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Chemistry

एएफएम आधारित फोर्स स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए एकल अणुओं का सहसंयोजक लगाव

Published: March 16, 2020 doi: 10.3791/60934
Automatic Translation
1, 1, 1,3, 2, 1,3
1Institute of Physical Chemistry, Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, 2Chair in Polymer Chemistry, Saarland University, 3Cluster of Excellence livMatS at FIT - Freiburg Center for Interactive Materials and Bioinspired Technologies, University of Freiburg

Summary

परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) कैंटिलीवर टिप्स के लिए जांच अणुओं का सहसंयोजक लगाव उनके भौतिक गुणों की जांच के लिए एक आवश्यक तकनीक है। यह हमें उच्च प्रजनन क्षमता के साथ एएफएम-आधारित एकल अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी के माध्यम से खींच बल, अपश्यकबल और पॉलिमर की लंबाई निर्धारित करने की अनुमति देता है।

Abstract

परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) -आधारित एकल अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी एक बहुलक और सतहों के बीच बातचीत की जांच के लिए एक आदर्श उपकरण है। एक सच्चे एकल अणु प्रयोग के लिए, जांच अणु का सहसंयोजक लगाव आवश्यक है क्योंकि तभी सैकड़ों बल-विस्तार एक के साथ निशान प्राप्त किए जा सकते हैं और एक ही अणु प्राप्त किया जा सकता है । कई निशान बदले में साबित करने के लिए आवश्यक है कि अकेले एक अणु की जांच की जाती है । इसके अतिरिक्त, एक जांच अणु और एएफएम कैंटिलीवर टिप के साथ-साथ एएफएम कैंटिलीवर टिप और अंतर्निहित सतह के बीच अवांछित बातचीत को रोकने के लिए पासिवेशन महत्वपूर्ण है। यहां प्रस्तुत कार्यात्मकता प्रोटोकॉल विश्वसनीय है और आसानी से विभिन्न प्रकार के पॉलिमर पर लागू किया जा सकता है। बल-विस्तार के निशान ों में विशेषता एकल अणु घटनाओं (यानी, हिस्सों और पठारों) का पता लगाया जाता है। इन घटनाओं से, स्ट्रेचिंग फोर्स, डिवरप्शन फोर्स और डिवरशन लेंथ जैसे फिजिकल पैरामीटर ्स प्राप्त किए जा सकते हैं । यह एकल अणु स्तर पर उत्तेजनाओं-उत्तरदायी प्रणालियों की सटीक जांच के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है । अनुकरणीय प्रणालियों के रूप में पॉली (एथिलीन ग्लाइकोल) (खूंटी), पालीx (एन-आइसोप्रोपाइलैरिलामाइड) (PNiPAM) और पॉलीस्टीरिन (पीएस) को एसआईओ एक्स (खूंटी और पनिपाम के लिए) से और जलीय वातावरण में हाइड्रोफोबिक स्व-इकट्ठे मोनोलेयर सतहों (पीएस के लिए) से फैला और डिसोरकिया जाता है।N

Introduction

1 9 80 केदशकमें अपने आविष्कार के बाद से, परमाणु बल माइक्रोस्कोप (एएफएम) प्राकृतिक विज्ञान में सबसे महत्वपूर्ण इमेजिंग तकनीकों में से एक बन गया है जिसमें उप-नैनोमीटर स्थानिक संकल्प, उप-पिकोन्यूटन बल संकल्प और विभिन्न विलायक और तापमान की स्थिति2,,3,,4,,55,6,,7में मापने की संभावना है।

इमेजिंग8,9केअलावा, एएफएम का उपयोग एकल अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी (एसएमएफएस) करने के लिए किया जाता है जो एकल बहुलक और सतहों के बीच चिपकने वाली बातचीत, एकल बहुलक के भौतिक गुणों और प्रोटीन के तंत्र का खुलासा7,,10,,11,,12,,13,,14,,15,,16के बीच चिपकने वाली बातचीत में अंतर्दृष्टि देता है। नियमित एसएमएफएस प्रयोग में, कार्यात्मक कैंटिलीवर टिप को सतह के संपर्क में लाया जाता है ताकि एएफएम कैंटिलीवर टिप फिजिशियन पर बहुलक इस सतह पर हो। सतह से एएफएम कैंटिलीवर टिप को वापस करके, एएफएम कैंटिलीवर के विक्षेप में परिवर्तन एक बल-विस्तार वक्र4के लिए अग्रणी एक बल में परिवर्तित हो जाता है। स्ट्रेचिंग फोर्स, डिफरेंट फोर्स और डिवरशन लेंथ जैसे भौतिक मापदंडों को विभिन्न मापदंडों जैसे वेग खींचने, सतह पर समय निवास, सतह में इंडेंटेशन गहराई, तापमान, विलायक17, 17,,18 और ठोस सब्सट्रेट्स, बहुलक फिल्मों या समर्थित लिपिड बाइलेयर्स19,20,,21,,22जैसे विभिन्न सतहों पर निर्भर के रूप में निर्धारित किया जा सकता है।, इसके अलावा, एक बहुलक की जांच विभिन्न स्थानिक दिशाओं में की जा सकती है, इस प्रकारबहुलक 23,,24,,25,,26के घर्षण गुणों की जांच की जा सकती है।

इस तरह के अध्ययनों के लिए एएफएम कैंटिलीवर टिप के लिए जांच की गई बहुलक का सहसंयोजक लगाव आवश्यक है। इस प्रकार, एक के साथ एकल अणु घटनाओं की एक उच्च उपज और एक ही बहुलक एक AFM cantilever टिप करने के लिए बाध्य AFM cantilever27,,28,अलग लगाव अंक29 या अलग बहुलक (विभिन्न समोच्च लंबाई के साथ) जैसे नैनोफिशिंग प्रयोगों के मामले में30,,31,,32के वसंत स्थिर के अंशांकन के कारण परिणामों के किसी भी पूर्वाग्रह को रोकता है । इसके अलावा, अन्य बहुलकों के साथ बातचीत के साथ-साथ औसत प्रभावों को व्यापक रूप से18,,28रोका जा सकता है। एएफएम कैंटिलीवर टिप के लिए बहुलक के सहसंयोजक लगाव के लिए, विभिन्न प्रकार के रासायनिक संशोधन लागू किए जा सकते हैं, जिनमें से कई हरमनसन33द्वारा पुस्तक में संक्षेप में दिए गए हैं। अमीन और थिओल आधारित लिंकिंग प्रतिक्रियाओं के साथ -साथ क्लिक करें रसायन विज्ञान एएफएम कैंटिलीवर टिप फंक्शनैलाइजेशन34,35,36,37 ,38,,39,,40,41,42में सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले तरीकों का प्रतिनिधित्व करता है .38 बेके एट अल४० शो कैसे 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid (EDC)/एनएचएस रसायन विज्ञान का उपयोग करने के लिए एक AFM cantilever टिप करने के लिए एक प्रोटीन संलग्न करते हैं । हालांकि, उक्त कार्यात्मक समूह क्रॉसलिंक करते हैं, इस प्रकार कार्यक्षमता43,,44का नुकसान होता है। इसके अलावा, कार्बोडिमिड्स समाधान43में हाइड्रोलेसिस को तेज करने की प्रवृत्ति दिखाते हैं। मैलेमिड और थिओल समूह आम तौर पर अधिक स्थिर होते हैं और क्रॉसलिंकिंग प्रतिक्रियाएं नहीं दिखाते हैं। प्रस्तुत प्रोटोकॉल35,39के संदर्भ में दिए गए पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल का अनुकूलन है .

यहां, एक विश्वसनीय कार्यात्मकता प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया जाता है जिसे बड़ी संख्या में विभिन्न पॉलिमर में आसानी से समायोजित किया जा सकता है, भले ही समोच्च लंबाई या हाइड्रोफोबीसिटी जैसे गुणों की परवाह किए बिना। उदाहरण के माध्यम से तीन अलग-अलग पॉलिमर चुने गए: हाइड्रोफिलिक पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) और पॉली (एन-आइसोप्रोपाइलैरिलामाइड) (PNiPAM) के साथ-साथ उच्च मोलर मास हाइड्रोफोबिक पॉलीस्टायरीन (पीएस)।N एक उपयुक्त लिंकर अणु के साथ एक सहसंयोजक बाध्यकारी क्षमता प्रदान करने के लिए, तीन बहुलक कार्यात्मक अंत समूह के रूप में एक टेलीचेलिक थिओल moiety की विशेषता के लिए चुना गया था । लिंकर अणु ही आम तौर पर दो सक्रिय साइटों, एक छोर पर एक सिलेन समूह और दूसरे छोर पर एक मैलिमिड समूह के साथ एक छोटा खूंटी बहुलक है । पूर्व एएफएम कैंटिलीवर टिप और बाद में कार्यात्मक उच्च मोलर मास बहुलक के थिओल समूह के साथ एक बाध्यकारी प्रतिक्रिया के लिए एक सहसंयोजक लगाव सक्षम बनाता है। इसके अलावा, निष्क्रिय खूंटी लिंकर अणु जांच बहुलक और एएफएम कैंटिलीवर टिप के साथ-साथ एएफएम कैंटिलीवर टिप और अंतर्निहित सतह के बीच अवांछित बातचीत को रोकने के लिए एक पासिवेशन परत के रूप में काम करते हैं।

Protocol

नोट: एक योजनाबद्ध सिंहावलोकन के लिए चित्रा 1 देखें ।

1. रिएजेंट सेटअप

नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए उपयोग किए जाने वाले बहुलक हैं: मैलिमिड-पॉलीथीन ग्लाइकोल-ट्राइथोक्सीलेन (सिलेन-खूंटी-मल, 5 केडीए), थिओल-पॉलीथीन ग्लाइकोल-थिओल (एचएस-खूंटी-एसएच, 35 केडीए), थिओल ने पाली (एन-आइसोप्रोपाइलैरिलामाइड) (PNiPAM-SH, 637 kDa) और थिओल टर्मिनेट पॉलीस्टीरिन (पीएस-एसएच, 1.3 एमडीए) को समाप्त कर दिया।N

  1. परमाणु हस्तांतरण कट्टरपंथी बहुलक के माध्यम से अच्छी तरह से परिभाषित और उच्च मोलर मास PNiPAM-SH तैयार करें, जिसके बाद रूपांतरण और एक थिओल moiety की शुरूआत के लिए कार्यात्मक अंत समूह में कमी, जैसा कि साहित्य18में वर्णित है। कृपया विस्तृत संरचनाओं के लिए चित्रा 1 देखें।
  2. रसायनों के भंडारण के लिए, वायुमंडलीय ऑक्सीजन और नमी के संपर्क से बचने के लिए नाइट्रोजन वातावरण के साथ एक सूखे दस्ताने के भीतर छोटे aliquots तैयार करें । खूंटी और PNiPAM हाइग्रोस्कोपिक45,46 और खूंटी, PNiPAM और PS के कार्यात्मक अंत समूहों को आसानी से ऑक्सीकरण हो जब परिवेश की स्थिति,33,47,,48पर संग्रहीत करने के लिए जाना जाता है । सभी रसायनों को -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित करना होगा।
  3. एनालिटिकल ग्रेड सॉल्वैंट्स या उससे ज्यादा का इस्तेमाल करें। इसके अलावा, एएफएम कैंटिकलवर्स चिप्स और ग्लासवेयर को कुल्ला करने के लिए अल्ट्राप्ली पानी का उपयोग करें क्योंकि एकल अणु प्रयोग सभी संदूषण के प्रति बहुत संवेदनशील होते हैं।

2. उपकरण सेटअप

नोट: स्टेनलेस स्टील या ग्लास से बने चिमटी और चोंच का उपयोग करें। एक सुरक्षित पकड़ के लिए उल्टे चिमटी का उपयोग करें (जैसे, मॉडल R3 एसए एक कम वसंत स्थिर होने) ।

  1. साफ कांच के बर्तन और चिमटी के लिए आरसीए (अल्ट्राप्योर पानी, हाइड्रोजन पेरोक्साइड और अमोनिया (5:1:1)) समाधान तैयार करें।
  2. जहाजों को एक बीकर में रखें और इसे आरसीए से भरें जब तक कि ग्लासवेयर या चिमटी पूरी तरह से कवर न हो जाएं।
  3. बीकर को 1 घंटे के लिए चरण 2.2 से 80 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें।
  4. जहाजों को बाद में अल्ट्राप्योर पानी के साथ कुल्ला करें जब तक कि कोई तीखी गंध अब और पता नहीं लगाया जा सकता है (कम से कम तीन बार)।
  5. एक ओवन (120 डिग्री सेल्सियस) में सूखे कांच के बर्तन और चिमटी।

3. टिप फंक्शनैलाइजेशन

नोट: कार्बनिक वाष्प के साँस लेने से बचने के लिए सभी चरणों को धुएं के हुड में किया जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, दस्ताने, प्रयोगशाला कोट और आंखों की सुरक्षा की आवश्यकता है। संदूषण से बचने के लिए हर कदम के लिए नाइट्रिक या लेटेक्स दस्ताने का उपयोग करें। टोल्यूईन का उपयोग करते समय सॉल्वेंट प्रतिरोधी दस्ताने पहनें। सभी कदम, जब तक अन्यथा निर्दिष्ट नहीं किए जाते हैं, आरटी में किया जाता है । संभावित क्रॉस-संदूषण से बचने के लिए हर कदम के लिए ताजा उपकरण और दस्ताने का उपयोग करें ।

  1. एएफएम कैंटिलीवर चिप एमएलसीटी-बायो-डीसी पर ऑक्सीजन प्लाज्मा लगाकर सतह सक्रियण करें।
    नोट: प्लाज्मा कक्ष में ऑक्सीजन की सामग्री के साथ आगे कार्यात्मकता कदम तराजू के लिए प्लाज्मा उपचार की दक्षता।
    1. एक प्लाज्मा चैंबर (40 kHz, 600 W) में एएफएम कैंटिलीवर चिप्स रखने के लिए हौसले से साफ चिमटी का उपयोग करें।
    2. कस्टम-संशोधित सक्रियण कार्यक्रम का उपयोग करें: निकासी (0.1 मीटर) - ऑक्सीजन के साथ बाढ़ के दबाव के लिए: 0.2 मीटर (4 मिनट) - प्लाज्मा प्रक्रिया (बिजली: 40%, अवधि: 2 मिनट, प्रक्रिया दबाव: 0.2 mbar)।
    3. कक्ष हवादार और हवा से एएफएम कैंटिलीवर चिप्स को संदूषकों के किसी भी सोखने को रोकने के लिए तुरंत चरण 3.2.2 के साथ जारी रखें।
  2. सीलनीकरण और पीईजिलेशन
    नोट: समय चरणों के बीच एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है। प्रतीक्षा समय के दौरान यथासंभव नए समाधान तैयार करें। मालेमिमिड समूह जलीय मीडिया में हाइड्रोलिसिस के अधीन होते हैं और थिओल आसानी से समाधान33,,47 बाधा एएफएम टिप कार्यात्मकप्रतिक्रियाओं में डिसुल्फिड्स के लिए ऑक्सीकृत हो जाते हैं।
    1. सॉल्वेंट प्रतिरोधी प्लास्टिक या कांच की ट्यूबों में टोलुईन (1.25 मिलीग्राम/mL) में एक सिलीन-खूंटी-मल समाधान तैयार करें और फ्लैट पेट्री व्यंजनों में समाधान का 6 मिलील डालें, प्रत्येक 3 मिलीग्राम।
      नोट: यदि एसएमएफएस प्रयोग में कई जांच पॉलिमर की बाध्यकारी देखी जाती है, तो गैर-कार्यात्मक सिलेन-खूंटी के साथ सिलेन-खूंटी-मल को मिलाने से एंकरिंग पॉइंट्स की संख्या कम हो सकती है। विभिन्न जनता (यानी, समोच्च लंबाई) के साथ पासिवेशन लेयर खूंटी के समायोजन के लिए27का उपयोग किया जा सकता है।
    2. 60 डिग्री सेल्सियस35पर 3 घंटे के लिए सिलेन-खूंटी-मल समाधान (10 चिप्स प्रति पेट्री डिश) में चरण 3.1.3 के तुरंत बाद एएफएम कैंटिलीवर चिप्स को इनक्यूबेट करें।
    3. पेट्री व्यंजन को ओवन से बाहर ले जाएं और समाधान को कम से कम 10 मिन के लिए ठंडा होने दें।
    4. प्रत्येक एएफएम कैंटिलीवर चिप को ध्यान से कुल्ला करें। एयर-सॉल्वेंट इंटरफ़ेस को पास करते समय एएफएम कैंटिलीवर पर केशिका बलों के प्रभाव को कम करें, उदाहरण के लिए समाधान में विसर्जित करते समय इन चिप्स को थोड़ा झुकाकर।
      1. खूंटी और पीएस बहुलक के लिए, टोलुईन के साथ तीन बार कुल्ला।
      2. PNiPAM बहुलक के लिए, टोलुईन के साथ एक बार कुल्ला और इथेनॉल के साथ दो बार।
    5. नियंत्रण एएफएम कैंटिलीवर चिप्स के रूप में कम से कम दो एएफएम कैंटिलीवर चिप्स चुनें, चरण 3.3 लंघन और उन्हें विलायक की ध्रुवता को बढ़ाने के लिए इस प्रकार कुल्ला करें:
      1. खूंटी और पीएस बहुलक के लिए, इथेनॉल के साथ दो बार कुल्ला और एक बार अल्ट्राप्यूरी पानी के साथ।
      2. PNiPAM बहुलक के लिए, अल्ट्राप्ली पानी के साथ दो बार कुल्ला।
        नोट: नियंत्रण एएफएम कैंटिलीवर चिप्स बहुलक लगाव (चरण 3.3) को छोड़कर सभी कार्यात्मकता चरणों से गुजरे हैं। वे कार्यात्मकता प्रक्रिया, एएफएम कैंटिलीवर चिप धारक प्रणाली, सतहों और एसएमएफएस प्रयोग के लिए उपयोग किए जाने वाले सॉल्वैंट्स की सफाई को साबित करने का काम करते हैं।
  3. सहसंयोजक बहुलक लगाव
    नोट: भले ही AFM cantilever टिप पूरी तरह से मैलिमिड समूहों के साथ कवर होने की उम्मीद है, वहां सिर्फ एक जांच बहुलक के लिए कुछ बाध्यकारी साइटों रहे हैं, क्योंकि maleimide पानी में हाइड्रोलिसिस से गुजरता है निष्क्रिय PEGs४७के लिए अग्रणी । ये निष्क्रिय पीईजी एक पासिवेशन परत के रूप में कार्य करते हैं, जैसा कि ऊपर वर्णित है।
    1. इनक्यूबेट एएफएम कैंटिलीवर चिप्स सीधे 3 mL पेट्री व्यंजनों में निम्नलिखित बहुलक समाधानों में से एक में चरण 3.2.5 के बाद। यदि संबंधित बहुलक ठीक से भंग नहीं होता है, तो 40 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान का उपयोग करें और समाधान को अच्छी तरह से हिलाएं।
      नोट: थिओल टर्मिनेट पॉलिमर के उपयोग के रूप में सिलेन-खूंटी-मल के मैलिमिड समूहों के साथ प्रतिक्रिया में बाधा डालने वाले डिसुल्फिफाइड बांड के गठन का कारण बन सकता है, विशेष रूप से यदि चरण 3.3 पानी में घुलनशील बहुलक33के लिए जलीय बफ़र्स में लागू किया जाता है।
      1. खूंटी और पीएस पॉलिमर के लिए, 60 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए टोल्यूईन में 1.25 मिलीग्राम/mL की एकाग्रता का उपयोग करें।
      2. PNiPAM बहुलक के लिए, आरटी में 3 घंटे के लिए इथेनॉल में 1.25 मिलीग्राम/mL की एकाग्रता का उपयोग करें।
        नोट: यदि एसएमएफएस प्रयोग में कई जांच पॉलिमर की बाध्यकारी देखी जाती है, तो बहुलक की एकाग्रता को कम किया जाना चाहिए।
    2. ध्यान से प्रत्येक एएफएम कैंटिलीवर चिप कुल्ला।
      1. खूंटी और पीएस बहुलक के लिए, टोलुईन के साथ दो बार कुल्ला, इथेनॉल के साथ दो बार और एक बार 10 00 ठंडा होने के बाद अल्ट्राप्यूरी पानी के साथ।
      2. PNiPAM बहुलक के लिए, इथेनॉल के साथ दो बार और अल्ट्राप्यूरी पानी के साथ दो बार कुल्ला।
    3. एक प्रयोग में उपयोग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर अल्ट्राप्योर पानी से भरे एक छोटे (1 mL) पेट्री डिश में प्रत्येक एएफएम कैंटिलीवर चिप को अलग से स्टोर करें।

4. सतह तैयार करना

  1. सिलिकॉन ऑक्साइड वेफर
    नोट: इस सतह खूंटी और PNiPAM के साथ SMFS के लिए इस्तेमाल किया गया था ।
    1. एक हीरे के चाकू का उपयोग कर छोटे टुकड़ों में एक सिलिकॉन ऑक्साइड वेफर काटें।
    2. सिलिकॉन ऑक्साइड के टुकड़ों को माइक्रोसेंट्रोफ्यूज ट्यूब में अलग से रखें और इन ट्यूबों को इथेनॉल से भरें।
    3. 10 मिन के लिए सिलिकॉन ऑक्साइड के टुकड़े को सोनीकेट करें।
    4. सिलिकॉन ऑक्साइड के टुकड़ों को दो बार इथेनॉल के साथ कुल्ला करें और उन्हें नाइट्रोजन प्रवाह के नीचे सावधानी से सुखा लें। सिलिकॉन ऑक्साइड के टुकड़ों का तुरंत इस्तेमाल करें।
  2. सोने पर हाइड्रोफोबिक अल्केन थिओल के स्व-इकट्ठे मोनोलेयर (सैम)
    नोट: इस सतह का उपयोग पीएस के साथ एसएमएफएस के लिए किया गया था। SAMsकेबारे में अधिक जानकारी के लिए साहित्य३९,४९ देखें ।
    1. कदम 4.1.1 - 4.1.4 करने के लिए सोने को टेड सिलिकॉन वेफर (ए [100], 5 एनएम टाइटेनियम, 100 एनएम सोना) का उपयोग करें।
    2. 18 घंटे के लिए 1-डोडेकैंथिओल समाधान (2 एमएम) में सतह के टुकड़ों को इनक्यूबेट करें।
    3. दो बार इथेनॉल में हौसले से तैयार एसएमएस को कुल्ला करें।
    4. सीधे उपयोग के लिए नाइट्रोजन प्रवाह के साथ शुष्क SAMs या बाद में उपयोग के लिए 4 दिनों तक के लिए इथेनॉल में स्टोर।

5. डेटा अधिग्रहण

नोट: यहां दिखाए गए सभी माप तापमान भिन्नता के लिए एक हीटिंग और कूलिंग नमूना चरण का उपयोग करके एक साइफर ईएस एएफएम के साथ अल्ट्राप्ली पानी में किए गए थे। आम तौर पर, तरल पदार्थों में मापने की क्षमता प्रदान करने वाले सभी एएफएमएस का उपयोग किया जा सकता है।

  1. एएफएम में फंक्शनलएटीकृत एएफएम कैंटिलीवर चिप डालें।
  2. तैयार सतह को एक नमूना धारक में गोंद करें जो तरल पदार्थों (जैसे, उच्च संकल्प प्रतिकृति यौगिक 101RF या यूवी इलाज चिपकने वाला) में मापने के लिए उपयुक्त है।
    नोट: ये बॉन्डिंग एजेंट बड़ी संख्या में ध्रुवीय सॉल्वैंट्स के लिए अत्यधिक निष्क्रिय और प्रतिरोधी हैं। नॉनपोलर सॉल्वैंट्स (जैसे, टोल्यूईन या हेक्साने) या उच्च तापमान के चिपकने वाले प्रतिरोध को उपयोग करने से पहले जांचा जाना चाहिए।
  3. एएफएम कैंटिलीवर चिप और तरल में जांच नमूना विसर्जित करें, यहां: अल्ट्राप्योर पानी।
    नोट: एएफएम कैंटिलीवर चिप धारक पर एक सॉल्वेंट ड्रॉप (लगभग 100 माइक्रोन) जमा किया जा सकता है। सॉल्वेंट के साथ एएफएम कैंटिलीवर चिप को कवर करने से केशिका बलों को कम कर देता है, जो अन्यथा एयर-सॉल्वेंट इंटरफेस से गुजरने वाले नमूना सतह के पास पहुंचने पर एएफएम कैंटिलीवर पर कार्य करेगा।
  4. यदि आवश्यक हो, तो तापमान को समायोजित करें और सिस्टम को समान होने दें।
    नोट: तापमान परिवर्तन एल्यूमीनियम या सोने की तरह एक चिंतनशील कोटिंग के साथ AFM cantilvers के लिए एक द्विधातु प्रभाव के कारण AFM cantilever के एक विक्षेप में परिणाम हो सकता है । संतुलन सतह (कई μm) से दूर किया जाना चाहिए जब तक कि विक्षेप संकेत का कोई और परिवर्तन नहीं देखा जाता है (एमएलसीटी-बायो-डीसी के लिए 15 किमी तक)।
  5. कार्यात्मकता के बुढ़ापे के किसी भी प्रभाव को बाहर करने के लिए तापमान को बेतरतीब ढंग से भिन्न करें। सुनिश्चित करें कि लागू तापमान AFM cantilever के एक अपरिवर्तनीय झुकने के लिए नेतृत्व नहीं करते हैं ।
    नोट: सॉल्वेंट गुणों (जैसे वाष्पीकरण या चिपचिपाहट में परिवर्तन) पर कोई तापमान प्रभाव आपके प्रयोगों में बाधा डाल सकता है। प्रस्तुत उदाहरणों में, तापमान 10 K के चरणों में 40 K तक की सीमा में भिन्न था जो एक विलायक के रूप में पानी ले रहा था (उदाहरण के लिए, 278 K से 318 K तक)।
  6. एक कठिन सतह (जैसे सिलिकॉन ऑक्साइड) पर बल-विस्तार घटता लेकर InvOLS (विलोम ऑप्टिकल लीवर संवेदनशीलता) निर्धारित करने के लिए सतह से संपर्क करें। इसके लिए, फोटोडिटेक्टर (वी में) बनाम पीजो दूरी के विक्षेप संकेत लें और एक रैखिक फ़ंक्शन का उपयोग करके अंतर्निहित सतह (प्रतिकारक शासन) में एएफएम कैंटिलीवर टिप के इंडेंटेशन का प्रतिनिधित्व करने वाले हिस्से की ढलान निर्धारित करें। त्रुटियों को कम करने के लिए, अंतिम InvOLS मूल्य प्राप्त करने के लिए कम से कम पांच मूल्यों का औसत लें। अधिक जानकारी के लिए, साहित्य4,39देखें।
    नोट: InvOLS केवल मज़बूती से कठिन सतहों पर निर्धारित किया जा सकता है । नरम सतहों या इंटरफेस पर प्रयोगों के मामले में सुनिश्चित करें कि आप अपनी नरम सतहों के करीब एक कठिन सतह जगह बनाते हैं। फिर, AFM सेटअप को अलग करने की आवश्यकता के बिना आपके नरम सतह प्रयोगों से पहले या बाद में InvOLS अंशांकन किया जा सकता है।
  7. वसंत निरंतर दृढ़ संकल्प के लिए, एएफएम कैंटिलीवर को एएफएम कैंटिलीवर टिप और सतह (कई माइक्रोन) के बीच न तो आकर्षक और प्रतिकारक बातचीत के साथ ऊंचाई पर ले जाएं। फिर, एक थर्मल शोर स्पेक्ट्रम रिकॉर्ड करें जहां पावर स्पेक्ट्रल घनत्व (पीएसडी) बनाम आवृत्ति की साजिश रची जाती है। निम्नलिखित चरण आमतौर पर वाणिज्यिक एएफएम सॉफ़्टवेयर में स्वचालित अंतर्निहित कार्यों द्वारा किए जाते हैं: पहला, अधिग्रहीत थर्मल शोर स्पेक्ट्रम पीएसडी के लिए एक फ़ंक्शन फिटिंग द्वारा विश्लेषण किया जाता है, उदाहरण के लिए, एक साधारण हार्मोनिक दोलन (एसएचओ)। फिट पहली और दूसरी प्रतिध्वनि के बीच न्यूनतम तक किया जाता है। दूसरा, पीएसडी बनाम फ्रीक्वेंसी प्लॉट के फिट हिस्से के तहत क्षेत्र ऊर्ध्वाधर दिशा में एएफएम कैंटिलीवर के मतलब वर्ग विस्थापन का प्रतिनिधित्व करने का निर्धारण किया जाता है। अंत में, समविभाजन प्रमेय का उपयोग एएफएम कैंटिलीवर बल निरंतर28,,50प्राप्त करने के लिए किया जाता है।
    नोट: एक उपयुक्त आवृत्ति रेंज का उपयोग किया जाना चाहिए जिसमें एएफएम कैंटिलीवर की पहली अनुनाद चोटी शामिल है। संतोषजनक सिग्नल-टू-शोर अनुपात प्राप्त करने के लिए, कम से कम 10 पीएसडी उच्चतम संभव आवृत्ति समाधान के साथ जमा किए जाने चाहिए।
  8. प्रयोग शुरू करें। किसी भी स्थानीय सतह प्रभाव (जैसे, अशुद्धियों, अव्यवस्थाओं) और औसत विभिन्न सतह क्षेत्रों से बचने के लिए ग्रिड जैसे फैशन (जैसे, 20 x 20 माइक्रोन2के क्षेत्र के लिए 10 x 10 अंक) में बल-विस्तार घटता लेकर रिकॉर्ड बल मानचित्र।
    नोट: विशिष्ट पैरामीटर पर्याप्त समाधान सुनिश्चित करने के लिए 1 μm/s का एक पुलिंग वेग और 5 किलोवाट की नमूना दर है। जब पुलिंग वेग भिन्न होता है तो नमूना दर को अनुकूलित किया जाना चाहिए। वापस लेने की दूरी को मापा बहुलक की समोच्च या अवशोषण लंबाई (लगभग दो बार अपेक्षित लंबाई) के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।
  9. उपयोग करें और सतह की ओर ध्यान केंद्रित समय बदलती हैं ताकि एकल बहुलक सतह (आमतौर पर 0 - 5 एस) का पालन करने की अनुमति दे सके।
  10. सिस्टम की स्थिरता और स्थिरता की जांच करने के लिए प्रयोग के अंत में InvOLS और वसंत स्थिर के दृढ़ संकल्प को दोहराएं।
    नोट: बहुलक और सतह के बीच मजबूत आसंजन के लिए, कार्यकरण को संरक्षित करने के लिए वास्तविक प्रयोग के बाद अंशांकन किया जा सकता है।

6. डेटा मूल्यांकन

नोट: डेटा मूल्यांकन के लिए, इगोर प्रो पर आधारित एक कस्टम-लिखित सॉफ्टवेयर का उपयोग निम्नलिखित चरणों को करने के लिए किया गया था।

  1. कच्चे विक्षेप संकेत (वोल्ट में) को रिकॉर्ड किए गए इनवल्स और निर्धारित वसंत स्थिर के साथ गुणा करके बल मूल्यों (न्यूटन में) में परिवर्तित करें।
  2. सही विस्तार (टिप-सतह दूरी)4प्राप्त करने के लिए ऊर्ध्वाधर दिशा में पीजो तत्वों द्वारा संचालित दूरी से एएफएम कैंटिलीवर (इनवल्स के साथ कच्चे विक्षेप संकेत के गुणा के बाद) के विक्षेप को घटाएं।
  3. अंतिम घटना के बाद बेसलाइन पर रैखिक समारोह को फिटिंग करके और बल-विस्तार वक्र से घटाकर बहाव के लिए प्राप्त बल-विस्तार घटता को सही करें। फिट भाग को सतह से पर्याप्त विस्तार का प्रतिनिधित्व करना चाहिए जहां एएफएम कैंटिलीवर टिप और अंतर्निहित सतह के बीच न तो आकर्षक और न ही प्रतिकारक बातचीत देखी जाती है। इसके बाद बेसलाइन जीरो-एक्सिस के लिए सेट हो जाती है ।
    नोट: सोने की तरह अत्यधिक चिंतनशील सतहों पर माप के मामले में, हस्तक्षेप दिखाई दे सकता है । ये सतह से लेजर बीम के आंशिक प्रतिबिंब से और एएफएम कैंटिलीवर की पीठ से परिणाम देते हैं। इसलिए, प्राप्त बल-विस्तार घटता ऊर्ध्वाधर विस्तार के साथ एक सिनसुइडल फोर्स सिग्नल विरूपण साक्ष्य दिखा सकता है। यह एक विरूपण साक्ष्य है जो अंतिम बल मूल्यों को बाधित करता है। अभी भी इन बल-एक्सटेंशन घटता को ध्यान में रखने के लिए, एक सुधार संभव है(चित्रा 2)।
  4. यदि हस्तक्षेप बल-विस्तार घटता में दिखाई देते हैं, तो एक प्रतिनिधि बल-विस्तार वक्र (रिऐक्शन वक्र) का चयन करें जिसमें संभवतः अविशिष्ट आसंजन की चोटी और एक ही सिनसुइडल विरूपण साक्ष्य (यानी, आयाम और चरण)(चित्रा 2ए)की तुलना में कोई अन्य घटनानहीं दिखाई दे रही है।
    नोट: हस्तक्षेप के कम आवृत्ति पैटर्न प्राप्त करने के लिए प्रतिनिधि बल-विस्तार वक्र को चिकना करें।
  5. एक बल-विस्तार वक्र का चयन करें जिसे ठीक किया जाना है(चित्रा 2बी)।
  6. 6.4 चरणों से बल-विस्तार दोनों घटता ओवरले करें। और 6.5। यह सुनिश्चित करने के लिए कि दोनों एक ही सिनसुइडल विरूपण साक्ष्य (यानी, आयाम और चरण)(चित्रा 2सी)दिखाते हैं।
  7. बल-विस्तार वक्र से (चिकनी) प्रतिनिधि बल-विस्तार वक्र को घटाएं ताकि एक सिनसुइडल बेसलाइन(चित्रा 2डी)के बजाय सीधे सही किया जा सके।
    नोट: ध्यान रखें कि प्रतिनिधि वक्र का अविशिष्ट आसंजन शिखर घटता में प्रदर्शित होने वाली किसी भी एकल अणु घटनाओं से अलग है जिसे ठीक किया जाए। वास्तव में, प्रतिनिधि वक्र का चयन उचित सुधार के लिए महत्वपूर्ण है।

Representative Results

निम्नलिखित उदाहरण पॉलीमर खूंटी, पनिपाम और पीएस के एकल अणु खींचऔर हताश होने के परिणाम दिखाते हैं। सभी एएफएम कैंटिलीवर टिप्स को ऊपर दिए गए प्रोटोकॉल के साथ कार्यावित किया गया था। खूंटी और PNiPAM तापमान भिन्नता के साथ एसआईओएक्स पर मापा गया । खूंटी और PNiPAM के लिए परिणामी तापमान पर निर्भर खींच घटता की एक विस्तृत चर्चा के लिए, कोलबर्ग एट अल देखें ।18 एक अलग बल-विस्तार आकृति निरंतर बल का एक पठार है (उदाहरण के लिए, जब स्वयं से पीएस desorbing मिथाइल के मोनोलेयर समाप्त अल्केन थिओल्स सोने पर (सैम) पानी में4,,27,,३९,,५१)।

उदाहरण 1: पानी में खूंटी और PNiPAM की खींच
पानी में तापमान पर निर्भर खींच व्यवहार एकल PNiPAM और खूंटी बहुलक सहसंयोजक का उपयोग कर मापा गया था सहसंयोजक एक छोर पर एक AFM cantilever टिप करने के लिए बाध्य और दूसरे छोर पर एक SiOएक्स सतह पर भौतिकीकृत । अंशांकन और स्वच्छ नियंत्रण प्रयोगों के बाद (बल-विस्तार घटता का 2% से कम एकल अणु घटनाओं को दिखाते हैं), प्रत्येक एएफएम कैंटिलीवर के लिए कम से कम दो बल मानचित्र दर्ज किए गए थे। प्रत्येक तापमान पर कम से कम एक बल मानचित्र रिकॉर्ड करके तापमान पर निर्भर प्रयोग किया गया। जब केवल कुछ खींच घटनाओं दिखाई दिया, संबंधित AFM cantilever खारिज कर दिया गया था और चिप के अगले AFM cantilever लिया गया था (आमतौर पर आदेश सी, बी, डी और MLCT-जैव डीसी के ई में) । खूंटी के अनुकरणीय आंकड़ों के लिए, ५०० मापा बल-विस्तार घटता (19%) में से ९५ में एक भी स्ट्रेचिंग इवेंट देखा गया । PNiPAM के लिए, ६०० बल-विस्तार घटता में से २५२ एक खींच पैटर्न (४२%) दिखाया । बल-विस्तार घटता की बेहतर तुलना के लिए, हर तापमान के लिए एक मास्टर वक्र उत्पन्न किया गया था। इस उद्देश्य के लिए, केवल कम से कम 500 पीएन के लिए एक खींच घटना के साथ उन घटता है, जहां प्रवर्तक उतार चढ़ाव और विलायक प्रभाव नगण्य हैं,52चुने गए थे। खाते में लिया हिस्सों की अंतिम संख्या 278 कश्मीर में 3, 298 कश्मीर में 7 और खूंटी के लिए 318 कश्मीर में 4 और 278 कश्मीर में 4, 298 K में 3 और 3 पर 318 K पर PNiPAM18था.

मास्टर वक्र्स पैदा करने की प्रक्रिया चित्रा 3में दी गई है । चुने गए बल-विस्तार घटता(चित्रा 3ए)को लंबाई एल0 (500 पीएन के बल पर विस्तार) तक फिर से बढ़ाया जाता है, चित्रा 3बीदेखें। आसंजन चोटी सतह और एएफएम कैंटिलीवर टिप के बीच अविशिष्ट आसंजन की एक बड़ी भिन्नता दिखाती है, लेकिन बहुलक खींच व्यवहार को प्रभावित नहीं करती है। रीस्केल्ड फोर्स-एक्सटेंशन घटता को मिलाने के बाद उनका औसत एक द्विनामा चौरसाई द्वारा किया जाता है जैसा कि चित्रा 3सीमें प्रस्तुत किया गया है। इसके लिए, एक गॉसियन फिल्टर पास्कल के त्रिकोण से प्राप्त सामान्यीकृत गुणांक ों के साथ डेटा को चौरसाई पैरामीटर 2053के बराबर स्तर पर संयोजी करता है। अंत में, चित्रा 3डी में दिए गए प्रत्येक तापमान के लिए एक मास्टर वक्र प्राप्त कियाजाताहै। ज़ूम-इन उस सीमा को दिखाता है जहां बल-विस्तार व्यवहार पर तापमान प्रभाव सबसे स्पष्ट है।

खूंटी (ए) और पनिपम(बी)के तापमान व्यवहार की तुलना चित्र 4में पाई जा सकती है । खूंटी के लिए बढ़ते तापमान के साथ खींच बल की कमी देखी गई । 100 पीएन पर रीस्केल ्ड एक्सटेंशन के लगभग 5% की वृद्धि देखी गई जब तापमान 278 से 318 K तक बढ़ रहा है। PNiPAM के लिए, एक विपरीत तापमान पर निर्भर बदलाव से पता चला जा सकता है । 100 पीएन पर रीस्केल ्ड एक्सटेंशन के लगभग 1% की कमी देखी गई जब तापमान 278 से 328 के तक बढ़ गया था। इसके अतिरिक्त, किसी भी बल मूल्य के लिए वक्र के तहत क्षेत्र का निर्धारण करके बल-विस्तार मास्टर वक्र्स से खींचमुक्त ऊर्जा प्राप्त की जा सकती है। इसका उपयोग आणविक गतिशीलता (एमडी) सिमुलेशन18की मदद से खींचमुक्त ऊर्जा के ऊर्जावान और एन्ट्रोपिक योगदान निकालने के लिए किया जा सकता है।

उदाहरण 2: पानी में एक सैम सतह से पीएस के अवशोषण
पानी में एक सैम सतह से पीएस के अवशोषण का उपयोग हताश बल और लंबाई निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है और इस तरह हाइड्रोफोबिक बातचीत की मात्रा निर्धारित करता है। अंशांकन के बाद सतह के दो अलग-अलग स्थानों पर कम से कम दो फोर्स के नक्शे दर्ज किए गए। जब बहुलक लगाव सफल रहा, बल-विस्तार घटता लगातार बल के पठारों को दिखाया, विशेषता सुविधा के रूप में, चित्रा 5ए और चित्रा 5सीदेखें । पठार की तरह हताश देखा जाता है जब जांच बांड की गतिशीलता एएफएम कैंटिलीवर टिप (अर्ध-संतुलन) की पुलिंग दर से बहुत तेज होती है। पठार की तरह बल-विस्तार घटता के हताश बलों सीधे बल-विस्तार ट्रेस५४को एकीकृत करके आसंजन मुक्त ऊर्जा प्रदान करते हैं । उनका उपयोग इलेक्ट्रोस्टैटिक, फैलाव और हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन के साथ-साथ,तरल वातावरण2,,4,,23,,51,54,,55में सतहों पर एकल पॉलिमर के घर्षण गुणों का निर्धारण करने के लिए किया गया है।

लगातार बल के प्रत्येक पठार को हताश बल और अवशोषण लंबाई निर्धारित करने के लिए एक सिग्मोइडल वक्र के साथ फिट किया गया था, जिसे तब हिस्टोग्राम में प्लॉट किया गया था। हिस्टोग्राम में अधिकतम मूल्य और मानक विचलन निकालने के लिए गॉसियन लगे थे। एक बेहतर सिंहावलोकन के लिए, डिवरप्शन फोर्स और लंबाई मूल्यों को एक तितर-बितर साजिश में एक साथ प्रदर्शित किया गया था, जैसा कि चित्रा 5बी और चित्रा 5डीमें दिया गया था।

पानी में सैम पर पॉलीस्टीरिन के लिए, निर्धारित हताश ताकतें पहले प्राप्त मूल्यों19,,23के अनुरूप हैं। चूंकि अवशोषण लंबाई बहुलक समोच्च लंबाई51के साथ सहसंबंधित है, इसलिए अवशोषण लंबाई वितरण का उपयोग अपने कार्यात्मक अंत समूह के माध्यम से एएफएम कैंटिलीवर टिप के लिए संबंधित बहुलक के सहसंयोजक बाइंडिंग के प्रमाण के रूप में किया जा सकता है। इस प्रकार, हताश लंबाई एक फिंगरप्रिंट के रूप में कार्य करता है ।

एएफएम कैंटिलीवर टिप से जुड़े एक से अधिक बहुलक के लिए, पठारों के झरने (असतत चरण) बल-विस्तार घटता56में मनाया जा सकता है। प्रत्येक पठार एक अलग विस्तार पर एक बहुलक के अवशोषण का प्रतिनिधित्व करता है। चित्रा 5सी और चित्रा 5डी में दिए गए प्रयोग में एक ही समय में एएफएम कैंटिलीवर टिप से जुड़े दो पॉलिमर का एक विशिष्ट मामला दिखाया गया । अंतिम टूटना फिटिंग द्वारा, एक बिमोडल वितरण हताश लंबाई के लिए पाया जा सकता है, जबकि हताश बल एक संकीर्ण वितरण दिखाया । इस मामले में, छोटे जीवनयापन की लंबाई बल-विस्तार घटता के 90% में पाया जा सकता है, या तो एक पठार के रूप में या लंबे पठार पर एक अतिरिक्त पठार के रूप में, जैसा कि चित्रा 5सीमें दिया गया है। उच्च अपशीलता लंबाई प्राप्त बल-विस्तार घटता के 37% में पाया गया था। इस प्रकार, एएफएम कैंटिलीवर टिप से जुड़े विभिन्न पॉलिमर की संख्या निर्धारित करने के लिए अवशोषण लंबाई वितरण का उपयोग किया जा सकता है। सामान्य तौर पर, अपश्यक लंबाई मूल्यों का एक संकीर्ण वितरण एक अच्छा संकेत है कि एक और एक ही बहुलक प्राप्त बल-विस्तार घटता में जांच की गई थी। इसके साथ ही संबंधित सेनाओं-विस्तार की एक अधिस्थान का उपयोग यह तय करने के लिए किया जा सकता है कि क्या एक और एक ही बहुलक मापा गया है ।

एक पीएस बहुलक के सहसंयोजक बाध्यकारी साबित करने के बाद, इस पीएस बहुलक के साथ आगे प्रयोगअलग सब्सट्रेट (ठोस सतह के साथ-साथ बहुलक फिल्मों), विलायक स्थितियों, तापमान, वेग खींचने या समय निवास किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: टिप कार्यात्मकता प्रक्रिया का योजनाबद्ध सिंहावलोकन। (1)प्लाज्मा सक्रियण(2)सीलनीकरण/PEGylation और(3)बहुलक लगाव के बाद AFM कैंटिलीवर टिप के रासायनिक संशोधन भी शामिल है । इसके अतिरिक्त, उपयोग किए जाने वाले पॉलिमर की विस्तृत रासायनिक संरचनाएं, नामत खूंटी, पनिपाम और पीएस दिखाए गए हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: बल-विस्तार घटता में हस्तक्षेप का उन्मूलन। (क)विस्तार के साथ एक सिनोसोइडल फोर्स सिग्नल विरूपण साक्ष्य दिखाते हुए एक बल-विस्तार वक्र का पता लगाएं, लेकिन कोई एक अणु खींच घटना नहीं है। (ख)एक अणु घटना के साथ एक बल-विस्तार वक्र चुनें, जिसे सिनसुइडल विरूपण साक्ष्य से ठीक किया जाना है । (ग)घटता को नियंत्रित करने के लिए अधिरोपित करें यदि घटता की सिनसोइडल कलाकृतियों वास्तव में मेल खाती है । (D)बल-विस्तार वक्र(ए)को घटाकर(बी)से एक सीधी बेसलाइन के साथ एक बल-विस्तार वक्र प्राप्त किया जाता है । यद्यपि आसंजन चोटी का उपयोग आगे के विश्लेषण के लिए नहीं किया जा सकता है, लेकिन अब संविर्फैक्ट के लिए बल-विस्तार वक्र को ठीक किया गया है जिससे एकल अणु घटना (यहां: और 0.2 माइक्रोन विस्तार) के क्षेत्र में अधिक सटीक बल मूल्य हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: 298 K पर खूंटी के बल-विस्तार घटता से मास्टर घटता का निर्धारण। (A)7 फोर्स-एक्सटेंशन वक्र्स का उपयोग करते हुए 298 K पर प्रायोगिक आंकड़े। 500 पीएन(बी)के बल पर लंबाई एल0 में रिस्केलिंग के बाद, बल-विस्तार घटता को विलय किया जा सकता है और एक मास्टर वक्र(सी)प्राप्त करने वाले द्विनामा चौरसाई द्वारा औसत किया जा सकता है। रीस्केल्ड घटता डॉट्स के रूप में दिया जाता है जबकि मास्टर वक्र को ठोस रेखा के रूप में दिखाया गया है। अंत में, विभिन्न तापमान के लिए प्राप्त मास्टर घटता(डी)की तुलना की जा सकती है। ज़ूम-इन उस सीमा को इंगित करता है जहां बल-विस्तार व्यवहार पर तापमान प्रभाव सबसे स्पष्ट है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: PNiPAM और खूंटी के तापमान पर निर्भर मास्टर घटता की तुलना । खूंटी के लिए 100 पीएन (मध्य बल रेंज) पर रीस्केल विस्तार की वृद्धि तापमान(ए)में वृद्धि करते समय देखी जाती है, जबकि PNiPAM के लिए एक विपरीत तापमान पर निर्भर बदलाव प्रकट होता है(बी)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: पानी में सैम पर पीएस के बल-विस्तार घटता का विश्लेषण। (क)पठार (बैंगनी) के सिग्मोइडल फिट के साथ अनुकरणीय बल-विस्तार वक्र (नीला) । इसके अतिरिक्त, तीर पठार के निर्धारित बल (लाल) और लंबाई (हरे) को चिह्नित करते हैं। सिग्मोइडल फिट द्वारा प्राप्त हताश बल और भ्रामक लंबाई मूल्यों को एक स्कैटर प्लॉट में प्रदर्शित किया जाता है और जिसके परिणामस्वरूप हिस्टोग्राम गॉसियन के साथ लगे होते हैं। (ख)निर्धारित औसत अपचारी बल और हताश लंबाई मूल्य (112 ± 6) पीएन और (659 ± 7) एनएम हैं, जिसमें 93% बल-विस्तार घटता इस तरह के एकल पठार घटनाओं को दिखाता है। (ग)एक ही समय में एएफएम कैंटिलीवर टिप से जुड़े दो पॉलिमर के लिए अनुकरणीय बल-विस्तार वक्र (नीला) । यहां, हताश बल (117 ± 5) पीएन के औसत बल मूल्य के साथ एक यूनिमोडल वितरण दिखाता है, जबकि एक बिमॉडल वितरण अवशोषण लंबाई के लिए पाया जा सकता है जिससे (656 ± 9) एनएम और (1050 ± 16) एनएम का औसत लंबाई मूल्य होता है। (D)नमूना बल-विस्तार घटता का ९०% केवल एक पठार घटनाओं को दिखाते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

एएफएम आधारित एसएमएफएस बहुलक भौतिकी में एकल अणु बातचीत की जांच के लिए प्रमुख उपकरणों में से एक है । एक सच्चे एकल अणु प्रयोग के लिए, एएफएम कैंटिलीवर टिप के लिए जांच बहुलक का सहसंयोजक लगाव आवश्यक है।

पिछले कई काम नैनोफिशिंग प्रयोगों पर आधारित होते हैं, विशेष रूप से PNiPAM के लिए, जहां बहुलक एक सतह पर सोखले जाते हैं और फिर एएफएम कैंटिलीवर टिप30,,31का उपयोग करके उन्हें सब्सट्रेट से बेतरतीब ढंग से उठाकर फैलाते हैं। यह परिणामों को बदल सकता है और एकल अणु व्यवहार की गलत व्याख्या का कारण बन सकता है। वहां, सहकारी प्रभाव परिणामों पर हावी हो सकते हैं क्योंकि पड़ोसी बहुलक के साथ बातचीत को बाहर नहीं रखा जा सकता है। यह परिणामों पर एक बड़ा प्रभाव पड़ता है, विशेष रूप से बहुलक के लिए जो एकल अलग-थलग अणुओं57,,58की तुलना में थोक में काफी अलग व्यवहार दिखाते हैं।

यहां प्रस्तुत कार्यात्मकता प्रोटोकॉल विश्वसनीय है और उनकी समोच्च लंबाई, हाइड्रोफोबिसिटी या मोनोमर की स्मेरिक बाधा के बावजूद, विभिन्न पॉलिमर पर आसानी से लागू किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, एकल जांच बहुलक और एएफएम कैंटिलीवर टिप के साथ-साथ एएफएम कैंटिलीवर टिप और अंतर्निहित सतह के बीच अवांछित बातचीत को रोकने के लिए एक पासिवेशन प्रदान किया जाता है। इसके अलावा, बल-विस्तार घटता का मूल्यांकन खींच घटनाओं दिखा दिखा दिखाया गया है । वहां मास्टर फोर्स-एक्सटेंशन वक्र्स के निर्धारण के लिए एक प्रक्रिया प्रस्तावित है । यह खुलासा करने का एक बेहतर साधन प्रदान करता है, उदाहरण के लिए, बल-विस्तार व्यवहार पर तापमान से संबंधित प्रभाव। इसके अलावा, निरंतर बल पठारों की विशेषता एकल अणु हताश घटनाओं का विश्लेषण प्रदान किया जाता है। इसके अलावा, फोर्स-एक्सटेंशन घटता में सिनोइडल फोर्स सिग्नल कलाकृतियों को ठीक करने का एक सरल तरीका दिया जाता है जो अन्यथा प्रयोग के परिणामों को ख़राब कर सकता है।

स्टैटर एट अल39की तुलना में, यहां प्रस्तुत कार्यात्मकप्रक्रिया को चार के बजाय तीन चरणों में कम कर दिया जाता है और प्रक्रिया की मजबूती में सुधार होता है। एक कदम में पीईजिलेशन और सीलनीकरण करने का बड़ा लाभ बेहतर नियंत्रित प्रतिक्रिया होना और उपज बढ़ाना है। इसके अलावा, कम समाधान तैयार करने की जरूरत है और कम rinsing कदम की आवश्यकता है । इससे तैयारी के लिए मेहनत और समय कम होता है और प्रजनन क्षमता बढ़ जाती है। इसके अलावा, एएफएम कैंटिविवर्स को स्थानांतरित करना हमेशा कार्यात्मकता प्रक्रिया का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है। एक समाधान से दूसरे के लिए एक हस्तांतरण हमेशा हवा पानी इंटरफेस के माध्यम से हस्तांतरण या चिमटी के अनुचित उपयोग से एएफएम cantilevers खोने के कारण कार्यात्मकता गुणवत्ता को मजबूती से प्रभावित करने का जोखिम चलाता है ।

आदेश में एक एएफएम कैंटिलीवर टिप के लिए एक बहुलक के उचित सहसंयोजक लगाव साबित करने के लिए विभिन्न शर्तों को पूरा किया जाना है। सबसे पहले, नियंत्रण एएफएम कैंटीवर्स महत्वपूर्ण महत्व के हैं और हर कार्यात्मकता के लिए तैयार किया जाना चाहिए। कार्यात्मकता प्रक्रिया और प्रयोगों को करने के लिए तरल पदार्थ सेल को केवल साफ माना जाता है, यदि नियंत्रण प्रयोग में कम संख्या में बल-विस्तार घटता फैला या पठार दिखाता है (प्रस्तुत उदाहरणों में 2%)

उचित एकल अणु खींच घटनाओं होने के लिए कोई और बूंदों या मैक्सिमा के साथ एक स्पष्ट खींच पैटर्न आवश्यक है । इसके अतिरिक्त, टूटना पर बल लोडिंग दर पर टूटना बल की निर्भरता या खींच वक्र की पूरी लोचदार प्रतिक्रिया का विश्लेषण किया जाना चाहिए ताकि कई बहुलक59,,60के एक साथ हताश होने को बाहर किया जा सके। खूंटी और PNiPAM के लिए, सतह के विभिन्न पदों पर लिए गए बल-विस्तार घटता के 19% और ४२% ने क्रमशः इस तरह के एक खींच पैटर्न दिखाया । खींच घटनाओं को प्राप्त करने के लिए, संबंधित अंतर्निहित सतह पर बहुलक का भौतिकीकरण मजबूत होना चाहिए। अन्यथा पठार जैसी डिसोरपिंग घटना देखी जाती है। यह उच्च बलों (500 पीएन या उससे अधिक तक) पर खींच घटनाओं का पता लगाने के लिए और भी निर्णायक है। चूंकि यह मजबूत भौतिकज्ञान हर बल-विस्तार वक्र के लिए नहीं मिला है, इसलिए ऐसी घटनाओं की उपज शुद्ध पठार जैसी हवाद की घटनाओं की तुलना में कम है। एक विकल्प के रूप में, बहुलक और अंतर्निहित सतह के बीच कैटेकोल्स या केमिसोर्पशन जैसे दृढ़ता से पालन करने वाले समूहों का उपयोग किया जा सकता है। हालांकि, इसके लिए बहुलक61,,62पर आगे कार्यात्मक समूहों या युग्मन साइटों की शुरुआत की आवश्यकता होती है।

वास्तव में, बहुलक का द्रव्यमान (यानी, समोच्च लंबाई) एक मूल्यवान फिंगरप्रिंट प्रदान करता है। हालांकि द्रव्यमान सीधे निम्नलिखित कारणों के लिए मापा समोच्च लंबाई में अनुवाद नहीं किया जा सकता है, लंबाई वितरण एकल अणु घटनाओं को परिभाषित करने के लिए बहुत मूल्यवान है । कम पॉलीस्पेलिटी(= = 1.28) के साथ एक PNiPAM बहुलक के मामले में, हमें प्रयोगों में प्राप्त खींच घटनाओं (और इस प्रकार बहुलक लंबाई में) के लिए विस्तार मूल्यों में महत्वपूर्ण अंतर मिला। इसका एक कारण बहुलक लंबाई और इसके वितरण का निर्धारण हो सकता है। आकार-अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी (एसईसी) में, लक्ष्य बहुलक का एक सापेक्ष वजन पीएस या पॉली (मिथाइल मेथेक्रिलेट) (पीएमएमए)63जैसे मानकों की तुलना में निर्धारित किया जाता है। माना सापेक्ष वजन पूर्ण आणविक वजन से विचलित होने की उम्मीद है क्योंकि लक्ष्य बहुलक और मानक के हाइड्रोडायनामिक त्रिज्या काफी अलग हो सकते हैं। इसके अतिरिक्त, कार्यात्मकप्रक्रिया के दौरान स्टोल्यून में नकली पानी द्वारा सिलेन परत को ओलिगोमरीकृत किया जा सकता है। एएफएम कैंटिलीवर टिप के लिए ऐसे ओलिगोमर्स के लगाव से एंकरपॉइंट्स 64के साथ अधिक लचीली परत हो जाती है । इसके अलावा, सिलिकॉन परत के लिए बहुलक का लगाव बिंदु जरूरी शीर्ष पर नहीं हो सकता है जिससे पता लगाया लंबाई मूल्यों29में बदलाव हो सकता है। जबकि वर्मनुमा चेन (डब्ल्यूएलसी) या स्वतंत्र रूप से संयुक्त श्रृंखला (एफजेसी) मॉडल जैसे बहुलक मॉडल पूरे विस्तार रेंज18,,29,,41,,65,,66पर खूंटी या पीएनआईपीएएम के लिए संबंधित बल-विस्तार व्यवहार को पुन: पेश नहीं कर सकता, ऐसा बहुलक मॉडल अन्य बहुलक और प्रोटीन सिस्टम10,,15,67,,68के लिए मूल्यवान हो सकता है।,

एक पीएस बहुलक (1 माइक्रोन से अधिक की समोच्च लंबाई के साथ) का सहसंयोजक लगाव केवल सफल माना जाता है, जब काफी संख्या में बल-एक्सटेंशन वक्र्स निरंतर बल का एक लंबा पर्याप्त पठार दिखाते हैं(चित्रा 5)। एक ही बहुलक को डेसरबिंग करने के परिणामस्वरूप एक पठार को एक निश्चित विस्तार पर बेसलाइन पर निरंतर बल की एक तेज बूंद द्वारा परिभाषित किया गया है, जैसा कि चित्रा 5एमें दिया गया है। यदि अधिक पॉलिमर एएफएम कैंटिलीवर टिप से जुड़े होते हैं, तो पठारों का झरना56 (चित्र5सी)मनाया जाता है। पठार की लंबाई (अवशोषण लंबाई), बहुलक समोच्च लंबाई51के साथ सहसंबद्ध, अंतर्निहित सतह (यहां लगभग 200 एनएम) के लिए एएफएम कैंटिलीवर टिप के अविशिष्ट आसंजन के कारण किसी भी आसंजन चोटी की तुलना में काफी लंबा होना चाहिए। केवल एक बल-विस्तार वक्र में प्रदर्शित होने वाली विशेषताओं की व्याख्या नहीं की जानी चाहिए। प्रस्तुत प्रयोगों में, १०० घटता में से कम से ८० सतह पर दो अलग स्थानों पर कम से दो बल नक्शे में २०० एनएम से अधिक एक पठार दिखाया । इसके अलावा, डिवोरशन लंबाई का वितरण, फिगर 5बी और 5डीमें दिए गए स्कैटर प्लॉट्स का उपयोग करके, पता चलता है कि एएफएम कैंटिलीवर टिप से कितने और कितने पॉलिमर बंधे हैं। पीएस के मामले में, बल-विस्तार घटता के पठारों से लिए गए हताश बल और लंबाई का एक संकीर्ण वितरण एक सफल सहसंयोजक लगाव के सबूत के रूप में कार्य करता था। यह अंत में कार्यात्मकता प्रोटोकॉल की सफलता साबित कर दिया। इस प्रकार, हम दृढ़ता से प्रकाशनों में इस तरह के बल और लंबाई वितरण पेश करने की सलाह देते हैं ।

बिल्ट-इन एल्गोरिदम का उपयोग करके बल-विस्तार घटता का मूल्यांकन करना जिसमें कई पूर्व-निर्धारित पैरामीटर शामिल हैं, देखभाल के साथ किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए कारण हैं कि एक निश्चित नमूना दर हर लागू पुलिंग वेग के लिए उपयुक्त नहीं है या कि बल-एक्सटेंशन घटता का एक स्वचालित चौरसाई महत्वपूर्ण विवरण औसत हो सकता है। आमतौर पर संबंधित मूल्यांकन प्रक्रिया की उचित समझ मूल्यांकन प्रक्रिया में त्रुटियों को रोक सकती है, जो बदले में एएफएम आधारित एसएमएफएस प्रयोग के अंतिम निष्कर्षों को दृढ़ता से प्रभावित कर सकती है।

संक्षेप में, हम एक कार्यात्मकता प्रोटोकॉल पेश करते हैं जो विश्वसनीय है और आसानी से विभिन्न प्रकार के पॉलिमर पर लागू किया जा सकता है। इसके अलावा, एकल अणु बल-विस्तार घटता का उचित मूल्यांकन प्रस्तुत किया जाता है, जिससे शारीरिक मापदंडों जैसे स्ट्रेचिंग फोर्स, डिवरपशन फोर्स और डिवशन लंबाई के निर्धारण की अनुमति मिलती है । प्रस्तुत प्रोटोकॉल और प्रक्रियाएं एकल अणु स्तर पर उत्तेजनाओं-उत्तरदायी प्रणालियों की जांच के लिए मूल्यवान हैं ।

Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित है ।

Acknowledgments

बी.एन.बी. और टीएच जर्मनी की उत्कृष्टता रणनीति के तहत ड्यूश फोर्सचुंग्सजेमिन्स्चफ्ट (डीएफजी, जर्मन रिसर्च फाउंडेशन) द्वारा वित्तपोषण स्वीकार करते हैं - EXC-2193/1 - 390951807, gefördert ड्यूरच मरो ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der Exzellenzstrategie des Bundes und der Länder-EXC-2193/1-390951807, और अनुदान एचयू 997/1-13 (परियोजना # 420798410) । एमजी हेसेन राज्य उच्च शिक्षा, अनुसंधान और कला मंत्रालय द्वारा LOEWE परियोजना iNAPO के फ्रेम में आंशिक समर्थन स्वीकार करते हैं । हम उच्च गुणवत्ता वाले सोने कोटेड सिलिकॉन वेफर्स के दान के लिए फ्रानहोफर इंस्टीट्यूट फॉर एप्लाइड सॉलिड स्टेट फिजिक्स आईएएफ से डॉ वोल्फगैंग ब्रोनर और डॉ एग्ने ज़ुकौकाइट को धन्यवाद देते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Dodecanethiol (≥98%) Sigma-Aldrich, USA 417364-500ML Used for SAM
Ammonia solution (30%) Roth, Germany CP17.2 Used for cleaning
Cypher ES Asylum Research, an Oxford Instruments company, USA - AFM
Ethanol (≥99.9%) Roth, Germany PO76.1 Solvent
Gold coated silicon wafer Fraunhofer Institute for Applied Solid State Physics IAF, Germany - Used for SAM
High Resolution Replicating Compound Microset Products Ltd, UK 101RF Bonding agent
Hydrogen peroxide solution Sigma-Aldrich, USA H1009 Used for cleaning
Igor Pro Wavemetrics, USA - Software environment
Tetra-30-LF-PC Diener Electronic, Germany - Plasma chamber
Maleimide-polyethylene glycol-triethoxysilane Creative PEG works, USA PHB-1923 Linker polymer
MLCT-Bio-DC Bruker, USA MLCT-Bio-DC AFM cantilever
Prime CZ-Si wafer, n-type (Phosphor) TTV < 10 µm MicroChemicals, Germany WSA40600250 P1314SNN1 Silicon wafer
Purelab Chorus 1, 18.2 MΩ cm Elga LabWater, Germany 10034-540 Ultrapure water source
R3 SA Vomm GmbH, Germany 5803 Blank Tweezers
Thiol terminated poly(N-isopropylacrylamide) Gallei Group, Saarland University, Germany - PNiPAM probe polymer
Thiol terminated polystyrene Polymer Source, Canada P40722-SSH PS probe polymer
Thiol-polyethylene glycol-thiol Creative PEGWorks, USA PSB-615 PEG probe polymer
Toluene (99.99%) Fisher Chemicals T324-500 Solvent

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रसायन विज्ञान अंक 157 एकल अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी परमाणु बल माइक्रोस्कोप आसंजन कार्यात्मकता PEGylation
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Kolberg, A., Wenzel, C., Hugel, T., Gallei, M., Balzer, B. N. Covalent Attachment of Single Molecules for AFM-based Force Spectroscopy. J. Vis. Exp. (157), e60934, doi:10.3791/60934 (2020).

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