionalitet43,44. Carbodimides udviser også en tendens til hurtig hydrolyse i opløsning43. Maleimide og thiol grupper er generelt mere stabile og viser ikke crosslinking reaktioner. Den præsenterede protokol er en optimering af de tidligere offentliggjorte protokoller ireferencerne 35,39.
Her præsenteres en pålidelig funktionaliseringsprotokol, der let kan justeres til et stort antal forskellige polymerer, uanset egenskaber som konturlængde eller hydrofobitet. Tre forskellige polymerer blev valgt som eksempel: hydrofile polyethylenglycol (PEG) og poly( N-isopropylacrylamid) (PNiPAM) samt høj molære masse hydrofobe polystyren (PS).N For at sikre en kovalent bindingsevne med et passende linkermolekyle blev de tre polymerer udvalgt til at byde på en telechelic thiol moiety som funktionel slutgruppe. Selve linkermolekylet er typisk en kort PEG-polymer med to aktive steder, en silanegruppe i den ene ende og en maleimidegruppe i den anden ende. Førstnævnte muliggør en kovalent fastgørelse til AFM cantilever spidsen og sidstnævnte en bindende reaktion med thiol gruppen af funktionaliseret høj molære masse polymer. Desuden tjener inaktive PEG-linkermolekyler som et passiveringslag for at forhindre uønskede interaktioner mellem sondepolymeren og AFM-kantilerspidsen samt mellem AFM-kantilspidsen og den underliggende overflade.
AFM-baserede SMFS er et af de vigtigste værktøjer til at undersøge enkelt molekyle interaktioner i polymer fysik. For en sand enkelt molekyle eksperiment, kovalent fastgørelse af sonden polymer til en AFM cantilever tip er afgørende.
Mange tidligere værker er baseret på nanofiskeri eksperimenter, især for PNiPAM, hvor polymerer adsorberes på en overflade og derefter strakt ved tilfældigt plukke dem fra substratet ved hjælp af en AFM cantilever tip30,31. Dette kan ændre resultaterne og føre til fejlfortolkning af det indre molekyle adfærd. Der kan samarbejdseffekter dominere resultaterne, fordi interaktioner med tilstødende polymerer ikke kan udelukkes. Dette har en stor indvirkning på resultaterne, især for polymerer, der viser signifikant anderledes adfærd i løs vægt sammenlignet med enkelt isolerede molekyler57,58.
Funktionaliseringsprotokollen præsenteres her, er pålidelig og kan let anvendes på forskellige polymerer, uanset konturlængde, hydrofobicity eller monomernes steriske hindring. Derudover er en passivitet forudsat at forhindre uønskede interaktioner mellem den enkelte sonde polymer og AFM cantilever spids samt mellem AFM cantilever spidsen og den underliggende overflade. Desuden vises evalueringen af kraftforlængelseskurver, der viser strækhændelser. Der foreslås en procedure for bestemmelse af master kraft-forlængelse kurver. Dette er et bedre middel til at afsløre, fx temperaturrelaterede effekter på kraft-forlængelse adfærd. Endvidere er analysen af enkelt molekyle desorption begivenheder byder konstant kraft plateauer forudsat. Også en enkel måde at korrigere sinusformede kraft signal artefakter i kraft-forlængelse kurver er givet, som ellers kunne forringe resultaterne af forsøget.
Sammenlignet med Stetter et al.39reduceres funktionaliseringsproceduren her til tre trin i stedet for fire , og procedurens robusthed forbedres. Den største fordel ved at udføre PEGylation og silanisering i ét trin er at have en bedre kontrolleret reaktion og øge udbyttet. Desuden skal der udarbejdes færre løsninger, og der er behov for færre skylningstrin. Dette reducerer indsatsen og tiden til forberedelse og øger reproducerbarheden. Desuden er flytning af AFM-cantilevers altid en kritisk del af funktionaliseringsprocessen. En overførsel fra den ene løsning til den anden indebærer altid risiko for stærkt at påvirke funktionaliseringskvaliteten på grund af overførsler gennem luftvandsgrænsefladen eller for at miste AFM-cantilevers ved forkert brug af pincet.
For at bevise korrekt kovalent fastgørelse af en enkelt polymer til en AFM cantilever tip forskellige betingelser skal være opfyldt. For det første, kontrol AFM cantilevers er af væsentlig betydning og bør være forberedt på hver funktionalisering. Funktionaliseringsprocessen og væskecellen til udførelse af forsøgene anses kun for at være rene, hvis et lille antal kraftforlængelseskurver viser strækninger eller plateauer i kontroleksperimentet (i de præsenterede eksempler mindre end 2 %).
En klar stretching mønster uden yderligere dråber eller maxima er afgørende for at have ordentlig enkelt molekyle stretching begivenheder. Desuden bør afhængigheden af brudkraft på kraftbelastningshastigheden ved brud eller den komplette elastiske reaktion af strækkurven analyseres for at udelukke samtidig desorption af flere polymerer59,60. For PEG og PNiPAM viste henholdsvis 19 % og 42 % af de kraftforlængelseskurver, der blev indtaget på forskellige positioner af overfladen. For at opnå stretching begivenheder, skal physisorption af polymeren til de respektive underliggende overflade være stærk. Ellers observeres en plateaulignende desorptionshændelse. Dette er endnu mere afgørende for påvisning af stretching begivenheder ved høje kræfter (op til 500 pN eller mere). Da denne stærke physisorption ikke er opfyldt for hver kraft-udvidelse kurve, udbyttet af sådanne begivenheder er mindre end for ren plateau-lignende desorption begivenheder. Alternativt kan der anvendes stærkt klæbende grupper såsom katekoler eller chemisorption mellem polymer og underliggende overflade. Dette kræver imidlertid, at der indføres yderligere funktionelle grupper eller koblingssteder på polymeren61,62.
Faktisk giver polymerens masse (dvs. konturlængde) et værdifuldt fingeraftryk. Selvom massen ikke direkte kan oversættes til den målte konturlængde af følgende årsager, er længdefordelingen meget værdifuld til at definere enkeltmolekylehændelser. I tilfælde af en PNiPAM polymer med en lav polydispersity (= = 1,28), fandt vi betydelige forskelle i forlængelsesværdierne for de opnåede stretching hændelser (og dermed i polymerlængden) i forsøgene. En af grundene til dette kunne være bestemmelsen af polymerens længde og dens fordeling. I størrelsesudelukkelseskromatografi (SEK) bestemmes målpolymerens relative vægt i forhold til standarder som PS eller poly (methylmethacrylat) (PMMA)63. Den formodede relative vægt forventes at afvige fra den absolutte molekylvægt, fordi målpolymerens og standardens hydrodynamiske radius og standard en væsentligt forskellig. Derudover kan silane lag være oligomerized af falske vand i toluen under funktionaliseringsprocessen. Fastgørelsen af sådanne oligomerer til AFM cantilever spidsen fører til et mere fleksibelt lag med færre ankerpunkter64. Polymerens fastgørelsespunkt til siliciumlaget er måske ikke nødvendigvis i spidsen, hvilket fører til et skift af de fundne længdeværdier29. Mens en polymermodel som den ormelignende kæde (WLC) eller fjc-modellen (frit fende kæde) ikke kan gengive den respektive kraftudvidelsesadfærd for PEG eller PNiPAM korrekt over hele udvidelsesområdet18,29,41,65,66, kan en sådan polymermodel være værdifuld for andre polymer- og proteinsystemer10,15,67,68.
Den kovalente fastgørelse af en enkelt PS-polymer (med en konturlængde på mere end 1 μm) anses kun for at være vellykket, når et betydeligt antal kraftforlængelseskurver viser et tilstrækkeligt plateau med konstant kraft (figur 5). Et plateau som følge af desorbing en enkelt polymer er defineret ved en enkelt skarp dråbe af en konstant kraft til baseline ved en vis forlængelse, som angivet i figur 5A. Hvis der er knyttet flere polymerer til AFM-kanorspidsen, observeres en kaskade af plateauer56 (Figur 5C). Plateauetlængde (desorptionslængde), der korrelerer med polymerkonturlængden51,skal være betydeligt længere end nogen vedhæftningstop på grund af uspecifik vedhæftning af AFM-kanorspidsen til den underliggende overflade (her omkring 200 nm). Funktioner, der udelukkende vises i en enkelt kraftudvidelseskurve, bør ikke fortolkes. I de præsenterede forsøg viste mindst 80 ud af 100 kurver et plateau, der var længere end 200 nm på mindst to kraftkort to forskellige steder på overfladen. Desuden viser fordelingen af desorptionslængder ved hjælp af punktområder som angivet i figur 5B og 5D,om og hvor mange polymerer der er bundet til AFM cantilever spidsen. For PS’s vedkommende tjente en snæver fordeling af desorptionskraften og længden fra plateauerne i kraftforlængelseskurverne som bevis for en vellykket kovalent fastgørelse. Dette viste sig endelig at være en succes for funktionaliseringsprotokollen. Vi anbefaler derfor på det kraftigste, at der præsenteres sådanne kraft- og længdefordelinger i publikationer.
Evaluering kraft-udvidelse kurver ved hjælp af indbyggede algoritmer, der omfatter mange forudindstillede parametre bør ske med omhu. Årsagerne er f.eks., at en fast prøvetagningshastighed ikke er passende for hver anvendt trækkrafthastighed, eller at en automatiseret udjævning af kraftforlængelseskurverne kan være en gennemsnitsværdi for vigtige detaljer. Normalt kan en korrekt forståelse af den respektive evalueringsprocedure forhindre fejl i evalueringsproceduren, hvilket igen kan have stor indflydelse på de endelige resultater af et AFM-baseret SMFS-eksperiment.
Sammenfattende præsenterer vi en funktionaliseringsprotokol, der er pålidelig og let kan anvendes på en række polymerer. Desuden præsenteres korrekt evaluering af enkelt molekylekraftforlængelseskurver, der gør det muligt at bestemme fysiske parametre såsom strækkraft, desorptionskraft og desorptionslængde. De præsenterede protokoller og procedurer er værdifulde for undersøgelsen af stimuli-responsive systemer på enkelt molekyleniveau.
The authors have nothing to disclose.
B.N.B. og T.H. anerkender finansiering fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) under Tysklands excellence strategi – EXC-2193/1 – 390951807, gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der Exzellenzstrategie des Bundes und der Länder – EXC-2193/1 – 390951807, og tilskud HU 997/1-13 (projekt # 420798410). M.G. anerkender delvis støtte inden for rammerne af LOEWE-projektet iNAPO fra Hessens statsministerium for videregående uddannelse, forskning og kunst. Vi takker Dr. Wolfgang Bronner og Dr. Agne Zukauskaite fra Fraunhofer Institute for Applied Solid State Physics IAF for donation af høj kvalitet guld belagt silicium vafler.
1-Dodecanethiol (≥98%) | Sigma-Aldrich, USA | 417364-500ML | Used for SAM |
Ammonia solution (30%) | Roth, Germany | CP17.2 | Used for cleaning |
Cypher ES | Asylum Research, an Oxford Instruments company, USA | – | AFM |
Ethanol (≥99.9%) | Roth, Germany | PO76.1 | Solvent |
Gold coated silicon wafer | Fraunhofer Institute for Applied Solid State Physics IAF, Germany | – | Used for SAM |
High Resolution Replicating Compound | Microset Products Ltd, UK | 101RF | Bonding agent |
Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich, USA | H1009 | Used for cleaning |
Igor Pro | Wavemetrics, USA | – | Software environment |
Tetra-30-LF-PC | Diener Electronic, Germany | – | Plasma chamber |
Maleimide-polyethylene glycol-triethoxysilane | Creative PEG works, USA | PHB-1923 | Linker polymer |
MLCT-Bio-DC | Bruker, USA | MLCT-Bio-DC | AFM cantilever |
Prime CZ-Si wafer, n-type (Phosphor) TTV < 10 µm | MicroChemicals, Germany | WSA40600250 P1314SNN1 | Silicon wafer |
Purelab Chorus 1, 18.2 MΩ cm | Elga LabWater, Germany | 10034-540 | Ultrapure water source |
R3 SA | Vomm GmbH, Germany | 5803 Blank | Tweezers |
Thiol terminated poly(N-isopropylacrylamide) | Gallei Group, Saarland University, Germany | – | PNiPAM probe polymer |
Thiol terminated polystyrene | Polymer Source, Canada | P40722-SSH | PS probe polymer |
Thiol-polyethylene glycol-thiol | Creative PEGWorks, USA | PSB-615 | PEG probe polymer |
Toluene (99.99%) | Fisher Chemicals | T324-500 | Solvent |