Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Kovalent fastgørelse af enkelte molekyler til AFM-baseret kraftspektroskopi

Published: March 16, 2020 doi: 10.3791/60934
Automatic Translation
1, 1, 1,3, 2, 1,3
1Institute of Physical Chemistry, Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, 2Chair in Polymer Chemistry, Saarland University, 3Cluster of Excellence livMatS at FIT - Freiburg Center for Interactive Materials and Bioinspired Technologies, University of Freiburg

Summary

Kovalent fastgørelse af sondemolekyler til atomkraftmikroskopi (AFM) cantilever tips er en vigtig teknik til undersøgelse af deres fysiske egenskaber. Dette giver os mulighed for at bestemme stretching kraft, desorption kraft og længden af polymerer via AFM-baserede enkelt molekyle kraft spektroskopi med høj reproducerbarhed.

Abstract

Atomic force mikroskopi (AFM)-baserede enkelt molekyle kraft spektroskopi er et ideelt værktøj til at undersøge samspillet mellem en enkelt polymer og overflader. For et ægte enkelt molekyle eksperiment, kovalent fastgørelse af sonden molekyle er afgørende, fordi først da kan hundredvis af kraft-forlængelse spor med en og samme enkelt molekyle opnås. Mange spor er igen nødvendige for at bevise, at et enkelt molekyle alene er undersøgt. Derudover, passivitet er afgørende for at forhindre uønskede interaktioner mellem enkelt sonde molekyle og AFM cantilever spids samt mellem AFM cantilever spidsen og den underliggende overflade. Funktionaliseringsprotokollen præsenteres her, er pålidelig og kan nemt anvendes på en række polymerer. Karakteristiske enkeltmolekylehændelser (dvs. strækninger og plateauer) påvises i kraftforlængelsessporene. Fra disse hændelser kan fysiske parametre såsom strækkraft, desorptionskraft og desorptionslængde opnås. Dette er især vigtigt for den præcise undersøgelse af stimuli-responsive systemer på enkelt molekyleniveau. Som eksemplariske systemer poly (ethylenglycol) (PEG), poly( N-isopropylacrylamid) (PNiPAM) og polystyren (PS) er strakt og desorbed fra SiOx (for PEG og PNiPAM) og fra hydrofobisk selvsamlede monolagoverflader (for PS) i vandige omgivelser.N

Introduction

Siden sin opfindelse i 1980'erne1, atomkraftmikroskopet (AFM) er blevet en af de vigtigste billeddannelsesteknikker i naturvidenskaben med rumlig opløsning under nanometer , subpiconewton kraftopløsning og muligheden for at måle i forskellige opløsningsmiddel- og temperaturforhold2,3,4,5,6,7.,

Bortset fra billeddannelse8,9, AFM bruges til at udføre enkelt molekyle kraft spektroskopi (SMFS) giver indsigt i klæbende interaktioner mellem en enkelt polymer og overflader, fysiske egenskaber af enkelte polymerer og udfoldelse mekanismer proteiner7,10,11,12,13,14,15,16. I et almindeligt SMFS-eksperiment kommer den funktionaliserede cantilever spids i kontakt med en overflade, så polymeren ved AFM cantilever spidsen sorber til denne overflade. Ved at trække AFM cantilever spidsen fra overfladen, en ændring i afbøjning af AFM cantilever omdannes til en kraft, der fører til en kraft-udvidelse kurve4. Fysiske parametre såsom strækkraft, desorptionskraft og desorptionslængde kan bestemmes som afhængige af forskellige parametre såsom trækkraft, dvæletid på overfladen, indrykningsdybde ind i overfladen, temperaturen, opløsningsmiddel17,,18 og forskellige overflader som faste substrater, polymerfilm eller understøttede lipidbilag19,20,21,22. Desuden kan en polymer undersøges i forskellige rumlige retninger, og dermed undersøge friktionsegenskaberne af polymeren23,24,25,26.

En kovalent fastgørelse af den undersøgte polymer til en AFM cantilever tip er afgørende for sådanne undersøgelser. Således forhindrer et højt udbytte af enkeltmolekylehændelser med en og samme polymer, der er bundet til en AFM cantilever-spids, enhver skævhed i resultaterne på grund af kalibrering af afårskonstanten af AFM-kantilever27,28, varierende fastgørelsespunkter29 eller varierende polymerer (med forskellige konturlængder), som i tilfælde af nanofisk3030,31,32. Interaktioner med andre polymerer samt gennemsnitseffekter kan også i vid udstrækning forebygges18,28. For den kovalente fastgørelse af en polymer til AFM cantilever spidsen, kan forskellige typer af kemiske ændringer anvendes, hvoraf mange er sammenfattet i bogen af Hermanson33. Amin og thiol-baserede sammenkædningsreaktioner samt klikkemi repræsenterer de mest anvendte metoder i AFM cantilever tip funktionalisering34,35,36,37,38,39,40,41,42. Becke et al.40 viser, hvordan man bruger 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC)/NHS kemi til at knytte et protein til en AFM cantilever tip. Men de nævnte funktionelle grupper har tendens til at krydslinke, hvilket fører til et tab af funktionalitet43,44. Carbodimides udviser også en tendens til hurtig hydrolyse i opløsning43. Maleimide og thiol grupper er generelt mere stabile og viser ikke crosslinking reaktioner. Den præsenterede protokol er en optimering af de tidligere offentliggjorte protokoller ireferencerne 35,39.

Her præsenteres en pålidelig funktionaliseringsprotokol, der let kan justeres til et stort antal forskellige polymerer, uanset egenskaber som konturlængde eller hydrofobitet. Tre forskellige polymerer blev valgt som eksempel: hydrofile polyethylenglycol (PEG) og poly( N-isopropylacrylamid) (PNiPAM) samt høj molære masse hydrofobe polystyren (PS).N For at sikre en kovalent bindingsevne med et passende linkermolekyle blev de tre polymerer udvalgt til at byde på en telechelic thiol moiety som funktionel slutgruppe. Selve linkermolekylet er typisk en kort PEG-polymer med to aktive steder, en silanegruppe i den ene ende og en maleimidegruppe i den anden ende. Førstnævnte muliggør en kovalent fastgørelse til AFM cantilever spidsen og sidstnævnte en bindende reaktion med thiol gruppen af funktionaliseret høj molære masse polymer. Desuden tjener inaktive PEG-linkermolekyler som et passiveringslag for at forhindre uønskede interaktioner mellem sondepolymeren og AFM-kantilerspidsen samt mellem AFM-kantilspidsen og den underliggende overflade.

Protocol

BEMÆRK: Se figur 1 for at få en skematisk oversigt.

1. Opsætning af reagens

BEMÆRK: De polymerer, der anvendes til denne protokol, er: maleimide-polyethylenglycol-triethoxysilane (silane-PEG-mal, 5 kDa), thiol-polyethylenglycol-thiol (HS-PEG-SH, 35 kDa), thiol afsluttet poly( N-isopropylacrylamid) (PNiPAM-SH, 637 kDa) og thiol afsluttet polystyren (PS-SH, 1,3 mDa).N

  1. Forbered den veldefinerede og høje molære masse PNiPAM-SH via atom overførsel radikal polymerisering, efterfulgt af konvertering og reduktion af den funktionelle endegruppe for indførelsen af en thiol moiety, som beskrevet i litteraturen18. Se figur 1 for de detaljerede strukturer.
  2. Til opbevaring af kemikalierne fremstilles mindre aliquots i et tørt handskebokssystem med nitrogenatmosfære for at undgå udsættelse for atmosfærisk ilt og fugt. PEG og PNiPAM er hygroskopiske45,46 og de funktionelle endegrupper peg, PNiPAM og PS er kendt for at blive let oxideret, når de opbevares under omgivende forhold33,47,48. Alle kemikalier skal opbevares ved -20 °C.
  3. Brug opløsningsmidler af analytisk kvalitet eller højere. Desuden bruge ultrarent vand til at skylle AFM cantilevers chips og glasvarer, fordi enkelt molekyle eksperimenter er meget følsomme over for al forurening.

2. Opsætning af udstyr

BEMÆRK: Brug pincet og bægerglas af rustfrit stål eller glas. Brug omvendt pincet for et sikkert greb (f.eks. model R3 SA med en lav fjederkonstant).

  1. Forbered RCA (ultraren vand, hydrogenperoxid og ammoniak (5:1:1)) opløsning til at rense glasvarer og pincet.
  2. Sæt beholderne i et bægerglas og fyld det med RCA, indtil glas eller pincet er fuldt tildækket.
  3. Bægerglasset opvarmes fra trin 2.2 i 1 time ved 80 °C.
  4. Skyl derefter beholderne med ultrarent vand, indtil der ikke længere kan konstateres skarp lugt (mindst tre gange).
  5. Tørglas og en pincet i en ovn (120 °C).

3. Funktionalisering af tip

BEMÆRK: Alle trin skal udføres i en røghætte for at undgå indånding af organiske dampe. Derudover kræves handsker, laboratoriekittel og øjenbeskyttelse. Brug nitril eller latex handsker for hvert skridt for at undgå forurening. Bær opløsningsmiddelbestandige handsker, når du bruger toluen. Alle trin, medmindre andet er angivet, udføres på RT. Brug nyt udstyr og handsker til hvert trin for at undgå eventuel krydskontaminering.

  1. Udfør overfladeaktivering ved at anvende iltplasma på AFM cantilever-chippen MLCT-Bio-DC.
    BEMÆRK: Plasmabehandlingens effektivitet ved yderligere funktionaliseringstrin skalaermed indholdet af ilt i plasmakammeret.
    1. Brug nyrensede pincet til at placere AFM cantilever chips i et plasmakammer (40 kHz, 600 W).
    2. Brug specialmodificeret aktiveringsprogram: evakuering (0,1 mbar) – oversvømmelse med ilt til et tryk på: 0,2 mbar (4 min) – plasmaproces (effekt: 40%, varighed: 2 min, procestryk: 0,2 mbar).
    3. Udluft kammer og fortsætte med trin 3.2.2 straks for at forhindre enhver adsorption af forurenende stoffer til AFM cantilever chips fra luften.
  2. Silanisering og PEGylation
    BEMÆRK: Timing er en kritisk parameter mellem trinnene. Forbered løsninger så friske som muligt i ventetiderne. Maleimidgrupper er udsat for hydrolyse i vandige medier og thioler let blive oxideret til disulfider i opløsning33,47 hindrer AFM tip funktionalisering reaktioner.
    1. Der fremstilles en silane-PEG-mal opløsning i toluen (1,25 mg/ml) i opløsningsmiddelbestandige plast- eller glasrør, og 6 ml af opløsningen hældes i flade petriskåle, hver 3 ml.
      BEMÆRK: Hvis der observeres binding af flere sondepolymerer i SMFS-eksperimentet, kan blanding af silane-PEG-mal med ikke-funktionel silane-PEG reducere antallet af forankringspunkter. Til justering af passiveringslaget PEG med forskellige masser (dvs. konturlængder) kan anvendes27.
    2. Inkuber af AFM cantilever-spånerne umiddelbart efter trin 3.1.3 i silane-PEG-mal-opløsningen (op til 10 spåner pr. Petriskål) i 3 timer ved 60 °C35.
    3. Tag petriskåle ud af ovnen og lad opløsningen køle af i mindst 10 min.
    4. Skyl hver AFM cantilever chip omhyggeligt. Reducer virkningen af kapillær kræfter på AFM cantilever, når de passerer luft-opløsningsmiddel interface, for eksempel ved at vippe disse chips lidt, når nedsænkning i opløsning.
      1. For PEG- og PS-polymerer skylles tre gange med toluen.
      2. For PNiPAM polymer skylles én gang med toluen og to gange med ethanol.
    5. Vælg mindst to AFM cantilever chips som kontrol AFM cantilever chips, springe trin 3.3 og skyl dem som følger for at øge polariteten af opløsningsmidlet:
      1. For PEG- og PS-polymerer skylles to gange med ethanol og én gang med ultrarent vand.
      2. For PNiPAM polymer skylles to gange med ultrarent vand.
        BEMÆRK: Kontrol AFM cantilever chips har været igennem alle funktionalisering trin undtagen polymer vedhæftet fil (trin 3.3). De tjener til at bevise renligheden af funktionaliseringsprocessen, AFM cantilever spånholdersystemet, overfladerne og de opløsningsmidler, der anvendes til SMFS-eksperimentet.
  3. Covalent polymer vedhæftet fil
    BEMÆRK: Selv om AFM cantilever spidsen forventes at være helt dækket med maleimide grupper, der er blot et par bindende steder for enkelt sonde polymer, fordi maleimid gennemgår hydrolyse i vand, der fører til inaktive PEGs47. Disse inaktive PEGs fungerer som et passiveringslag som beskrevet ovenfor.
    1. Inkuber AFM cantilever chips direkte efter trin 3.2.5 i en af følgende polymeropløsninger i 3 ml Petri-skåle. Hvis den pågældende polymer ikke opløses korrekt, skal du bruge et 40 °C vandbad og omrøre opløsningen godt.
      BEMÆRK: Da brugen af thiolopafsluttetpolymerer kan føre til dannelse af disulfidbindinger, der hæmmer reaktionen med maleimidgrupperne af silane-PEG-mal, anbefales et reduktionsmiddel, især hvis trin 3.3 anvendes i vandige buffere til vandopløselige polymerer33.
      1. For PEG- og PS-polymerer anvendes en koncentration på 1,25 mg/ml i toluen i 1 time ved 60 °C.
      2. For PNiPAM-polymerer anvendes en koncentration på 1,25 mg/ml i ethanol i 3 timer ved RT.
        BEMÆRK: Hvis der observeres binding af flere sondepolymerer i SMFS-eksperimentet, skal polymerkoncentrationen reduceres.
    2. Skyl omhyggeligt hver AFM cantilever chip.
      1. For PEG- og PS-polymerer skylles to gange med toluen, to gange med ethanol og én gang med ultrarent vand efter 10 min. nedkøling.
      2. For PNiPAM polymerer skylles to gange med ethanol og to gange med ultrarent vand.
    3. Hver AFM-kantilchip opbevares separat i en lille (1 ml) petriskål fyldt med ultrarent vand ved 4 °C, indtil den anvendes i et forsøg.

4. Forberedelse af overfladen

  1. Siliciumoxid wafer
    BEMÆRK: Denne overflade blev brugt til SMFS med PEG og PNiPAM.
    1. Skær en siliciumoxid wafer i små stykker ved hjælp af en diamant kniv.
    2. Sæt siliciumoxid stykker separat i mikrocentrifuge rør og fyld disse rør med ethanol.
    3. Sonikere siliciumoxid stykker i 10 min.
    4. Skyl siliciumoxidstykkerne med ethanol to gange og tør dem under et kvælstofflow omhyggeligt. Brug straks silikonestykkerne.
  2. Selvsamlet monolag af hydrofobalkane thiol på guld (SAM)
    BEMÆRK: Denne overflade blev brugt til SMFS med PS. Se litteratur39,49 for mere information om SA'er.
    1. Brug en guldbelagt siliciumwafer (A [100], 5 nm titanium, 100 nm guld) til at udføre trin 4.1.1 – 4.1.4.
    2. Der inkuberes overfladestykkerne i en opløsning på 1 dodecanthiol (2 mM) i 18 timer.
    3. Skyl de frisklavede SAMs i ethanol to gange.
    4. Tørre SA'er med nitrogengennemstrømning til direkte brug eller opbevar dem i ethanol i op til 4 dage til senere brug.

5. Dataindsamling

BEMÆRK: Alle målinger vist her blev udført i ultrarent vand med en Cypher ES AFM ved hjælp af en opvarmning og køling prøve fase for temperaturvariation. Generelt kan alle AFM'er, der giver mulighed for at måle i væsker, anvendes.

  1. Sæt den funktionaliserede AFM cantilever chip ind i AFM.
  2. Lim den forberedte overflade fast i en prøveholder, der er egnet til måling i væsker (f.eks. højopløsningsreplikationsforbindelse 101RF eller et UV-hærdet klæbemiddel).
    BEMÆRK: Disse bindemidler er meget inert og modstandsdygtige over for et stort antal polære opløsningsmidler. Klæbemidmens modstandsdygtighed over for ikke-polære opløsningsmidler (f.eks. toluen eller hexan) eller høje temperaturer skal kontrolleres før brug.
  3. Nedsænk AFM cantilever chip og sondeprøven i væsken, her: ultrarent vand.
    BEMÆRK: Der kan aflejres et opløsningsmiddeldråbe (ca. 100 μL) på AFM-spånholderen. Ved at dække AFM-cantilever-spånen med opløsningsmiddel reduceres kapillærkræfterne, som ellers ville virke på AFM-kantilen, når den nærmer sig prøvefladen, der passerer gennem luftopløsningsmidlet.
  4. Om nødvendigt justeres temperaturen, og systemet skal bringes i ækvilibrere.
    BEMÆRK: Temperaturændringer kan resultere i en afbøjning af AFM cantilever på grund af en bimetallisk effekt for AFM cantilevers med en reflekterende belægning som aluminium eller guld. Der skal udføres ligevægt væk fra overfladen (flere μm), indtil der ikke observeres yderligere ændringer af afbøjningssignalet (op til 15 min for MLCT-Bio-DC).
  5. Varier temperaturen tilfældigt for at udelukke eventuelle virkninger af funktionaliseringens ældning. Sørg for, at de anvendte temperaturer ikke fører til en irreversibel bøjning af AFM cantilever.
    BEMÆRK: Enhver temperatureffekt på opløsningsmiddelegenskaberne (f.eks. fordampning eller ændringer i viskositeten) kan hæmme dine eksperimenter. I de præsenterede eksempler blev temperaturen varieret over et interval på op til 40 K i trin på 10 K og tog vand som opløsningsmiddel (f.eks. fra 278 K til 318 K).
  6. Anvæn overfladen for at bestemme InvOLS (omvendt optisk håndtagsfølsomhed) ved at tage kraftforlængelseskurver på en hård overflade (f.eks. siliciumoxid). Til dette formål skal du tage afbøjningssignalet fra fotodetektoren (i V) vs. piezoafstand og bestemme hældningen af den del, der repræsenterer indrykningen af AFM-kantilspidsen ind i den underliggende overflade (frastødende regime) ved hjælp af en lineær funktion. For at reducere fejl skal du tage gennemsnittet på mindst fem værdier for at opnå den endelige InvOLS-værdi. Yderligere oplysninger findes i litteraturen4,39.
    BEMÆRK: InvOLS kan kun bestemmes pålideligt på hårde overflader. I tilfælde af forsøg på bløde overflader eller grænseflader skal du sørge for at placere en hård overflade tæt på dine bløde overflader. Derefter kan InvOLS-kalibreringen udføres før eller efter dine eksperimenter med den bløde overflade uden at skulle adskille AFM-opsætningen.
  7. Ved forårskonstantbestemmelse flyttes AFM-kantilnår til en højde med hverken attraktive eller frastødende interaktioner mellem AFM-kanorspids og overflade (flere μm). Derefter registreres et termisk støjspektrum, hvor effektspektraltætheden (PSD) vs. frekvens afbildes. Følgende trin udføres normalt af automatiserede indbyggede funktioner i kommerciel AFM-software: For det første analyseres det erhvervede termiske støjspektrum ved at tilpasse en funktion til PSD, f.eks. Pasformen sker op til minimum mellem den første og anden resonans. For det andet bestemmes arealet under den monterede del af PSD vs-frekvensområdet, der repræsenterer den gennemsnitlige kvadratisk forskydning af AFM-kantileren i lodret retning. Endelig er ækvikle sætning bruges til at opnå AFM cantilever kraft konstant28,50.
    BEMÆRK: Der bør anvendes et passende frekvensområde, der omfatter den første resonanstop i AFM-kantilen. For at få et tilfredsstillende signal-støj-forhold skal der akkumuleres mindst 10 psd'er med den højest mulige frekvensopløsning.
  8. Start eksperimentet. Optag kraftkort ved at tage kraftforlængelseskurver på en gitterlignende måde (f.eks. 10 x 10 punkter for et areal på 20 x 20 μm2) for at undgå lokale overfladeeffekter (f.eks. urenheder, forskydninger) og til gennemsnitlige forskellige overfladearealer.
    BEMÆRK: Typiske parametre er en trækkrafthastighed på 1 μm/s og en prøvetagningshastighed på 5 kHz for at sikre tilstrækkelig opløsning. Prøvetagningshastigheden bør tilpasses, når trækhastigheden er varieret. Tilbagetrækkeafstanden skal tilpasses den målte polymers kontur eller desorptionslængde (ca. det dobbelte af den forventede længde).
  9. Brug og varier er tid mod overfladen for at gøre det muligt for den enkelte polymer at klæbe til overfladen (typisk 0 – 5 s).
  10. InvOLS's og fjederkonstantens bestemmelse gentages ved forsøgets afslutning for at kontrollere systemets konsistens og stabilitet.
    BEMÆRK: Ved stærk vedhæftning mellem polymer og overflade kan kalibreringen udføres efter selve eksperimentet for at bevare funktionaliseringen.

6. Evaluering af data

BEMÆRK: Til dataevaluering blev der brugt en brugerdefineret skriftlig software baseret på Igor Pro til at udføre følgende trin.

  1. Konverter det rå afbøjningssignal (i Volt) til kraftværdier (i Newton) ved multiplikation med den registrerede InvOLS og den bestemte fjederkonstant.
  2. Træk afdrejningen af AFM-kantilduken (efter multiplikation af det rå afbøjningssignal med InvOLS) fra den afstand, der drives af piezoelementerne i lodret retning for at opnå den sande forlængelse (spids-overfladeafstand)4.
  3. Ret de kraftforlængelseskurver, der opnås for afdrift, ved at tilpasse en lineær funktion til baseline efter den sidste hændelse og trække det samme fra kraftforlængelseskurven. Den monterede del skal udgøre en tilstrækkelig forlængelse fra overfladen, hvor der hverken observeres attraktive eller frastødende interaktioner mellem AFM cantilever-spidsen og den underliggende overflade. Derefter indstilles grundlinjen til nulaksen.
    BEMÆRK: I tilfælde af målinger på meget reflekterende overflader som guld kan der forekomme interferens. Disse skyldes delvis refleksion af laserstrålen fra overfladen og fra bagsiden af AFM cantilever. Så, den opnåede kraft-forlængelse kurver kan vise en sinusformet kraft signal artefakt langs den lodrette forlængelse. Dette er en artefakt, der hæmmer de endelige kraftværdier. For stadig at tage hensyn til disse kraftforlængelseskurver er det muligt at foretage en korrektion (figur 2).
  4. Hvis interferenserne vises i kraftforlængelseskurverne, skal du vælge en repræsentativ kraftforlængerkurve (tilbagetrækningskurve), der ikke viser andre hændelser end muligvis en top af uspecifik vedhæftning og den samme sinusformede artefakt (dvs. amplitude og fase) (figur 2A).
    BEMÆRK: Udglat den repræsentative kraftforlængerkurve for at opnå interferensens lavfrekvente mønster.
  5. Vælg en kraftudvidelseskurve, der skal korrigeres (Figur 2B).
  6. Overlejr begge kraftforlængelseskurver fra trin 6.4. og 6,5. for at sikre, at begge udviser den samme sinusformede artefakt (dvs. amplitude og fase) (figur 2C).
  7. Træk den (glattede) repræsentative kraftforlængerkurve fra kraftforlængelseskurven for at blive korrigeret, hvilket fører til en lige snarere end en sinusformet baseline (figur 2D).
    BEMÆRK: Pas på, at den uspecifikke vedhæftningstop i den repræsentative kurve adskiller sig fra eventuelle hændelser med et enkelt molekyle, der vises i de kurver, der skal korrigeres. Faktisk er udvælgelsen af den repræsentative kurve afgørende for en korrekt korrektion.

Representative Results

Følgende eksempler viser resultater af enkelt molekyle stretching og desorption af polymerer PEG, PNiPAM og PS. Alle AFM cantilever tips blev funktionaliseret med protokollen ovenfor. PEG og PNiPAM blev målt på SiOx med temperaturvariation. For en detaljeret diskussion af de deraf følgende temperaturafhængige strækkurver for PEG og PNiPAM, se Kolberg et al.18 Et andet kraftforlængelsesmotiv er et plateau af konstant kraft (f.eks. når desorbing PS fra selvsamlede monolag af methyl opsagt alkane thioler på guld (SAM) i vand4,27,39,51).

Eksempel 1: Strækning af PEG og PNiPAM i vand
Den temperaturafhængige strækadfærd i vand blev målt ved hjælp af en enkelt PNiPAM og PEG polymerer kovalent bundet til en AFM cantilever spids i den ene ende og physisorbed på en SiOx overflade i den anden ende. Efter kalibreringog ren kontrol eksperimenter (mindre end 2% af kraft-udvidelse kurver viser enkelt molekyle begivenheder), mindst to kraft kort blev registreret for hver AFM cantilever. Det temperaturafhængige eksperiment blev udført ved at registrere mindst ét kraftkort ved hver temperatur. Når kun få stretching begivenheder dukkede op, den respektive AFM cantilever blev kasseret, og den næste AFM cantilever af chippen blev taget (normalt i rækkefølgen C, B, D og E af MLCT-Bio-DC). For peg's eksemplariske data blev der observeret en enkelt stretching-hændelse i 95 ud af 500 målte kraftforlængelseskurver (19 %). For PNiPAM viste 252 ud af 600 kraftforlængerkurver et strækmønster (42 %). For en bedre sammenligning af kraft-forlængelse kurver, en enkelt master kurve for hver temperatur blev genereret. Til dette formål blev kun de kurver med en strækkende hændelse til mindst 500 pN, hvor konformationsudsving og opløsningsmiddeleffekter er ubetydelige, valgt52. Det endelige antal strækninger taget i betragtning var 3 ved 278 K, 7 ved 298 K og 4 ved 318 K for PEG og 4 ved 278 K, 3 ved 298 K og 3 ved 318 K for PNiPAM18.

Proceduren for generering af masterkurver findes i figur 3. De valgte kraftforlængerkurver (figur 3A) skaleres til en længde L0 (forlængelse med en kraft på 500 pN), se figur 3B. Den vedhæftning peak viser en stor variation af uspecifik vedhæftning mellem overfladen og AFM cantilever tip, men påvirker ikke polymer stretching adfærd. Efter sammenlægning af de nyskalerede kraftforlængelseskurver beregnes de i gennemsnit ved en binominel udjævning som vist i figur 3C. Til dette, en Gaussisk filter involves data med normaliserede koefficienter stammer fra Pascal's trekant på et niveau svarende til udjævning parameter 2053. Endelig opnås en masterkurve for hver temperatur som angivet i figur 3D. Zoom-in viser det område, hvor temperatureffekten på kraftforlængelsesadfærden er mest udtalt.

En sammenligning af peg (A) ' temperaturfunktionsmåde og PNiPAM (B) findes i figur 4. For PEG blev der observeret et fald i strækkraften med stigende temperatur. En stigning på ca. 5% af den nyskalerede forlængelse ved 100 pN blev observeret ved en forøgelse af temperaturen fra 278 til 318 K. For PNiPAM kunne der afsløres et modsat temperaturafhængigt skift. Der blev observeret et fald på ca. 1 % af den nyskalerede forlængelse ved 100 pN, da temperaturen blev forøget fra 278 til 328 K. Derudover kunne den strækkefrie energi opnås fra kraftforlængelsesmasterkurverne ved at bestemme arealet under kurven for en given kraftværdi. Dette kunne bruges til at udvinde energiske og entropic bidrag af stretching fri energi ved hjælp af molekylære dynamik (MD) simuleringer18.

Eksempel 2: Desorption af PS fra en SAM-overflade i vand
Desorptionen af PS fra en SAM-overflade i vand kan anvendes til at bestemme desorptionskraften og længden og derved kvantificere den hydrofobe interaktion. Efter kalibrering blev der optaget mindst to kraftkort på to forskellige steder på overfladen. Når polymertilbehøret var vellykket, viste kraftforlængelseskurverne plateauer med konstant kraft, som karakteristisk træk, se figur 5A og figur 5C. Plateau-lignende desorption observeres, når dynamikken i de undersøgte obligationer er meget hurtigere end trækhastigheden af AFM cantilever spidsen (kvasi-ligevægt). Desorptionskræfter af plateaulignende kraftforlængelseskurver giver direkte adhæsionfrie energier ved at integrere kraftforlængelsessporet54. De er blevet anvendt til at bestemme elektrostatiske, dispersive og hydrofobe interaktioner samt friktionsegenskaber af enkelte polymerer på overflader i flydende miljø2,4,23,51,54,55.

Hvert plateau af konstant kraft var udstyret med en sigmoidal kurve til at bestemme desorption kraft og desorption længde, som derefter blev plottet i histogrammer. Histogrammerne var udstyret med en gaussisk til at udtrække den maksimale værdi og standardafvigelse. For at få et bedre overblik blev desorptionskraften og længdeværdierne vist sammen i et punktområde, som angivet i figur 5B og figur 5D.

For polystyren på SAM i vand svarer de bestemte desorptionskræfter til tidligere opnåede værdier19,23. Da desorptionslængden korrelerer med polymerkonturlængden51,kan fordelingen af desorptionslængden bruges som bevis for den kovalente binding af den respektive polymer til AFM-kantilspidsen via dens funktionelle slutgruppe. Således desorption længde fungerer som et fingeraftryk.

For mere end én polymer fastgjort til AFM cantilever spidsen, kaskader af plateauer (diskrete trin) kan observeres i kraft-forlængelse kurver56. Hvert plateau repræsenterer desorption af en polymer på en anden udvidelse. Forsøget i figur 5C og figur 5D viste et typisk tilfælde af to polymerer, der var fastgjort til AFM-kanstillspidsen på samme tid. Ved montering af det endelige brud kunne der findes en bimodal fordeling for desorptionslængden, mens desorptionskraften viste en smal fordeling. I dette tilfælde kunne den mindre desorptionslængde findes i 90% af kraftforlængelseskurverne, enten som et enkelt plateau eller som et ekstra plateau på det længere plateau, som angivet i figur 5C. Den højere desorptionslængde blev fundet i 37% af de opnåede kraftforlængelseskurver. Således desorption længde fordeling kunne bruges til at bestemme antallet af forskellige polymerer knyttet til AFM cantilever spidsen. Generelt er en smal fordeling af desorptionslængdeværdierne en god indikation af, at en og samme enkelt polymer blev undersøgt i de opnåede kraftforlængelseskurver. Samtidig kan en overposition af de respektive styrker-forlængelse bruges til at afgøre, om en og samme enkelt polymer er blevet målt.

Efter at have bevist kovalent binding af en enkelt PS polymer, kan yderligere forsøg med denne PS polymer udføres varierende substrat (fast overflade samt polymer film), opløsningsmiddel betingelser, temperatur, trække hastighed eller dvæle tid.

Figure 1
Figur 1: Skematisk oversigt over tipfunktionaliseringsprocessen. Omfatter den kemiske modifikation af AFM cantilever spidsen efter (1) plasma aktivering (2) silanisering / PEGylation og (3) polymer vedhæftet fil. Desuden vises de detaljerede kemiske strukturer af de anvendte polymerer, nemlig PEG, PNiPAM og PS. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Eliminering af interferens i kraftforlængelseskurver. (A) Find en kraft-forlængelse kurve viser en sinusformet kraft signal artefakt langs forlængelsen, men har ingen enkelt molekyle stretching begivenhed. (B) Vælg en kraft-forlængelse kurve med et enkelt molekyle begivenhed, som skal korrigeres fra sinusformet artefakt. (C) Overlejr kurverne for at kontrollere, om de sinusformede artefakter af kurverne virkelig passer. (D) Ved at trække kraftforlængelseskurven (A) fra (B) opnås en kraftforlængelseskurve med en lige baseline. Selvom vedhæftningstoppen ikke kan bruges til yderligere analyse, korrigeres kraftforlængelseskurven nu for artefakten, hvilket fører til langt mere nøjagtige kraftværdier i området af enkeltmolekylehændelsen (her: > 0,2 μm forlængelse). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Bestemmelse af masterkurver fra PEG's kraftforlængelseskurver ved 298 K. (A) Forsøgsdata ved 298 K ved hjælp af 7 kraftforlængelseskurver. Efter reskalering til en længde L0 ved en kraft på 500 pN (B) kan kraftforlængelseskurverne flettes og beregnes i gennemsnit ved binominel udjævning, der opnår en masterkurve (C). De nyskalerede kurver angives som prikker, mens masterkurven vises som en fast linje. Endelig kan de opnåede master kurver for forskellige temperaturer sammenlignes (D). Zoom-in angiver det område, hvor temperatureffekten på kraftforlængelsesadfærden er mest udtalt. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Sammenligning af pNiPAM's og PEG's temperaturafhængige masterkurver. For PEG observeres en stigning i den nyskalerede forlængelse ved 100 pN (mellemkraftområde), når temperaturen øges (A), mens der for PNiPAM konstateres et modsat temperaturafhængigt skift (B). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Analyse af kraftforlængelseskurver af PS på SAM i vand. (A) Eksemplarisk kraft-forlængelse kurve (blå) med en sigmoidal pasform af plateauet (lilla). Derudover markerer pilene plateauets bestemte kraft (rød) og længde (grøn). Desorptionskraften og desorptionslængdeværdierne opnået ved sigmoidal-krampepasser vises i et scatter plot, og de resulterende histogrammer er udstyret med en gaussisk. (B) Den bestemte gennemsnitlige desorptionskraft og desorptionslængdeværdierne er (112 ± 6) pN og (659 ± 7) nm, hvor9 % af kraftforlængelseskurverne viser sådanne hændelser med et enkelt plateau. (C) Eksemplarisk kraftforlængelseskurve (blå) for to polymerer, der er fastgjort til AFM-kantilspidsen på samme tid. Her viser desorptionskraften en ikke-modal fordeling med en gennemsnitlig kraftværdi på (117 ± 5) pN, mens der kan findes en tomodal fordeling for desorptionslængden, der fører til gennemsnitlige længdeværdier på (656 ± 9) nm og (1050 ± 16) nm. (D) 90 % af de styrkeudvidelseskurver, der er udtaget prøver, viser kun enkeltplateauhændelser. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

AFM-baserede SMFS er et af de vigtigste værktøjer til at undersøge enkelt molekyle interaktioner i polymer fysik. For en sand enkelt molekyle eksperiment, kovalent fastgørelse af sonden polymer til en AFM cantilever tip er afgørende.

Mange tidligere værker er baseret på nanofiskeri eksperimenter, især for PNiPAM, hvor polymerer adsorberes på en overflade og derefter strakt ved tilfældigt plukke dem fra substratet ved hjælp af en AFM cantilever tip30,31. Dette kan ændre resultaterne og føre til fejlfortolkning af det indre molekyle adfærd. Der kan samarbejdseffekter dominere resultaterne, fordi interaktioner med tilstødende polymerer ikke kan udelukkes. Dette har en stor indvirkning på resultaterne, især for polymerer, der viser signifikant anderledes adfærd i løs vægt sammenlignet med enkelt isolerede molekyler57,58.

Funktionaliseringsprotokollen præsenteres her, er pålidelig og kan let anvendes på forskellige polymerer, uanset konturlængde, hydrofobicity eller monomernes steriske hindring. Derudover er en passivitet forudsat at forhindre uønskede interaktioner mellem den enkelte sonde polymer og AFM cantilever spids samt mellem AFM cantilever spidsen og den underliggende overflade. Desuden vises evalueringen af kraftforlængelseskurver, der viser strækhændelser. Der foreslås en procedure for bestemmelse af master kraft-forlængelse kurver. Dette er et bedre middel til at afsløre, fx temperaturrelaterede effekter på kraft-forlængelse adfærd. Endvidere er analysen af enkelt molekyle desorption begivenheder byder konstant kraft plateauer forudsat. Også en enkel måde at korrigere sinusformede kraft signal artefakter i kraft-forlængelse kurver er givet, som ellers kunne forringe resultaterne af forsøget.

Sammenlignet med Stetter et al.39reduceres funktionaliseringsproceduren her til tre trin i stedet for fire , og procedurens robusthed forbedres. Den største fordel ved at udføre PEGylation og silanisering i ét trin er at have en bedre kontrolleret reaktion og øge udbyttet. Desuden skal der udarbejdes færre løsninger, og der er behov for færre skylningstrin. Dette reducerer indsatsen og tiden til forberedelse og øger reproducerbarheden. Desuden er flytning af AFM-cantilevers altid en kritisk del af funktionaliseringsprocessen. En overførsel fra den ene løsning til den anden indebærer altid risiko for stærkt at påvirke funktionaliseringskvaliteten på grund af overførsler gennem luftvandsgrænsefladen eller for at miste AFM-cantilevers ved forkert brug af pincet.

For at bevise korrekt kovalent fastgørelse af en enkelt polymer til en AFM cantilever tip forskellige betingelser skal være opfyldt. For det første, kontrol AFM cantilevers er af væsentlig betydning og bør være forberedt på hver funktionalisering. Funktionaliseringsprocessen og væskecellen til udførelse af forsøgene anses kun for at være rene, hvis et lille antal kraftforlængelseskurver viser strækninger eller plateauer i kontroleksperimentet (i de præsenterede eksempler mindre end 2 %).

En klar stretching mønster uden yderligere dråber eller maxima er afgørende for at have ordentlig enkelt molekyle stretching begivenheder. Desuden bør afhængigheden af brudkraft på kraftbelastningshastigheden ved brud eller den komplette elastiske reaktion af strækkurven analyseres for at udelukke samtidig desorption af flere polymerer59,60. For PEG og PNiPAM viste henholdsvis 19 % og 42 % af de kraftforlængelseskurver, der blev indtaget på forskellige positioner af overfladen. For at opnå stretching begivenheder, skal physisorption af polymeren til de respektive underliggende overflade være stærk. Ellers observeres en plateaulignende desorptionshændelse. Dette er endnu mere afgørende for påvisning af stretching begivenheder ved høje kræfter (op til 500 pN eller mere). Da denne stærke physisorption ikke er opfyldt for hver kraft-udvidelse kurve, udbyttet af sådanne begivenheder er mindre end for ren plateau-lignende desorption begivenheder. Alternativt kan der anvendes stærkt klæbende grupper såsom katekoler eller chemisorption mellem polymer og underliggende overflade. Dette kræver imidlertid, at der indføres yderligere funktionelle grupper eller koblingssteder på polymeren61,62.

Faktisk giver polymerens masse (dvs. konturlængde) et værdifuldt fingeraftryk. Selvom massen ikke direkte kan oversættes til den målte konturlængde af følgende årsager, er længdefordelingen meget værdifuld til at definere enkeltmolekylehændelser. I tilfælde af en PNiPAM polymer med en lav polydispersity (= = 1,28), fandt vi betydelige forskelle i forlængelsesværdierne for de opnåede stretching hændelser (og dermed i polymerlængden) i forsøgene. En af grundene til dette kunne være bestemmelsen af polymerens længde og dens fordeling. I størrelsesudelukkelseskromatografi (SEK) bestemmes målpolymerens relative vægt i forhold til standarder som PS eller poly (methylmethacrylat) (PMMA)63. Den formodede relative vægt forventes at afvige fra den absolutte molekylvægt, fordi målpolymerens og standardens hydrodynamiske radius og standard en væsentligt forskellig. Derudover kan silane lag være oligomerized af falske vand i toluen under funktionaliseringsprocessen. Fastgørelsen af sådanne oligomerer til AFM cantilever spidsen fører til et mere fleksibelt lag med færre ankerpunkter64. Polymerens fastgørelsespunkt til siliciumlaget er måske ikke nødvendigvis i spidsen, hvilket fører til et skift af de fundne længdeværdier29. Mens en polymermodel som den ormelignende kæde (WLC) eller fjc-modellen (frit fende kæde) ikke kan gengive den respektive kraftudvidelsesadfærd for PEG eller PNiPAM korrekt over hele udvidelsesområdet18,29,41,65,66, kan en sådan polymermodel være værdifuld for andre polymer- og proteinsystemer10,15,67,68.

Den kovalente fastgørelse af en enkelt PS-polymer (med en konturlængde på mere end 1 μm) anses kun for at være vellykket, når et betydeligt antal kraftforlængelseskurver viser et tilstrækkeligt plateau med konstant kraft (figur 5). Et plateau som følge af desorbing en enkelt polymer er defineret ved en enkelt skarp dråbe af en konstant kraft til baseline ved en vis forlængelse, som angivet i figur 5A. Hvis der er knyttet flere polymerer til AFM-kanorspidsen, observeres en kaskade af plateauer56 (Figur 5C). Plateauetlængde (desorptionslængde), der korrelerer med polymerkonturlængden51,skal være betydeligt længere end nogen vedhæftningstop på grund af uspecifik vedhæftning af AFM-kanorspidsen til den underliggende overflade (her omkring 200 nm). Funktioner, der udelukkende vises i en enkelt kraftudvidelseskurve, bør ikke fortolkes. I de præsenterede forsøg viste mindst 80 ud af 100 kurver et plateau, der var længere end 200 nm på mindst to kraftkort to forskellige steder på overfladen. Desuden viser fordelingen af desorptionslængder ved hjælp af punktområder som angivet i figur 5B og 5D,om og hvor mange polymerer der er bundet til AFM cantilever spidsen. For PS's vedkommende tjente en snæver fordeling af desorptionskraften og længden fra plateauerne i kraftforlængelseskurverne som bevis for en vellykket kovalent fastgørelse. Dette viste sig endelig at være en succes for funktionaliseringsprotokollen. Vi anbefaler derfor på det kraftigste, at der præsenteres sådanne kraft- og længdefordelinger i publikationer.

Evaluering kraft-udvidelse kurver ved hjælp af indbyggede algoritmer, der omfatter mange forudindstillede parametre bør ske med omhu. Årsagerne er f.eks., at en fast prøvetagningshastighed ikke er passende for hver anvendt trækkrafthastighed, eller at en automatiseret udjævning af kraftforlængelseskurverne kan være en gennemsnitsværdi for vigtige detaljer. Normalt kan en korrekt forståelse af den respektive evalueringsprocedure forhindre fejl i evalueringsproceduren, hvilket igen kan have stor indflydelse på de endelige resultater af et AFM-baseret SMFS-eksperiment.

Sammenfattende præsenterer vi en funktionaliseringsprotokol, der er pålidelig og let kan anvendes på en række polymerer. Desuden præsenteres korrekt evaluering af enkelt molekylekraftforlængelseskurver, der gør det muligt at bestemme fysiske parametre såsom strækkraft, desorptionskraft og desorptionslængde. De præsenterede protokoller og procedurer er værdifulde for undersøgelsen af stimuli-responsive systemer på enkelt molekyleniveau.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende økonomisk interesse.

Acknowledgments

B.N.B. og T.H. anerkender finansiering fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) under Tysklands excellence strategi – EXC-2193/1 – 390951807, gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der Exzellenzstrategie des Bundes und der Länder – EXC-2193/1 – 390951807, og tilskud HU 997/1-13 (projekt # 420798410). M.G. anerkender delvis støtte inden for rammerne af LOEWE-projektet iNAPO fra Hessens statsministerium for videregående uddannelse, forskning og kunst. Vi takker Dr. Wolfgang Bronner og Dr. Agne Zukauskaite fra Fraunhofer Institute for Applied Solid State Physics IAF for donation af høj kvalitet guld belagt silicium vafler.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Dodecanethiol (≥98%) Sigma-Aldrich, USA 417364-500ML Used for SAM
Ammonia solution (30%) Roth, Germany CP17.2 Used for cleaning
Cypher ES Asylum Research, an Oxford Instruments company, USA - AFM
Ethanol (≥99.9%) Roth, Germany PO76.1 Solvent
Gold coated silicon wafer Fraunhofer Institute for Applied Solid State Physics IAF, Germany - Used for SAM
High Resolution Replicating Compound Microset Products Ltd, UK 101RF Bonding agent
Hydrogen peroxide solution Sigma-Aldrich, USA H1009 Used for cleaning
Igor Pro Wavemetrics, USA - Software environment
Tetra-30-LF-PC Diener Electronic, Germany - Plasma chamber
Maleimide-polyethylene glycol-triethoxysilane Creative PEG works, USA PHB-1923 Linker polymer
MLCT-Bio-DC Bruker, USA MLCT-Bio-DC AFM cantilever
Prime CZ-Si wafer, n-type (Phosphor) TTV < 10 µm MicroChemicals, Germany WSA40600250 P1314SNN1 Silicon wafer
Purelab Chorus 1, 18.2 MΩ cm Elga LabWater, Germany 10034-540 Ultrapure water source
R3 SA Vomm GmbH, Germany 5803 Blank Tweezers
Thiol terminated poly(N-isopropylacrylamide) Gallei Group, Saarland University, Germany - PNiPAM probe polymer
Thiol terminated polystyrene Polymer Source, Canada P40722-SSH PS probe polymer
Thiol-polyethylene glycol-thiol Creative PEGWorks, USA PSB-615 PEG probe polymer
Toluene (99.99%) Fisher Chemicals T324-500 Solvent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Physical Review Letters. 56 (9), 930-933 (1986).
  2. Hugel, T., Seitz, M. The Study of Molecular Interactions by AFM Force Spectroscopy. Macromolecular Rapid Communications. 22 (13), 989-1016 (2001).
  3. Butt, H. -J., Cappella, B., Kappl, M. Force measurements with the atomic force microscope: Technique, interpretation and applications. Surface Science Reports. 59 (1-6), 1 (2005).
  4. Balzer, B. N., Hugel, T. Single-Molecule Detection and Manipulation. Reference Module in Materials Science and Materials Engineering. Hashmi, S. , Elsevier. Amsterdam. (2016).
  5. Krieg, M., et al. Atomic force microscopy-based mechanobiology. Nature Reviews Physics. 1 (1), 41-57 (2019).
  6. Edwards, D. T., Faulk, J. K., LeBlanc, M. -A., Perkins, T. T. Force Spectroscopy with 9-μs Resolution and Sub-pN Stability by Tailoring AFM Cantilever Geometry. Biophysical journal. 113 (12), 2595-2600 (2017).
  7. Alsteens, D., et al. Nanomechanical mapping of first binding steps of a virus to animal cells. Nature Nanotechnology. 12 (2), 177-183 (2017).
  8. Kodera, N., Yamamoto, D., Ishikawa, R., Ando, T. Video imaging of walking myosin V by high-speed atomic force microscopy. Nature. 468, 72-76 (2010).
  9. Shibata, M., et al. Real-space and real-time dynamics of CRISPR-Cas9 visualized by high-speed atomic force microscopy. Nature Communications. 8 (1), 1-9 (2017).
  10. Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. Reversible unfolding of individual titin immunoglobulin domains by AFM. Science. 276 (5315), 1109-1112 (1997).
  11. Oesterhelt, F., Oesterhelt, D., Pfeiffer, M., Engel, A., Gaub, H. E., Müller, D. J. Unfolding pathways of individual bacteriorhodopsins. Science. 288 (5463), New York, N.Y. 143-146 (2000).
  12. Hugel, T., Holland, N. B., Cattani, A., Moroder, L., Seitz, M., Gaub, H. E. Single-molecule optomechanical cycle. Science. 296 (5570), New York, N.Y. 1103-1106 (2002).
  13. Yu, H., Siewny, M. G. W., Edwards, D. T., Sanders, A. W., Perkins, T. T. Hidden dynamics in the unfolding of individual bacteriorhodopsin proteins. Science. 355 (6328), New York, N.Y. 945-950 (2017).
  14. Erlich, K. R., Sedlak, S. M., Jobst, M. A., Milles, L. F., Gaub, H. E. DNA-free directed assembly in single-molecule cut-and-paste. Nanoscale. 11 (2), 407-411 (2019).
  15. Rico, F., Russek, A., González, L., Grubmüller, H., Scheuring, S. Heterogeneous and rate-dependent streptavidin-biotin unbinding revealed by high-speed force spectroscopy and atomistic simulations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (14), 6594-6601 (2019).
  16. Löf, A., et al. Multiplexed protein force spectroscopy reveals equilibrium protein folding dynamics and the low-force response of von Willebrand factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (38), 18798-18807 (2019).
  17. Kienle, S., Liese, S., Schwierz, N., Netz, R. R., Hugel, T. The effect of temperature on single-polypeptide adsorption. Chemphyschem : a European journal of chemical physics and physical chemistry. 13 (4), 982-989 (2012).
  18. Kolberg, A., et al. Opposing Temperature Dependence of the Stretching Response of Single PEG and PNiPAM Polymers. Journal of the American Chemical Society. 141 (29), 11603-11613 (2019).
  19. Balzer, B. N., et al. Cohesion Mechanisms of Polystyrene-Based Thin Polymer Films. Macromolecules. 46 (18), 7406-7414 (2013).
  20. Balzer, B. N., et al. Adhesion property profiles of supported thin polymer films. ACS Applied Materials & Interfaces. 5 (13), 6300-6306 (2013).
  21. Stetter, F. W. S., Cwiklik, L., Jungwirth, P., Hugel, T. Single Lipid Extraction: The Anchoring Strength of Cholesterol in Liquid-Ordered and Liquid-Disordered Phases. Biophysical journal. 107 (5), 1167-1175 (2014).
  22. Schwierz, N., Krysiak, S., Hugel, T., Zacharias, M. Mechanism of Reversible Peptide-Bilayer Attachment: Combined Simulation and Experimental Single-Molecule Study. Langmuir. 32 (3), 810-821 (2016).
  23. Balzer, B. N., et al. Nanoscale Friction Mechanisms at Solid-Liquid Interfaces. Angewandte Chemie International Edition. 52 (25), 6541-6544 (2013).
  24. Balzer, B. N., Kienle, S., Gallei, M., von Klitzing, R., Rehahn, M., Hugel, T. Stick-Slip Mechanisms at the Nanoscale. Soft Materials. 12, 106-114 (2014).
  25. Kühner, F., Erdmann, M., Sonnenberg, L., Serr, A., Morfill, J., Gaub, H. E. Friction of single polymers at surfaces. Langmuir. 22 (26), 11180-11186 (2006).
  26. Grebíková, L., Gojzewski, H., Kieviet, B. D., Klein Gunnewiek, M., Vancso, G. J. Pulling angle-dependent force microscopy. The Review of Scientific Instruments. 88 (3), 33705 (2017).
  27. Geisler, M., et al. Hydrophobic and Hofmeister effects on the adhesion of spider silk proteins onto solid substrates: an AFM-based single-molecule study. Langmuir. 24 (4), 1350-1355 (2008).
  28. Pirzer, T., Hugel, T. Atomic force microscopy spring constant determination in viscous liquids. Review of Scientific Instruments. 80 (3), 35110 (2009).
  29. Liese, S., et al. Hydration Effects Turn a Highly Stretched Polymer from an Entropic into an Energetic Spring. ACS Nano. 11 (1), 702-712 (2017).
  30. Cui, S., Pang, X., Zhang, S., Yu, Y., Ma, H., Zhang, X. Unexpected Temperature-Dependent Single Chain Mechanics of Poly(N-isopropyl-acrylamide) in Water. Langmuir. 28 (11), 5151-5157 (2012).
  31. Liang, X., Nakajima, K. Nanofishing of a Single Polymer Chain: Temperature-Induced Coil-Globule Transition of Poly(N -isopropylacrylamide) Chain in Water. Macromolecular Chemistry and Physics. 219 (3), 1700394 (2018).
  32. Zhang, W., Zou, S., Wang, C., Zhang, X. Single Polymer Chain Elongation of Poly(N -isopropylacrylamide) and Poly(acrylamide) by Atomic Force Microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 104 (44), 10258-10264 (2000).
  33. Hermanson, G. T. Bioconjugate techniques - 3rd Edition. , Academic Press. San Diego. (2013).
  34. Leitner, M., et al. Single-molecule AFM characterization of individual chemically tagged DNA tetrahedra. ACS Nano. 5 (9), 7048-7054 (2011).
  35. Walder, R., et al. Rapid Characterization of a Mechanically Labile α-Helical Protein Enabled by Efficient Site-Specific Bioconjugation. Journal of the American Chemical Society. 139 (29), 9867-9875 (2017).
  36. Tang, J., et al. High-affinity tags fused to s-layer proteins probed by atomic force microscopy. Langmuir. 24 (4), 1324-1329 (2008).
  37. Wildling, L., et al. Linking of sensor molecules with amino groups to amino-functionalized AFM tips. Bioconjugate Chemistry. 22 (6), 1239-1248 (2011).
  38. Maity, S., Viazovkina, E., Gall, A., Lyubchenko, Y. A. A Metal-free Click Chemistry Approach for the Assembly and Probing of Biomolecules. Journal of Nature and Science. 2 (4), 187 (2016).
  39. Stetter, F. W. S., Kienle, S., Krysiak, S., Hugel, T. Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (96), e52456 (2015).
  40. Becke, T. D., et al. Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (138), e58167 (2018).
  41. Ott, W., et al. Elastin-like Polypeptide Linkers for Single-Molecule Force Spectroscopy. ACS Nano. 11 (6), 6346-6354 (2017).
  42. Newton, R., et al. Combining confocal and atomic force microscopy to quantify single-virus binding to mammalian cell surfaces. Nature Protocols. 12 (11), 2275-2292 (2017).
  43. Staros, J. V., Wright, R. W., Swingle, D. M. Enhancement by N-hydroxysulfosuccinimide of water-soluble carbodiimide-mediated coupling reactions. Analytical Biochemistry. 156 (1), 220-222 (1986).
  44. Grabarek, Z., Gergely, J. Zero-length crosslinking procedure with the use of active esters. Analytical Biochemistry. 185 (1), 131-135 (1990).
  45. Baird, J. A., Olayo-Valles, R., Rinaldi, C., Taylor, L. S. Effect of Molecular Weight, Temperature, and Additives on the Moisture Sorption Properties of Polyethylene Glycol. Journal of Pharmaceutical Sciences. 99 (1), 154-168 (2010).
  46. Halperin, A., Kröger, M., Winnik, F. M. Poly(N-isopropylacrylamide) Phase Diagrams: Fifty Years of Research. Angewandte Chemie International Edition. 54 (51), 15342-15367 (2015).
  47. Barradas, R. G., Fletcher, S., Porter, J. D. The hydrolysis of maleimide in alkaline solution. Canadian Journal of Chemistry. 54 (9), 1400-1404 (1976).
  48. Kharasch, N., Tarbell, D. S. Chapter 10 - The Mechanism of Oxidation of Thiols to Disulfides. Organic Sulfur Compounds. , 97-102 (1961).
  49. Folkers, J. P., Laibinis, P. E., Whitesides, G. M. Self-assembled monolayers of alkanethiols on gold: comparisons of monolayers containing mixtures of short- and long-chain constituents with methyl and hydroxymethyl terminal groups. Langmuir. 8 (5), 1330-1341 (1992).
  50. Hutter, J. L., Bechhoefer, J. Calibration of atomic-force microscope tips. Review of Scientific Instruments. 64 (7), 1868-1873 (1998).
  51. Krysiak, S., Liese, S., Netz, R. R., Hugel, T. Peptide desorption kinetics from single molecule force spectroscopy studies. Journal of the American Chemical Society. 136 (2), 688-697 (2014).
  52. Hugel, T., Rief, M., Seitz, M., Gaub, H. E., Netz, R. R. Highly Stretched Single Polymers: Atomic-Force-Microscope Experiments Versus Ab-Initio Theory. Physical Review Letters. 94 (4), 48301 (2005).
  53. Marchand, P., Marmet, L. Binomial smoothing filter: A way to avoid some pitfalls of least-squares polynomial smoothing. Review of Scientific Instruments. 54 (8), 1034-1041 (1983).
  54. Horinek, D., et al. Peptide adsorption on a hydrophobic surface results from an interplay of solvation, surface, and intrapeptide forces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (8), 2842-2847 (2008).
  55. Friedsam, C., Gaub, H. E., Netz, R. R. Adsorption energies of single charged polymers. EPL (Europhysics Letters). 72 (5), 844-850 (2005).
  56. Scherer, A., Zhou, C., Michaelis, J., Brauchle, C., Zumbusch, A. Intermolecular Interactions of Polymer Molecules Determined by Single-Molecule Force Spectroscopy. Macromolecules. 38 (23), 9821-9825 (2005).
  57. Abbott, L. J., Tucker, A. K., Stevens, M. J. Single Chain Structure of a Poly(N-isopropylacrylamide) Surfactant in Water. The Journal of Physical Chemistry B. 119 (9), 3837-3845 (2015).
  58. Okano, T., Bae, Y. H., Jacobs, H., Kim, S. W. Thermally on-off switching polymers for drug permeation and release. Journal of Controlled Release. 11 (1), 255-265 (1990).
  59. Sulchek, T., Friddle, R. W., Noy, A. Strength of multiple parallel biological bonds. Biophysical journal. 90 (12), 4686-4691 (2006).
  60. Sulchek, T. A., et al. Dynamic force spectroscopy of parallel individual Mucin1-antibody bonds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (46), 16638-16643 (2005).
  61. Krysiak, S., Wei, Q., Rischka, K., Hartwig, A., Haag, R., Hugel, T. Adsorption mechanism and valency of catechol-functionalized hyperbranched polyglycerols. Beilstein Journal of Organic Chemistry. 11, 828-836 (2015).
  62. Jobst, M. A., Schoeler, C., Malinowska, K., Nash, M. A. Investigating receptor-ligand systems of the cellulosome with AFM-based single-molecule force spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (82), e50950 (2013).
  63. Trathnigg, B. Determination of MWD and chemical composition of polymers by chromatographic techniques. Progress in Polymer Science. 20 (4), 615-650 (1995).
  64. Blass, J., Albrecht, M., Wenz, G., Zang, Y. N., Bennewitz, R. Single-molecule force spectroscopy of fast reversible bonds. Physical Chemistry Chemical Physics. 19 (7), 5239-5245 (2017).
  65. Oesterhelt, F., Rief, M., Gaub, H. E. Single molecule force spectroscopy by AFM indicates helical structure of poly(ethylene-glycol) in water. New Journal of Physics. 1, 1-11 (1999).
  66. Xue, Y., Li, X., Li, H., Zhang, W. Quantifying thiol-gold interactions towards the efficient strength control. Nature Communications. 5, 4348 (2014).
  67. Lyu, X., Song, Y., Feng, W., Zhang, W. Direct Observation of Single-Molecule Stick-Slip Motion in Polyamide Single Crystals. ACS Macro Letters. 7 (6), 762-766 (2018).
  68. Hugel, T., et al. Elasticity of Single Polyelectrolyte Chains and Their Desorption from Solid Supports Studied by AFM Based Single Molecule Force Spectroscopy. Macromolecules. 34 (4), 1039-1047 (2001).

Tags

Kemi enkelt molekyle kraftspektroskopi atomkraftmikroskop vedhæftning funktionalisering PEGylation
Kovalent fastgørelse af enkelte molekyler til AFM-baseret kraftspektroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kolberg, A., Wenzel, C., Hugel, T.,… More

Kolberg, A., Wenzel, C., Hugel, T., Gallei, M., Balzer, B. N. Covalent Attachment of Single Molecules for AFM-based Force Spectroscopy. J. Vis. Exp. (157), e60934, doi:10.3791/60934 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter